DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y CIRUGIA ANIMAL UNIVERSIDAD DE CORDOBA UNIDAD DE INVESTIGACION HOSPITAL UNIVERSITARIO REINA SOFIA EFECTO DIRECTO DEL PH SOBRE LA SECRECION DE HORMONA PARATIROIDEA (PTH) IGNACIO LÓPEZ VILLAL BA CORDOBA, 2002 DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y CIRUGIA ANIMAL UNIVERSIDAD DE CORDOBA UNIDAD DE INVESTIGACION HOSPITAL UNIVERSITARIO REINA SOFIA EFECTO DIRECTO DEL PH SOBRE LA SECRECION DE HORMONA PARATIROIDEA (PTH) Memoria de Tesis Doct oral presentada por IGNACIO LOPEZ VILLALBA, Licenciado en Veterinaria, para optar al grado de DOCTOR. Los directores Dr. Escolástico Aguilera Tejero Profesor Titular del Departamento de Medicina y Cirugía Animal de la Universidad de Córdoba Dr. Juan Mariano Rodríguez Portillo Profesor Asociado del Departamento de Medicina de la Universidad de Córdoba “[...] Lo que sea importante quedará; lo que sea inútil desaparecerá. Pero que cada uno juzgue simplemente las prop ias conquistas: no somos jueces de los sueños de nuestro prójimo. Para tener fe en nuestro camino, no es preciso demostrar que el camino del otro es equivocado. El que actúa así, no confía en sus propios pasos.” Paulo Coelho Maktub A mis padres A mis hermanos y a Meike Durante la elaboración de este trabajo ha habido muchas personas que han contribuido de alguna u otra manera a que esta Tesis Doctoral saliera adelante y a que finalm ente vea la luz. A todas ellas debo dedicar estas páginas y quiero expresarles mi agradecimiento. Este agradecimiento debe tener mención especial para: El Dr. Escolástico Aguilera Tejero , por su magnífica tarea como director de este trabajo de Tesis Doct oral, al que ha dedicado pacientemente mucho tiempo y esfuerzo. También quiero expresarle aquí mi satisfacción y mi agradecimiento por haber podido trabajar junto a él todos estos años. Durante este tiempo, que se remonta hasta mis primeros pasos como cola borador del Dpto. de Patología Médica antes de obtener la licenciatura, ha constituido para mi un modelo ejemplar de rigor y superación profesional. El Dr. Juan Mariano Rodríguez Portillo , por haberme concedido el privilegio de trabajar bajo su direcci ón y asesoramiento. Además de las valiosas aportaciones científicas que ha hecho a este trabajo, quiero destacar y agradecer su capacidad de análisis, siempre tan constructiva y optimista que resulta muy útil para afrontar con entusiasmo e ilusión el enorm e esfuerzo que constituye un trabajo de estas características. El Dr. Rafael Mayer Valor , director del Departamento de Medicina y Cirugía Animal, por haber puesto a mi alcance los medios necesarios para el desarrollo de este trabajo. También quiero agra decerle su continuo apoyo y la confianza que me ha mostrado desde el momento en que comencé a trabajar en este departamento. El Dr. Arnold J. Felsenfeld , por las aportaciones científicas prestadas a lo largo de la realización de esta Tesis Doctoral. El D r. José Carlos Estepa , por haberme ofrecido en todo momento su ayuda y colaboración de manera incondicional, mostrándose siempre como un magnífico compañero. Además de las innumerables aportaciones profesionales que me ha brindado desde el momento que com encé a trabajar con él, he de agradecer a José Carlos su entrega personal como amigo. La Dra. Yolanda Almadén , por haber sido una excelente compañera desde el primer día que entre en el laboratorio de los “Paratiroideos”, ofreciéndome siempre su inestima ble ayuda y colaboración. También quiero expresarle mi agradecimiento por poder disfrutar de su valiosa amistad, que me confiere la oportunidad de compartir muy buenos momentos dentro y fuera del trabajo. El Dr. Antonio Canalejo , por comportarse como un excelente compañero, del que he recibido, además de su ayuda, una inquietud especial por encontrar siempre el interés científico de las cosas. Además de estar agradecido por disfrutar de sus conocimientos, he de estarlo por poder compartir con él alguna s aficiones. Sonia Bas y Bartolomé Garfia , quienes me han ayudado en numerosas ocasiones durante la realización de la parte experimental de este trabajo. Los demás compañeros de laboratorio: Gracia Añón, Fernando Luque , Sagrario Cañadillas y Alicia Ba s, por haber sido igualmente unos estupendos compañeros y haberme ayudado siempre que ha sido necesario. Todos ellos constituyen, no sólo un magnífico grupo de trabajo, sino un círculo de amigos del que me siento orgulloso y feliz de formar parte. El resto de mis compañeros de la Unidad Experimental (por orden alfabético): Amira, Ana Quintero, Carmen Marín, Chari López, Charo Jiménez, Elier Paz, Emilio Siendones, Jordi Muntané, José Manuel Lozano, Juan Antonio Madueño, Juan Moreno, Julia Carracedo, Lo la Bravo, Nuria Barbarroja, Pablo Dobado, Puri Gómez, Rafael Ramírez , Silvia Sainz, Yolanda Jiménez , con quienes he compartido tantísimos momentos de trabajo prestándome su ayuda y soportando pacientemente los inconvenientes de mi trabajo con perros. Tambi én quiero agradecerles los buenos momentos de ocio que hemos compartido fuera del trabajo, imprescindibles para afrontar el día a día con buen humor. Katiuska Satué , por haber sido una muy buena compañera, con la que he compartido en la sala de becarios l argos días de trabajo inmersos en nuestros trabajos de tesis. Los miembros del Departamento de Medicina y Cirugía Animal de la Universidad de Córdoba . El personal de trabajo de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario Reina Sofía , sin cuya ayuda y colaboración no hubiera sido posible la realización de este trabajo. Especialmente quiero dar gracias a José Luis Delgado , por haberme facilitado el trabajo en todo lo posible y haberse mostrado siempre con excelente disposición y voluntad. De for ma no menos especial, también quiero destacar la colaboración prestada por Manoli Gallego , gracias a la cual he podido disponer del material necesario para este trabajo y a Maria Dolores Castro, por agilizarme los trámites burocráticos necesarios para la p resentación de esta Tesis. También quiero agradecer la valiosa ayuda y colaboración de Francisco Javier Sánchez, Leovigilda Ortiz y María Francisca de Molina. Los miembros del Servicio de Medicina Nuclear del Hospital Universitario Reina Sofía , por el bue n trato que siempre me han ofrecido. De forma especial, quiero resaltar la ayuda prestada por Antonio, Chelo y Mari Carmen quienes me ofrecieron en todo momento su atención y colaboración. Además tengo que agradecerles los buenos momentos que pasé en su “a cogedor” laboratorio durante las infinitas mediciones de “pth” que allí realicé. El Centro de Control Animal de Córdoba , por habernos provisto de los animales necesarios para el desarrollo de este estudio. Quiero resaltar la especial importancia que ha te nido para nuestro grupo de trabajo el contar con el apoyo y participación de todos los miembros de esta entidad. Mis padres, Ignacio López y Benilde Villalba , quienes son responsables en gran medida de la realización de esta Tesis Doctoral, pues gracias a su esfuerzo y sacrificio he tenido la oportunidad de obtener una licenciatura y seguir después dedicado a la investigación. Además, quiero agradecerles de forma especial la confianza y el cariño que siempre han depositado en mi, a pesar de no comprender m uy bien el sentido de todo este tiempo dedicado al trabajo de Tesis. Mis hermanos, Escolástica y Félix, por apoyar y aceptar todas mis decisiones. Gracias a su comprensión y cariño incondicional ha sido posible gran parte de los esfuerzos que he dedicad o en mi formación profesional. Meike , que ha soportado con paciencia y resignación mis cambios de humor en los últimos meses de redacción de este trabajo, durante los cuales el tiempo y la atención que le he prestado han sido escasos. Sin su cariño y su apoyo no hubiera podido superar los bajos momentos que he atravesado cuando las cosas no iban bien. LISTA DE ABREVIATURAS A continuación, se presenta una relación de las abreviaturas más utilizadas a lo largo del texto. AA Acido araquidónico AC Adenilato ciclasa Ac. Met. Acidosis metabólica Ac. Res. Acidosis respiratoria ADH Hormona antidiurética ADN Acido desoxirribonucleico Alb Albúmina Alc. Met. Alcalosis metabólica Alc. Res. Alcalosis respiratoria AMPc Adenosina monofosfato cíclica ARN A cido ribonucleico ARNm Acido ribonucleico mensajero At Acidos débiles no volátiles ATP Trifosfato de adenosina Ca 2+ Calcio iónico Cai 2+ Calcio iónico intracelular CaR Receptor de calcio CT Calcitonina CTR Calcitriol DAG Diacilglicerol HETEs A cidos hidroxieicosatrenoicos HPETEs Acidos hidroxiperoxieicosatrenoicos HPTH2 Hiperparatiroidismo renal secundario IP 3 Inositol trifosfato IRC Insuficiencia renal crónica LO Lipoxigenasa MAP Proteína activada por mitógenos Mg Magnesio total Mg 2+ Magnesio iónico nCaRE Elemento de respuesta negativa al Ca 2+ P Fósforo inorgánico PIP 2 Fosfatidil - inositol 4,5 - bifosfato PKC Proteína quinasa C PLA 2 Fosfolipasa A 2 PLC Fosfolipasa C PTH Hormona paratiroidea PTHrP Péptido relacionado con la PTH S ID Diferencia de iones fuertes TPX Tiropatiroidectomia VDR Receptor de vitamina D VDRE Elemento de respuesta a la vitamina D INDICE Página I. INTRODUCCION 1 II. REVISION BIBLIOGRAFICA 7 III. MATERIAL Y METODOS 113 IV. RESULTADOS 145 V. DISCUSION 217 VI. CONCLUSIONES 271 VII. RESUMEN 275 VIII. SUMMARY 279 IX. BIBLIOGRAFIA 283 I Introducción 1 I. INTRODUCCION I Introducción 2 I Introducción 3 Los enfermos con insuficiencia renal crónica (IRC) frecuentemente desarrollan hiperparatiroidismo secundario (HPTH2). 383 El exceso en la producción de hormona paratiroidea (PTH) se debe a varios factores relacionados con la reducción de masa renal funcionante: hipocalcemia, disminución en los niveles de calcitriol (CTR) e hiperfosfatemia, principalmente. 323 Estos enfermos también suelen padecer acidosis metabólica, causada por la disminución en l a excreción renal de ácidos fijos. Aunque se sabe que la disminución del pH favorece la descalcificación ósea, 99,294 una cuestión que está actualmente por resolver es si la acidosis que acompaña a la IRC influye directamente en la secreción de PTH. Este he cho tiene gran relevancia, puesto que el manejo terapéutico de los pacientes con IRC no será idóneo mientras existan dudas sobre los mecanismos por los que la acidosis favorece el HPTH2. La relación entre PTH y equilibrio ácido - base no se conoce con exact itud. Desde un punto de vista filogenético, se ha propuesto que las glándulas paratiroides podrían haber tenido un papel importante en la homeostasis ácido - base y que, posteriormente, habrían evolucionado hacia la regulación del metabolismo mineral. 521 Dic ha hipótesis se basa en que la acción de la PTH sobre el hueso proporciona un incremento de sustancias tampón con las que se puede neutralizar la acidosis. Por otro lado, la PTH actúa sobre los túbulos renales favoreciendo la eliminación de hidrogeniones e n la orina (al aumentar la presencia de fosfato en el túbulo contorneado distal, que se comporta como aceptor de protones, favoreciendo así la reabsorción de bicarbonato en este punto de la nefrona). 51,382 Si la PTH ayuda a controlar el pH, parece lógico p ensar que los cambios del pH deberían influir sobre la secreción de PTH. Sin embargo, hasta hoy no existen datos que hayan demostrado un efecto directo de los cambios del pH sobre la secreción de PTH. La relación entre acidosis y HPTH2 es compleja. Existe n estudios que sugieren que la disminución del pH puede favorecer el desarrollo de HPTH2, aunque otros investigadores no han conseguido demostrar un efecto de la acidosis sobre la secreción I Introducción 4 de PTH. La disparidad de resultados está condicionada, en parte, p or la dificultad para realizar estudios in vivo , dado que las modificaciones de pH influyen sobre diversos parámetros que alteran la secreción de PTH. En concreto, las variaciones del pH provocan cambios en la ionización del calcio plasmático, modificando la proporción de calcio unido a la albúmina. 458 Además, la acidosis produce un descenso en la síntesis de CTR, el cual influye sobre la secreción de PTH directa e indirectamente. 92,122, 195,272,311 La disminución del pH también ejerce un efecto directo sobre el hueso, independientemente de la acción hormonal, que favorece la reabsorción mineral y, por lo tanto, tiende a modificar la calcemia y fosfatemia. 106,115 Finalmente, la excreción urinaria de calcio, fósforo, y magnesio sufre modificaciones cuando varía el pH del medio interno. 121,135,238,288,295,444 Estas acciones colaterales determinan que se desconozca si existe un efecto directo del pH sobre la secreción de PTH, puesto que en ninguno de los estudios realizados hasta ahora se ha logrado controlar la calcemia cuando se modifica el pH. Nuestro grupo investigador ha desarrollado un modelo experimental canino in vivo con el que se consigue modificar de forma aguda el pH sanguíneo, a la vez que se mantienen constantes los niveles de calcio iónico (Ca 2 + ). De esta forma, se puede aislar el efecto del pH sobre la secreción de PTH sin las interferencias que suponen los cambios en la calcemia. En este trabajo, se ha utilizando este modelo experimental, con el propósito de conseguir los siguientes objetivos: 1. Evaluar in vivo el efecto de los cambios en el estado ácido - base sobre la secreción de PTH. 2. Determinar si el efecto es diferente cuando las alteraciones del pH son debidas a procesos metabólicos o respiratorios. I Introducción 5 3. Analizar si los cambios en el equilibri o ácido - base provocan modificaciones en el metabolismo de la PTH. II Revisión bibliográfica 7 II. REVISION BIBLIOGRAFICA II Revisión bibliográfica 8 II. REVISION BIBLIOGRAFICA A. METABOLISMO MINERAL A.1. HOMEOSTASIS DEL CALCIO Y DEL FOSFORO A.1.1. ELEMENTOS INTEGRANTES DEL SISTEMA HOMEOST A TICO A.1.2. RESPUESTA DEL SISTEMA HOMEOST A TICO A LAS VARIACIONES DE CALCIO Y F O SFORO EXTRACELULAR ES A.2. LAS GLANDULAS PARATIROIDES Y LA PARATHORMONA (PTH) A.2.1. ANATOMIA DE LAS GL A DULAS PARATIROIDES A.2.2. HISTOLOGIA DE LAS GLANDULAS PARATIROIDES A.2.3. BIOS I NTESIS DE LA P TH A.2.4. ESTRUCTURA DE LA P TH A.2.5. RELACION ESTRUCTURA - ACTIVIDAD DE LA PTH A.2.6. METABOLISMO DE LA P TH A.3. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA A .3.1. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA POR CALCIO A .3.2. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA POR CALCITRIOL A.3.3. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA POR FOSFORO B. ESTADO ACIDO - BASE B.1. REGULACION DEL ESTADO ACIDO - BASE B.1.1. ANALISIS TRADICIONAL DEL ESTADO ACIDO - BASE B .1.1.1. REGULACI O N DEL PH B.1.1.2. ELECTROLITOS Y PH B.1.2. ANALISIS CUANTITATIVO DEL ESTADO ACIDO - BASE B.1.2.1. VARIABLES DEPENDIENTES E INDEPENDIENTES B.1.2.2. PRESION PARCIAL DE CO 2 B.1.2.3. DIFERENCIA DE IONES FUERTES B.1.2.4. CONCENTRACION DE ACIDOS DEBILES NO VOLATILES B.2. ALTERACIONES DEL EQUILIBRIO ACIDO - BASE B.2.1. ANALISIS TRADICIONAL B.2.2. AN A LISIS CUANTITATIVO C. RELACION ENTRE EL METABOLISMO MINERAL Y EL ESTADO ACIDO - BASE C.1. LA PTH Y EL EQUILIBR IO ACIDO - BASE C.1.1. PTH Y ACIDIFICACI O N URINARIA C.1.2. PTH Y BU F F ER S EXTRARRENALES C.2. HIPERPARATIROIDISMO RENAL SECUNDARIO (HPTH 2 ) C.2.1. INSUFICIENCIA RENAL CR O NICA Y HPTH 2 C.2.2. ACIDOSIS METAB O LICA Y HPTH 2 C.2.2.1. EL HUESO Y LA HOMEOSTASIS MINERAL C.2.2.2. OSTEODISTROFIA RENAL C.2.2.3. EFECTO DE LA ACIDOSIS SOBRE EL HUESO C.2.2.4. PAPEL DE LOS ANIONES EN LA OSTEODISTROFIA RENAL C.2.2.5. EFECTO DE LA ACIDOSIS SOBRE PTH Y CALCITRIOL II Revisión bibliográfica 9 A. METABOLISMO MI NERAL A.1. HOMEOSTASIS DEL CALCIO Y DEL FOSFORO El mantenimiento de la homeostasis del calcio y del fósforo es de gran importancia para el correcto funcionamiento del organismo, dado el importante papel que desempeñan estos dos minerales en el ser vivo . El calcio es un elemento esencial en todas las especies que integran la escala filogenética. En mamíferos, tiene una gran variedad de funciones tanto a nivel extracelular como intracelular: participa en numerosas reacciones enzimáticas, en mecanismos d e secreción y acción hormonales y está íntimamente ligado a la transmisión del impulso nervioso y a la contracción muscular; además, también juega un es en cial papel en la transmisi ón de señales celulares , en los fenómenos de división celular, fe cundación y coagulación sanguínea. 85 El 99 % del calcio presente en el organismo está depositado en el hueso, que representa el principal reservorio de este mineral. Del calcio presente en sangre, aproximadamente el 45 % se encuentra unido a proteínas, sobre todo albúmina; entre un 5 y un 10% forma complejos con ácidos débiles (bicarbonato, citrato, fosfato , etc . ); y el resto, alrededor del 50 % (1.25 mM), se encuentra en forma iónica (Ca 2+ ), siendo este último el único que tiene actividad biológica. 39 0 La concentración extracelular de Ca 2+ debe mantenerse regulada dentro de unos límites bastante estrechos, por lo que existe un complejo y preciso sistema hormonal encargado de mantener la homeostasis del calcio. 85 El fósforo también desarrolla un pap el trascendental en numerosos procesos biológicos. Así, aparece en los productos intermediarios que participan en el metabolismo de la glucosa, siendo un constituyente esencial de elementos transmisores de alta energía, entre los que II Revisión bibliográfica 10 destaca el trifosfato de adenosina (ATP). Asimismo, el fósforo forma parte de cofactores, como el dinucleótido del ácido nicotínico, y de sustancias de naturaleza lipídica, como la fosfatidilcolina, y puede actuar como modificador covalente de numerosas enzimas. 29 2 Al igua l que el calcio, la mayor parte (80%) del fósforo presente en los mamíferos se encuentra integrando la estructura cristalina del hueso, siendo éste su principal depósito de reserva. En el resto del organismo, el fósforo se localiza preferentemente a nivel intracelular. En el fósforo sanguíneo se pueden diferenciar tres fracciones: a) el fósforo lipoídico, que corresponde a los fosfolípidos; b) el fósforo incorporado a proteínas, al ATP, al ácido adenílico y a otras moléculas orgánicas; y c) y el fósforo i norgánico (P ), que es la fracción constituida por los fosfatos y pirofosfatos. Este último es el que se mide rutinariamente en sangre. 248 A.1.1. ELEMENTOS INTEGRANTES DEL SISTEMA HOMEOSTATICO El sistema homeostático del Ca 2+ está constituido por tres componentes fundamentales: a) E l primero de ellos está formado por los iones, Ca 2+ y P , que serán los principales protagonistas y en torno a cuya regulación girará el resto de elementos del sistema. 85 b) El segundo elemento de este sistema homeostático es un “componente sensor”, en cargado de percibir y responder a pequeñas variaciones en las concentracion de Ca 2+ extracelular. Aquí se incluyen a las células paratiroide a s, las células de los túbulos proximales del riñón y las células C del tiroides, encargadas de producir hormona par atiroidea (PTH), calcitriol (CTR) y calcitonina (CT), respectivamente. 27 , 65 , 83 , 3 29 , 453 c) Finalmente está el “componente efector”, compuesto por las células renales, óseas e intestinales, que responden a los estímulos producidos por las hormonas. De esta forma, modulan el intercambio de Ca 2+ entre el medio extracelular, el riñón, el sistema esquelético y II Revisión bibliográfica 11 el intestino, con la finalidad de mantener estables las concentraciones plasmáticas de estos iones. 26 , 83 , 39 0 , 409 , 481 A. 1.2. RESPUESTA DEL SISTEMA HOMEOSTATICO A LAS VARIACIONES DE CALCIO Y FOSFORO EXTRACELULAR ES El sistema homeostático anteriormente descrito está preparado para responder a variaciones muy pequeñas de la concentración extracelular de Ca 2+ . La resp uesta inmediata a las fluctuaciones de la calcemia viene determinada fundamentalmente por la PTH. De esta manera, pequeñas reducciones en la concentración plasmática de Ca 2+ desencadenan un aumento en la secreción de PTH. 453 El sistema homeostático tam bién es capaz de reconocer fluctuaciones en la concentración de P extracelular: el incremento en la concentración de P estimula la secreción de PTH y el descenso de P plasmático da lugar a un aumento en la síntesis de CTR. La PTH actúa sobre el sistem a esquelético favoreciendo los fenómenos de resorción ósea, provocando una salida de Ca 2+ y de P desde el hueso hacia el espacio extracelular. Al mismo tiempo, a nivel renal, esta hormona favorece los procesos de reabsorción de Ca 2+ y la eliminación de P . 6 , 153 Por último, la PTH estimula la síntesis de CTR a partir del 25 - hidroxicolecalciferol. 187 , 242 Por lo tanto, el conjunto de las acciones de la PTH va encaminado a incrementar la calcemia y reducir la fosfatemia. 85 El CTR actúa fundamental mente a nivel intestinal, favoreciendo la absorción de Ca 2+ y P , y a nivel óseo, provocando salida de Ca 2+ y de P desde el esqueleto hacia el medio extracelular. Así pues, el CTR tiende a aumentar tanto la calcemia como la fosfatemia. 85 El CTR presenta al mismo tiempo un efecto “feed - back” negativo sobre las glándulas paratiroides, de forma que niveles elevados de CTR inhiben la síntesis y, posiblemente, la secreción de PTH. 85 , 326 , 35 4 , 406 II Revisión bibliográfica 12 Al incrementarse la concentración de Ca 2+ extrac elular se produce el efecto contrapuesto sobre las glándulas paratiroides: una inhibición de la secreción de PTH. La disminución en los niveles de PTH circulante da lugar a un incremento en la eliminación de Ca 2+ por la orina, a una disminución en la salid a de Ca 2+ y P desde el hueso hacia la sangre, y a una menor absorción de estos iones desde el intestino (al cesar el efecto estimulador que ejerce la PTH sobre la síntesis de CTR). 85 , 481 En algunas especies animales, como la rata, la hipercalcemia eleva notablemente la secreción de CT. Ello da lugar a una inhibición directa de los osteoclastos, reduciéndose así el flujo de Ca 2+ desde el sistema óseo hacia la sangre, y a un aumento en la eliminación de Ca 2+ por orina. 27 Sin embargo, en la mayoría de los mamíferos adultos la acción de la CT es muy limitada, debido a la relativamente baja tasa de remodelación del hueso. 85 II Revisión bibliográfica 13 A.2. LAS GLANDULAS PARATIROIDES Y LA PARATHORMONA Como se ha descrito anteriormente, la PTH desempeñ a un papel fundamental en el complejo sistema de regulación del metabolismo fosfocálcico. Su principal misión es mantener el Ca 2+ y el P extracelulares en unos niveles constantes, regulando los procesos de intercambio de estos iones entre el medio extrace lular y el esqueleto, y modulando los procesos de absorción intestinal y excreción renal de Ca 2+ y P . 85 A.2.1. ANATOMIA DE LAS GLANDULAS PARATIROIDES En la mayoría de los mamíferos se distinguen dos grupos de glándulas paratiroides: las externas , procedentes del III arco branquiógeno; y las internas, cuyo origen embriológico es el IV arco branquiógeno. 364 En el perro, sujeto experimental en el presente trabajo, las glándulas paratiroides externas generalmente se localizan en la mitad craneal de la glándula tiroides, tanto en su cara lateral como en la medial (Figura 1). Sin embargo, en algunas ocasiones también pueden ocupar territorios más caudales, situándose en posiciones dorsolaterales al polo caudal de la glándula. Las glándulas paratiro ides externas presentan una morfología oval, aplanada, y una coloración amarillo - rojiza, siendo fácilmente distinguibles de la glándula tiroides. Su tamaño depende del peso corporal, pudiendo ser tan pequeñas como un grano de arroz en las razas caninas de menor tamaño. 364 Las glándulas paratiroides internas se encuentran generalmente embutidas en el espesor del parénquima de la glándula tiroides, aunque también pueden localizarse superficialmente en su cara medial, o incluso en el borde dorsal. Las glán dulas paratiroides internas presentan morfología y coloración similares a las externas, aunque su tamaño es menor. 364 El riego sanguíneo de estas glándulas corre a cargo de las arterias y venas paratiroideas, II Revisión bibliográfica 14 dependientes de una pequeña red lateral de la arteria carótida común y de la vena yugular, o bien de las arterias y venas tiroideas craneales. 364 La inervación es satélite; junto a las arterias, les llegan ramos sueltos del sistema nervioso simpático procedentes del ganglio cervical craneal , al mismo tiempo que reciben inervación del sistema nervioso parasimpático procedente del nervio laríngeo caudal. 364 Figura 1. Imagen ventral de la localización anatómica de las glándulas paratiroides en el perro. 364 II Revisión bibliográfica 15 A .2.2. HISTOLOGIA DE LAS GLANDULAS PARATIROIDES La célula secretora de las glándulas paratiroides, también denominada célula principal , presenta morfología poligonal . Es una célula polar de origen ectodérmico, como cla ramente se demuestra por la localización citoquímica de ATPasa, fosfatasa alcalina y 5' - nucleotidasa. 449 , 450 , 496 , 517 La zona basal de la membrana plasmática presenta un recorrido recto y descansa sobre una membrana basal. Las zonas lateral y apical forman varios pliegues e interdigitaciones con las células del parénquima vecino. El grado de plegamiento de la membrana plasmática aumenta al estimularse la actividad secretora de las glándulas paratiroides y decrece cuando éstas se inhiben. 514 , 516 De forma ocasional aparecen desmosomas en el borde que limita las zonas basal y lateral, y mucho más frecuentemente en la región de tránsito entre las zonas lateral y apical. Existe una importante actividad enzimática en los polos lateral y apical de la membrana plasmática. 517 El polo basal contiene mitocondrias y cisternas de retículo endoplásmico rugoso dispuestas en capas paralelas. En el polo apical se observan mitocondrias, cisternas de retículo endoplásmico rugoso y complejo de Golgi rode ado por vesículas. Los gránulos de secreción se encuentran distribuidos entre el complejo de Golgi y las zonas lateral y apical, a menudo en contacto con la membrana plasmática. Raramente, puede observarse fusión de la membrana del gránulo con la membrana plasmática y huecos de endocitosis. 515 En las células paratiroide a s de animales de edad avanzada se aprecian cuerpos multivesiculares, lisosomas, gránulos de lipofucsinas y vacuolas lipídicas. Por otra parte, la cantidad y tamaño de estas vacuolas de lí pidos puede variar en consonancia con el estado hormonal. 48 Las células paratiroide a s pueden formar quistes y a menudo contienen algunos cilios móviles en el polo apical. 518 Además de las células principales, y distribuidas entre ellas, en las glánd ulas paratiro i des de animales viejos se aprecian células oxífilas y células de aspecto claro. Wild y Setoguti describen la existencia de células oxífilas en glándulas paratiroides de caballos, vacas y perros. II Revisión bibliográfica 16 Estas células, que derivan de las principales y pueden segregar PTH, son mucho menos numerosas que las células principales y aparecen aisladas o formando pequeños grupos. Son más grandes que las células principales y presentan una gran concentración de mitocondrias alargadas, con numerosas crestas. En los espacios que hay entre las mitocondrias se observan abundantes partículas de glucógeno, si bien no forman grandes masas como lo hacen en las células principales. El complejo de Golgi es poco llamativo y el retículo endoplásmico, escaso. Las células de aspecto claro tan sólo se han descrito en hamsters y en conejos. 518 En las glándulas paratiroides de los mamíferos también puede encontrarse, aunque de forma ocasional, otros tipos celulares. Wild y Setoguti describieron células de características similares a las C tiroideas en glándulas paratiroides de caballo, y células similares a las productoras de somatostatina en glándulas paratiroides de conejo. 518 II Revisión bibliográfica 17 Figura 2 : Histología de las glándulas paratiroides . 28 7 IS Espacio int racelular, I interdigitación, M mitocondria, ER retículo e ndoplásmico, G aparato de Golgi, Ly l i sosoma, SeG g ranulos de secreción , PG granulos pre - secreción, StG gránulos de almac é n . II Revisión bibliográfica 18 A.2.3. BIOSINTESIS DE LA P TH En rata, bovino y humano, el gen para la síntesis de la molécula de PTH se presenta en el genoma haploide como una copia única que se localiza en la porción distal del brazo corto del cromosoma 11. El análisis de su estructura demuestra que contiene 2 intrones y un promotor único, a partir del cual la ARN polimerasa fabrica una gran molécula inicial de ácido ribonucleico (ARN). Tras la transcripción, el ARN inicial sufre en el núcleo un procesamiento por el que se eliminan las 2 secuencias no codificantes , quedando un ácido ribonucl eico mensajero (ARNm) que será responsable de la síntesis de la pre - proPTH (Figura 2). 230 , 499 La traducción del ARNm se lleva a cabo asociada a la membrana del retículo endoplásmico. La secuencia "pre" o péptido señal es la primera parte que surg e del ribosoma, quedando por su carácter hidrófobo asociada a la membrana del retículo, lo que confiere a la PTH su carácter exportable. La síntesis de PTH comienza con la pre - proPTH, una proteína de 115 aminoácidos que contiene toda la información estruc tural codificada en el gen para la PTH. A medida que la cadena polipeptídica naciente va pasando a través de la membrana hacia la luz, una peptidasa específica situada en la cara interna de la membrana del retículo endoplásmico escinde, a partir del extrem o N - terminal, 2 aminoácidos y, posteriormente, 23 aminoácidos, dando lugar a la aparición de un precursor intermedio de 90 aminoácidos denominado proPTH. La proPTH se transporta en el interior de vesículas desde el retículo endoplásmico rugoso hasta el co mplejo de Golgi, donde se eliminará la prosecuencia N - terminal constituida por 6 aminoácidos, apareciendo finalmente la molécula de PTH madura de 84 aminoácidos. 221 , 399 A continuación, la PTH se introduce en gránulos de secreción que se dirigen hacia la membrana plasmática, donde se liberarán por exocitosis en respuesta a una disminución en el nivel de Ca 2+ extracelular. La hormona secretada es fundamentalmente la molécula de PTH intacta de 84 aminoácidos, aunque también se segrega una cantidad variab le de fragmentos de PTH C - terminal y, posiblemente también, de fragmentos PTH N - terminal. 180 , 221 , 222 , 259 , 330 II Revisión bibliográfica 19 El proceso que desencadena la liberación de PTH requiere tan sólo unos segundos, mientras que la síntesis de nuevas moléculas de P TH necesita de un tiempo superior a 2 horas. 222 Figura 3 . Organización del gen de la pre - proPTH y proceso de biosíntesis de la PTH. 173 Gen pre - proPTH AAAA ARNm pre - proPTH NUCLEO AAAA Precursor AR Nm pre - proPTH Promotor Exón I INTRON A INTRON B Exón II Exón III Elementos reguladores pre - proPTH proPTH RETÍCULO ENDOPL Á SMICO AAAA proPT COMPLEJO DE GOLGI PTH Gránulo secretor Fragmentos N - t y C - t II Revisión bibliográfica 20 A.2.4. ESTRUCTURA DE LA P TH Los prim eros extractos biológicamente activos de paratiroides se prepararon hace 74 años por Collip. 139 En 1962, Rasmussen y Craig 408 purificaron la hormona, y su estructura primaria completa la determinaron Brewer y Ronan en 1970. 66 En la actualidad, se ha aislado y se conoce la secuencia estructural aminoacídica de la PTH de distintas especies de mamíferos y aves, destacando la información que existe al respecto en hombre, vaca, cerdo, rata y pollo. 399,52 8 En el caso del perro se ha aislado y secuen ciado el cDNA de la PTH y , a partir de esta información, se ha podido p redecir la secuencia de aminoácidos que forman la proteína. 42 4 La secuencia d e aminoácidos de la PTH bovina, porcina y humana se determinó por la técnica automatizada de Edman, mediante un proceso secuencial y progresivo de separación e identificación de los aminoácidos del grupo aminoterminal del polipéptido intacto y de subfragm entos hormonales preparados por digestión proteolítica. 66 , 67 , 260 , 362 , 363 , 440 Con la aparición de técnicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante, se logró analizar la secuencia de nucleótidos de la porción codificadora del gen de la PTH, pudiendo así deducir la secuencia proteica a partir del gen, sin necesidad de tener que aislar la proteína. Este método se ha utilizado para obtener la secuencia de PTH de rata y de pollo. 228 , 264 , 436 La secuencia amino terminal de de las moléculas de PTH humana, canina, porcina, bovina y de rata 260 se muestra en la Figura 4 . La PTH es una proteína monocatenaria de peso molecular 9600 daltons que contiene 84 aminoácidos. Diversos estudios conformacionales han intentado dilucidar la estructura tridimensional de la molécula de PTH, aunque hasta el momento no está perfectamente definida. La molécula de PTH parece ser asimétrica, distinguiéndose , tanto por gel de filtración, como por microscopía electrónica , dos fr agmentos que se encuentran conectados: II Revisión bibliográfica 21 fragmento 1 - 34 o amino - terminal (35 - 52) y fragmento 53 - 84 o carboxi - terminal (C - terminal). Estos dos fragmentos parecen tener estructura helicoidal y encontrarse unidos por un segmento (región intermedia), enrollado a l azar. 137 , 180 , 399 Figura 4 . Secuencia amin o -terminal de la molécula de PTH en distintas especies de mamíferos. 399 PERRO NH2 ----- Ser Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser Met CERDO NH2 ----- Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Leu HOMBRE NH2 ----- Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met RATA NH2 ----- Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ala Ser Val VACA NH2 ----- Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser Ser MetAlaAla II Revisión bibliográfica 22 A .2.5. RELACION ESTRUCTURA - ACTIVIDAD DE L A P TH Existe una gran constancia evolutiva en la estructura del fragmento N - terminal de la molécula de PTH, lo que sugiere que esta región ha de tener una gran importancia biológica. Los primeros estudios sobre las relaciones entre la estruct ura bioquímica y la actividad de la PTH ya definían la región 1 - 34 de la molécula como esencial y suficiente para desarrollar su actividad biológica completa en múltiples sistemas de bioensayo. 397 , 495 Estudios posteriores permitieron discernir que l a región 1 - 27 de la molécula de PTH era la secuencia mínima que conservaba actividad estimulante de adenosina monofosfato cíclica (AMPc). 370 , 42 3 Otros trabajos pusieron de manifiesto la importancia crítica de los aminoácidos 1 y 2 para la bioactivid ad adenilato ciclasa. 261 , 495 Desde hace más de una década se conoce la importancia crucial de los primeros 5 - 7 aminoácidos de la región N - terminal de la molécula de PTH. En bovino, la eliminación del primer aminoácido de la cadena, alanina N - termi nal, durante las fases iniciales de la síntesis de PTH, dando lugar al fragmento 2 -34, resulta en una pérdida del 98% de la actividad biológica. 496 La eliminación adicional de la posición valina 2 se asocia con la pérdida completa de la actividad adeni lato ciclasa medida en membranas renales de perro. 207 , 42 2 , 495 Cualquier sustitución que se intente hacer del primer aminoácido de la molécula de PTH, da como resultado una pérdida casi completa de la actividad hormonal. La única excepción a esta r egla es la PTH humana, al sustituir la serina, primer aminoácido de su molécula, por alanina. 384 Las regiones intermedia y C - terminal también tienen funciones específicas, hecho que se ha puesto de manifiesto en experimentos realizados con condrocitos embrionarios. 268 , 441 Además, diversos estudios apuntan a la existencia de un receptor específico de PTH C - terminal, siendo también esta parte de la molécula esencial en el proceso de síntesis y secreción de la hormona. 30 0 La PTH se une específi camente a un receptor de membrana que es una glicoprote í na de la II Revisión bibliográfica 23 superfamilia de los receptores unidos a prot eí na G. Esta prote í na tiene 593 aminoácidos, y posee un dominio extracelular aminoterminal, una regi ón intermedia intermembrana (con 6 hélices) y u n dominio intracelular formado por su extremo carboxiterminal . 253 La interacción de la PTH con su receptor es bastante compleja e implica la interacción de la región C - terminal de la hormona con el dominio extracelular del receptor, y una débil uni ón entre la región N - terminal y la porción intermembran a del receptor, la cu a l induce la tradución de la señal al interior de la c élula. 198 La señalización de este receptor a la célula se hace a través de , al menos , dos sistemas de segundos mensajeros: vía adenil ato ciclasa ( AC ) y vía fosfolipasa C ( PLC ) . Este receptor de la PTH puede ser activado con similar potencia por un péptido análogo , la PTHrP , debido a la gran homología que existe entre la región N - terminal de amb a s moléculas . 253 II Revisión bibliográfica 24 A.2.6. M ETABOLISMO DE LA P TH A partir de los estudios de Berson et al . 47 se constató que la PTH sérica era inmunoquímicamente diferente de la extraída de las glándulas paratiroides. Esta heterogeneidad de la hormona endógena circulante se debe a que la PTH, después de su biosíntesis, sufre procesos metabólicos proteolíticos que tienen lugar dentro y fuera de las glándulas paratiroides. 138 , 398 El significado biológico de este metabolismo proteolítico es de gran interés, puesto que no está cl aro si su función es destruir la hormona o generar fragmentos biológicamente activos. 20 Inicialmente, se pensaba que sólo la PTH intacta era secretada por las glándulas paratiroides y que todos los restantes fragmentos hormonales encontrados en suero era n producto del metabolismo periférico. 328 , 445 Silverman y Yalow 462 pusieron de manifiesto que la hormona extraída directamente de la glándula muestra múltiples picos inmunorreactivos en gel de filtración, los cuales son similares a los picos det ectados en plasma. Estos autores también indican que todos los fragmentos C - terminales biológicamente inactivos del plasma de pacientes urémicos deberían ser considerados productos de secreción glandular en base al prolongado tiempo de vida media de los mi smos, siendo más de 100 veces superior al tiempo de vida media de la PTH en este tipo de pacientes. A partir de estos datos, concluyen que la secreción glandular y no el metabolismo periférico da lugar a todas las formas inmunorreactivas de la hormona pre sente en la circulación periférica. 462 Estudios posteriores han demostrado que las glándulas paratiroides segregan fragmentos C - terminal de PTH y posiblemente también fragmentos N - terminal, junto a PTH intacta. 183 , 330 La existencia de proteolis is periférica de PTH se ha demostrado en experimentos en los que se inyecta PTH intacta a perros y terneros, monitorizando seguidamente la desaparición plasmática de la hormona administrada y comprobando la aparición de fragmentos que i n muno - y fisico - quí micamente son idénticos a los fragmentos hormonales producidos endógenamente. Actualmente, se puede asegurar que la molécula de PTH intacta sufre II Revisión bibliográfica 25 proteolisis intraglandular y periférica, aunque todavía no se conoce el lugar donde predomina este proceso. 21 9 , 398 , 446 , 463 Numerosos estudios han demostrado que el hígado y el riñón están implicados en el metabolismo de la PTH. 1 19 , 319 , 448 El hígado capta PTH intacta y genera fragmentos C - terminales similares a los que se presentan en la ci rculación. 1 19 , 360 Además, el metabolismo hepático de PTH produce uno o más fragmentos N - terminales biológicamente activos. 120 Segre et al . 447 han confirmado la existencia de metabolismo de PTH en el hígado utilizando ratas hepatectomizadas. Es tos autores han observado que tras la hepatectomía no se detectan fragmentos C - terminales con residuos N - terminales en posiciones 34 y 37. Este estudio establece claramente que el hígado es el principal órgano periférico implicado en la generación de fragm entos C - terminales. 447 Segre et al. 448 también han demostrado in vitro que las células de Kupffer y los macrófagos intrasinusoidales poseen enzimas específicas implicadas en el metabolismo de la PTH. Los fragmentos de PTH producidos por las células de Kupffer son inmunorreactiva y químicamente idénticos a los que aparecen en el plasma tras la inyección de hormona intacta. El ataque proteolítico inicial que sufre la molécula de PTH intacta corre a cargo de una endopeptidasa que da lugar a fragmentos N - terminales y C - terminales. Inicialmente, la cantidad de fragmentos N - terminales y C - terminales formados es equivalente, pero los fragmentos N - terminales desaparecen rápidamente del medio. 203 Estos resultados son similares a los hallazgos obtenidos in viv o, donde se aprecian altas concentraciones plasmáticas de fragmentos C -terminales y bajas concentraciones de fragmentos N - terminales. El índice de desaparición de PTH intacta en suspensiones de células de Kupffer es similar al índice de desaparición encont rado en estudios in vivo , con un tiempo de vida media que se sitúa alrededor de los 10 minutos . 448 El metabolismo intraglandular de PTH se ha estudiado en células paratiroide a s de cerdo incubadas in vitro . En estos experimentos, además de PTH intacta, se aislaron del medio dos fragmentos C - terminales: PTH (37 - 84) y PTH (34 -84), los cuales eran idénticos a los fragmentos aislados in vivo procedentes del metabolismo hepático de la PTH. 342 , 447 Se ha II Revisión bibliográfica 26 comp robado que la enzima catepsina B purificada a partir de glándulas paratiroides de cerdo es capaz de cortar la PTH y la Pro - PTH entre los residuos 36 y 37, produciendo un gran fragmento C - terminal y fragmentos N -terminales de menor tamaño, que se degradan p osteriormente mediante la eliminación de pequeños péptidos de su extremo carbox ílico . 333 La catepsina hepática purificada actúa sobre la PTH del mismo modo que la enzima procedente de glándulas paratiroides. 333 La catepsina B (EC 3.4.22.1.) es la responsable del metabolismo glandular que origina el fragmento PTH (37 - 84), aunque todavía no está claro si es capaz de generar el fragmento (34 - 84). 333 El riñón parece ser el órgano responsable del aclaramiento de los fragmentos C - terminales. 322 , 44 7 Aparentemente, la captación renal de fragmentos de PTH C - terminal depende de la filtración glomerular, mientras que en la reabsorción y degradación estarían implicadas las células tubulares. 320 La PTH intacta se elimina por filtración glomerular y captación peritubular. El riñón, además de eliminar de la circulación PTH intacta y sus fragmentos, también es capaz de actuar como fuente generadora de tales fragmentos. Martin et al . 322 y Hruska et al . 240 demostraron in vitro que el riñón degrad aba la molécula de PTH con la consiguiente producción de fragmentos C - terminales y N - terminales, similares a los obtenidos in vivo en animales de experimentación y en seres humanos. No obstante, el riñón parece tener menor efecto cuantitativo que el hígado en el metabolismo de PTH intacta y en la eliminación de fragmentos de PTH . 447 La cuestión más importante en el metabolismo de la PTH es conocer si éste da lugar a fragmentos biológicamente activos que sean necesarios para el funcionamien to del organismo. Martin et al . han estudiado in vitro el efecto de la PTH intacta y del fragmento N - terminal (1 - 34) bovinos sobre el hueso, observando que tanto el ritmo de captación por parte del hueso como la producción de AMPc son mayores en el caso de l fragmento N - terminal. 321 , 322 Estos autores concluyen que la captación de PTH en hueso difiere de la de riñón e hígado, sugiriendo también que el metabolismo periférico de PTH intacta puede jugar un papel importante en la regulación del efecto de la PTH sobre el tejido óseo. 321 ,322 Por otra parte, la II Revisión bibliográfica 27 PTH intacta es capaz de activar la adenilato ciclasa en tejido esquelético in vitro sin previa escisión. 208 Además, las células óseas y el tejido esquelético pueden metabolizar PTH bovina (1 - 84) , contribuyendo así a la inmunoheterogeneidad de la PTH circulante. 189 En conclusión, aún se necesitan más estudios para determinar de forma clara si la PTH debe metabolizarse para poder ejercer alguna de sus acciones biológicas so bre el hueso. 20 El metabolismo proteolítico de PTH en las glándulas paratiroides y en órganos periféricos (hígado, riñón y hueso) da lugar a la formación de fragmentos N - terminales, que aparecerán durante un corto periodo de tiempo en la circulación, y a fragmentos C - terminales, que por el contrario poseen un mayor tiempo de vida media. Roos et al . 419 sugieren que el metabolismo de la PTH es aún más complejo, basándose en la existencia de un pequeño fragmento de la región intermedia. Este fragmento ti ene un tamaño y unas características inmunoquímicas similares tanto cuando se aísla de la glándula como de la circulación periférica. 325 , 419 II Revisión bibliográfica 28 A.3. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA Los principales reguladores de la función paratiroidea son el Ca 2+ , el CTR y el P , aunque existen otros elementos que también participan en dicha regulación, como el Mg 2+ , las catecolaminas y la histamina. 54 A.3.1. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA POR CALCIO MECANISMO DE ACCION DEL CALCI O La capacidad de las células paratiroide as para detectar pequeñas variaciones en la concentración de Ca 2+ extracelular es esencial para el mantenimiento de la homeostasis del Ca 2+ . No obstante, los mecanismos a través de los cuales estas células reconoce n y responden a los cambios en la concentración de Ca 2+ no están totalmente elucidados. La clonación del receptor de Ca 2+ ( CaR) en paratiroides bovinas, realizada por Brown et al . 84 en 1993, confirma la hipótesis de que las células paratiroide s expresan en la superficie celular un sensor capaz de detectar y responder a pequeños cambios en la concentración del Ca 2+ extracelular. Este receptor reconoce también otros cationes divalentes (Mg 2+ , Ba 2+ ), cationes trivalentes (Gd 3+ ) e incluso policatio nes (neomicina). 85 El ARNm del PCaR bovino, de un tamaño de 5,3 Kb, codifica una proteína de 1085 Aa (121 Kd) que tiene tres dominios estructurales. 84 , 86 El primero es un gran dominio N - terminal, con 613 Aa, predominantemente hidrofílico, de loca lización extracelular, glicosilable y con una estructura terciaria que forma dos lóbulos en los que queda englobado el Ca 2+ . El segundo es un dominio central e hidrofóbico, constituido por 7 segmentos transmembrana y perteneciente a la superfamilia de rece ptores acoplados a proteínas G. Por último, el receptor presenta un tercer dominio hifrofílico de localización citoplasmática, constituido por 222 Aa, (Figura 5 ). 84,86 II Revisión bibliográfica 29 T ambién se ha clonado el ADNc del CaR humano que codifica una p roteína de 1078 Aa, altamente glicosilada y que presenta 7 dominios transmembrana. 203 Figura 5 . Modelo estructural propuesto para el CaR de la célula paratiroide a . 84 II Revisión bibliográfica 30 PCaR Gi AC PCaR PLA 2 Ac Fosfatídico fosfatidilcolina PIP 2 } HPETEs HETEs 12 - LO Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ ATP AMPc PTH Vesícula de secreción ? ? ? Gs PLC PIP2 IP3 DAG REIP4 Cai PKC + AA La reg ulación de la función paratiroidea mediada por Ca 2+ comienza a nivel de la membrana celular, donde tiene lugar la unión de Ca 2+ y CaR. A continuación, esta información se traduce en el interior de la célula en una o varias señales que finalmente regu larán el proceso de secreción y, probablemente, el de síntesis de PTH. Se ha propuesto la existencia de varios mecanismos de transducción intracelular, los más importantes de los cuales son: el sistema Adenilato Ciclasa -AMPc, el sistema de la Fosfolipasa C (PLC) y el sistema de la Fosfolipasa A 2 (PLA 2 ) (Figura 5). 81 , 85 Figura 6 . Representación esquemática de los mecanismos de transducción intracelular propuestos para la acción del Ca 2+ sobre la célula paratiroide a . 85 II Revisión bibliográfica 31 Sistema de la Adenilato Ciclasa - AMPc En 1989, Chen et al . 128 demostraron que cuando disminuye la concentración de Ca 2+ extracelular se produce una acumulación citosólica de AMPc y se estimula la secreción de PTH. El C a R está acoplado a una aden ilato ciclasa (AC) mediante una prote í na G inhibidora (Gi) , de man era que niveles elevados de Ca 2 + inactivan, v í a prote í na G i, a la AC , disminuyendo la concentración de AMPc citosólico e inhibiéndose, consecuentemente , la secreción de PTH. En trabajos real izados por otros autores, se ha observado que la elevación de los niveles de AMPc, mediante la adición de inhibidores de la fosfodiesterasa o por adición directa de análogos del AMPc, estimula la secreción de PTH. 75 Por otra parte, Shoback et al . 456 y Brown et al . 82 han comprobado que el incremento en los niveles de AMPc intracelular no está relacionado con cambios en la concentración de Ca 2+ intracelular ni con variaciones en los niveles de inositol fosfato, lo que indica que el AMPc regula directa mente la secreción de PTH, independientemente de otras rutas paralelas de segundos mensajeros. Sistema de la Fosfol ipasa C En este sistema, al contrario de lo que ocurría en el sistema Adenilato Ciclasa - AMPc, el CaR situado en la membrana plasmática está acoplado a una proteína G estimuladora ( Gs). La p roteína Gs se encarga de activar una fosfolipasa C ( PLC ) que catalizará la hidrólisis de fosfatidil - inositol 4,5 bifosfato (PIP 2 ), produciéndose diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP 3 ), siendo este último producto el responsable de la liberación del Ca 2+ almacenado en los reservorios int racelulares lo que hace aumentar el nivel de Ca 2+ citosólico . En la secreción de PTH influyen tanto el calcio citosólico como la proteína quinasa C (PKC) y diversos productos derivados del metabolismo de los fosfoinositoles. 81 , 85 II Revisión bibliográfica 32 A) Calcio citosóli co y liberación de PTH Los niveles de Ca 2+ extra - e intracelular están estrechamente relacionados. Como dato indicativo, podemos decir que un cambio de 1 mM en la concentración de Ca 2+ extracelular se acompaña de una variación paralela de, apro ximadamente, 100 - 200 nM en la concentración de Ca 2+ intracelular. Además, existe correspondencia entre las variaciones en la secreción de PTH, mediadas por la acción del Ca 2+ extracelular, y los cambios en la concentración de Ca 2+ intracelular. También se sabe que el aumento de los niveles de Ca 2+ citosólico requiere de la participación de dos mecanismos: a) el primero es la entrada de iones Ca 2+ desde el espacio extracelular, a través de la membrana plasmática, mediante canales selectivos para el Ca 2+ , 395 b) el segundo conlleva la liberación de las reservas intracelulares de Ca 2+ en respuesta a segundos mensajeros: el aumento en la concentración de Ca 2+ extracelular actuará incrementando los niveles de IP 3 intracelu lar, el cual intervendrá en la liberación de las reservas intracelulares de Ca 2+ . 45 La relación entre Ca 2+ intracelular y secreción de PTH se considera en cierto modo paradójica, ya que en la mayoría de las células con capacidad secretora los procesos de secreción van precedidos de aumentos en la concentración de Ca 2+ citosólico. En las paratiroide a s, en cambio, la secreción de PTH se acompaña de una disminución del Ca 2+ intracelular. 85 No se conoce con exactitud el mecanismo por el que el aumento en la concentración de Ca 2+ intracelular inhibe la secreción de PTH. Se sabe que los cambios en la concentración de Ca 2+ intracelular pueden ser marcadores de otras vías intracelulares , como la de la de la fosfolipasa A 2 ( PLA 2 ) y el ácido araquid ónioco ( AA ) , 12 aunque también es posible que la concentración de Ca 2+ intracelular per se contribuya directamente a la regulación de la secreción hormonal . 85 II Revisión bibliográfica 33 B) Metabolismo de los fosfoinositoles, la proteína quinasa C y liberación de PTH Como se ha descrito anteriormente, niveles elevados de Ca 2+ extracelular estimulan la hidrólisis de PIP 2 , por la actuación de una PLC, generándose dos mensajeros intracelulares: el DAG, que parece servir como un mediador intracelular inhibiendo la actividad PKC; y el IP 3 , que actúa liberan do Ca 2+ de las reservas intracelulares. 45 , 262 En la mayoría de las células, las sustancias hormonales que producen un incremento en el metabolismo de los fosfoinositoles activan la PKC, a través del aumento asociado en los niveles de DAG y en la conc entración de Ca 2+ intracelular. 44 , 368 Sin embargo, en las células paratiroide a s, el aumento en los niveles de DAG está asociado , a través de la formación de esfingosina , con la inhibición de la actividad PKC y, por tanto, de la secreción de PTH. 335 En t rabajos realizados con células paratiroideas en cultivo, se ha comprobado que la PKC presenta una actividad máxima a bajas concentraciones de Ca 2+ y una actividad mínima con niveles altos de Ca 2+ . 267 ,343 La activación de la PKC se acompaña de un aumento en los niveles de ARNm de PTH citoplasmático y de una estimulación de la secreción de PTH . 129 Se ha comprobado que se puede estimular la actividad PKC con la utilización de ésteres de forbol. 78 , 343 Se sabe tambi én que estas sustancias pueden disminu ir los niveles de Ca 2+ intracelular bloquea ndo los canales de Ca 2+ o inhibiendo directamente la entrada de calcio . 196 , 284 , 359, 457 Al mismo tiempo, los esteres de forbol pueden reducir la producción de IP 3 , 503 aumenta do su hidrólisis por estimulación de las IP 3 fosfatasas, 368 o desensibiliza ndo los recepto res unidos a PLC. 231 , 503 Sistema de la Fosfolipasa A 2 Existen evidencias de que la PLA 2 , el ácido araquidónico (AA) y/o los productos resultantes de su metabolismo juegan un papel clave en la inhibición de la secreción de PTH mediada por II Revisión bibliográfica 3 4 el Ca 2+ extracelular. Bourdeau et al . encontraron que la incubación de células paratiroideas porcinas en medios con altas concentraciones de Ca 2+ (2.0 mM) inducía la liberación de AA y producía una inhibición de la secreción de PTH. 59 D ado que la PLA 2 libera AA a partir de la posición 2 - acil de los fosfolípidos, 126 , 28 6 la activa ción de esta enzima por altas concentraciones de Ca 2+ podría ser la causa directa de la liberación de AA y, por tanto, de la inhibición de PTH inducida por Ca 2+ . Esta hipótesis se apoya en el hecho de que dos inhibidores de la PLA 2 : la indometacina y la mepacrina, restauran la sec reción de PTH en las células paratiroides incubadas en medios de cultivo con alta concentración de Ca 2+ . El AA puede seguir tres rutas metabólicas: a) la vía de la ciclooxigenasa, que da lugar a la formación de prostaglandinas; b) la vía de la lipooxigenasa, a través de la cual se forman leucotrienos y otros metabolitos activos ; y, c) la vía del citocromo P450. En experiencias realizadas para conocer la implicación de estas rutas en los mecanismos de señalización intracelular, se observó que la vía de la ciclooxi genasa no está implicada en el control de la secreción de PTH mediada por altos niveles de Ca 2+ extr acelular. 199 En cambio, al estudiar la ruta de la lipoxigenasa (LO) se comprobó que puede jugar un papel importante en la regulación de la secreción de PTH. 59 En la ruta de la LO, el AA se convierte en varios á cidos hidroxiperoxieicosatetranoicos (HPETEs), y en sus correspondientes formas reducidas, los ácidos hidroxieicosatetranoicos (HETEs), que son potentes inhibidores de la secreción de PTH. 60 Ya que los niveles altos de Ca 2+ intracelular inhiben la secreción de PTH, los HETEs podrían estar íntimamente relacionados con el metabolismo del Ca 2+ en las células pa ratiroideas. 358 En un estudio reciente se observ ó q ue, en glándulas paratiroides de rata incubadas con sustancias que provocan un incremento en la concentración de calcio intracelular ( ionóforo o thapsigargina ), existe un aumento en la producción de AA junto con una inhibición de la II Revisión bibliográfica 35 secreci ón de PTH . 13 Est os datos sugieren que la PLA 2 es activada por la elevaci ón del calcio intracelular. Por otro lado , en un reciente trabajo de Kifor et al. 263 con cultivos de c élulas paratiroides bovinas , se sugiere que el CaR media la activaci ón de la PLA 2 a través de una cascada de prote í nas k inasas activadas por mitógenos (MAP kinasas), cuya activaci ón parece mediada por acción de la PLC. A partir de toda esta información, se puede concluir que no existe un único mecanismo de señalización intr acelular para la regulación de la función paratiroidea medi a da por Ca 2+ , sino más bien un conjunto de rutas complementarias relacionadas entre sí, sin que todavía esté muy clara la importancia relativa de cada una de ellas. REGULACION DE LA SECRECION DE P TH POR CALCIO La concentración de Ca 2+ presente en el fluido extracelular es el principal regulador de la secreción de PTH. La relación PTH - Ca 2+ se puso de manifiesto por primera vez en experimentos con perros , al comprobar que la eferencia obtenida de las glándulas paratiroides perfundidas con sangre descalcificada era capaz de producir un aumento del Ca 2+ sérico. 39 0 Posteriormente, en trabajos realizados con vacas, se confirmó la validez de los experimentos anteriores mediante la cuantificación de la concentración plasmática de PTH durante la inducción de hipocalcemia. 407 , 453 La secreción de PTH es inversamente proporcional a la concentración de Ca 2+ extracelular. 81 Aumentos en la concentración de Ca 2+ extracelular (en una escala de mM) se acompañan de un incremento en los niveles de Ca 2+ intracelular (en una escala de nM), y de una inhibición de la secreción de PTH. 395 Por esta razón, se ha co nsiderado el fenómeno secretor de las glándulas paratiroides como paradójico, ya que , genera l mente, en la mayor ía de las células con función secretora, la secreción va precedida por un aumento del calcio citos ólico. La respuesta de las glándulas paratiroides a los descensos en los niveles de Ca 2+ ocurre rápidamente, en cuestión de segundos, tanto in vivo 56 , 329 como in vitro . 80 , 50 4 II Revisión bibliográfica 36 Las concentraciones plasmáticas de PTH y de Ca 2+ muestran una relación sigmoidal inversa (Figura 7 ). Esta curva, observada tanto in vivo como in vitro , se puede describir en función de 4 parámetros: PTH máx ima, PTH mínima, "set - point" y pendiente de la curva. 77 , 83 , 173 El descenso en la concentración de Ca 2+ extracelular produce una estimulación de la secreción de PTH hasta unos niveles elevados y estables. La máxima secreción de PTH (PTH máxima) se alcanza cuando la calcemia basal disminuye aproximadamente un 25%. 392 En los individuos normales, la PTH basal es aproximadamente un 25% de la PTH máxima. 65 Por otra parte, si aumenta la calcemia disminuye la secreción de PTH, alcanzándose la secreci ón mínima de PTH (PTH mínima) cuando la calcemia basal se incrementa un 25% aproximadamente, aunque nunca existe supresión total de la secreción glandular. 135 El “set point” se ha definido como la concentración de Ca 2+ que produce una reducción del 50% de la PTH máxima, o, dicho de otra forma, el nivel de Ca 2+ al que la concentración de PTH es la mitad de la máxima. 173 Finalmente, la pendiente de la curva se define por algunos autores como el cociente entre la diferencia PTH máxima (PTH máx ) menos PTH mínima (PTH mín ), y la diferencia Ca 2+ máximo (Ca 2+ máx ) menos Ca 2+ mínimo (Ca 2+ mín ): [(PTH máx - PTH mín )/( Ca 2+ máx - Ca 2+ mín )]. La pendiente o "slope" mide el promedio de secreción de PTH por célula funcional e indica la sensibilidad de la célula paratiroidea, definida como los cambios producidos en la secreción de PTH para un determinado cambio de Ca 2+ . 173 Otros autores realizan los cálculos de los parámetros que definen la curva PTH - Ca 2+ mediante la fórmula propuesta por Brown en el llamado "modelo de los cu atro parámetros": 77 y={[A - D]/[1+(x/C) B ]}+D Donde: A es la secreción máxima; D, la secreción mínima; C, el “set - point” ; y B, la pendiente a nivel del “set point” (Figura 7 ). II Revisión bibliográfica 37 Figura 7 . Relación sigmoidal ent re las concentraciones plasmáticas de PTH y Ca 2+ . Esta relación inversa está basada en la expresión Y=[(A - D)/(1+(X/C) B ]+D . 77 II Revisión bibliográfica 38 En la relación PTH - Ca 2+ existen otros elementos que introducen mayor complejidad, como por ejemplo el fenómeno de histéres is. Este consiste en que para un mismo nivel de Ca 2+ extracelular, la concentración de PTH es mayor cuando se está induciendo hipocalcemia que cuando la calcemia está recuperando niveles basales. Dicho fenómeno también se observa en el tramo hipercalcémico de la curva PTH - Ca 2+ , de manera que para una misma concentración de Ca 2+ , los niveles de PTH son más bajos durante la fase de inducción de hipercalcemia que durante el periodo de recuperación. 172 La explicación de la histéresi s en la curva PTH - Ca 2+ no está completamente aclarada. Según algunos autores, podría estar relacionada con la velocidad con la que se producen los cambios en la concentración de Ca 2+ . 216 Otra posible explicación se basa en el agotamiento de las glándulas paratiroideas tras la inducción de hipocalcemia. 172 Recientemente, se ha demostrado que ni la velocidad de inducción de hipocalcemia ni el agotamiento glandular influyen en el fenómeno de histéresis, y que posiblemente la finalidad de éste sea evitar so brecorrecciones de la calcemia durante las fases de recuperación, desde hipo - e hipercalcemia, hacia la situación basal de normocalcemia . 3 REGULACION DE LA SINTESIS DE PTH POR CALCIO Habener et al . , 223 determinando la cantidad de hormona almacenada y su tasa de secreción, estimaron que las glándulas paratiroides pueden secretar PTH a ritmo máximo durante hora y media. Esto hace pensar que existe un acoplamiento entre los procesos de síntesis y de secreción hormonales. Los primeros datos indicativos de que la síntesis de PTH está regulada por el Ca 2+ sérico se obtuvieron tras la realización de cortes histológicos sobre preparaciones tisulares expuestas a niveles bajos de Ca 2+ , tanto en modelos experimentales in vitro 42 8 como in vivo . 42 9 Las cél ulas paratiroideas mostraron evidencia de un aumento de la síntesis proteica, basada en la aparición de cambios característicos del retículo endoplásmico rugoso y en la agregación de ribosomas, en respuesta a la hipocalcemia. 42 8 , 429 En estudios in vitro de células paratiroideas bovinas realizados por Russell et al ., 434 se comprobó que los aumentos en la concentración de Ca 2+ extracelular producían una caída II Revisión bibliográfica 39 reversible en el ARNm de PTH, si bien no se observaron diferencias entre los niveles de A RNm detectados en células expuestas a Ca 2+ normal o bajo. Además, estos mismos autores observaron que a las 6 horas de cultivo se producía un descenso en la tasa de transcripción del gen de la PTH de células paratiroideas bovinas dispersadas. 435 En est a misma línea, MacGregor et al ., 334 estudiando la incorporación de [ 3 H] - leucina, demostraron que las variaciones en la concentración de Ca 2+ extracelular inducían modificaciones en la síntesis de pre - proPTH, probablemente como consecuencia de cambios previ os en los niveles de ARNm de PTH. En estudios in vivo realizados en ratas, se ha demostrado que los incrementos en la concentración de Ca 2+ sérico originan pequeños descensos en el ARNm de PTH, mientras que la hipocalcemia incrementa hasta casi el dob le el nivel de ARNm. 35 3 ,35 4 , 52 3 Esto indica que las glándulas paratiroides están aparentemente mejor preparadas para responder aumentando la síntesis de ARNm de PTH, en respuesta a situaciones de hipocalcemia, que disminuyéndola, en respuesta a p rocesos de hipercalcemia. Al parecer, la hipercalcemia puede regular la secreción de PTH y el catabolismo de la hormona, pero no la transcripción del gen. 35 5 Aunque los resultados de los experimentos in vivo e in vitro presentan cierta similitud, exist en claras diferencias en las características de la respuesta en ambos sistemas. En primer lugar, en los sistemas in vitro la mayoría de los cambios en los niveles de PTH tienen lugar cuando la concentración de Ca 2+ aumenta por encima de los niveles normale s, mientras que en los modelos in vivo , los cambios más relevantes se observan en hipocalcemia. En segundo lugar, la velocidad de respuesta observada en modelos experimentales in vivo es mucho más rápida que la observada en las experiencias realizadas in v itro . Estas diferencias podrían ser debidas a una respuesta alterada al Ca 2+ por parte de las células paratiroideas cuando se dispersan y se mantienen en cultivo. 365 II Revisión bibliográfica 40 Actualmente se sabe poco acerca del mecanismo de regulación transcripcional del gen de la PTH mediado por Ca 2+ , no conociéndose con exactitud si la transducción de la señal extracelular de Ca 2+ hacia el núcleo celular requiere la participación del receptor de Ca 2+ . Okazaki et al . 373 han sugerido la existencia de "elementos de respuesta al Ca 2+ ". Estos autores proponen la existencia de una secuencia de ADN de 3,5 Kb situada por encima del promotor del gen de la pre - proPTH humana, conocida con el nombre de nCaRE ("negative calcium - responsive element"). Este elemento de respuesta consiste en una secuencia palindrómica de 15 pares de bases precedida por una secuencia rica en timidina. En la actualidad no se conocen los detalles de este mecanismo de regulación, aunque se ha identificado una proteína nuclear denominada REF1 que actúa como regu ladora del ARNm de PTH a nivel postranscripcional , teniendo a su vez capacidad para unirse al nCaRE y participar en la represión transcripcional de la PTH mediada por Ca 2+ (Figura 8 ). 374 II Revisión bibliográfica 41 Figura 8 . Mecanismo transcripcional propuesto para el Ca 2+ en el gen de la PTH. 374 PCaR Gs Ca 2+ ref 1 nCaRE ? ? preproPTH PCaR receptor/ sensor de calcio extracelular maquinaria de transcripción nCaRE elemento de respuesta al calcio Gs proteína G activadora Gs nCaRE ? ? preproPTH PCaR receptor/ sensor de calcio extracelular maquinaria de transcripción nCaRE elemento de respuesta al calcio proteína G activadora II Revisión bibliográfica 42 REGULACION DE LA PROLIFERACION DE CELULAS PARATIROIDE A S POR CALCIO Existen trabajos in vivo que sugieren que la hipocalcemia prolongada puede provocar hipe rplasia en las glándulas paratiroides. En estos estudios es complicado separar los efectos de la hipocalcemia de los del CTR, dado que el descenso de Ca 2+ aumenta la producción de CTR . Naveh - Many y Silver encontraron que, en ratas alimentadas durante 3 semanas con una dieta deficitaria en calcio y vitamina D, el número de células paratiroideas se incrementó 1.7 veces. 35 4 Algunos estudios in vitro han puesto de manifiesto el efe cto del Ca 2+ sobre la proliferación celular, demostrando un incremento en la incorporación de [ 3 H] - timidina en glándulas paratiroides de rata mantenidas en cultivo con baja concentración de Ca 2+ durante un intervalo de 24 - 48 horas. 83 En este mismo senti do, Kremer et al . 280 estudiaron in vitro la incorporación de [ 3 H] - timidina y la expresión de los oncogenes c - myc y c - fos, implicados en los procesos de división celular, encontrando que el CTR y no el Ca 2+ es el principal regulador de proliferación. Exp eriencias realizadas recientemente por el grupo de T. Drüeke, confirman este hecho. 143 Resumiendo, el CTR parece ser el factor clave en la regulación de la proliferación celular, aunque el Ca 2+ y más concretamente la hipocalcemia, también se relaciona con procesos de hipertrofia e hiperplasia celular . 35 6 , 514, 461 II Revisión bibliográfica 43 A.3.2. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA POR CALCITRIOL MECANISMO DE ACCION DEL CALCITRIOL El CTR actúa sobre la función secretora de las glándulas paratiroides a través de mecanismos directos e indirectos. De forma directa, el CTR influye sobre las células paratiroid eas ejerciendo un efecto “feed - back” negativo sobre la síntesis de PTH. Por otra parte, el CTR aumenta la concentraci ó n plasmática de Ca 2+ , lo que inhibe la síntesis y secreción de PTH. 85 , 326 , 35 4 , 406 A pesar de que se han realizado numerosos trabajos para dilucidar el mecanismo mediante el cual el CTR actúa en las células paratiroide as , aún quedan muchos puntos por esclarecer. El CTR actúa a nivel transcripcional y ejerce sus efectos a través de un receptor específico de localización nuclear, el VDR ("vitamin D receptor"), que molecularmente se define como un factor de transcripción dependiente de ligando. El mecanismo de acción del CTR es parecido al de las hormonas esteroideas, tiroideas y la vitamina A, por lo que a todos estos receptores se les engloba dentro de la superfamilia de receptores de hormonas esteroideas - tiroideas. 167 Debido a su naturaleza química, el CTR atraviesa sin dificultad las membranas plasmática y nuclear de sus células diana para unirse al VDR y producir así su activación. El receptor, una vez activado, reconoce específicamente una secuencia del ADN situada cerca del promotor del gen, denominada elemento de respuesta a la vitamina D o VDRE ("vitamin D responsive element"). La ocupación del VDRE por parte del VDR activado interfiere con la maquinaria de transcripción . (Figura 9 ). Existen numerosos genes en los que se ha encontrado al menos un VDRE, si bien el efecto producido varía en cada uno de ellos. El CTR regula positivamente la expresión de los genes de la calbindina, la osteocalcina, la osteop ontina, la 24 - hidroxilasa renal, la fosfatasa alcalina II Revisión bibliográfica 44 ósea, etc.; e inhibe la expresión de la colagenasa, de la 1 - α- hidroxilasa y de la PTH. La razón de esta disparidad de acciones se debe a que todos estos genes no tienen ni el mismo número ni las mismas secuencias de VDREs, y a que estas secuencias tampoco ocupan la misma posición en el gen. 224 Figura 9 . Mecanismo transcripcional propuesto para el CTR en el gen de la PTH. VDRE preproPTH 1,25 (OH) 2 D 3 Receptor de 1,25 (OH) 2 D 3 Maquinaria de transcripción VDRE Elemento de respuesta al 1,25 (OH) 2 D 3 VDRE preproPTH 1,25 (OH) D Receptor de 1,25 (OH) 2 3 Maquinaria de transcripción VDRE Elemento de respuesta al 1,25 (OH) 2 3 II Revisión bibliográfica 45 Los receptores de CTR de las células paratiroideas es tán identificados y caracterizados, estando clonado y secuenciado el ADNc del VDR en varias especies animales. 29 , 88 , 39 1 A demás, con técnicas de ADN recombinante se ha conseguido producir y purificar la proteína, 367 , 42 5 lo que ha facilitado el estudio de su estructura y de la interacción que ésta mantiene con el ADN. 86 ,332 REGULACION DE LA SINTESIS Y SECRECION DE PTH POR CALCITRIOL La regulación de la expresión génica de PTH por CTR, la estudiaron por pr imera vez Silver et al . 459 Estos autores demostraron que los niveles de ARNm de PTH de células paratiroideas bovinas mantenidas en cultivo con niveles fisiológicos de CTR disminuyen a lo largo del tiempo . Este efecto se acentúa en presencia de concentraciones crecientes de CTR (entre 10 pM y 0.1 µM) en forma dosis - dependiente. El efecto del CTR sobre la transcripción del gen de la PTH también se ha constatado en diversos estudios realizados in vivo . Así, se ha comprobado que la inyección intraperitoneal de CTR en ratas produce una rápida y drástica caída de la transcripción del gen de la PTH, incluso utilizando dosis de CTR suficientemente bajas como para no modificar los niveles plasmáticos de Ca 2+ . 460 En otras experiencias realizadas con ratas a las que se les administró durante 3 semanas una dieta deficiente en vitamina D, los niveles de ARNm de PTH alcanzaron valores dos veces superiores a los que presentaban los animales d el grupo control. Este aumento en el ARNm de PTH se produjo sin la aparición de cambios paralelos en la concentración de Ca 2+ sérico y se pudo revertir posteriormente con la administración de inyecciones diarias de CTR. 35 4 Las acciones del Ca 2+ y del CTR están estrechamente interrelacionadas, siendo difícil separar sus efectos o establecer la predominancia de uno de ellos. El resultado neto que se observa al variar la concentración de cada uno de forma independiente dependerá de la cronicidad de la ma nipulación que se haya efectuado y de la magnitud del cambio producido en cada variable. 35 5 II Revisión bibliográfica 46 L os niveles de Ca 2+ y CTR rara vez varían independientemente. En trabajos realizados con ratas, se puso de manifiesto que, cuando se provoca hi pocalcemia aguda, el efecto inhibidor d el CTR sobre las glándulas paratiroides predomina sobre la estimulación que supone la hipocalcemia, observándose una caída en los niveles de ARNm de PTH como consecuencia de la acción del CTR. 35 3 Sin embargo, en experimentos realizados durante un periodo de tiempo prolongado los resultados fueron diferentes. De este modo, en un grupo de ratas alimentadas durante 3 semanas con una dieta de bajo contenido en calcio y cantidad normal de vitami na D, se encontró un descenso en los niveles de Ca 2+ sérico y un aumento en los niveles de CTR, resultando que los niveles de ARNm de PTH fueron 5 veces superiores a los encontrados en el grupo de ratas control . 35 5 Esto demuestra que la estimulación de la transcripción inducida por la hipocalcemia no se puede suprimir completamente por el CTR. Esta puede ser una de las razones por las cuales, en los enfermos con avanzado hiper paratiroidismo renal secundario, el tratamiento con CTR no suprime completamente la producción de PTH si existe una hipocalcemia persistente. 35 5 También se ha estudiado la acción del CTR sobre la secreción de PTH, observándose una inhibición de la secreción de PTH sólo tras la administración de tratamientos prolongados con CTR. Esto sugiere que los efectos del CTR sobre la secreción d e PTH son debidos a la supresión de la síntesis de ARNm de PTH más que a una acción sobre el proceso de secreción en sí. 73 , 1 20 REGULACION DE LA PROLIFERACION DE CELULAS PARATIROIDE A S POR CALCITRIOL En la actualidad existe bastante información ac erca de la influencia del CTR sobre la capacidad proliferativa del tejido paratiroideo: se sabe que el CTR ejerce un claro efecto inhibidor sobre la progresión de la hiperplasia paratiroidea. En este sentido, Kremer et al . 280 observaron que cuando se inc uban células paratiroideas bovinas en presencia de CTR y de [ 3 H] - timidina, se produce una inhibición en la incorporación del isótopo. 280 Esta inhibición en II Revisión bibliográfica 47 la incorporación de [ 3 H] -timidina inducida por CTR también se ha evidenciado en experiencias real izadas con glándulas paratiroides humanas. 143 Además, existen estudios realizados en ratas en los que se ha demostrado que, tras el consumo de una dieta deficiente en calcio y vitamina D durante tres semanas, el número de células paratiroideas se incre mentaba 1.7 veces, poniéndose una vez más de manifiesto este efecto antiproliferativo del CTR. 35 4 De todos estos trabajos, quizás el más completo haya sido el realizado por Szabo et al . 488 Estos autores encontraron que tras la administración de CTR a ratas urémicas, alcanzando niveles ligeramente superiores a las encontradas en el rango fisiológico, se producía: a) una disminución en el peso de las glándulas paratiroides; b) una reducción en la tasa de incorporación de [ 3 H] - timidina, al incubar las glándulas inmediatamente después de su extracción; y, c) una disminución en el número de células paratiroideas en fase de mitosis. De este modo se ponía de manifiesto, una vez más, el efecto antiproliferativo del CTR sobre las glándulas paratiroides. 488 En este mismo campo de trabajo , también se han realizado estudios sobre pacientes con insuficiencia renal. Así, Fukagawa et al . 193 observaron que, en pacientes en hemodiálisis, el tratamiento con CTR oral en forma de pulsos durante 12 semanas reduc ía el volumen de las glándulas paratiroides en un 40%. Esta reducción en el volumen glandular se observó principalmente durante las primeras 4 semanas de tratamiento. El CTR puede modular la proliferación de células paratiroideas alterando la expresión de ciertos oncogenes. 280 Kremer et al . 280 evaluaron la expresión de proto - oncogenes en células paratiroideas bovinas en incubación, encontrando que el tratamien to con CTR inhibe la expresión del oncogen c - myc, que participa en la regulación de la proliferación celular; la expresión de c - myc es necesaria para el paso de la F ase C1 a la F ase S ( duplicación de ADN) del ciclo celular. Fukagawa et al . 194 realizaron un trabajo en el que estudiaron el efecto antiproliferativo del CTR sobre el tejido paratiroideo, encontrando que la administración de dosis farmacológicas II Revisión bibliográfica 48 de CTR inducía un patrón de fragmentación del ADN de las células pa ratiroideas típico de la muerte celular programada o apoptosis. Aunque las dosis administradas eran suprafisiológicas, los autores sugi rieron que el CTR puede, no sólo inhibir los procesos de división celular sino, además, desencadenar un proceso de apoptosis. Este último resultado no ha sido confirmado por otros autores , así Canalejo et al . , 11 8 en estudios in vitro con gl ándulas paratiroides de perro , observaron que el CTR inhibe , de forma dosis - dependiente , la proliferación y tambié n la apoptosis en glándulas paratiroides normales . Además, existen grupos de investigación que ponen en duda la importancia cuantitativa de la apoptosis en un tejido como el paratiroideo en el que la tasa de mitosis es muy baja . II Revisión bibliográfica 49 A.3.3. REGULACION DE LA FUNCION PARATIROIDEA POR FOSFATO MECANISMO DE ACCION DEL FOSFORO Tradicionalmente, sólo se han considerado dos reguladores directos de la célula paratiroidea: el Ca 2+ y el CTR. Hasta hace poco tiempo, se pensaba que la acci ón del P sobre las glándulas paratiroides era exclusivamente de tipo indirecto, mediada por modificaciones en las concentraciones de Ca 2+ y/o de CTR. El incremento en los niveles de P da lugar a una disminución en la síntesis de CTR, por inhibición de la enzima 1 - α- hidroxilasa; por otro lado determina un descenso en la calcemia, por precipitación de Ca 2+ extracelular, reducción de la respuesta ósea a la acción de la PTH, y descenso de CTR . 61 , 62, 459 , 52 3 Sin embargo, existen estudios recientes in vivo e in vitro, en los que se ha puesto de manifiesto que el P también actúa de forma directa sobre la función de las glándulas paratiroides, estimulando la secreción de PTH, independientemente de las acciones indirectas descritas anteriormente . 10 , 163, 365 , 470 Es bien conocido que, en pacientes humanos y animales con insuficiencia renal crónica (IRC), los niveles elevados de fósforo en la dieta contribuyen a agravar el HPTH2 61 , 62 , 141 , 186 , 307 , 323 , 437 , 465, 467 . Los efectos beneficiosos de la reducción de los niveles de fósforo dietético se ponen de manifiesto en diferentes estudios clínicos en pacientes humanos con IRC . 19,140, 157, 31 2 ,31 4 , 404, 41 8 Aunque menos numerosos, también existen algunos estudios clínicos realizados en animales con insuficiencia renal e HPTH2 que demuestran el efecto beneficioso de la restric ción dietética de fósforo sobre la progresión del HPTH2 . 31 , 178 , 437 , 465 En este sentido, cabe destacar los trabajos de Finco et al ., 178 en perros, y de Barber et al ., 31 en gatos. Se conoce que la hiperfosfatemia disminuye la sensibilidad de l sistema óseo a la acción calcémica de la PTH. Este fenómeno, que se denomina resi s tencia esquelética a la PTH, es tan evidente que basta con modificar el contenido en fósforo en la dieta para que se II Revisión bibliográfica 50 incremente la resistencia esquelética, inclus o antes de que se produzcan modificaciones en el Pi plasmático. 61 , 62 , 152 REGULACION DE LA SINTESIS Y SECRECION DE PTH POR FOSFORO E n los últimos años, se ha abordado el estudio de los mecanismos celulares implicados en el efecto estimulador de P so bre la secreci ón de PTH. En un estudio in vitro con glándulas paratiroides de rata, Almadén et al . 10 o bservaron que pese a los elevados niveles de P en el medio, la adición de AA exógeno restauró la capacidad de inhibición de la secreción de PTH por cambio s de Ca 2+ extracelular. Es decir, la adición de AA revirtió el efecto estimulador del P sobre la secreci ón de PTH. Por otra parte , los resultados de ot ro trabajo in vitro de este mismo grupo , con tejido paratiroideo de rata y de perro , 12 demuestran que el efecto estimulador del P sobre la secreción de PTH está asociado a un descenso en la producción de AA inducida por elevados niveles de calcio (el cual es un potente inhibidor de la secreci ón de PTH) . Este fenómeno ocurre de forma específica en el tejido paratiroideo y no en otros tejidos glandulares estudiados. Por ello, se ha sugerido que el mecanismo de acción del fósforo sobre la secreción de PTH podría estar mediado por la vía de la PLA 2 – AA. 12 Así se confirma en unos recientes resultados de este grupo , en los que se observ ó que la elevaci ón del Ca 2+ intracelular fue capaz de prevenir el descenso en los niveles de AA y la estimulaci ón en la secreción de PTH i nducida por niveles elevados de P; dem o stra ndo que el mecanismo por el que el P estimula la secreci ón de PTH implica la reducción del Ca 2+ intracelular , que impid e la activación de la vía PLA 2 - AA. 13 Un dato más sobre el mecanismo de acción del P es que el efecto de éste sobre la secreción de PTH in vitro sólo se ha observado cuando se cultiva el tejido íntegro y no cuando se utilizan células dispersas , 365,430,468,470, 485 por lo que se ha sugerido que la intercomunicación entre las c élulas es necesaria para que se observe el efecto del fó s foro , al igual que se ha descrito en el caso del efecto del calcio . 485 Este hecho puede estar relacionado con la influencia ejercida por determinadas sustancias producidas en una célula sobre las células II Revisión bibliográfica 51 vecinas, como se ha demostrado en otros tejidos diferentes del paratiroideo . 472 Por otro lado, los mecanismos sensores de las células paratiroide a s para captar la concentración de fósforo extracelular son desconocido s, pero se ha propuesto recientemente que pudieran establecerse a través de un cotransportador Na/P (PiT - 1), que se expresa específicamente en dichas células y que ha sido recientemente clonado . 491, 339 Dada la estrecha relación que existe entre los diferentes elementos del sistema homeostático fosfocálcico, siempre ha resultado difícil aislar un efecto directo del P sobre la secreción de PTH. Es por ello que las acciones del P sob re las células paratiroide a s se conocen con mucha menor exactitud que las del Ca 2+ y el CTR . Existen estudios in vivo e in vitro sobre regulaci ó n de la funci ó n paratiroidea por fósforo, que pon en de manifiesto que los niveles de fósforo m odifican la secreción y síntesis de PTH . 10,11,163 ,179,186,232,233, 256,257, 264, 307 ,365,454, 464,469,470, 489, 52 4 E studios in vivo recientes ha n demostrado que el efecto del fósforo sobre la secreción de PTH es dosis dependiente, aunqu e la respuesta de las glándulas paratiroides a las variaciones de fósforo plasmático es de muy inferior magnitud a la que se da cuando se modifican los niveles de Ca 2+ . 163 Mientras que las glándulas paratiroides responden a variaciones minúsculas de Ca 2+ plasmático (inferiores a 0.5 mM), se requieren cambios mucho mayores en la concentración de P (del orden de 3 mM) para detectar modificaciones en la concentración plasmática de PTH. Además , los niveles máximos de secreción de PTH que se alcanzan du rante la hiperfosfatemia son muy inferiores a los observados en hipocalcemia. No obstante, es importante señalar que la sensibilidad de las glándulas paratiroides a las variaciones en la concentración plasmática de P puede potenciarse en situaciones pato lógicas donde exista una hiperfosfatemia crónica, como en el caso de un gran número de pacientes con insuficiencia renal crónica. Así , ligeras elevaciones en la fosfatemia (del orden de 1mM) , en este tipo de pacientes , podrían desencadenar un incremento en la secreción de PTH. II Revisión bibliográfica 52 En diferentes trabajos en los que se estudia el efecto de la modificación en el contenido de fósforo en la dieta, se han observado cambios en la concentración plasmática de PTH y en los niveles de ARNm de PTH. Estos datos in di can q ue el P no sólo modifica la secreción de PTH sino que también altera la síntesis de esta hormona. 232 , 264 , 52 4 En experi mentos in vitro e in vivo se ha comprobado que los niveles de fósforo extracelular pueden modificar la expresión del gen de la PTH, aunque no se conoce exactamente si este efecto tiene lugar a nivel tra n scripcional, postranscripcional o a ambos niveles. 11 , 340 REGULACI O N DE LA PROLIFERACI O N DE CELULAS PARATIROIDEAS POR FOSFORO Se ha comprobado que el fósforo tiene también un efecto sobre la tasa de proliferación celular de las g lándulas paratiroides , y parece claro que la sobreproducción de PTH y la hiperplasia celular, con el consecuente aumento del tamaño glandular, que se producen en fases avanzadas de la insuficiencia renal, están directamente relacionadas con la retención de fósforo. Así, existen estudio s en los que se observ aron cambios en la tasa de proliferación celular de las células paratiroide a s al modificar los niveles de P en la dieta . 11 7 ,151,156, 225 , 232,35 6 , 470 , 50 6 , 52 4 S in embargo , l os mecanis mos implicados en este efecto del P sobre el ciclo celular de las células paratiroide a s no están claros . A lgunos trabajos sugieren que este efecto del P puede estar relacionado con cambios en la expresión del CaR de las glándula s paratiroides . 414 A nteriormente s e ha descrito que la hiperfosfatemia es un factor que contribuye de manera importante en la falta de respuesta al tratamiento con CTR para la reducci ón de la hiperplasi a glandular en paciente s urémicos . 41 7 L a interferencia que produce el P sobre los efectos antiprolifer ativos del CTR en las células paratiroide a s ha sido recientemente evidenciada en estudios in vivo en ratas con dietas altas en P . 14 A vanzando en esta l í nea de estudio , trabajos recientes de Dusso et al . 160 ha n de mostrado que ratas con alto f ósforo en la dieta presentaban un incremento en la proliferación celular por aumento de l factor de crecimiento TGF - ∝, mientras que la dieta con bajo P h izo descender la proliferación celular estimulando la II Revisión bibliográfica 53 expresión de l fac tor de transcripción p21/WAF . S e sabe que el CTR hace descender la proliferación celular inhibiendo la expresión del oncogen c -myc, el cual resulta en la estimulaci ón de p21 /WAF . Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la sobrecarga de f ósforo en la die ta estimula la proliferación celular en las células paratiroides al reducir el efecto estimulante del CTR sobre el factor p21 /WAF . En resumen, r esulta evidente que, al igual que el calcio y el CTR, los niveles de fósforo pueden regular de forma directa la función paratiroidea, a tres niveles: secreción, síntesis y proliferación celular, aunque a ú n no se conocen bien los mecani smos de acción. II Revisión bibliográfica 54 A.3.4. OTROS FACTORES REGULADORES DE LA FUNCION PARATIROIDEA Las paratiroide a s representan un ejemplo típico de células sensibles a los iones: su gran sensibilidad para captar cambios en la concentración ex tracelular de Ca 2+ juega un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis de este ion. Pero las células paratiroideas no sólo integran información sobre la concentración extracelular de Ca 2+ , sino que también pueden modificar su repuesta secretora se gún los niveles circulantes de otros iones y de factores no iónicos. 83 Conviene resaltar que, además del Ca 2+ y del P , existen otros iones minerales, como el magnesio (Mg 2+ ) que influyen sobre la función paratiroidea. 15 , 83 El Mg 2+ es uno de los cationes más abundantes en el organismo y juega un papel fundamental en el metabolismo intracelular, interviniendo en procesos de producción y utilización de energía, así como en numerosas reacciones enzimáticas. 336 Diversos estudios han demostra do que el Mg 2+ puede regular la secreción de PTH de forma similar al Ca 2+ . 431 Trabajos realizados in vitro con glándulas paratiroides de rata y de vaca han puesto de manifiesto que los aumentos en la concentración de Mg 2+ presente en el medio inhiben la secreción de PTH, y viceversa. 375 , 455 Estas acciones del Mg 2+ tienen lugar a través del mismo receptor y de los mismos mecanismos por los que actúa el Ca 2+ . 81 En estudios realizados con glándulas de vacuno se ha comprobado que el efecto estimulador del descenso de Mg 2+ sobre la secreción de PTH es 2.5 a 3 veces menos potente, en bases de molaridad, que el del Ca 2+ . Además, el aumento de Mg 2+ es todavía menos efectivo que el del Ca 2+, alrededor de unas 30 veces, a la hora de inhibir la secreción de PTH. 79,220 Si consideramos que la concentración extracelular de Mg 2+ es similar a la de Ca 2+ , parece improbable que, en circunstancias normales, los cambios de Mg 2+ modulen de forma importante la secreción de PTH. II Revisión bibliográfica 55 Por otra par te, concentraciones elevadas de Mg 2 + estimulan la secreción de CT , 38 7 y pueden inhibir la respuesta de las células del túbulo proximal del riñón a la PTH. 466 En estas acciones , el Mg 2+ y el Ca 2+ tienen una potencia relativa similar. L a influencia de las hormonas calciotrópicas (PTH y CTR, fundamentalmente) sobre la concentración extracelular de Mg 2+ no está del todo aclarada. L a homeostasis del Mg 2+ depende tanto de las acciones que las hormonas calciotrópicas ejercen s obre los tejidos diana (hueso, riñón e intestino) como del efecto directo del Mg 2+ sobre el riñón y/o otros tejidos involucrados en la regulación de la concentración extracelular de Mg 2+ . Como ya se ha comentado, existen determinados factores n o iónicos que también pueden afectar la secreción de PTH . L a dopamina y el isoproterenol estimulan la secreción de PTH, a través de su acción sobre mediadores intracelulares. Concretamente, est a s sustancias activan la enzima adenilato ciclasa , determinando un aumento en el contenido intracelular de AMPc. 74,75 De manera inversa, otr o s compuestos pueden inhibir la s ecreción de PTH reduciendo el contenido intracelular de AMPc, como , por ejemplo , los agonistas α adrenérgicos (epinefrina y norepinefrina) y la prostaglandina F 2 α . Estas sustancias inhiben la enzima adenilato ciclasa a través de proteínas G de membrana inh ibidoras. 76,181,200,476 En relación a los cambios en la secreción de PTH producidos por las variaciones en la actividad y concentración de media dores intracelulares, es importante comentar que una variación del pH extracelular puede tener múltiples efectos a nivel celular, ya que hay muchos elementos de membrana e intracelulares cuya actividad es pH dependiente. Por lo tanto, es lógico pensar que desviaciones del pH extracelular hacia la acidosis o hacia la alcalosis puedan determinar cambios en la respuesta secretora de las glándulas paratiroides. II Revisión bibliográfica 56 B. ESTADO ACIDO - BASE B.1. REGULACI O N DEL ESTADO ACIDO - BASE Existen varias teorías para expli car el concepto de equilibrio ácido - base. La más aceptada en la actualidad es la de Bronsted - Lowry, según el cual un ácido es una sustancia capaz de donar protones, mientras una base sería aquella sustancia que puede aceptar protones. Dichas propiedades so n independientes de la carga de la sustancia. Esta teoría tiene la ventaja de que extiende el concepto de equilibrio ácido - base a cualquier tipo de soluciones, acuosas o no acuosas, y que permite explicar el estado ácido - base de una solución sin necesidad de conocer detalladamente sus componentes. 1 16 ,401,421 Para estudiar el estado ácido - base en los seres vivos, cuyo componente principal es el agua, también es interesante la teoría clásica de Arrenio. Según Arrenio, un ácido es una sustanc ia que al disolverse en el agua da lugar a la producción de hidrogeniones, mientras que una base es una sustancia capaz de generar radicales hidroxilo. La neutralidad de una solución, según esta teoría, se consigue cuando el número de hidrogeniones es igua l al de hidroxilos (H + = OH - ). 401 El agua, componente principal de los seres vivos, se comporta como un electrolito débil y se disocia en hidrogeniones e hidroxilos: H 2 O H + + OH - La constante de disociación de esta ecuación (Ka) es el prod ucto [H + ] x [OH - ]. A 37 ºC, el valor de esta constante es 2.4 x 10 - 14 . Dado que , para satisfacer la ley de la electroneutralidad, [H + ] debe ser igual [OH - ], la concentración de hidrogeniones en agua pura es 1.55 x 10 - 7 mol/l. 401,421 II Revisión bibliográfica 57 Un a de las constantes que el organismo intenta mantener dentro de unos límites más estrechos es la concentración de H + . 421 Mantener un nivel constante de hidrogeniones en el medio interno es esencial para el correcto funcionamiento celular. 251,27 1 , 35 1 Los hidrogeniones, debido a su pequeño tamaño, son extraordinariamente reactivos, especialmente con las proteínas, a cuyas porciones con carga tienden a unirse. 421 Cuando se modifica la concentración de hidrogeniones, se producen alteraciones en la distribución de las cargas y en la configuración molecular de las proteínas, con el consiguiente deterioro en la función de las mismas. En condiciones normales, la concentración de hidrogeniones en el medio interno se mantiene prácticamente constante alrededor de 40 n mol/l. 421 B.1.1. ANALISIS TRADICIONAL DEL ESTADO ACIDO - BASE Para describir el estado ácido - base de una solución, generalmente se recurre a la medición del pH. El pH se define como el logaritmo negat ivo de la concentración de hidrogeniones: pH = - log [H + ] Por lo tanto, en el caso del agua, a una temperatura de 37 ºC, su pH sería 6.8. Obviamente, el medio interno de los organismos no está compuesto sólo por agua. Cuando se consideran toda s las sustancias presentes en el medio interno, se observa que existe una concentración de hidrogeniones de 40 n mol/l. Por ello, el pH del medio interno es de 7.4. 421 B.1.1.1. Regulación del pH La regulación del pH del medio se lleva a c abo fundamentalmente por tres mecanismos: 1. Tamponamiento por medio de buffers extra e intracelulares. II Revisión bibliográfica 58 2. Regulación de la PCO 2 3. Control del bicarbonato plasmático por medio del riñón. Sistemas tampón Normalmente, como consecuencia del metabolismo se producen gran cantidad de ácidos, como el ácido carbónico procedente del CO 2 , el ácido sulfúrico, el ácido fosfórico y diversos ácidos orgánicos que aportan numerosos protones. Estos ácidos han de ser eliminados para que se mantenga el pH constante, por lo que se d ispone de una serie de mecanismos de excreción. No obstante , para evitar las fluctuaciones del pH del medio interno durante el tiempo que media entre la producción de esas sustancias ácidas en el organismo y su posterior eliminación, el organismo utiliza u na serie de sistemas amortiguadores o tampón. 158,421 Los principales sistemas neutralizadores en el líquido extracelular son el sistema compuesto por HCO 3 - / H 2 CO 3 , la hemoglobina y el hueso. La hemoglobina , en realidad , no está presente en el espacio extracelular, sino que actúa como un tampón dentro de los hematíes. Existen otros dos sistemas amortiguadores muy poderosos en líquido extracelular: los fosfatos y las proteínas. Cuando un ácido fuerte ingresa en el organismo, el sistema HCO 3 - / H 2 CO 3 contribuye con el 42 % de la amortiguación, la hemoglobina, con el 6% y los fosfatos orgánicos y las proteínas intracelulares con el 51 %. No obstante, el sistema HCO 3 - / H 2 CO 3 , por su fácil disponibilidad en el líquido extracelular, es el más importan te inicialmente. Los sistemas intracelulares y del hueso necesitan varias horas para alcanzar plena actividad, debido al tiempo que requiere la carga de hidrogeniones para difundir uniformemente por todo el organismo. 236, 324,401,421 Los otros dos factores que consolidan la importancia extrema del sistema HCO 3 - / H 2 CO 3 en el líquido extracelular son: las cantidades de HCO 3 - disponibles y el control de la excreción pulmonar de H 2 CO 3 y de la eliminación renal de HCO 3 - . 158,421 II Revisión bibliográfica 59 Sistema Bicarbonato /Acido carbónico La ecuación de Henderson - Hasselbach relativa al sistema HCO 3 - / H 2 CO 3 se expresa como: 401,421 pH = pK + log [HCO 3 - / H 2 CO 3 ] Donde pK = 6.1. Por tanto, pH = 6.1 + log [HCO 3 - / H 2 CO 3 ] Como el ácido carbónico es difícil de medir directamente, se utiliza la relación constante que existe en el líquido extracelular entre PCO 2 y [H 2 CO 3 ], tal que [H 2 CO 3 ] = 0.03 x PCO 2 , y así la ecuación de Henderson - Hasselbach se puede expresar en una forma clínicamente más útil: 401,421 pH = 6.1 + log [HCO 3 - ]/0.03 PCO 2 En general, un sistema tampón es más eficiente en un rango de pH situado una unidad por encima o por debajo de su pK. En el caso del tampón bic arbonato, el pK se encuentra 1.3 unidades debajo del pH fisiológico y , sin embargo, este es el sistema amortiguador más eficaz. Ello es debido a la propiedad única de este sistema, que al funcionar como un sistema abierto, permite regular constantemente y de forma inmediata la PCO 2 mediante cambios en la ventilación pulmonar. Así, a medida que se van neutralizando ácidos, se incrementa la concentración de H 2 CO 3 , pero este producto puede eliminarse fácilmente incrementando la ventilación alveolar. Efectivame nte, la hiperventilación reducirá la PCO 2 y, como ya sabemos, [H 2 CO 3 ] = 0.03 x PCO 2 . 401,421 II Revisión bibliográfica 60 Regulación de la PCO 2 L a regulación de la PCO 2 se lleva a cabo en los pulmones, que eliminan constantemente el CO 2 producid o como consecuencia del metabolismo aerobio. Dada la gran difusibilidad del CO 2, el control de su concentración en el medio interno vendrá determinado de forma casi exclusiva por los procesos de ventilación alveolar. 401 La regulación de la PCO 2 llevará asociada, por lo tanto, cambios en la ventilación alveolar. El control de la ventilación se lleva a cabo por parte del centro respiratorio que es capaz de responder a diversos tipos de estímulos, fundamentalmente a cambios de la PO 2 y de la PCO 2 . Un incremento en PCO 2 representa un estímulo positivo para el centro respiratorio, que de esta manera se encarga de incrementar la ventilación pulmonar. Por el contrario la reducción de los niveles de PCO 2 actuará como estímulo negativo sobre el centro res piratorio. 421 Control del bicarbonato plasmático por el riñón El riñón desempeña dos funciones en la regulación del equilibrio ácido - base. Por una parte, se encarga de excretar los ácidos fijos (no volátiles) que provienen del metab olismo de las proteínas de la dieta y que no pueden eliminarse por vía respiratoria. Además, interviene de manera decisiva en la regulación de la concentración plasmática de bicarbonato. 158,401,421 La excreción de los ácidos fijos por par te del riñón se lleva a cabo mediante la combinación de los protones con buffers urinarios (como los fosfatos) o con el amoniaco, para formar iones amonio. 421 Estos procesos son muy importantes, puesto que la capacidad de excreción de hidrogenio nes libres por la orina es limitada, dado que la excreción masiva de estos iones supondría una gran disminución del pH urinario. El mecanismo básico por el que se llevaba a cabo la secreción de protones se basa en la II Revisión bibliográfica 61 formación de un ion hidrógeno a part ir del ácido carbónico que, a su vez , deriva de la unión del dióxido de carbono y del agua, lo que requiere la presencia de la enzima anhidrasa carbónica. CO 2 + H 2 O an h idrasa carbónica H 2 CO 3 H + + HCO 3 - La acidificación de la ori na en los túbulos proximales es mínima ; no es así en los túbulos distales y colectores, donde existe un movimiento de hidrogeniones hacia el lumen gracias a un mecanismo de transporte activo que puede actuar en contra de gradiente de concentración. Este t ransporte implica el intercambio de ion por ion entre hidrogeniones e iones de sodio del filtrado (antiporte electroneutro), por lo que no s ó lo se acidifica la orina sino que se ingresan iones de sodio al medio interno. Los iones bicarbonato , resultantes en la célula tubular de la disociación del H 2 CO 3 , se desplazan pasivamente hacia la sangre, donde neutralizarán eléctricamente a los iones de sodio reabsorbidos en los túbulos. 16,421 La cantidad de hidrogeniones que se elimina por la orina aumenta en una situación de acidemia y disminuye en alcalemia. En situaciones de acidemia, el pH de las células tubulares disminuye y la [CO 2 ] se eleva, lo que causa un incremento en la formación y secreción de hidrogeniones. Por el contrario, cuando se el eva el pH del medio interno, la [CO 2 ] es inferior y se deprime la secreción de hidrogeniones. Exi ste otro factor intracelular que puede influir en la secreción de hidrogeniones, se trata de la concentración de potasio. Los iones de potasio e hidrógeno comp arten el mismo mecanismo de transporte, a través de la membrana de la célula tubular, hacia la luz del túbulo. Por ello cuando la [K + ] intracelular es alta, disminuye la secreción de hidrogeniones; y si por el contrario la concentración de potasio es baja tiende a aumentar la secreción de hidrogeniones. El i o n bicarbonato es el principal aceptador de H + del plasma y se encuentra presente en II Revisión bibliográfica 62 el filtrado glomerular, siendo la cantidad filtrada diariamente mucho mayor que la cantidad total de que dispone el organismo, por lo tanto es evidente que la mayor parte de este bicarbonato es reabsorbido del líquido tubular en distintas partes de la nefrona. Casi todo el bicarbonato filtrado en el glomérulo se recupera pasivamente en los túbulos proximales, al mismo t iempo que se reabsorben iones sodio de forma activa. Otra parte se reabsorbe en los túbulos colectores por un mecanismo que implica la secreción en forma activa de hidrogeniones mediante una bomba protónica. Cuando existe bicarbonato en el líquido tubul ar, el ion hidrógeno puede reaccionar con él, dando lugar a la formación de CO 2 : 421 H + + HCO 3 - H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O Este dióxido de carbono generado en la luz del túbulo difunde a través de la membrana tubular con facilidad, pasando al interior de la célula, donde servirá de sustrato para la formación de bicarbonato e hidrogeniones. Cada molécula de dióxido de carbono que es utilizada por la anhidrasa carbónica en la formación de ácido carbónico y la co nsiguiente secreción de hidrogeniones es remplazada por otra reabsorbida de esta manera en el líquido tubular. 158 De lo anterior se deduce que la cantidad iones bicarbonato filtrados que se reabsorben va a depender de la cuantía de hidrogenio nes que se secrete. Si la cantidad de hidrogeniones excretados en los túbulos excede a la de iones bicarbonato filtrados en el glomérulo, se reabsorberá todo el bicarbonato, pero si, por el contrario, la secreción de hidrogeniones es menor que la de filtra ción de bicarbonato, algunas moléculas de bicarbonato escaparán a la reabsorción tubular y aparecerán en orina. 39 3 En una situación de acidosis se eleva la secreción de hidrogeniones, lo que propicia la reabsorción de todo el bicarbonato, con lo que la orina se acidifica. Sin embargo , en II Revisión bibliográfica 63 alcalosis se segregan menos hidrogeniones, por lo que aparecen más iones bicarbonato en la orina, y ésta se alcalinizará. En la mayoría de los trastornos ácido - base, los cambios en la cantidad de hidrogeniones que se secretan a la orina parecen determinar la cantidad de bicarbonato que aparecerá en la orina, de modo que los cambios en la filtración glomerular del bicarbonato juegan un papel de menor importancia. Sin embargo, si se adiciona una gran cantidad de b ases a los líquidos orgánicos, como sucede tras la ingestión de bicarbonato sódico, el gran incremento en la filtración de los iones bicarbonato excederá a la capacidad de secreción tubular de hidrogeniones y por tanto no se podrá reabsorber todo el bicarb onato filtrado, apareciendo éste rápidamente en gran cantidad en orina. 158,421 II Revisión bibliográfica 64 Figura 10 . Esquema de los mecanismos renales de regulación del equilibrio ácido - base. CELULA Membrana luminal H + Na + Túbulo proximal H + Bomba protónica Túbulo colector H + HPO 4 2 - H 2 PO 4 - ORINA sale HCO 3 - H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O CO 2 H 2 CO 3 HCO 3 - H + HCO 3 - SANGRE Na + K + FILTRADO Membrana basolateral sale CELULA Membrana luminal Membrana luminal H + Na + Túbulo proximal H + Bomba protónica Túbulo colector H + HPO 4 2 - H 2 PO 4 - ORINA sale HCO 3 - H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O CO 2 H 2 CO 3 HCO 3 - H + HCO 3 - SANGRE Na + K + FILTRADO Membrana basolateral sale H + Na + Túbulo proximal H + Bomba protónica Túbulo colector H + HPO 4 2 - H 2 PO 4 - ORINA sale HCO 3 - H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O CO 2 H 2 CO 3 HCO 3 - H + HCO 3 - SANGRE Na + K + FILTRADO Membrana basolateral sale H + Na + Túbulo proximal H + Na + Túbulo proximal H + Bomba protónica Túbulo colector Bomba protónica Túbulo colector H + HPO 4 2 - H 2 PO 4 - ORINA sale sale HCO 3 - H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O CO 2 H 2 CO 3 HCO 3 - H + HCO 3 - SANGRE Na + K + FILTRADO Membrana basolateral Membrana basolateral sale II Revisión bibliográfica 65 B.1.1.2. Electr ó litos y pH La intervención de los electr ó litos en el organismo es muy amplia. Están implicados en la conducción del impulso nervioso, en el transporte de O 2 y CO 2 , en multitud de re acciones enzimáticas, etc. Además, los electrolitos desempeñan un papel fundamental en el equilibrio ácido - base. 158 La distribución de los electr ó litos en el organismo es como sigue: los iones Na + , Cl - y HCO 3 - se encuentran preferentemente en e l líquido extracelular, mientras que la mayor parte del K + y Mg 2+ se acumula el el espacio intracelular. Estos cationes intracelulares están equilibrados eléctricamente por fosfatos orgánicos, proteínas, sulfatos y una pequeña cantidad de bicarbonato. 421 A continuación, revisaremos los electr ó litos más abundantes del medio interno, que son también los que tienen mayor importancia en la regulación del estado ácido - base. SODIO El sodio es el catión más importante del medio extracelular, donde dese mpeña un papel fundamental en la regulación del volumen extracelular y de la osmola r idad plasmática. El volumen extracelular viene determinado por la cantidad absoluta de sodio y agua, mientras que la osmola ridad representa la relación existente entre los solutos (fundamentalmente el sodio) y el agua. 421 El equilibrio salino se consigue manteniendo un a concentración de sodio relativamente constante en el líquido extracelular, para lo cual se requiere regular la ingesta y excreción de sodio y agua. El sistema que rige la ingesta de sodio no es del todo conocido, pero se piensa que está controlado por un mecanismo neurológico similar al que controla la sed. Por otro lado , la excreción de Na + por los riñones implica, primero, la filtración del Na + II Revisión bibliográfica 66 plasmático en el glomérulo y, después, la reabsorción tubular de la mayor parte del sodio filtrado. La reabsorción del Na + tiene lugar preferentemente en el túbulo proximal (70%) y, en menor medida, en el asa de Henle (20%), túbulo distal (5%) y túbulos colectores (4%). La diferencia del sodio filtrado y el reabsorbido representa la cantidad excretada por la orina. 16,158 Existen dos grupos de mecanismos que actúan en la regulación de la concentración de sodio : a) Los meca nismos reguladores del volumen ( contenido total de sodio ) y b) los mecanismos reguladores de la osmola r idad ( contenido total de agua ) . a) Mecanismos reguladores del volumen La excreción renal de sodio se ve afectada por múltiples factores. Parece ser que la aldosterona y el péptido natriurético atrial son los responsables de corregir las pequeñas variaciones en e l volumen extracelular que se producen como consecuencia de las fluctuaciones en la ingestión de Na + . La aldosterona promueve la reabsorción tubular de sodio, mientras que el péptido natriurético favorece su eliminación. Así, cuando disminuye la ingestión de Na + , se produce un descenso en e l volumen extracelular que da lugar a activación del eje renina - angiotensina - aldoster ona, a la vez que se inhibe el péptido natriurético. Como consecuencia de ello, se incrementa la reabsorción tubular de sodio en los túbulos colectores. Cuando la disminución de l volumen extracelular es más marcada, se produce, además, un descens o en la filtración glomerular y un aumento en la reabsorción tubular proximal de sodio, que ayudan a mantener la natremia. En esta respuesta contribuyen también la angiotensina I y la norepinefrina. Si, por el contrario, se produce una expansión en el volu men extracelular tendrán lugar fenómenos opuestos, con un incremento en la secreción de péptido natriurético y una disminución en la secreción de aldosterona, que facilitarán la eliminación de sodio al reducirse la reabsorción de este ion en los túbulos co lectores. Cuando la hipervolemia es más marcada, también disminuye la reabsorción de sodio en e l túbulo proximal. 202,239,421 II Revisión bibliográfica 67 Existe otro mecanismo para regular el volumen extracelular que, aunque tiene poca importancia en individuos sanos, puede ser relevante cuando los otros sitemas de regulación se encuentran alterados (enfermedad renal, exceso de angiotensina II o de aldosterona): se trata del fenómeno de natriuresis inducida por la hipertensión. Este fenómeno, cuyas bases fisi ológicas no se conocen por completo, consiste en una disminución en la reabsorción tubular de sodio en respuesta a la elevación en la presión arterial. 421 b) Mecanismos reguladores de la osmola r idad La osmola r idad del líquido extracelular viene determinada por la proporción entre solutos (básicamente sales de Na + y K + ) y el agua. Las modificaciones en la osmola r idad plasmática van a estar determinadas primariamente por cambios en la concentración de sodio. Sin embargo, a diferencia de lo que oc urre en la regulación de las alteraciones del volumen extracelular, el control de la osmola r idad no se realiza mediante la ingestión y excreción de sodio. La osmola r idad del medio extracelular se regula mediante cambios en la ingestión y excreción de agu a, controlados por los mecanismos de la sed y la hormona antidiurética (ADH) , respectivamente. 421 Los cambios en la osmola r idad plasmática son detectados por osmorreceptores situados en el hipotálamo. Cuando la osmola ridad sanguínea aumenta, est as neuronas especializadas del hipotálamo se encargan de desencadenar la sensación de sed y el animal ingiere agua. Además, favorecen la secreción de ADH, con lo que aumenta la retención renal de agua, y de esta forma se recupera la proporción sodio/agua. Al dismuinuir la osmola r idad sanguínea tienen lugar fenómenos opuestos: desaparición de la sensación de sed e inhibición en la secreción de ADH, que determinan que no se ingiera agua al tiempo que se aumenta la excreción renal de agua. 158,421 II Revisión bibliográfica 68 POTASIO El potasio es el principal catión del espacio intracelular. El 98% del contenido orgánico de potasio está localizado en el interior de las células, en contraste con el sodio que está primariamente limitado al espacio extracelular. La localiz ación del Na + y del K + en los diferentes compartimentos se mantiene constante gracias a la bomba Na + /K + de la membrana celular que, consumiendo ATP, transporta Na + en contra de gradiente hacia fuera y K+ hacia dentro de la célula en proporción 3:2. 4 21 El potasio entra normalmente en el organismo a través de la dieta, (40 a 120 mEq al d í a en el hombre ) y, como ya hemos visto, se almacena principalmente en el interior de las células. La excreción de potasio se realiza primariamente por la o rina y, en menor grado, por las heces y el sudor. Por lo tanto, cuando se altera la concentración plasmática de potasio deben estar involucrados algunos de estos procesos. Un estado de hipokalemia puede producirse por: a) incremento en la entrada de K + a l interior de las células, b) incremento en las pérdidas urinarias de K + o, c) restricción de K + en la dieta. Aunque la restricción dietética de potasio puede contribuir a la hipokalemia, en sujetos con una función renal normal raramente causará depleci ón de potasio ya que el riñón tiene una enorme capacidad para reducir las pérdidas urinarias de K + (por debajo de 15 mEq/día en el hombre ). Entre las causas que pueden determinar un incremento en la entrada de potasio al interior de las células cab e destacar las siguientes: elevación del pH extracelular, incremento en la disponibilidad de la insulina, elevación de la actividad β- adrenérgica e hipotermia . Por otro lado, el incremento en las pérdidas de K + suele producirse principalmente a niv el II Revisión bibliográfica 69 gastrointestinal (diarreas, vómitos, etc) y renal (diuréticos de asa y tiazidas, hiperaldosteronismo, flujo distal incrementado, alteraciones en la reabsorción de sodio, hipomagnesemia, poliuria, etc). Inversamente, la hiperkalemia se produce en la may oría de los casos por aumento en la liberación de K + desde el interior de las células o por un descenso en la excreción urinaria de este catión. Si la función adrenal y renal de un individuo están intactas, un incremento en la ingestión de potasio no condu ce normalmente a una hiperkalemia. Cuando se ingiere potasio en exceso, éste pasa al interior de las células gracias a un proceso que se ve facilitado por la insulina y por las catecolaminas. De esta forma, se minimiza el aumento de la potasemia en el int ervalo que transcurre hasta que el potasio pueda ser excretado por el riñón. 421 Los movimientos de K + desde el interior de las células al fluido extracelular, que pueden generar una h i perkalemia, se dan en procesos tales como: acidosis metabólica , diabetes mellitus (deficiencia de insulina unida a hiperosmolaridad), catabolismo tisular, ejercicio intenso, dosis elevadas de algunos fármacos como los bloqueantes β- adrenérgicos, etc. Las causas más comunes de hiperkalemia son debidas a problemas en la excrección renal de este ion, relacionadas fundamentalmente con fallo renal, depleción de volumen circulante, hipoaldosteronismo, acidosis tubular renal tipo 1, etc. La excreción renal de potasio se lleva a cabo en la porción final de la nefrona, fun damentalmente en los túbulos colectores. El proceso excretor está regulado por la aldosterona y por la concentración plasmática de potasio . 421 La aldosterona juega un papel fundamental en la homeostasis del potasio merced a que promueve un increme nto en la secreción de potasio en los túbulos colectores. Los niveles II Revisión bibliográfica 70 de aldosterona varían en forma directamente proporcional a la concentración plasmática de potasio: se incrementan en hiperpotasemia y disminuyen en hipopotasemia. En las células de los t úbulos colectores, la aldosterona promueve todos los mecanismos relacionados con la excreción de potasio: aumenta el número de canales Na + /K + abiertos en la membrana luminal e incrementa la actividad de la bomba Na + /K + en la membrana basolateral. Al increm entarse la permeabilidad al Na + , se favorece la reabsorción de este ion en la célula, pasando después a la circulación sistémica gracias a la bomba Na + /K + . Este proceso favorece la excreción de potasio por dos mecanismos: a) el transporte de Na + , desde la célula tubular al plasma, da lugar a la entrada de K + , procedente de la circulación, en la célula tubular, b) la reabsorción de Na + luminal determina que en el espacio luminal se cree un gradiente electonegativo, lo que favorece la excreción de K + . 421 Por otra parte, diversos experimentos han puesto de manifiesto que la excreción de potasio está directamente relacionada con la concentración plasmática de potasio, independientemente de los niveles de aldosterona, indicando que deben existir otros f actores reguladores involucrados. 421 CLORO El cloruro es el principal anión del líquido extracelular y constituye el 60% o más de los aniones de este compartimento líquido. Debido a su abundancia, el ion cloruro tiene una actuación importante en el equilibrio ácido - base. 421 Los iones cloruro y bicarbonato están equilibrados eléctricamente en su mayor parte con los iones sodio del líquido extracelular. Osmóticamente, el efecto de estos iones iguala al de los iones de sodio. 158 La regulación de la concentración de Cl - es secundaria a la regulación de la concentración de Na + y de HCO 3 -. Si se excreta un exceso de sodio por el riñón, el II Revisión bibliográfica 71 cloruro lo acompaña. Si debido a un estado de alcalosis el nivel plasmático de bicarbonato se el eva, éste debe ser eliminado por el riñón, reteniéndose una cantidad equivalente de cloro, con el fin de que se mantenga la electroneutralidad en el líquido extracelular. 158 La concentración del ion cloruro está sujeta a más variaciones que las de sodio, ya que otros aniones, especialmente el bicarbonato, pueden intercambiarse con él. 421 El cloruro se excreta fundamentalmente en las heces, sudor y orina, como cloruro sódico o potásico, aunque también puede acompañarse de iones amonio, cu ando necesitan conservarse las bases. 158 ELECTROLITOS Y P H La composición electrolítica del medio interno es uno de los factores más relevantes a la hora de determinar su estado ácido - base. La importancia de los electr ó litos en el esta do ácido - base empezó a ser apreciada a principios del siglo pasado, cuando los avances en química analítica permitieron un conocimiento más exacto del contenido electrolítico del medio interno. No obstante, es a partir de los trabajos de Gamble, en la déca da de los sesenta, cuando se populariza el uso de los electr ó litos en el estudio del equilibrio ácido - base. 197 La aplicación de los electr ó litos en el estudio del estado ácido - base se basa en el principio de elctroneutralidad, según el cual, la suma de todas las cargas positivas (cationes) debe estar equilibrada con la suma de las cargas negativas (aniones). Con el fin de comparar la contribución eléctrica de los iones presentes en el medio interno, sus concentraciones deben expresarse en mEq/l. 1 61 Como ya henos visto los cationes más importantes del medio extracelular son el sodio y II Revisión bibliográfica 72 el potasio (representan el 95 % de todos los cationes), mientras que los aniones más abundantes en el mismo son el cloro y el bicarbonato (aunque éstos tan s olo suponen el 85% de la carga aniónica total). Las concentraciones de todos estos iones se pueden medir fácilmente y su estudio conjunto permite definir el concepto de anion gap. 154,161 El anion gap representa la diferencia entre los cationes y aniones anteriormente citados: 161 Anion Gap = (Na + + K + ) – (Cl - + HCO 3 - ) Puesto que la concentración de Na + es muy superior a la de K + , el anion gap también se puede calcular obviando la concentración de K + . Debido a que el cloro y el bicar bonato representan un porcentaje menor de la cantidad total de aniones (85%) que el sodio y el potasio respecto a los cationes (95%), en condiciones normales, el anion gap será positivo. El principio de la electroneutralidad requiere que todas las cargas positivas estén contrarrestadas por un número igual de cargas negativas. Por lo tanto, el anion gap indica el número de aniones, distintos de Cl - y HCO 3 -, que deben existir para contrarrestar las cargas positivas de Na + y de K + . En circunstancias fisiológi cas, el anion gap representa una estimación de las cargas negativas suministradas por las proteínas, fosfatos , sulfatos y ácidos orgánicos , principalmente. 421 La utilidad fundamental del anion gap radica en la evaluación del estado ácido - básico . Salvo algunas excepciones, el incremento del anión gap es sinónimo de acidosis metabólica. 161 La acidosis metabólica consiste en un acúmulo de ácidos orgánicos o inorgánicos en el espacio extracelular. La adición de ácidos a los fluidos orgánicos tiene dos efectos simultáneos sobre la composición electrolítica del medio interno: 50 5 II Revisión bibliográfica 73 a) Los iones hidrógeno se unen al bicarbonato para formar ácido carbónico, el cual se deshidrata rápidamente, dando lugar a dióxido de carbono que es elimina do por el pulmón. b) Por otro lado, el consumo de bicarbonato conlleva una disminución en las cargas negativas. Si el ácido que ingresa en el organismo es HCl, cada mEq de bicarbonato que se pierde es reemplazado por un mEq de Cl -, con lo que no se va alterar e l anion gap (estaríamos en el caso de una acidosis metabólica hiperclorémica). La adición al medio interno de un ácido distinto del HCl, conllevaría un aumento del anion gap , puesto que se sustituyen aniones “medibles “ (HCO 3 - ) por aniones “no rutinariamente medibles”, (como podrían ser lactato, fosfato, citrato, sulfato, etc.). 50 5 B.1.2. ANALISIS CUANTITATIVO DEL ESTADO ACIDO - BASE A principios de los años 80 Stewart presentó su teoría sobre análisis f í sico - químico, también denominado cuantitativo, del estado ácido - base. Dicha teoría se basa en el estudio pormenorizado de todos los factores que intervienen en el equilibrio ácido - base. Este análisis, que anteriormente había sido considerado imposible por su complejida d de cálculo, se ha convertido en factible mediante el uso de sistemas informáticos que permiten realizar complejas operaciones matemáticas con gran rapidez. 480 Recientemente, las ideas de Stewart se han desarrollado, permitiendo la aplicación clí nica de sus principios. 174,175,177,191,29 3 La teoría de Stewart se fundamenta en tres conceptos fisicoquímicos fundamentales: 1. Principio de electroneutralidad . Es decir, en todo momento, en el medio interno la suma de las cargas positivas debe ser igual a la de las cargas negativas. 2. Principio de conservación de masa . Esto significa que la concentración total de una II Revisión bibliográfica 74 sustancia que no se disocia completamente se puede calcular siempre como la suma de la concentr ación de la forma disociada y de la no disociada. 3. Principio de disociación . La disociación o ionización de una sustancia en el agua viene determinada por una constante de disociación. Dicha constante determina cómo de ionizad a se encuentra una sustanc ia en un estado de equilibrio. En los fluidos biológicos, los electr ólitos débiles son aquellos que se encuentran parcialmente ionizados o disociados, mientras que los electr ó litos fuertes son los que están completamente disociados. Electr ó litos déb iles importantes en la fisiología ácido - base son los ácidos débiles (como las proteínas o los fosfatos) mientras que el Na + y el Cl - son ejemplos de electrolitos completamente ionizados. B.1.2.1. Variables dependientes e independientes Según el análisis cuantitativo introducido por Stewart, existen tres componentes principales para evaluar el estado ácido - base: a) variables independientes o primarias, b) variables dependientes, y c) constantes de disociación de ambas variables. Las tres variables indep endientes son : la PCO 2 , la diferencia entre las cargas positivas y negativas de los iones fuertes (“strong ion difference “ o SID) y la concentración total de ácidos débiles (A t ). Estos tres factores influyen sobre otras variables, denominadas dependient es, entre las que se incluyen la concentración de: hidrogeniones, hidroxilos, bicarbonato y carbonato. Estas variables dependientes cambian, todas simultáneamente, siempre que una o más variables independientes se modifican. Por ejemplo, las alteraciones e n la [H + ] sólo suceden secundariamente a cambios en uno o varios factores independientes (PCO 2 , SID y/o A t ). Este concepto difiere radicalmente de la interpretación fisiológica tradicional del estado ácido - base, que se basa en la premisa de que la [H + ] y la [HCO 3 - ] son las variables II Revisión bibliográfica 75 fundamentales cuyas modificaciones se ven afectadas directamente por diferentes enfermedades o por diferentes respuestas homeostáticas. 175 En un sistema in vivo , los valores de las variables dependientes se pueden calcular a partir de los datos de las variables independientes del sistema, ya que todas ellas están interrelacionadas y deben cumplir los tres principios físico - químicos fundamentales. Matemáticamente, dicha interrelación puede expresarse media nte la siguiente fórmula: [H + ]4 + (K A +SID) [H + ]3 + {K A (SID – A t ) – (K C · PCO 2 + K’ W ) } [H + ]2 - {K A ( K C · PCO 2 + K’ W ) + (K 3 · K C · PCO 2 ) } [H + ] - (K A · K 3 · K C · PCO 2 ) = 0 Donde K’ W , K A , K 3 , y K C son las constantes de disoci ación del agua, de los ácidos débiles, del ácido carbónico y del bicarbonato. Seguidamente, describiremos brevemente las tres variables independientes: B.1.2.2. Presión parcial de CO 2 La presión parcial de CO 2 en la sangre arterial se regula por medio de la ventilación alveolar. 511 Dado que la molécula de CO 2 es liposoluble y difunde libremente a través de las membranas biológicas, la diferencia de PCO 2 entre membranas es despreciable. Por lo tanto, referido a la concentración de CO 2 , se pueden considerar los diferentes compartimentos corporales como un único sistema abierto. El CO 2 se produce constantemente en los tejidos y es eliminado, al mismo ritmo de producción, por los pulmones. De esta forma, alteraciones en la ventilación dan lugar, de forma inmediata, a cambios significativos en la PCO 2 del plasma y, simultáneamente, en los demás fluidos corporales. Normalmente , las modificaciones en la producción de CO 2 se controlan mediante ajustes en la circulación y la respiración . II Revisión bibliográfica 76 B.1.2.3. Diferencia de iones fuertes La diferencia de iones fuertes o “stro n g ion differen ce” (SID) representa la diferencia de carga eléctrica neta entre todos los cationes y todos los aniones fácilmente disociables presentes en el organismo. 35 1 SID = (Na + + K + + Ca 2+ + Mg 2+ ) – (Cl - + otros aniones fácilmente disociables) El Na + y el Cl - representan la mayor parte de la carga iónica inorgánica en el fluido extracelular de los mamíferos. El K + y el SO 4 - también son iones fuertes, pero están presentes en mucha menor concentración que los anteriores. En algunas ocasiones, el Ca 2+ y e l Mg 2+ pueden actuar también como iones fuertes, pero su concentración es muy pequeña comparada con la de Na + y Cl - , por lo que, en condiciones normales, se pueden despreciar en el cálculo del SID. El ácido láctico tiene una constante de disociación del or den de 10 - 3 Eq/l; por lo tanto, el lactato puede comportarse como un ion orgánico fuerte en plasma o fluido extracelular. El lactato puede ser cuantitativamente significativo en determinadas circunstancias (por ejemplo, cuando se realiza ejercicio físico intenso). De forma práctica, en animales en los que la producción de lactato no está elevada, el valor de SID se puede calcular como: Na + + K + - Cl - . El SID está controlado primariamente en el plasma por el flujo iónico a través de las membranas, fun damentalmente en los túbulos renales y, en menor medida, en el intestino. En comparación con las variaciones de PCO 2 , los cambios en el SID suceden de forma más lenta. Los movimientos de iones fuertes entre los distintos fluidos corporales, que se realiz a n a través de las membranas, provocan cambios en el valor de SID, y estas variaciones del SID constituyen los principales mecanismos de interacción ácido - base entre los fluidos corporales. 480 Por lo tanto , la manipulación del SID, a través de i ntercambios iónicos II Revisión bibliográfica 77 t ransmembrana, sirve para mantener o establecer una diferente acidificación en dos fluidos separados por una membrana . El SID se puede cambiar en un compartimento transfiriendo de forma diferencial cationes o aniones fuertes (principalm ente el Cl - ) a través de las membranas. Por ejemplo, para producir ácido gástrico (pH ≅1) desde el fluido intersticial en la mucosa gástrica (pH ≅ 7.4) se debe transferir en exceso Cl - , junto con agua, a través de la membrana epitelial; esto crea un valor negativo de SID en el fluido secretado ( y al mismo tiempo, resulta en un valor positivo alto del SID en fluido gástrico intersticial y en el plasma sanguíneo que pasa por la mucosa gástrica, lo que se denomina alcalinización postprand ial). Los cambios d el SID plasmático producidos por los riñones y el intestino se tra n smitirán a los demás fluidos corporales mediante modificaciones apropiadas en el equilibrio de Donnan, ya que las membranas de los capilares son permeables a los iones fuertes pero no a las proteínas . En la regulación del pH intracelular también están involucradas las mismas consideraciones que he m os descrito anteriormente. El pH intracelular depende en gran medida del control del SID. En este control, el transporte activo a través de membranas, mediante bombas iónicas, se convierte en un elemento muy importante, ya que es en definitiva el mayor responsable del movimiento de moléculas químicas no reactivas: cationes y aniones fuertes entre los distintos compartimentos. De esta manera , la s concentración es intracelular es de H + , HCO 3 - , NH 4 + son variables dependientes que no se pueden modificar directamente por estas bombas, sino a través de cambios en el SID, la variable independiente. 175 En condiciones normales, lo s valores del SID del plasma y del fluido extracelular son positivos. Desviaciones en la concentración de los iones fuertes se traducirán en alteraciones del equilibrio ácido -base, así un aumento del SID produce alcalosis metabólica mientras que la reducci ón del SID da lugar a acidosis metabólica. II Revisión bibliográfica 78 Como puede apreciarse, en el análisis cuantitativo del estado ácido - base, la composición electrolítica del plasma desempeña un papel fundamental, puesto que a partir de ella puede determinase uno de los tres pará metros que se utilizan en dicho análisis (SID). 175,480 B.1.2.4. Concentración de ácidos débiles no volátiles Los ácidos débiles no volátiles más relevantes son: a) las proteínas plasmáticas, entre las que destaca la concentración de albúmina plasmática (Alb) ; y, b) la concentración total de f ósforo inorgánico (P) . 176,331, 42 6 , 42 7 En la práctica, la concentración de ácidos débiles no volátiles [At ] se puede calcular utilizando la siguiente expresión matemát ica: A t = Alb (1.23 pH - 6.31) + P (0.309 pH – 0.469) 10 30.97 La concentración plasmática de albúmina está determinada primariamente por la producción hepática; por lo tanto, de la buena funcionalidad de este órgano depende en gran medida que la [A t ] no varíe. Los niveles de P dependen de la absorción intestinal de fósforo y de su eliminación selectiva por el riñón, a través del tra n sporte activo en los túbulos. Estos procesos están funcionalmente orientados primariamente a mantener una conc entración de P constante en los fluidos extracelulares. 175,480 La [A t ] podría teóricamente sufrir variaciones por intercambios ácido - base entre los diferentes compartimentos corporales , sin embargo , estas variaciones tienen poca significac ión en el estado ácido - base porque las proteínas son macromoléculas que no pueden traspasar las membranas biológicas y, además, no se conoce ningún sistema biológico que pueda variar los niveles de P para regular el estado ácido - base de un compartimento c orporal. Por lo tanto, los cambios más significativos de la [A t ] tienen II Revisión bibliográfica 79 lugar en situaciones patológicas, normalmente relacionadas con disfunciones hepáticas. Para facilitar el entendimiento de este análisis cuantitativo del estado ácido - base haremos un resumen de las premisas fundamentales que lo diferencian del análisis tradicional: 175 ( Figura 11 ) 1) El análisis tradicional enfoca el estudio del estado ácido - base a partir del equilibrio de un único ácido, el ácido carbónico. El análisis cuantitativo, por el contrario, enfatiza la distinción de variables dependientes e independientes en un sistema abierto de soluciones iónicas, que son los distintos compartimentos corporales con sus distintos fluidos separados por membranas. En estos fluidos corporales las variables independientes son tres: PCO 2 , SID y [A t ]. Además, existen unas variables dependientes (concentración de hidroxilos, carbonato, bicarbonato y hidrogeniones) cuyos valores pueden determi narse a partir de las variables independientes por medio de una ecuación matemática. 2) Los movimientos de H + entre los fluidos no pueden afectar la [H + ] o pH de este fluido, solamente cambios en las variables independientes pueden hacerlo. Los fluidos c orporales interaccionan, a través de las membranas que los separan, primariamente por movimientos de iones fuertes, lo que altera el SID. 3) El balance ácido -base de un organismo puede ser entendido cuantitativamente en términos de sólo tres variables ind ependientes y de su regulación fisiológica llevada a cabo, fundamentalmente, por los pulmones, los riñones, el intestino y el hígado. II Revisión bibliográfica 80 Figura 11 : Esquema del análisis cuantitativo del estado ácido - base ( según Stewart 480 ) . Donde PCO 2 es la presión parcial de CO2, SID es la diferencia de iones fuertes y A TOT son los ácidos d ébiles no volátiles. PULMONES TEJIDOS Perfusión Metabolismo Transporte CO 2 SID Ventilación Perfusión CO 2 HIGADO Síntesis Degradación PROTEINAS RIÑONES Filtración Reabsorción Secreción SID INTESTINO Absorción Secreción SID PLASMA CIRCULANTE INDEPENDIENTE DEPENDIENTE PCO 2 [SID] [ A TOT ] [ HCO 3 - ] [ A - ] [ HA ] [ CO 3 2 - ] [ OH - ] [ H + ] ( pH ) BALANCE ACIDO - BASICOPULMONES TEJIDOS Perfusión Metabolismo Transporte CO 2 SID Ventilación Perfusión CO 2 HIGADO Síntesis Degradación PROTEINAS RIÑONES Filtración Reabsorción Secreción SID INTESTINO Absorción Secreción SID PLASMA CIRCULANTE INDEPENDIENTE DEPENDIENTE PCO 2 [SID] [ A TOT ] [ HCO 3 ] [ A ] [ HA ] [ CO 3 2 ] [ OH ] [ H + ] ( pH ) TEJIDOS Perfusión Metabolismo Transporte CO 2 SID TEJIDOS Perfusión Metabolismo Transporte CO 2 SID Ventilación Perfusión CO 2 Ventilación Perfusión CO 2 HIGADO Síntesis Degradación PROTEINAS HIGADO Síntesis Degradación PROTEINAS RIÑONES Filtración Reabsorción Secreción SID RIÑONES Filtración Reabsorción Secreción SID INTESTINO Absorción Secreción SID INTESTINO Absorción Secreción SID PLASMA CIRCULANTE INDEPENDIENTE DEPENDIENTE PCO 2 [SID] [ A TOT ] [ HCO 3 ] [ A ] [ HA ] [ CO 3 2 ] [ OH ] [ H + ] ( pH ) PLASMA CIRCULANTE INDEPENDIENTE DEPENDIENTE PCO 2 [SID] [ A TOT ] [ HCO 3 ] [ A ] [ HA ] [ CO 3 2 ] [ OH ] [ H + ] ( pH ) BALANCE ACIDO - BASICO II Revisión bibliográfica 81 B.2. ALTERACIONES DEL EQUILIBRIO ACIDO - BASE A pesar de que los mecanismos de regulación anteriormente descritos son muy eficientes en el control del equilibrio ácido - base, en determinadas circunstancias patológicas se producen alteraciones del pH del medio interno. B.2.1. AN A LISIS TRADICIONAL El pH del organismo puede elevarse, lo que se denomina alcalosis, o de scender lo que se conoce como acidosis. A su vez , ambas situaciones pueden deberse a trastornos respiratorios o metabólicos. Los trastornos de tipo respiratorio estarán relacionados con alteraciones en la eliminación de CO 2 por los pulmones y, por lo tanto , cursarán primariamente con cambios en el denominador de la ecuación de Henderson - Hasselbach (0.03 x PCO 2). Por el contrario, los procesos de tipo metabólico se refieren a alteraciones extrapulmonares que generalmente se relacionan con cambios primarios e n la concentración de bicarbonato, es decir afectando al numerador de la citada ecuación (HCO 3 -). Asimismo, pueden presentarse trastornos mixtos en los que se dan simultáneamente alteraciones respiratorias y metabólicas, con efectos aditivos o contrapuest os. 71,72,204,433 Las variaciones de HCO 3 - y de PCO 2 pueden ser primarias, cuando son las responsables directas del cambio del pH, o secundarias, cuando resultan de la actuación d e los mecanismos compensatorios. 519 Acidosis respiratoria Se produce por el aumento de la PCO 2 causada por la dificultad en la eliminación de dióxido de carbono, por problemas en la ventilación alveolar. Así , la producción de CO 2 supera de forma transitoria la excreción del mismo. El dióxido de carbono difunde a II Revisión bibliográfica 82 través del pulmón mucho más fácilmente que el oxígeno, de ahí , que en aquellas enfermedades en las que está comprometida la ventilación, normalmente , se produce antes hipoxemia que hiper capnia. Como consecuencia de la hipercapnia se reduce el cociente HCO 3 - / PCO 2 y, por consiguiente, disminu ye el pH. Generalmente, esta alteración tiende a compensarse mediante la retención renal de bicarbonato, con lo que se pretende reequilibrar el coc iente HCO 3 - / PCO 2. 142,401 Alcalosis respiratoria En este caso , debido a la hiperventilación, se produce una disminución de la PCO 2 . La hiperventilación puede estimularse por hipoxemia asociada a trastornos pulmonares, insuficiencia cardiaca, anemia o alteraciones neurológicas. Como consecuencia de la hipocapnia, se produce un aumento en el cociente HCO 3 - / PCO 2 lo que dará lugar a un incremento en el pH. La compensación renal en la alcalosis respiratoria consiste en un incremento en la excreci ón de bicarbonato. 142,324 Acidosis metabólica En los trastornos metabólicos se produce un cambio primario en la concentración de bicarbonato. En el caso de la acidosis, la concentración de bicarbonato disminuye, lo que puede ocurrir por tres mecanismos: a) Consumo excesivo de HCO 3 - , debido a que se combina con los H + de los ácidos que ingresan masivamente en el organismo, como ocurre en enfermos tratados con ácido salicílico ; o que se producen en el mismo, como sucede con los cuerpos cetónic os o el ácido láctico , en la cetoacidosis diabética y en el shock, respectivamente. 270,39 3 b) Eliminación de bicarbonato por vía digestiva, esto es lo que ocurre , por ejemplo , en las diarreas, ya que se pierden secreciones digestivas alcalin as. 265,308 II Revisión bibliográfica 83 c) Incapacidad del riñón para recuperar y/o regenerar el HCO 3 -, esto sucede en la insuficiencia renal, en las acidosis tubulares renales y en el hipoaldosteronismo. 188 En todas estas situaciones, decrece el cociente HCO 3 - / PCO 2 , con la consiguiente disminución del pH. En un proceso de acidosis metabólica se produce una respuesta fisiológica compensatoria de los sistemas org áni c os que dará lugar a una hiperventilación pulmonar, lo que se traduce en una disminución de l a PCO 2 . 324 Alcalosis metabólica La alcalosis metabólica cursa con un exceso de bicarbonato. Este proceso puede ocurrir por dos mecanismos: a) Aporte excesivo de HCO 3 - desde el exterior, en forma de bicarbonato sódico o de otras sustancias como el lactato o el citrato sódicos, que al metabolizarse generan bicarbonato. 236,282,303 b) Producción en exceso de HCO 3 - . Esto ocurre cuando se pierden fluidos digestivos de carácter ácido. La secreción de H + en el estómago va ligada al aporte de HCO 3 - al medio interno, por lo que si no se reponen los protones perdidos, el HCO 3 - generado queda libre. Esto se puede com plicar con hiperaldosteronismo, porque la aldosterona promueve la incorporación de HCO 3 - al medio interno al estimular directamente la retención de sodio en los túbulos, e indirectamente mediante la hipopotasemia resultante, que favorece también la acidificación urinaria . 251 Otra causa de exces iva producción de HCO 3 - sería el hiperaldosteronismo primario. Es importante tener en cuenta que la capacidad de eliminación renal del HCO 3 - sobrante es de tal magnitud que no es posible que se establezca una alcalosis a no ser que se trate de un proceso muy agudo o que existan unos factores asociados que limiten la excreción II Revisión bibliográfica 84 de bicarbonato, entre los que podemos incluir: hipovolemi a o hipopotasemia. 166, 265 ,308 - Hipovolemia. Ante la disyuntiva de mantener normal la [HCO 3 - ] o el volumen de sangre circulante, el organismo se inclina por esto último y , así , aumenta la reabsorción de Na + en el túbul o proximal, que arrastra el anión HCO 3 - . - Hipopotasemia. El bajo K + existente dentro de las células tubulares estimula la secreció n de hidrogeniones a la luz tubular, lo que promueve el ingreso de HCO 3 - al medio interno . Estos procesos tenderán a aumentar el cociente HCO 3 - /PCO 2 , con la consiguiente elevación del pH. La compensación respiratoria, que supondría hipoventilación para incrementar l a PCO 2 , generalmente, es pequeña, pudiendo incluso estar ausente. Trastornos mixtos Tienen lugar cuando se producen simultáneamente alteraciones de origen respiratorio y metabólico. Generalmente, estos trastornos son debidos a la actuación de los mecanismos compensadores (compensación respiratoria de un proceso metabólico y viceversa) y, en la mayoría de las ocasiones, dificultan el diagnóstico puesto que el pH del medio interno puede permanecer relativamente constante. Cuando, por el contrari o, tienen efectos aditivos, se producen graves modificaciones del pH del medio interno. B.2.2. AN A LISIS CUANTITATIVO Como ya hemos definido anteriormente , la homeostasis ácido - base, según este análisis, requiere la regulación de tres variables independ ientes que determinan el estado ácido - base (SID, PCO 2 y A t ). SID y PCO 2 son regulados por los riñones y el sistema respiratorio, respectivamente. La concentración plasmática de ácidos débiles no volátiles II Revisión bibliográfica 85 [A t ], que tienen una influencia importante en el estado ácido - base, no se regula por propósitos directamente relacionados con la homeostasis ácido - base. Las alteraciones ácido - base primarias surgen de los cambios de una o más variables independientes , pu d iendo estar presente más de una alteración primaria, con efectos aditivos o contrarios. 480 Por otro lado , las alteraciones secundarias o compensatorias del equilibrio ácido - base se producen como respuesta del sistema homeostático a los cambios del SID o la PCO 2 . Si se produce una alteración primaria en una de estas dos variables, normalmente se dará al mismo tiempo un cambio compensatorio en la otra variable. Por ejemplo: en respuesta a alteraciones primarias de el SID se da una compensación res piratoria regulada (cambio en la PCO 2 ); por el contrario , si lo que se altera de forma primaria es la PCO 2 sucede n cambios compensatorios controlados por el riñón (cambio en la concentración de Cl - , lo que produce un cambio en el SID). 480 La [A t ] generalmente no se regula de forma compensatoria , incluso se ha observado que en respuesta a una alcalosis provocada por una hipoproteinemia crónica primaria (reducción del valor de A t ) no se produce ni una compensación renal ni respiratoria, sino que , paradójicamente, se produce una hiperventilación ( descenso de la PCO 2 ) . 42 7 L a s alteraciones ácido - base, según el análisis cuantita tivo , se clasifican en acidosis y alcalosis respiratorias y no respiratorias (“metabólicas”), lo cual difiere en ciertos matices respecto de la clasificación tradicional. Acidosis y alcalosis respiratorias Este tipo de alteraciones resulta de las modifi caciones en la variable independiente PCO 2 , que puede estar anormalmente elevada (acidosis) o disminuida (alcalosis). Su base patogénica está relacionada directamente con la relación entre la producción tisular de II Revisión bibliográfica 86 CO 2 y la ventilación alveolar. En estas a lteraciones del equilibrio ácido base, la interpretación según el análisis cuantitativo es muy similar a la del análisis tradicional. Acidosis y alcalosis no respiratorias (“metabólicas”) Estos d esequilibrios del estado ácido - base son consecuen cia de las variaciones anormales de una o de las dos variables independientes restantes, es decir de los cambios en el SID, en la [At ], o en ambos simultáneamente. A nivel práctico, las alteraciones de la [At ] pueden deberse a cambios en la concentra ción de Pi o de la albúmina. La hiperfosfatemia que se da en una insuficiencia renal crónica, es un factor importante en el estado de acidosis que se desarrolla en esta enfermedad. La hipofosfatemia, por el contrario, no suele producir una alcalosis detect able, ya que la concentración normal de fosfato es sólo de 1mM. 175 En cuanto a la albúmina, la hipoalbuminemia puede causar alcalosis no respiratoria (metabólica), en situaciones patológicas de cirrosis hepática, síndrome nefrótico y malnutrición. 331, 42 6 La hiperproteinemia, como consecuencia de hemoconcentración, ha sido descrita como un factor importante en el desarrollo de la acidosis metabólica que produce en enfermos con cólera. 50 5 Si analizamos la influencia de los cambios del SID en el estado ácido - base, podemos decir que, en general, un descenso del SID produce acidosis metabólica, mientras que el incremento de esta variable causa alcalosis metabólica. Existen dos mecanismos gen erales por los que el valor del SID puede modificarse: El primero de estos mecanismos se entiende como cambios en el contenido de agua del plasma, es decir , la concentración de los iones fuertes en el plasma cambia cuando se modifica la canti dad de solvente, aunque no varíe la cantidad relativa de los solutos. Así , cuando aumenta la cantidad de agua del plasma (en intoxicaciones acuosas) o cuando se II Revisión bibliográfica 87 pierde agua del plasma (en déficits aislados de agua, sin pérdida de electr ó litos) , los cation es y aniones fuertes se diluirán o concentrarán en igual proporción, produciendo el correspondiente descenso o aumento del SID. Las alteraciones metabólicas resultantes son “acidosis dilucional” y “alcalosis concentracional”. 174 El segundo de los mecanismos implicados en los cambios del SID está basado en un desequilibrio de los iones fuertes, que puede afectar a los cationes, a los aniones, o a ambos. Con respecto a los cationes, la concentración de Na + no variará apreciablemente en tanto en cuanto la osmorregulación permanezca intacta y no existan procesos patológicos que conlleven una p érdida importante de este ion, como sucede en las alteraciones gastrointestinales que cursan con diarrea, o en l a insuficiencia renal pierde sal. C uando exis ten estas pérdidas anormales de Na + , se produciría un descenso del SID y , consecuentemente, un estado de acidosis metabólica. O tros cationes: K + , Mg 2+ y Ca 2+ están regulados de forma estricta con fines distintos a la regulación del estado ácido - base . P or lo tanto , la concentración de estos cationes no está sujeta a variaciones lo suficientemente grandes como para que produzcan cambios importantes en el SID. C uando la concentración de Na + está entre los límites normales, los cambio s del SID van a surgir de las desviaciones en la suma de la concentración de los aniones fuertes. Esta variación en la concentración de los aniones fuertes la analizamos a continuación. El SID se reduce, dando como resultado una acidosis, si la concentración de Cl - es anormalmente elevada, lo que resultaría en una acidosis hiperclorémica. También descendería el valor del SID si se acumulan en el plasma los “aniones no identificados” o no medidos habitualmente , entre los q ue podemos destacar: el lactato y los cetoácidos (productos ácidos del metabolismo); el sulfato y otros aniones fuertes que se acumulan en el fallo renal; y sustancias ácidas exógenas como el salicilato. 175 En el sentido contrario, para producir una alcalosis, por una elevación del SID, la concentración de Cl - debe descender anormalmente. Las alteraciones a la baja de la concentración de Cl - serían el único factor que podría determinar una alcalosis significativa, ya que el descenso en la II Revisión bibliográfica 88 concent ración de los demás aniones fuertes, que existen normalmente en el plasma, no podrían producir un efecto alcalinizante importante. Por lo tanto , en condiciones osmóticas normales del plasma, es decir , con una concentración normal de Na + , la aparición de un a alcalosis metabólica debida a cambios iónicos sólo p uede ser consecuencia de deficiencias de cloro. 175 II Revisión bibliográfica 89 C. RELACION ENTRE EL METABOLISMO MINERAL Y EL ESTADO ACIDO - BASE C.1. LA PTH Y EL EQUILIBRIO ACIDO - BASE La relación entre PTH y equilibrio ácido - base no se conoce con exactitud. Como ya se dijo, d esde un punto de vista filogenético, se ha propuesto que las glándulas paratiroides podrían haber tenido un papel importante en la homeostasis ácido - base y que, post eriormente, habrían evolucionado hacia la regulación del metabolismo mineral. 521 Lo que s í parece claro es que el mantenimiento de un ambiente ácido - básico estable en los mamíferos depende de la capacidad de neutralización y de excreción del exceso de carga ácida . El hueso participa de forma activa en la neutralización de cargas ácidas , proporcionando un gran reservorio de sustancias buffer, como el carbonato, que pueden ser movilizadas por re s orción ósea. Por lo tanto, la PTH, que es un potente agente estimulador de la re sorción ósea, puede ser considerada como un factor regulador del balance ácido - básico. Además, esta hormona puede modificar la acidificación urinaria mediante efectos directos sobr e distintos segmentos de la nefrona o también con acciones indirectas , a través de sus efectos sobre los niveles de calcio y de fósforo. 482 C.1.1. PTH Y ACIDIFICACION URINARIA La PTH participa en la acidificación urinaria por varios mecanismos. Aislar los efectos directos de la PTH sobre la acidificación urinaria resulta complejo, debido a los efectos indirectos que ejerce esta hormona en el riñón, a través de los cambios en calcitriol, calcio y fósforo. En numerosos estudios clínicos 22,346,347 ,416 realizados en pacientes que sufrían hiperparatiroidismo primario o secundario se ha encontrado un estado de acidosis metabólica hiperclorémica. Este hecho ha llevado a plantear una relación ca usal entre el II Revisión bibliográfica 90 exceso de PTH y la acidosis. La fisiopatología de la acidosis que desarrollan los pacientes hiperparatiroideos se ha explicado argumentando que la PTH inhibe la reabsorción de bicarbonato en el túbulo proximal. 21,269, 346,347, 349,403 Otros autores, sin embargo , han observado que los pacientes con hiperparatiroidismo no muestran de forma unifome acidosis metabólica, por lo que han minimizado el papel de la PTH en la regulación del equilibrio ácido - base. 134 Por otro lado, algunos trabajos realizados en animales de experimentación 30,229,255,369,403 que recibieron dosis elevadas de PTH confirmaron los efecto s inhibitorios de la PTH sobre la acidificación urinaria a nivel proximal de la nefrona. No obstante, los efectos de la PTH sobre la excreción urinaria de bicarbonato son variables y difieren mucho entre distintas especies. Algunos autores han descrito un aumento en la excreción urinaria de bicarbonato en perros que recibían PTH . 255,403 Otros, trabajando con ratas, han encontrado un incremento en la reabsorción de bicarbonato en los túbulos renales tras la administración de PTH . 52 Finalmente, también existen trabajos en los que no se encuentra modificación alguna en la excreción de bicarbonato tras la adiministración de PTH . 30 Parte de la variabilidad en los resultados experimentales puede ser debida a las modificaciones q ue se producen en el GFR de los animales durante los estudios, relacionadas probablemente con las propiedades vasodilatadoras de la PTH. En cuanto a los trabajos que estudian la acidificación a nivel distal de la nefrona producida por la administración d e PTH, también muestran cierta variación en sus observaciones: algunos autores no encuentran modificaciones , 21 mientras que otros observan un incremento de la acidificación y de la excreción de amonio tras la administración de PTH. 30,51 ,525 Se ha demostrado que la PTH induce un aumento en la excreción distal de fosfato que promueve la acidificación urinaria , al actuar como sustancia buffer no reabsor b ible, que es capaz de aceptar iones H + , lo que favore ce la reabsorción de bicarbonato a este nivel. 51,382 La acidificación distal puede, por tanto, modificarse en función de la fosfaturia. La importancia de los niveles de fosfato para la II Revisión bibliográfica 91 excreción y neutralización de sustancias ácidas a nivel renal ha sido descrit a ampliamente, y se pone de manifiesto en numerosos trabajos en los que se estudian las consecuencias de una depleción de fósforo 24,162,206,252,283 y las que se producen tras la administración de fosfato a individuos con función renal normal . 274 En los primeros, es constante la aparición de acidosis metabólica; de forma inversa, la sobrecarga de fósforo genera y mantiene una alcalosis metabólica. En estudios recientes de Jara et al ., 2 4 9 realizados en ratas azotémicas que sufrían acidosis metabólica, mantenidas con una dieta alta en fósforo, se ha observado que la sobrecarga de fósforo a nivel renal les protegía de los efectos nocivos de la acidosis. Estos y otros hallazgo s anteriormente citados, ponen de manifiesto la importancia del fosfato como buffer a nivel renal cuando se produce una sobrecarga de ácidos. E sto puede resultar contradictorio con la idea de que l a retención de f ósforo , como ácido d é bil que es, contribu ye al desarrollo de acidosis me tabólica en los enfermos renales ; sin embargo, se debe puntu a lizar que el aporte de grandes cantidades de f ósforo en forma de sales en la dieta implica el ingreso de cationes fuertes asociados a este elemento, que act ú an increm entando el SID, de ah í su efecto alcalinizante. Por otro lado, a la hora de analizar y discutir el efecto que la PTH pueda tener sobre los mecanismos renales de acidificación urinaria y reabsorción de bicarbonato, hay que tener en cuenta la importante contribución del balance calcio - fósforo sobre la excreción renal de ácidos y, por lo tanto, sobre el equilibrio ácido - base. Este hecho se observa claramente en modelos animales y humanos con un exceso de PTH. Diferentes estudios en ratas, perros y humanos, a los que se les administraba un exceso de PTH de forma prolongada, demuestran que estos individuos desarrollan un estado de alcalosis metabólica, además de presentar hipercalcemia, hipofosfatemia, hipercalciuria e hiperfosfaturia. 30, 244,245,246, 299 ,338 La contribución del riñón al mantenimiento de esta alcalosis metabólica parece mediada por distintos mecanismos según la especie estudiada: en los humanos el principal factor es un descenso en la excreción de II Revisión bibliográfica 92 bicarbonato, mientras que en los perros se debe en mayor medida a la elevada fosfaturia. 482 Al mismo tiempo, conviene resaltar que la hipercalcemia, que se produce como consecuencia del exceso de PTH, tiene efectos sobre la acidificación urinaria independientes de la PTH. En estudios rea lizados en perros, se demuestra que la hipercalcemia por si sola potencia la reabsorción proximal de bicarbonato, en presencia o ausencia de PTH. 2 2 , 144 El efecto del calcio sobre la acidificación urinaria se explica por acciones directas, en la células de los túbulos , o indirectas, a través de alteraciones hemodinámicas en el flujo renal. 482,525 En resumen, la PTH claramente puede influir sobre la acidificación urinaria actuando en diferentes puntos de la nefrona, tant o por mecanismos directos como por sus efectos sobre el calcio y fósforo. C.1.2. PTH Y BUF F ER S EXTRARRENALES Numerosas enfermedades en las que está potenciada la re sorción ósea, tales como hipercalcemia neoplásica, hiperparatiroidismo e hiperv itaminosis D, están asociadas con un estado de alcalosis metabólica, que se origina debido a la liberación de sustancias alcalinas desde el hueso. 25, 38, 185, 227,244 ,29 5 La acidosis metabólica crónica determina u na mayor disolución del hueso, el cual va a proporcionar una fuente importante de sustancias b uf fer s . 29 4 L a re sorción ósea mediada por la acidosis metabólica es independiente de la PTH . Por otro lado , se ha observado que la PTH también puede potenciar la capacidad de b ú fer extrarrenal a través de su acción resort iva sobre el hueso . 438 Esto se comprobó en estudios in vivo que utilizaban animales nefrectomizados y tiro paratiroidectomizados (TPX) a los cuales se les infundían sustancias ácidas , de manera , que los animales que re cibi eron dosis farmacológicas de PTH antes de la infusión de ácidos presentaban una menor tasa de mortalidad que los animales que no recibieron la PTH. 185 Este aumento en la capacidad de neutralización de II Revisión bibliográfica 93 sustancias ácidas fuera del riñón se observ ó también en animales intactos cuando se estimulaba la secreción de PTH endógena ; bien , mediante infusión de sustancia s como el EDTA o la colchicina ; o bien , provocando un hiperparatiroidismo secundario a insuficiencia renal crónica. 23 O tros autores , como Madias et al ., 313 ponen en duda el papel de la PTH , tanto endógena como exógena , en la capacidad buffer de un individuo expuesto a una carga aguda de ácidos, ya que no encontraron diferencias entre animales intac tos y animales TPX suplementado s con hormona tiroidea y calcio, sometidos a una sobrecarga de ácidos. En estudios posteriores se ha profundizado más sobre las acciones de la PTH en el hueso. Actualmente , se conoce que la hormona paratiroidea promueve la re sorción ósea mediada por célula s. De esta manera , al mismo tiempo que produce una salida de calcio desde el hueso, se liberan los aniones que están unidos a este ion en la fase mineral del hueso, como son el fosfato y carbonato, que pueden actuar como tampones de los iones de H + . 502 También se ha demostrado que la PTH promueve la desmineralización ósea estimulando los osteoclastos, que van a segregar ácidos al microambiente que existe entre la membrana de estas células y la superficie mineral ósea. 17,32,33,55, 498 Por último, es importante destacar algunos trabajos, tanto in vitro como in vivo , que han evidenciado que la acidosis y la PTH tienen efectos sinérgicos sobre el hueso, potenciando sus efectos desmineralizantes. Así , se ha observado que la activ idad de los osteoclastos, determinada por su enzima β- glucuronidasa, se eleva por la acción de la acidosis y del exceso de PTH , pero aún más cuando se combina n los dos factores. 40,111 Por lo tanto , a través de t oda la bibliografía que existe al respecto, al margen de que aparezcan determinados hallazgos contradictorios sobre la acciones de la PTH en el control del estado ácido - base, parece claro que la PTH emerge como un componente más de todo el sistema multifa ctorial que en los mamíferos se encarga de mantener el equilibrio ácido - base. 247, 438,482 II Revisión bibliográfica 94 C.2. HIPERPARATIROIDISMO RENAL SECUNDARIO (HPTH2) C.2.1. INSUFICIENCIA RENAL CRONICA E HPTH2 La asociación existente entre insuficiencia renal, alteraciones óseas e hiperplasia de las glándulas paratiroides se conoce en medicina humana desde hace más de 50 años. 8, 383 El esclarecimiento de los factores implicados en el inicio y mantenimiento de esta alteración de las glándulas paratiroides no sólo tiene interés fisiopatológico, sino que además puede ser muy útil para abordar un tratamiento racional de las complicaciones de la insuficiencia renal. La hiperplasia de las glándulas paratiroides, que se acompaña de elevad os niveles plasmáticos de PTH, es una de las primeras alteraciones que se producen en el metabolismo mineral cuando disminuye la función renal. Este proceso da lugar a un incremento en la secreción basal de PTH y a una respuesta exagerada de las glándulas paratiroides a la hipocalcemia. 302 En la insuficiencia renal se dan una serie de factores que contribuyen a alterar la secreción de PTH, entre los que destacan: hipocalcemia, retención de fósforo, descenso de los niveles de calcitriol, alteraciones funcionales de las glándulas paratiroides y resistencia del hueso a la acción de la PTH. 323 Todos estos factores no actúan de forma aislada, sino que están interrelacionados. A continuación, vamos a describir la forma en que interviene cada uno de ellos en el desarrollo del hiperparatiroidismo renal secundario (HPTH2). Hipocalcemia Una disminución en los niveles de calcio extracelular es la alteración más común en el curso de la insuficiencia renal y tiene origen multifactorial: se v e influida por la ret e nción II Revisión bibliográfica 95 de fósforo, por la disminución de calcitriol y por el aumento en la resistencia esquelética a la acción de la PTH. La retención de fósforo conduce a hiperfosfatemia que va a resultar en la formación de complejos minerales con e l calcio ; por lo tanto , la hipocalcemia puede producirse por la deposición de estos complejos minerales en los tejidos blandos y/o hueso , aunque esta circunstancia es poco relevante al comienzo de l desarrollo del hiperparatiroidismo renal . Dado que la pri ncipal acción del calcitriol es la de favorecer la absorción intestinal de calcio, si los niveles de calcitriol disminuyen progresivamente, la absorción intestinal de calcio se va a ver reduci da a medida que progresa la enfermedad renal. Este descenso de la absorción intestinal de calcio contribu ye a la aparición de hipocalcemia. Una causa adicional de hipocalcemia, en pacientes con insuficiencia renal, es la resistencia esquelética a l a acción de PTH, que se define como una alteración en la respuesta del hueso a la acción calcemiante de la PTH. Así , en individuos con IRC , existe dificultad para extraer calcio del hueso, lo que puede contribuir a un estado de hipocalcemia. Como ya se ha señalado, la disminución en los niveles de Ca 2 + extracelular es el principal factor estimulante de la secreción de PTH. 323 Retención de fosfato El incremento de los nive les de fosfato sérico es uno de los signos que aparecen más precozmente en el desarrollo de la insuficiencia renal, ya que los riñones enfermos tienen disminuida su capacidad para excretar fósforo. 464,465 La hiperfosfatemia produce un descenso en los niveles de calcio, por disminución en la movilización ósea de Ca 2 + , por inhibición de la síntesis de calcitriol y también, por la formación de complejos que se depositan en los tejidos blandos. Ambos factores unidos, hipocalcemia e hiperfosfatemia , producen un aumento en la secreción de PTH, orientado a restablecer los valores séricos normales de estos iones. Por tanto, la homeostasis de este nuevo estado de equilibrio se consigue a expensas de mantener unos elevados niveles de PTH. 32 3 Para confirmar la influencia de la retención de fósforo en el desarrollo del HPTH2 se han II Revisión bibliográfica 96 realizado experiencias en perros con insuficiencia renal, comprobándose que al restringirles el aporte de P en la dieta se previene el desarrollo de HPTH2. 4 37 Resultados similares se han obtenido en enfermos humanos . 302 Los mecanismos por los que la hiperfosfatemia puede favorecer el desarrollo del HPTH2 son complejos. Clásicamente, se ha considerado que la hiperfosfatemia es timula la secreción de PTH por dos efectos indirectos: inducción de hipocalcemia y descenso de los niveles de calcitriol. En personas sanas, se ha demostrado que un incremento en los niveles séricos de P determina una disminución en la concentración de ca lcio sérico y un aumento en la secreción de PTH. 412 Sin embargo, no está muy claro que en una insuficiencia renal temprana los niveles de P estén lo suficientemente elevados como para producir un descenso de la calcemia. 396,522 Por otra parte , no todos los pacientes con insuficiencia renal presentan hipocalcemia, aunque la tendencia sea ésta en la mayoría de ellos. 302 Además, en perros con uremia a los cuales se les han normalizado los niveles de calcio, se ha observado que la PTH sigue aumentada; 306 por lo tanto, la hipocalcemia pudiera no ser esencial para el desarrollo de un HPTH2. Los efectos beneficiosos de la restricción de fósforo en la dieta observados en pacientes con IRC parecen estar relacionados con el aumento d e calcit r iol. 306,307 Conviene recordar que el P es un factor fundamental en la regulación de la síntesis de calcitriol, y que la retención de fosfato en la insuficiencia renal conduce a una disminución en la producción de 1,25 dihidroxicolecalcifero l, al inhibir la actividad de la enzima 1 α hidroxilasa renal. 490 Recientemen te, se ha demostrado in vitro e in vivo , que la hiperfosfatemia tiene un efecto estimulante directo sobre la secreción de PTH, independientemente de los factores considerados anteriormente. 10,11,163, 186 Lo que pone de manifie sto la importancia que tiene el control del P en la insuficiencia renal para prevenir el desarrollo del HPTH2. II Revisión bibliográfica 97 Descenso en la síntesis de calcitriol El riñón interviene de forma decisiva en la síntesis de calcitriol . P or lo tanto, los problemas renales suelen conllevar déficits en la producción de esta sustancia. La deficiencia de calcitriol, por su parte, contribuirá al desarrollo del HPTH2. 323 En pacientes con insuficiencia renal, se ha observado que la producción de calcitriol desciende cuan do el filtrado glomerular disminuye por debajo de 50 ml/min. La disminución en la producción de calcitriol está directamente relacionada con la pérdida de masa renal funcionante. En los individuos con insuficiencia renal existen otros factores que influyen sobre la producción de calcitriol. Así, los niveles elevados de PTH que presentan estos pacientes favorecen la síntesis de calcitriol. Por otra parte, la retención de P, la acidosis metabólica y otros facto res plasmáticos derivados de la uremia, actúan, todos ellos, inhibiendo la enzima 1 α hidroxilasa renal. 241 A medida que avanza el trastorno renal, se va reduciendo progresivamente el parénquima renal y, por tanto, cada vez se produce menos calcitr iol. Por ello, hay que considerar el déficit de esta vitamina como uno de los factores principales en el desarrollo del HPTH2. 323 Resistencia del esqueleto a la acción de la PTH Se ha demostrado que el incremento de calcio sérico, como respuesta a la infusión de PTH, es proporcionalmente menor en pacientes con fallo renal que en individuos sanos. 168,327 Además , la recuperación de los niveles de calcio extracelular desde una situación de hipocalcemia está retrasada en aqu e llos con respecto a éstos, a pesar de que los pacientes con insuficiencia re nal presentan niveles más elevados de PTH. 473 Estos hechos demuestran que en situaciones de uremia existe una menor respuesta del esqueleto a la acción de la PTH. 473 La resistencia esquelética de la PTH parece deberse a II Revisión bibliográfica 98 una desensibilizació n (“ down regulation ”) en el sistema de receptores de la PTH y de la adenilato ciclasa en el hueso, como resultado a la exposición continuada a altos niveles de PTH , 376,377 aunque existe un estudio donde se demuestra que la uremia per se determin a una resistencia del esqueleto a la acci ón de la PTH , sin que existan niveles elevados de esta hormona . 42 Asimismo, la hiperfosfatemia , el descenso de C TR , y la acidosis metabólica que suelen presentar estos pacientes desempeñan u n papel importante en este fenómeno. 4 1 8,474 Alteraciones propias de las glándulas paratiroides En la insuficiencia renal concurren muchos factores (hipocalcemia, hiperfosfatemia, déficit de calcitriol, etc.) que directa e indirectamente, pro ducen un aumento en la secreción de PTH. En estos enfermos parece que existen, además, cambios en las células que van a alterar la respuesta glandular . En células hiperplásicas de paratiroides se ha observado un aumento del set - point de la curva PTH - Ca, l o que se traduce en la necesidad de una mayor concentración de Ca para hacer descender la secreción de PTH. 41 E sta elevación en el set - point puede estar relacionada con cambios en el contenido celular de receptores de calcio (CaR) . 205 El calcitriol tiene efectos inhibitorios en la tra n scripción del gen de la PTH. Parece ser que el descenso de calcitriol influye también de forma directa e indirecta en las alteraciones de las células paratiroide a s. Los efectos directos consisten en la disminución de su acci ón inhibitoria sobre la tra n scripción del gen de la PTH. 323 Además, los animales con fallo renal crónico tienen un menor número de receptores de calcitriol (VDR) en las glándulas paratiroides. 270 La densidad de VDR en las glándulas paratiroides está contr olada por los niveles de calcitriol. Se ha observado que en pacientes con insuficiencia renal tratados con vitamina D se produce un aumento de estos receptores. 270 II Revisión bibliográfica 99 El calcitriol también actúa como sustancia reguladora del crecimiento celular en las glánd ulas paratiroides: bajos niveles de calcitriol inducen proliferación celular ; inversamente, la administración de calcitriol puede suprimir esta hiperplasia. 169 Todas estas anomalías en la función de las glándulas paratiroides, como consecuencia de la dis minución en el nivel de calcitriol, contribuyen a la generación y al mantenimeinto del hiperparatiroidismo en el curso de la insuficiencia renal. C.2.2. ACIDOSIS METABOLICA Y H PTH2 Entre las alteraciones más frecuentes y d e mayor significación clínica que suceden en el hiperparatiroidismo renal secundario están los problemas óseos (osteodistrofia renal). Para comprender la génesis de estas alteraciones óseas es importante conocer con detalle el importante papel que desarrol la el hueso en la homeostasis mineral. C.2.2.1. El hueso y la homeostasis mineral El esqueleto no sólo soporta la estructura física de los animales , sino que tiene un papel muy importante en el mantenimiento de la homeostasis de los dif erentes iones. El hueso contiene una fase mineral y una fase orgánica. La fase mineral está constituida por cristales de hidroxiapatita (Ca 10 (PO 4 ) 6 OH 2 ) ( más del 99% del calcio y el 80% del carbonato del cuerpo están integrados en la fase mine ral del hueso ) . La parte orgánica del hueso contiene una matriz no mineralizada y las células óseas. La matriz no mineralizada está formada principalmente por colágeno tipo - 1 y otras proteínas como la osteocalcina y la osteonectina. Por otra part e , existen tres tipos de células óseas: osteoblastos, osteoclastos y osteocitos. Los osteoblastos sintetizan la matriz orgánica (osteoide) y tienen receptores para la PTH y el calcitriol . Los osteoblastos que dejan de segregar la matriz orgánica y quedan inmersos en la fase mineral se denominan osteocitos. Por último , están los osteoclastos que reabsorben el mineral óseo mediante la II Revisión bibliográfica 100 secreción de hidrogeniones en el microambiente situado entre la célula y la fase mineral. La comu nicación y coordinación entre la función formadora de los osteoblastos y la reabsortiva de los osteoclastos resulta en un remodelado activo del hueso ( “turnover” ) del 10 al 15 % del esquleto cada año. Este proceso normal de “turnover” es necesario para la reparación de microfracturas y para evitar que se transformen en fracturas de mayor significación clínica. 112 El calcio, el fósforo, la PTH y el calcitriol constituyen un eje de suma importanc ia en la actividad normal del hueso. El calcitriol puede estimular la formación y/o re sorción del hueso , dependiendo del contenido iónico del ambiente. La PTH moviliza el calcio del hueso estimulando la re sorción ósea llevada a cabo por los osteoclasto s e incrementando la secreción de calcitriol. Por otro lado, la elevación en los niveles de calcio y fósforo plasmáticos , y especialmente del producto Ca x P, puede incrementar la mineralización ósea, además de inducir mineralización en tejidos blandos. Es importante también destacar que un incremento en la concentración de H + en el microambiente existente entre los osteoclastos y la fase mineral del hueso estimula directamente la disolución fisicoquímica del hueso, así como la re sorción mineral mediada por estas células. 112 C.2.2.2. Osteodistrofia renal Un fallo renal alterará, en diversos aspectos, el complejo mecanismo homeostático que controla la actividad ósea. Las alteraciones que más influyen sobre el hueso son: descenso en la producción d e calcitriol y retención de fosfato e hidrogeniones. Las dos primeras, además, darán lugar a una disminución en la concentración de calcio y a una elevación de la PTH. Estos desequilibrios iónicos y hormonales van a determinar alteraciones en la formac ión ósea y en los procesos de disolución fisicoquímica y de re sorción mineral mediada por células. Como consecuencia de ello, se producirán una serie de modificaciones en la composición y estructura del hueso , que se agrupan de forma general bajo el nomb re de osteodistrofia renal. 112 II Revisión bibliográfica 101 Hay dos tipos principales de alteraciones óseas en la fase final de la insuficiencia renal: enfermedades de alto remodelado, fundamentalmente osteitis fibrosa, y enfermedades de bajo remodelado, entre las que destacan la osteomalacia y el hueso adinámico o aplásico. 132, 213, 452 En la osteitis fibrosa está incrementado el número y el tamaño de los osteoclastos y osteoblastos , determinando la aparición de profundas lagunas de re sorción ósea, y la deposición d el colágeno es menos ordenada , aparec iendo fibrosis . La osteomalacia se caracteriza por una disminución del número de células óseas y un a deficiente mineralización ósea, siendo el ritmo de mineralización proporcionalmente inferior al ritmo de la síntesis d e colágeno, produciéndose en consecuencia un acúmulo de materia osteoide no mineralizada, con amplias uniones de osteoide. En la osteodistrofia renal aplásica o adinámica también desciende el número de células óseas y se produce una reducción similar , ta nto en el ritmo de mineralización , como en la síntesis de colágeno, por lo que no existe un acúmulo de materia oste o ide . La osteodistrofia renal de alto remodelado se debe principalmente a los elevados niveles séricos de PTH que se producen por el descenso de la función renal. 112 Por otra parte las alteraciones óseas de bajo remodelado en la insuficiencia renal se asocian a diversos factores. La osteo malacia se ha relacionad o estrechamente con la toxicidad del aluminio. El aluminio ha sido utilizado durante mucho tiempo en estos pacientes como quelante del fóforo. El aluminio se deposita en el frente de mineralización afectando negativame nte a la mineralización ósea. 9,211,235, 290, 317,380,389,394 Además , el aluminio parece reducir el número y la actividad de los osteoblastos, determinando un descenso en la formación ósea y aumentando la re sorción ósea que producen los osteoclast os. Finalmente , en la osteomalacia existe una disminución de PTH . 112,212,477,478 Las enfermedades de hueso adinámico vienen condicionadas por la reducción relativa de los niveles de PTH que existe en algunos pacientes con insuficienc ia renal . En estos enfermos , el descenso de PTH puede ser debido a : la avanzada edad, diabetes y/o excesivo aporte de calcio. E n estos individuos, e l aporte de II Revisión bibliográfica 102 calcio a través de fuentes exógenas puede hacer descender la concentración de PTH hasta niveles que son inadecuados para mantener un remodelado óseo normal. C.2.2 .3. Efecto de la acidosis sobre el hueso En un individuo adulto el metabolismo diario de las proteínas genera aproximadamente 1 mEq de hidrogeniones /kg de peso vivo . Estos iones de hidrógeno deben ser excretados, primariamente a través del riñón, para mantener el equilibrio ácido - base. 113 Cuando existe una insuficiencia renal se imposibilita la eliminación de los ácidos producidos diariamente. En este caso, para evitar que se produzca una variación significativa del pH, van actuar los sistemas tampón del hueso y de los tejidos blandos reteniendo estos iones H + . El acúmulo progresivo de H + inducirá la liberación de calcio desde la fase mineral del hueso, por fenómenos fisicoquímicos y por mecanismos mediados por células. 99,107,294,29 5,297 ,442 De este modo , la disfunción progresiva del riñón, antes de la instauración de una terapia adecuada, estará acompañada por una producción continuada de ácidos con inadecuada excreción neta de ellos, resultando en una sustancial acide mia. Una vez instaurada una terapia renal sustitutiva, bien sea por diálisis peritoneal o hemodiálisis, se van a paliar favorablemente est a s alteraciones del equilibrio ácido - base, pero es importante destacar que en ambas formas de diálisis, los niveles de bicarbonato y pH estarán generalmente por debajo de los niveles fisiológicos al inicio de cada sesión . Esto es indicativo de la existencia de una acidosis metabólica. 91,318 A continuación, resumire mos los hallazgos encontrados en numerosos estudios in vivo y , sobre todo , in vitro , realizados para determinar el efecto de una acidosis aguda y crónica sobre el hueso. Acidosis Aguda II Revisión bibliográfica 103 Cuando se infunde una solución de ácido inorgánico a animales nefrec tomizados, el calcio sérico se incrementa rápidamente. 276 Si consideramos que hueso contiene el 99% del calcio total del cuerpo , 512,513 este hecho implica que hay una disolución del mineral óseo. Usando cultivos de hueso de rato nes neonatos se observó que un descenso en el pH del medio producía una disolución del mineral óseo con la liberación de calcio al medio en un periodo de 3 horas. De forma inversa, cuando el medio era alcalino, existía un flujo de calcio desde el medio hac ia el interior de hueso. Finalmente , no se encontra ron cambios en el flujo de calcio cuando el pH del medio era igual al fisiológico. 93,94 Los mecanismos por los cuales los iones hidrógeno inducen una liberación de calcio desde el hueso , en un corto espacio de tiempo , pueden estar mediados por la disolución fisicoquímica directa del calcio o por estimulación de re sorción ósea mediada por osteoclastos. Ambos mecanismos han sido demostrados en sendos trabajos realizados por Bushinsky et al . 94,110 utilizando cultivos óseos in vitro . Estos mismos autores demostraron el papel fundamental del carbonato óseo en la disolución mineral mediada por protones, al observar, en estudios in vitro , una relación inversa entre la sal ida de calcio desde el hueso y la concentración de bicarbonato del medio. 96, 105 De este modo, existen evidencias de que el hueso puede responder en un lapso de 3 horas a un descenso de pH en el rango que pre sentan tanto los pacientes con una insuficiencia renal progresiva como los enfermos renales dializados entre las sesiones de diálisis . Pero el hueso no sólo responde a la acidemia liberando calcio, sino que funciona también como u n tampón de H + ayudando a restaurar el pH hacia el rango fisiológico. Hace más de 40 años que Swan y Pitts demostraron que aproximadamente el 60% de los H + administrados por la infusión aguda de un ácido eran tamponados fuera del espacio extracelular por los tejidos blandos y el hueso. 487 II Revisión bibliográfica 104 Existe un gran número de estudios in vivo e in vitro que ponen en evidencia la respuesta de los b uf fer s del hueso a una sobrecarga de ácidos, observando un descenso de Na + , y carbonato en la composición del hu eso por efecto de la acidosis. 49, 93, 95,96, 97,98, 108,109 La salida de sodio desde el hueso sugiere el intercambio de éste con protones, mientras que la disminución del contenido óseo en carbonato sugiere el consumo de este tampón por los protones. El hueso contiene aproximadamente el 80% de la reserva total de dióxido de carbono (CO 3 2 - , HCO 3 - y CO 2 ) del cuerpo. Aproximadamente 2/3 del dióxido de carbono del hueso está n en forma de carbonato (CO 3 2 - ), formando complejo s con calcio, sodio y otros cationes, y localizado en los cristales óseos, siendo relativamente inaccesible para la circulación general. El tercio restante está en forma de bicarbonato, localizado en la estructura hidratada de la hidroxiapatita, sitio acce sible para la circulación sistémica. 112 Una acidosis metabólica aguda hace descender el contenido total de dióxido de carbono del hueso. La pérdida de dióxido de carbono del hueso, presumiblemente desde la reserva de bicarbonato disponible, sugiere q ue el hueso participa activamente tamponando el aumento de la concentración de H + . 112 Por lo tanto , durante una acidosis metabólica aguda, el descenso del pH provoca la salida de calcio y de b uf fer s del hueso. Esta liberación de ca lcio y sustancias tampón e s s ó lo un componente más de la acción neutralizante de protones que el hueso ejerce, ya que al mismo tiempo que tiene lugar la salida de calcio , se produce una liberación importante de otros cationes como el N a + y el K +, que son desplazados de la fase mineral del hueso . 95,108,217, 278 II Revisión bibliográfica 105 Acidosis crónica En pacientes no urémicos, una acidosis metabólica crónica incre menta la excrec ión urinaria de calcio, sin alteración en la absorción intestinal de este ion, dando lugar a una pérdida neta de calcio corporal. 294,296,301 Con mucha probabilidad, la fuente del calcio que se pierde por orina es el hu eso. La acidosis metabólica crónica parece inducir una liberación de calcio óseo del mismo modo que lo hace un proceso de acidosis aguda, por medio de mecanismos directos de disolución fisicoquímica del mineral óseo mediados por la elevada [H + ], y por me canismos de reabsorción ósea mediados por células. 100,277,281 En cultivos celulares óseos, se ha demostrado que un descenso en la concentración de bicarbonato del medio de cultivo estimula la producción de la enzima β- glucuronidasa (enzima pro ducida por los osteoclastos) e inhibe la síntesis de colágeno y la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (ambas dependientes de los osteoblastos). 281 Estos y otros hallazgos surgidos en posteriores estudios evidencian que la acidosis metabóli ca crónica estimula la actividad de los osteoclastos e inhibe la función de los osteoblastos en cultivo. De este modo , podemos decir que tanto el incremento e n la re sorción ósea como el descenso en la formación de hueso mediados por células juegan un p apel muy importante en la hipercalciuria que tiene lugar en un proceso de acidosis metabólic a crónic a . 281, 479 Durante un fallo renal crónico, la concentración de bicarbonato y el pH del líquido extracelular permanecen reducidos, aunque de for ma estable , durante largos períodos de tiempo. 103,104,210, 443 Considerando la masa y la capacidad tampón del hueso, podríamos pensar que éste es el lugar donde se neutraliza la sobrecarga de hidrogeniones que se produce en el fallo renal cró nico. 210 Esta idea se ve apoyada por la observación de que la II Revisión bibliográfica 106 cantidad de calcio y carbonato del hueso se ven reducidas de forma significativa en pacientes con uremia, y que esta reducción es proporcional a la duración de la enfermedad renal. 386 En pacientes no urémicos , el hueso aparece también como el sitio donde son neutralizados el exceso de H + durante la administración de ácidos. 294 Como en el caso de la acidosis aguda, la imposición de una carga de ác idos crónica determina una reducción del carbonato del hueso . D e este modo , también puede decirse que el carbonato óseo es el aceptor de los iones de hidrógeno. 35,89 C.2.2.4. Papel de los aniones en la osteodistrofia renal En diversos estu dios realizados in vitro se ha puesto de manifiesto que el anión que acompaña al ácido en el medio es determinante de la magnitud con la que se libera el calcio del hueso y de la capacidad de neutralización de iones hidrógeno del hueso. Esto es aún más ev idente cuando comparamos los diferentes efectos que provoca en el hueso una acidosis respiratoria frente una acidosis metabólica. 93,94, 95,96, 97, 98, 100, 103, 104, 105, 106, 109, 110, 113, 125,281 En incubaciones durante un corto período de tiempo, la acidosis respiratoria no sólo está acompañada de un a menor salida de calcio desde el hueso, sino que además causa una deposición del calcio del medio en la superficie ósea. 106 En una acidosis metabólica , los bajos nive les de bicarbonato favorecen la disolución del hueso, mientras que durante una acidosis respiratoria el incremento en PCO 2 y bicarbonato favorecen la deposición de carbonato. 98 Cuando se realizan incubaciones de larga duración, los mecanismos celula res que determinan la liberación de calcio óseo durante una acidosis metabólica no ocurren en acidosis respiratori a . 100 Además, se ha demostrado que la acidosis respiratoria no estimula la acción re sortiva de los osteoc lastos, ni inhibe la síntesis de colágeno ni la II Revisión bibliográfica 107 actividad fosfatasa alcalina mediada por osteoblastos, como sucede en un proceso de acidosis metabólica. 114,281 Finalmente, existe otro hallazgo que diferencia ambos tipos de acidosis en el hueso, y es que el proceso respiratorio no modifica la concentración de otros iones, distintos del calcio, en la supeficie ósea como se había visto que sucedía en la acidosis metabólica. 125 C.2.2.5. Efecto de la acidosis sobre PTH y calcitriol Una de las cuestiones que aún no está muy clara es si la carga de ácidos que se da en los pacientes con insuficiencia renal puede determinar un incremento en los niveles de PTH y complicar aún más el hiperparatiroidismo. Se conoc e que la acidosis produce un desplazamiento del calcio unido a la albúmina, aumentándose así los niveles de calcio iónico, lo que reduciría la secreción de PTH. 341 Por otro lado, la acidosis provoca un aumento de la calciuria, lo que tiende a reducir los niveles séri cos de calcio y a incrementar la concentración de PTH. Existen numerosos estudios , realizados a lo largo de estas últimas décadas , en l o s que se ha intentado poner de manifiesto si la acidosis tiene algún efecto sobre la secreción de PTH, con resultados m uy dispares. A continuación, haremos un recorrido por los trabajos más destacados que han abordado este tema. Un grupo importante de autores ha defendido a lo largo de sus trabajos un efecto estimulante de la acidosis sobre la secreción de PT H: Wachman et al . 502 ya en 1970 , en un estudio en individuos sanos, resaltaron el aumento de actividad de PTH que existía durante la acidosis metabólica, según ellos , dirigida primariamente a la liberación de tampones fosfato desde el hueso para el c ontrol del exceso de H + . En 1975 , Coe et al . , 135 provoca ron acidosis aguda a humanos sanos mediante la II Revisión bibliográfica 108 administración de ClNH 4 + , y observa ro n un aumento ligero de la PTH que relaciona ro n con un aumento de fosfato y un descenso de calc io sérico. Cuando establecieron un a acidosis crónic a , el aumento de PTH que observa ron fue mucho más evidente, aunque no concluye ron que el aumento de PTH fuera provocado directamente por el desce nso del pH, sino que estaba relacionado con un balance negativo de calcio total, derivado de la hipercalciuria. Una idea muy similar ob tuvieron Scott et al . 444 en un estudio realizado en corderos en crecimiento, a lo s que infundieron durante 4 horas una solución de HCl. Estos autores o bserva ron también un aumento en la concentración de PTH con la acidosis metabólica que relacion aron , del mismo modo , con el descenso del calcio en el plasma debido a la hi percalciuria existente . A demás , en ese mismo estudio no se consigui ó mejorar el balance de calcio negativo administra ndo a los animales PTH exógena , por lo que concluye ron que en un estado de acidosis la respuesta del riñón a la PTH esta ba alterada . Este f enómeno fue apuntado anteriormente por Batl l e et al . 37 en 1982 en un estudio realizado en perros. Beck et al . , 40 trabaja ndo con ratas, p usieron de manifiesto la existencia de una conexión importante entre la PTH y la acidosis metabólica, ya que observa ron que la acidosis potencia ba la acción re sortiva de la PTH en el hueso, aumentando la salid a de calcio del hueso ; mientras que los efectos de la PTH sobre el calcio a nivel renal contrarresta ban la hipercalciur ia provocada por la acidosis. La acción sinérgica en el hueso de la PTH y la acidosis, potenciando la salida de mineral es desde el hueso, va a ser corroborada posteriormente en varios trabajos en cultivos de tejido óseo por Bushinsky et al . 93,111 Una evidencia más de que la acidosis puede ser de alguna manera un estímulo para la secreción de PTH result a de los diferentes estudios realizados en pacientes di a lizados o urémicos en prediálisis, en los cuales los niveles de PTH se estabiliza ron o incluso se redu jeron cuando se les proporcion ó una adecuada corrección de la acidosis, aumentando la adició n de bicarbonato en la solución de diálisis o infundiéndoles una solución de bicarbonato . De esta manera, se consigu ía fren ar la progresión del HPTH2 y II Revisión bibliográfica 10 9 la evolución de la osteodistrofia renal que presentaban este tipo de pacientes . 21 5, 291, 310 Pero además , Graham et al . 215 aventura ron una hipótesis para explicar el posible efecto de la acidosis sobre la glándula paratiroides, é sta era que el pH ác ido modifica ba la estructura de los receptores de Ca 2+ de la glándula haciéndolos menos afines a este ion, de modo que la glándula perd ía sensibilidad para captar el Ca 2+ extracelular. Paillard M y Bichara M 382 en una completa revisión sobre los efectos de las hormonas peptídicas en el control renal del estado ácido - base, apunta ro n que la PTH act uab a sobre el riñón potenciando la eliminación de ácidos y , por lo tanto , un acúmulo de ácidos pod ía estimular la secreción de PTH. Posteriormente, estos mismos autores , en un estudio en ratas a las que se les provoc ó acidosis metabólica aguda , administrando una solución de HCl, observaron un aumento significativo de los niveles de PTH. Este aumento de PTH era directamente proporcional a la [H + ], e independiente del calcio (aunque no consigu i e ro n evitar que la calcemia aument ase durante la acidosis). 53 También a través de este estudio reafirma ro n su idea de que la PTH favorec ía los mecanismos renales de eliminación de ácidos, aumentando la excreción renal de fosfato. Este es el trabajo más destacado que consigue ver un efecto estimulante de la acidosis aguda sobre la secreción de PTH, aunque no puedan controlar factores tan importantes para las glándul a s paratiroides como son los niveles de Ca 2+ extracelular. Otros hallazgos que apoya n la idea de que la acidosis y el bajo bicarbonato pueden estimular las glándulas paratiroides son , por un lado , que los niveles de PTH registrados en pacientes con IRC sometidos a diálisis peritoneal son inferiores a los observados e n este mismo tipo de pacientes sometidos a hemodiálisis ; y por otro lado , que los valores de PTH que presentan los individuos con diabetes asociada a IRC son menores si se comparan con los recogidos en pacientes con el mismo grado de IRC y sin diabetes. En ambos casos se c ompr ueba que , de forma generalizada , los individuos con valores m ás bajos de PTH presentan niveles superiores de bicarbonato y un pH más estable . 18,28, 123 ,226, 385,483,500, 501, 510 II Revisión bibliográfica 110 Por otro lado , hay una serie de trabajos en los que no se ha conseguido evidenciar un aumento en la concentración de PTH asociado a la acidosis metabólica, encontra ndo incluso un descenso en los niveles de esta hormona provocado por la acidosis. Kaplan et al . 254 realizaron estudios en ovejas en l os años 70, en los que se observ ó un marcado incremento en la PTH asociado a la alcalosis metab ólica , mientras que la acidosis metabólica aguda produ jo un descenso de los niveles de PTH . T odo ello se relacion ó con las variaciones de Ca 2+ producidas por los cambios de pH. En estudios posteriores, Weber et al . 509 no encontraron un aumento de la PTH en individuos sanos a los que se provoc ó una acidosis metabólica crónica administrándoles ClNH 4 + en la dieta. Estos individuos sufrieron un a acelerada desca lcificación ósea, aunque los niveles de fosfato plasmático no experimentaron cambios apreciables, lo que fue uno de sus argumentos para explicar que los niveles de PTH no estuvieran aumentados. Posteriormente, en otro estudio en huma nos a los cuales también se administr ó una carga crónica de ácidos, Adams et al . 1 observaron un leve descenso en los niveles de PTH, y concluye ro n que las pérdidas urinarias de calcio y la mayor descalcificación que presenta r on estos individuos durante la acidosis metabólica eran independientes de la PTH. Del mismo modo , Bushinsky et al . 92 no encontraron modificados los niveles de PTH en ratas sometidas a una acidosis metabólica crónica por la administr ación de ClNH 4 + en el agua de bebida. Kraut et al . 275 tampoco detectaron un efecto de la acidosis metabólica aguda o crónica sobre los niveles de PTH en humanos suplementados con ClNH 4 + en la dieta . Incluso, no se descart ó la existencia de un pequeño descenso de esta hormona asociado a la acidosis. Aún llega ro n más lejos a través de este trabajo, y concluye ro n que la respuesta del riñón y del hueso a la PTH no se modifica ba en un estado de acidosis metabólica, como II Revisión bibliográfica 111 anteriormente algunos autores habían sugerido. En estudios más recientes en pacientes en diálisis a los que se alter ó el equilibrio ácido - base , modificando la con centración de bicarbonato en la solución de dializado, no se observ aron variaciones en la concentración de PTH. 315, 381,520 Ouseph et al . , 381 que estudiaron la relación Ca 2+ - PTH , no encont raro n que durante una acidosis metabólica aguda esta relación sufriera modificaciones . E n este mismo estudio se sug i r ió que la ausencia de cambios en la dinámica de secreción de la PTH durante la acidosis p udo ser debid a a que sus pacientes , a pesar de tener descendidos los niveles de bicarbonato y de PCO 2 (compensación respiratoria) , no experimentaron cambios importantes en el pH sérico ; por lo que se sugir ió que debía ser el cambio de pH, y no los n iveles de bicarbonato, lo que afectar ía la respuesta de la glándula paratiroides . Para añadir aún más polémica sobre este tema, citaremos un interesante trabajo de Oster et al ., 379 en el que se p one de manifiesto que el anión que acompaña al ácido tiene una gran importancia en las alteraciones que se d an en el metabolismo fosfocálcico por efecto de la acidosis. Así , cuando los autores infund iero n HCl y ácido metilmalónico a perros sanos obt uvieron una elevación en la concentración de PTH, asociada a un incremento en Ca 2+ y P, y a un descenso de l Mg 2+ ; mientras que con la infusión de ácido láctico, los perros sufr i e ron un descenso en los niveles de PTH , con un aumento en la concentración de Ca 2+ y Mg 2+ , estando el P descendido. En cuanto al efecto de la acidosis sobre el metabolismo del calci triol se observa que depende de una compleja interrelación, ya que la producción de esta hormona está influenciada por varios factores como son: los niveles de PTH , y la concentración de calcio y fósforo. De esta manera , si la acidosis produce cambios sobr e estos factores , influirá indirectamente sobre la producción del calcitriol. Por otra parte , se ha demostrado que la acidosis tiene efectos directos sobre la síntesis de la forma activa de la vitamina D (1,25 (OH) 2 D 3 ). II Revisión bibliográfica 112 Numerosos estudios en ratas han puesto de manifiesto que la conversión de 25 (OH) D 3 a 1,25 (OH) 2 D 3 está alterada en una situación de acidosis metabólica, porque la acidosis inhibe la en z ima 1 α hidroxilasa renal, encargada de esta hidroxilación . 146, 258,285, 289 ,410,415 Sin embargo , otros autores afirman que la síntesis de calcitriol puede ver se alterada por la acidosis metabólica dependiendo de los niveles de calcio y fósforo en estas ratas. 92,101,277 Por otra parte , la influencia de la acidosis sobre la síntesis de calcitrol no está aclarada en humanos , pues hay muchos resultados contradictorios. Alguno s autores no han observa do un descenso en los niveles de calcitrol con acidosis metabólica en sus estudios con p acientes . 1,509 Sin embargo , en otros trabajos se p uso de manifi esto que en humanos, al igual que en las rata s , la actividad de la enzima 1 α hidroxilasa renal también se altera ba por la acidosis . 145, 285,311 U n estudio en pacientes hemodi alizados demuest ra de forma indirecta la influencia de la aci d osis sobre la síntesis de calc itriol, de modo que cuando en esos pacientes se aumentó la concentración de bicarbonato en la diálisis para corregir la acidosis metabólica que sufrían, se encontr ó que los niveles de c alcitriol se elevaron . 315 A ú n más contradictorio p arece el hallazgo de Krapf et al . 272 en un t rabajo realizado en individuos sanos, en los que se obtiene un aumento en la producción de 1,25 (OH) 2 D 3 cuando se induce a cidosis metabólica administrándoles ClNH 4 + . Este h echo , según ellos, se explica por el descenso de fosfato que produce la acidosis. III Material y Métodos 113 III. MATERIAL Y METODOS III Material y Métodos 114 III. MATERIAL Y METODOS A. ANIMALES B. PREPARACION E INSTRUMENTACION DE LOS ANIMALES C. SOLUCIONES IONICAS D. PROTOCOLO EXPERIMENTAL E. RECOGIDA Y CONSERVACION DE MUESTRAS F. DETERMINACIONES BIOQUIMICAS F.1. Parámetros medidos F.1.1. pH, PCO 2 , PO 2 , Na + , K + , Ca 2+ y Cl - F.1.2. Fósforo inorgánico (P) F.1.3. Magnesio total (Mg) F.1.4. Albúmina plasmática (Alb) F.1.5. Hormona paratiroidea (PTH) F.2. Parámetr os calculados F.2.1. B icarbonato (HCO 3 - ) F.2.2. Anion gap (AG) F.2.3. Diferencia de iones fuertes (SID) F.2.4. Concentración total de ácidos débiles no volátiles (At ) G . ANALISIS ESTADISTICO H . DISEÑO Y PRESENTACION GRAFICA III Material y Métodos 115 A. ANIMALES Todos los perros utilizados en este trabajo procedían del Centro de Control Animal de Córdoba y estaban destinados a recibir eutanasia. Antes de ser aceptados como sujetos experimentales, los animales se mantuvieron en observación durante una semana en el animalario de la “Unidad de Investigación del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba”. Durante este periodo, recibieron un manejo acorde con la normativa legal vigente. 20,62 (BOE 1990, DOCE 1986) . Los perros se alojaron en jaulas individuales, se alimentaron con una dieta comercial equilibrada (Tabla I) y recibieron agua ad libitum . Asimismo, se realizaron controles diarios para comprobar su estado clínico - sanitario. Una vez transcurrido el periodo de observación, se seleccionaron aquellos animales que se encontraban en buen estado de salud. En los experimentos, se utilizaron perros mestizos de ambos sexos, con un peso corporal de 22.54 ± 0.24 kg (x ± SE) y una edad, estimada por la dent adura, de 3.55 ± 0.14 años (x ± SE). Humedad....................10 % Proteína Bruta ............20 % Grasa Bruta..................7 % Celulosa Bruta............4.3 % Cenizas Brutas..............9 % Calcio..............................1.7 % Fósforo... .........................0.9 % Vitamina A...................6.600 UI/kg Vitamina D 3 ....................660 UI/kg Vitamina E........................40 mg/kg Tabla 1. Composición de la dieta administrada a los perros utilizados en el estudio. III Material y Métodos 116 B. PREPARAC ION E INSTRUMENTACION DE LOS ANIMALES Previamente a la realización de los experimentos, los perros se mantuvieron en ayuno durante un periodo de 18 - 24 horas. Para facilitar el manejo de los animales, antes de iniciar los experimentos, se les administ ró por vía intramuscular (i.m.) clorhidrato de ketamina (Ketolar 50 mg, Parke - Davis S.L, El Prat de Llobregat, España), a una dosis de 7.5 mg/kg, fentanilo y droperidol (Thalamonal, Productos Roche S.A., Madrid, España) a unas dosis de 7.5 y 375 µg/kg, res pectivamente. Posteriormente, se rasuró la cara craneal de ambos antebrazos, la zona latero - ventral derecha del cuello y la zona inguinal de la extremidad posterior izquierda. Dichas áreas se prepararon quirúrgicamente mediante limpieza sucesiva con una so lución de povidona yodada y alcohol etílico. A continuación, se procedió a colocar catéteres intravenosos (i.v.) en ambas venas cefálicas, 18G x 51 mm, (Abbocath -T, Abbott Ireland, Sligo, Irlanda). Una vez colocados dichos cateteres, se indujo la anestesi a infundiendo, por vía i.v., tiopental sódico (Pentothal Sódico 1 g, Abbott Laboratories S.A., Madrid, España) 12.5 mg/kg, diluido en solución de ClNa al 0.9% (Suero Fisiológico, Bieffe Medital S.A., Sabiñánigo, España). Seguidamente, se proced ió a la co locación de una sonda endotraqueal 8.5 mm x 34 cm (Rüsch sterile endotracheal tube, Rüsch AG, Kernen, Alemania), que fue conectada a un servoventilador (Servoventilador modelo de empleo abreviado, Siemens - Elema 900, Suecia) ajustado para administrar aire medicinal (Aire medicinal 20 - 23 % Oxígeno en Nitrógeno, Praxair, Madrid, España) enriquecido con Oxígeno (O 2 ) para conseguir una mezcla final al 27% de O 2 , a una dosis de 15 ml/kg/min, con un ritmo ventilatorio de 12 respiraciones por minuto. Una vez en v entilación asistida, se administró también por vía i.v., 0.25 mg/kg de midazolam (Dormicum 15 mg/3 ml, Productos Roche S.A., Madrid, España), 2.5 µg/kg de fentanilo (Fentanest 0.15 mg/3 ml, productos Roche S.A., Madrid, España) y 0.1 mg/kg de bromuro de pa ncuronio (Pavulon 4 mg/2 ml, Organon Teknika Española, S.A., Sant Boi de Llobregat, Barcelona, España) para mantener la anestesia y curarizar al animal . E stas mismas dosis III Material y Métodos 117 hubieron de repetirse cada 20 minutos a lo largo de los experimentos. Seguidament e, se colocaron en la vena yugular derecha y en la arteria femoral izquierda cat é teres 16 G x 51 mm, (Abbocath - T, Abbott Ireland, Sligo, Irlanda). El catéter de la vena yugular se utilizó para la administración de solución salina (Suero Fisiológico, Bieff e Medital S.A., Sabiñánigo, España) y también para la administración repetida del anestésico (fentanilo), relajante muscular (midazolan) y bloqueante muscular (bromuro de pancuronio). El catéter localizado en la arteria femoral se utilizó para la obtención de muestras de sangre arterial y para el control de la presión arterial mediante un sistema manométrico acoplado a una columna de monitorización (Hewlett Packard 7754B System, USA). Finalmente, los catéteres colocados en ambas venas cefálicas se usaron pa ra la infusión de las diferentes soluciones iónicas utilizadas en los distintos protocolos experimentales desarrollados en este trabajo. III Material y Métodos 118 C. SOLUCIONES IONICAS 1. - EDTA Se utilizaron 4 soluciones diferentes de EDTA de acuerdo a las nece sidades del experimento. Estas se prepararon disolviendo 300, 2 9 0 , 280 y 260 mg/k g de peso vivo (pv) de EDTA disódico (Etylenediaminetetraacetic acid, disodium salt dihydrate 99 %, Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) en 250 ml de dextrosa y a gua al 5% (Suero Glucosado 5%, Bieffe Medital S.A., Sabiñánigo, España) . 2. - CALCIO Se utilizaron 2 solucio nes diferentes de calcio conformes a las necesidades de los experimentos, preparadas disolviendo 23.5 y 22 mg/kg pv de CaCl 2 10% (Cloruro Cálcico, B. Braun Medical S.A., Barcelona, España) en 55 ml de dextrosa y agua al 5% (Suero Glucosado 5%, Bieffe Medit al S.A., Sabiñánigo, España) . 3. - HCl Las soluciones de HCl se prepararon, a partir de una solución concentrada 12.1 M de HCl (Acido clorhídrico fumante 3 7 %, Merk KgaA, Dormstadt, Alemania), diluyendo en 200 ml de agua desionizada vitulia (agua destilada vitulia estéril y apirógena, Laboratorios ERN, S.A., Barcelona, España) un volumen de esta solución que contenía 2.5 mE q por cada kg de peso vivo. 4. - MAGNESIO Se utilizó una solución de Mg preparada median te la disolución de 125 mg / kg pv de sulfato magnésico (Na 2 SO 4 , Magnesium Sulphate 7 - hydrate , Panreac, Montplet & Esteban S.A., Sabiñánigo, España) en 100 ml de dextrosa y agua al 5% (Suero Glucosado 5%, Bieffe Medital S.A., Sabiñánigo, España). III Material y Métodos 119 5. - BIC ARBONATO La solución de bicarbonato se preparó disolvien do 10 mEq /kg pv de NaHCO 3 (Sodium bicarbonate 99.5 %, Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) en 200 ml de agua desionizada (agua destilada vitulia estéril y apirógena, Laboratorios ERN, S.A., Barcelona, España). 6. - HIPEROSMOLAR Finalmente, la solución hiperosmolar se obtuvo disolviendo , por cada kg de peso vivo del animal, 9 mEq de ClNa (Sodium cloride 99.5 %, Sigma - Aldrich Chemie G mbH, Steinheim, Alemania) y 1 mEq de NaHCO 3 (Sodium bicarbonate, Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) en 200 ml de agua desionizada. III Material y Métodos 120 D. PROTOCOLO EXPERIMENTAL Durante los experimentos, los animales se mantuvieron anestesiados y en ventilación asistida. En los 15 minutos previos al inicio de los protocolos se tomaron cuatro muestras de sangre arterial basales, con int ervalos de 5 minutos entre cada extracción. Se han estudiado en total 8 grupos experimentales, agrupados en diferentes fases según el objetivo que se intentaba conseguir. Primera fase: Modificación del estado ácido - base con control del calcio. En esta p rimera fase se realizaron 6 grupos de experimentos. En estos experimentos, el animal, una vez tomadas las muestras basales, permanec ió en normocalcemia durante 60 minutos. Seguidamente, se indujo hipocalcemia mediante la infusión de EDTA, haciendo desce nder en 30 minutos los niveles de calcio iónico desde 1.25 hasta 0.8 mM, para después mantener un clamp hipocalcémico 30 minutos más, siguiendo un protocolo estandarizado. 3 Se realizaron distintos protocolos para provocar, de una parte, estados agudos de acidosis y alcalosis metabólica, mediante la infusión de soluciones de HCl y bicarbonato sódico, respectivamente, y de otra, procesos de acidosis y alcalosis respiratorias, modificando el volumen minuto de aire medicinal. Al mismo tiempo, para controlar los niveles de calcio iónico a lo largo de los experimentos, se necesit ó administrar soluciones de EDTA o de calcio , según el tipo de experimento. Las soluciones de HCl y bicarbonato sódico se infundieron mediante el uso de bombas de flujo programable (Modelo 591, IVAC Corporation, San Diego, USA), mientras que para la perfusión de soluciones de EDTA y Ca se utilizaron bombas de infusión con jeringa (Vial Medical III Material y Métodos 121 Becton Dickinson Program 2, Prim S.A., Madrid, España). - GRUPO I: CONTROL. Este gru po, que se utilizó como control, estaba integrado por 10 perros. Estos animales recibieron solución salina isotónica a través de los catéteres situados en ambas venas cefálicas. El ritmo de infusión y los cambios de velocidad a lo largo del experimento se ajustaron para que los animales recibiesen un volumen de solución salina equivalente al volumen de soluciones iónicas administrado en el resto de los grupos experimentales. El volumen de aire medicinal administrado a los perros de este grupo fue de 15 ml/ kg/min, con un 27 % de ox ígeno y un ritmo respiratorio de 12 respiraciones por minuto, manteniéndose constante el volumen minuto durante todo el experimento. Para inducir y mantener la hipocalcemia, en la segunda hora de experimento, se perfundió una sol ución de EDTA ( 3.83 mmol/l/ /kg) al ritmo de infusión que aparece reflejado en la Figura 12. En esta figura puede apreciarse que la cantidad de EDTA administrada aumentó progresivamente durante los primeros 30 min utos de la fase hipocalcémica para, seguidamente, descender desde el minuto 90 de experimento hasta el final del mismo. III Material y Métodos 122 Tiempo (minutos) Solución salina (ml/ kg /h) 0 30 60 90 1200 5 2.5 7.5 10 12.5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 FIO 2 = 0.27 Vt = 15 ml/ kg fr = 12/ min EDTA (m mol /kg /h) Figura 12. Ritmos de infusión de solu ción salina ( ) y EDTA ( ), y constantes respiratorias (FIO 2 = fracción de oxígeno inspirada, Vt = volumen tidal, fr =frecuencia respiratoria) en el Grupo I: Control. - GRUPO II: ACIDOSIS METABOLICA. En este grupo se estudiaron 10 perros a los q ue se les provocó acidosis metabólica infundiendo una solución de HCl . El ritmo ventilatorio de estos perros fue exactamente igual que el utilizado en el grupo Control. Para prevenir el aumento de los niveles de calcio iónico que se produce co mo consecuencia del descenso del pH, los perros recibieron al mismo tiempo una solución de EDTA ( 3.97 mmol/l /kg) . Así, se mantuvo el pH en valores inferiores a 7.2 al mismo tiempo que se controlaron los niveles de c alcio iónico. El ritmo de administración de estas soluciones aparece reflejado en la Figura 13. III Material y Métodos 123 La velocidad de infusión de la solución de HCl se redujo a los 60 minutos de experimento, desde 2.25 a 1.75 m Eq /kg/h, y de nuevo en el minuto 90 a 1.25 m Eq /kg/h. La cantidad total de HCl administrada durante los experimentos fue 3.75 mEq/kg. La solución de EDTA se administró a un ritmo constante de 0.08 mmol/kg/h, durante la primera hora de clamp normoc alc émico, teniendo que incrementarse progres ivamente a partir del minuto 60, con el fin de provocar hipocalcemia. En este grupo fue necesario infundir cantidades totales de EDTA superiores a las del grupo control para conseguir el mismo grado de hipocalcemia: 0.432 versus 0.303 mmol/kg en el grupo C ontrol. Tiempo (minutos) HCl (mEq /kg /h) 0 30 60 90 1201 1,5 2 2,5 3 0 0,2 0,4 0,6FIO = 0.27Vt = 15 ml/ kg fr = 12/ min 2 EDTA (m mol /kg /h) Figura 13. Ritmos de infusión de HCl ( ) y EDTA ( ), y constantes respiratorias (FIO 2 = fracción de oxígeno inspirada, Vt = volumen tidal, fr =frecuencia respiratoria) en el Grupo II: Acidosis Metabólica. III Material y Métodos 124 GRUPO III: ACIDOSIS RESPIRATORIA. A los 10 perros integrados en este grupo se les provocó acidosis reducie ndo el volumen minuto, disminuyendo el volumen de aire administrado de 15 a 10 ml/kg pv y reduciendo el ritmo respiratorio de 12 a 8 respiraciones por minuto. Para evitar la hipoxemia, consecuente a esta hipoventilación, se aumentaron en este grupo los ni veles de O 2 en el aire inspirado de 27 a 30 %. En estos animales, en los que se pretendía conseguir el mismo grado de descenso del pH que en el grupo anterior, también fue necesaria la administración de una solución de EDTA ( 3.56 mmol/l /kg) para mantener el calcio iónico al mismo nivel que los valores basales. Como se ve reflejado en la Figura 14, el ritmo de infusión de EDTA en este grupo durante la primera hora fue decreciente (descendió desde 0.08 mmol/kg/h, al inicio, hasta 0.036 mmol/kg/h a los 60 min ) y no constante como en el grupo de Acidosis Metabólica. Además, la cantidad total de EDTA administrada al final del experimento en el grupo de Acidosis Respiratoria (0.399 mmol/kg) fue sensiblemente inferior a la recibida por el grupo de Acidosis Metaból ica (0.432 mmol/kg). III Material y Métodos 125 Tiempo (minutos) Solución salina (ml/ kg /h) 0 30 60 90 1200 2.5 5 7.5 10 12.5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 FIO = 0.30 Vt = 10 ml/ kg fr = 8/ min 2 EDTA (m mo l/kg /h) Figura 14 . Ritmos de infusión de solución salina ( ) y EDTA ( ), y constantes respiratorias (FIO 2 = fracción de oxígeno inspirado, Vt = volumen tidal, fr =frecuencia respiratoria) en el Grupo III: Acidosis Respiratoria. GRUPO CONTROL CON CLAMP DE MAGNESIO A los 7 perros que se incluyen en este grupo se les instauró un protocolo experimental con los mismos ritmos de infusión de solu ción salina y EDTA, y el mismo ritmo respiratorio que los utilizados en el grupo Control. Además, a este nuevo grupo, durante la fase de hipocalcemia, se le infundió una solución de MgSO 4 para prevenir la caída de Mg que se observó al administrar EDTA. El ritmo de administración de la solución de Mg fue creciendo progresivamente desde el minuto 60 al 90, para después descender hasta el final del experimento (Figura 15). La cantidad total de Mg infundida a cada perro de este grupo, durante la hipocalcemia, f ue de 0.225 mmol/kg de peso vivo. III Material y Métodos 126 GRUPO IIB: ACIDOSIS METABÓLICA CON CLAMP DE MAGNESIO Este grupo lo integran 7 perros a los cuales se les somet ió a un protocolo exactamente igual al grupo de A cidosis M etabólica anteriormente descrito , s ólo que en este ca so se les infund ió, además, una solución de sulfato magnésico, para evitar el descenso de Mg observado en el Grupo II . Como se aprecia en la Figura 15, el ritmo de infusión de esta solución fue constante durante la primera hora, 0.05 mmol/kg/h. Durante la segunda hora de experimento, el ritmo de infusión de Mg ascendió sensiblemente desde 0.225 hasta 0.375 mol/kg/h, para después, a partir del minuto 90, reducirse progresivamente hasta el final del experimento. GRUPO IIIB: ACIDOSIS RESPIRATORIA CON CLAMP DE MAGNESIO En este grupo se utilizaron 7 animales en los que se realizó un protocolo de acidosis respiratoria idéntico al protocolo de acidosis respiratoria descrito anteriormente y, del mismo modo que en el grupo anterior, para prevenir los cambios de Mg observados como consecuencia de la acidosis, se infundió una solución de sulfato magnésico. En la Figura 15 se aprecia que el ritmo de infusión de Mg utilizado en este grupo fue siempre inferior al del grupo de Acidosis Metabólica. Del mismo modo, la canti dad total de Mg administrada fue de 0.183 mmol/kg, sensiblemente inferior a la suministrada al grupo de Acidosis Metabólica que requirió 0.308 mmol/kg. III Material y Métodos 127 Tiempo (minutos) Mg (mmol /kg /h) 0 30 60 90 1200 0,1 0,2 0,3 0,4 Figura 15. Ritmos de infusión de Mg en el grupo Control ( ), Grupo IIB: Acidosis Metabólica ( ) y Grupo IIIB: Acidosis Respiratoria ( ). GRU PO IV: ALCALOSIS METABOLICA. A los 10 perros que forman este grupo, se les infundió una solución de bicarbonato sódico por una de las venas cefálicas para aumentar el pH por encima de 7.6. Las constantes respiratorias establecidas en este grupo fueron la s mismas que se utilizaron en el grupo Control. La solución de bicarbonato se preparó para conseguir que en el volumen infundido en una hora (200 ml) se administraran 10 m Eq por kg de peso vivo del animal. Como se refleja en la Figura 16, el ritmo de in fusión se redujo ligeramente en la segunda hora del experimento para evitar una elevación excesiva del pH. Al mismo tiempo que se administró la solución de bicarbonato, fue necesario perfundir, por la otra vena cefálica, una solución de calcio (1.95 mmol/l /kg) para evitar el descenso de calcio III Material y Métodos 128 iónico que se produce con la alcalosis. El ritmo inicial de administración de esta solución fue de 156 nmol/kg/h, incrementándose progresivamente hasta 195 nmol/kg/h, en el minuto 25, momento a partir del cual se mant uvo constante hasta los 60 min. En este grupo, al igual que los anteriores, se perfundió una solución de EDTA ( 4.1 mmol/l/kg ) durante la segunda hora de experimento para producir hipocalcemia, utilizando un ritmo de infusión muy similar al del grupo Contro l (Figura 16). Bicarbonato ( mEq /kg /h) 0 30 60 90 1200 2 4 6 8 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Tiempo (minutos) FIO = 0.27 Vt = 15 ml/ kg fr = 12/ min 2 EDTA y Calcio (m mo l/kg /h) Figura 16. Ritmos de infusión de bicarbonato ( ) EDTA ( ) y calcio ( ) y constantes respiratorios (FIO 2 = fracción de oxígeno inspirado, Vt = volumen tidal, fr =frecuencia respiratoria) en el Grupo IV: Alcalosis Metabólica. III Material y Métodos 129 GRUPO V: ALCALOSIS RESPIRATORIA. En este grupo, integrado por 10 anim ales, se incrementó progresivamente el volumen minuto de aire medicinal para provocar una alcalosis respiratoria (Figura 17). El volumen de aire que recibieron estos perros se aumentó progresivamente desde 16 ml/kg, al iniciarse el experimento, hasta 38 ml /kg en el minuto 120, con un ritmo respiratorio constante de 20 respiraciones por minuto durante las dos horas de experimento. Al mismo tiempo, se redujo la fracción de O 2 inspirada ( FIO 2 ) de un 27 a un 20 %. De esta manera, se pretendía conseguir una elev ación de pH igual a la obtenida en el grupo de Alcalosis Metabólica. En este grupo de Alcalosis Respiratoria, del mismo modo que en el anterior, fue necesaria la infusión de una solución de calcio (1.83 mmol/l/kg), para prevenir el descenso de calcio iónic o debido a la alcalosis. En este caso, como se observa en la Figura 17, el ritmo de infusión de calcio fue descendiendo progresivamente, desde 64 hasta 15 nmol/kg/h, de modo que se necesitó infundir una cantidad total de 34.4 nmol/kg, francamente inferior a los 183.7 nmol/kg administrados en el grupo de Alcalosis Metabólica. Como en los demás grupos, durante la segunda hora de experimento se infundió una solución de EDTA (3.83 mmol/l/kg), para producir un descenso del calcio iónico de la misma magnitud que en los anteriores (Figura 17). El ritmo de perfusión de esta solución de EDTA fue idéntico al del grupo Control. III Material y Métodos 130 Tiempo (minutos) Volumen tidal (ml/ kg ) 0 30 60 90 1200 10 20 30 40 0 0,2 0,4 0,6 0,8 FIO = 0.20 Vt = 16 - 38 ml/ kg fr = 20/ min 2 EDTA y Calcio (m mo l/kg /h) Figura 17. Ritmos de infusión de calcio ( ) y EDTA ( ), volumen tidal ( ) y constantes respiratorias (FIO 2 = fracción de oxígeno inspirada, Vt = volumen tidal, fr = frecuencia respiratoria) en el Grupo VI : Alcalosis Respiratoria. GRUPO VI: CONTROL HIPEROSMOLAR. Con la finalidad de provocar un aumento en los niveles de Na + plasmático de similar magnitud al alcanzado en el grupo de Alcalosis Metabólica, a los 6 perros que constituían este grupo se les administró una solución hiperosmolar de ClNa . Además, para evitar el pequeño descenso de pH que producía en los animales la infusión de esta solución, se le adic ionó también una pequeña cantidad de bicarbonato . Como se describe en la Figura 18, la infusión de la solución hiperosmolar se efectuó al mismo ritmo de III Material y Métodos 131 administración que la solución de bicarbonato en el grupo de alcalosis metabólica. Debido al ligero descenso de Ca 2+ que se producía, fue necesaria, durante la primera hora, la infusión de una solución de calcio , a un ritmo constante de 42 nmol/kg/h. La solución de EDTA que se perfundió en este grupo durante la segunda hora de experimento para provocar hipocalcemia fue la misma que la utilizada en el grupo Control ( 3.83 mmol/l/kg) (Figura 18). Tiempo (minutos) Sol. Hipert .(mEq de Na /kg /h) 0 30 60 90 1200 2 4 6 8 10 12 0 0,2 0,4 0,6 0,8 FIO = 0.27 Vt = 15 ml/ kg fr = 12/ min 2 EDTA y Calcio (m mo l/kg /h) Figura 18. Ritmos de infusión de solución hipertónica ( ), EDTA ( ), y calcio ( ) y constantes respiratorias (FIO 2 = fracción de oxígeno inspirada, Vt = volumen tidal, fr = frecuencia respiratoria) en el Grupo VI: Con trol Hiperosmolar. III Material y Métodos 132 Para apreciar mejor la cantidad EDTA y calcio que fue necesaria infundir en los distintos grupos estudiados para controlar los niveles de Ca 2+ , en la Figura 19 se recogen los ritmos de infusión de EDTA en el grupo Control y en los grupo s de Acidosis, mientras que en la Figura 20 se representan los ritmos de infusión de calcio y EDTA en el grupo Control y en los grupos de Alcalosis. 0 30 60 90 1200 0,2 0,4 0,6 Tiempo (minutos) EDTA ( mmol /kg /h) Figura 19. Ritmos de infusión de EDTA en el Grupo I: Control ( ), Grupos II y IIB: Acidosis Metabólica ( ) y Grupos III y IIIB: Acidosis Respiratoria ( ). III Material y Métodos 133 0 30 60 90 120 0 0,2 0,4 0,6 Tiempo (minutos) 0 30 60 90 1200 0,1 0,2 0,3 0 Tiempo (minutos) Calcio ( mmol /kg /h) 0 30 60 90 1200 0 EDTA (m mo l/kg /h) Figura 20. Ritmos de infusión de EDTA en el Grupo I: Control ( ), Grupo IV: Alcalosis Metabólica ( ) y Grupo V: Alcalosis Respiratoria ( ); e infusión de calcio en el Grupo IV: Alcalosis Metabólica ( ) y Grupo V: Alca losis Respiratoria ( ) III Material y Métodos 134 Segunda fase: Modificación del estado ácido - base sin control del calcio. En esta segunda fase se estudió un grupo d e 7 perros a los que, una vez tomadas las muestras de sangre basales, se les provocó acidosis metabólica siguiendo el mismo protocolo que en el Grupo II. En este caso los perros completaron únicamente la primera hora de experimento y, además, no se tomaron medidas para evitar la elevación del calcio iónico debida a la acidosis (en este caso no se les perfundió EDTA). III Material y Métodos 135 Tercera fase: Estudio de la influencia del estado ácido - base en el metabolismo de la PTH. Para este estudio se utili zaron 5 grupos de 5 perros cada uno, en los que se llevaron a cabo protocolos experimentales idénticos a los realizados en la primera fase, distinguiendo, de igual modo los siguientes grupos: Control, Acidosis Metabólica, Acidosis Respiratoria, Alcalosis M etabólica y Alcalosis Respiratoria. En estos nuevos 5 grupos, llegados al minuto 90 de experimento, punto donde se iniciaba el clamp hipocalcémico, se procedió a realizar una tiroparatiroidectomía. Para ello, previamente al inicio del experimento y con el animal anestesiado, se incidió la línea media ventral del cuello, separando luego la capa muscular (esternohiodeo), para acceder a la cara ventral de los primeros anillos traqueales donde se alojan las glándulas tiroides y paratiroides, bajo los músculos tiroideos. Tras retirar estos músculos, se disecaron ambos lóbulos de la glándula tiroides, al mismo tiempo que se localizaban en su superficie las glándulas paratiroides externas e internas. Una vez disecados los pedículos vasculares craneal y caudal de l as glándulas tiroides y paratiroides se colocaron sendas ligaduras de seda trenzada sin proceder aún a su cierre. De este modo quedaron perfectamente localizadas las glándulas tiroides y paratiroides, para después, en el momento determinado, proceder a su extracción de la forma más rápida posible tras ligar ambos pedículos vasculares. Una vez realizada la tiroparatiroidectomia, proceso en el que se empleaba un tiempo invariable de 5 minutos, los animales se mantuvieron 30 minutos más en hipocalcemia, durant e los cuales se obtuvieron muestras de sangre arterial cada 5 minutos. III Material y Métodos 136 E. RECOGIDA Y CONSERVACION DE MUESTRAS La toma de muestras sanguíneas se realizó en condiciones de anaerobiosis, a través del catéter situado en la arteria femoral, utilizando jeringuillas de 3 y 5 ml (B. Braun, Melsungen, Alemania) heparinizadas con heparina de litio (Lithium Heparin, Industrias Aulabor S.A. España). En el transcurso de los experimentos, además de las cuatro muestras basales, se obtuvieron muestras de sangre ar terial cada 10 minutos durante la primera hora de experimento, cada 5 minutos entre el minuto 60 y 90 de experimento y, finalmente, cada 10 minutos hasta el final del experimento (Figura 21). Cada vez que se obtenían las muestras se tomaba por separado un volumen de 2.5 ml en una jeringuilla y de 5 ml en otra. Inmediatamente después de la extracción, la jeringuilla con 2.5 ml de sangre se introdujo en un recipiente con hielo picado, y así se conservó hasta el final del experimento, momento el que se proced ió a medir en esta muestra los siguientes parámetros: pH, PCO 2 , PO 2 , Na + , K + , Ca 2+ y Cl -. Las muestras que contenían 5 ml de sangre se centrifugaron a 3500 r.p.m. durante 5 minutos, en una citocentrífuga termostatizada a 4º C. Seguidamente, se separó el pl asma, obteniendo tres alícuotas que se conservaron a una temperatura de -20º C, hasta el momento de realizar la cuantificación del resto de los parámetros. III Material y Métodos 137 Figura 21. Esquema de la recogida de muestras de sangre en los experimentos de cad a una de las fases de estudio. Las flechas señalan cada una de las extracciones de sangre. TPX = tiroparatiroidectomia. - 15 – 10 – 5 0 0 10 20 30 40 50 60 60 70 80 90 100 110 120 BASAL CLAMP NORMOCALCEMICO H IPOCALCEMIA TIEMPO (minutos) - 15 – 10 – 5 0 0 10 20 30 40 50 6 0 60 70 80 90 0 10 20 30 TPX BASAL CLAMP NORMOCALCEMICO HIPOCALCEMIA METABOLISMO PTH TIEMPO (minutos) - 15 – 10 – 5 0 0 10 20 30 40 50 6 0 BASAL ACID. MET. SIN CLAMP DE Ca 2+ TIEMPO (minutos) FASE 1 FASE 3 FASE 2 – –– – – – TPX – – TPXTPX – – 0 2+ – – 0 2+ 2+ III Material y Métodos 138 F. DETERMINACIONES BIOQUIMICAS En cada una de la muestras obtenidas en la totalidad de los grupos de animales utilizados en este traba jo se midieron los siguientes parámetros: pH, presión parcial de CO 2 (PCO 2 ), presión parcial de O 2 (PO 2 ), Na + , K + , Ca 2+ , Cl - y hormona paratiroidea (PTH); y, a partir de ellos, se calcularon estos otros: bicarbonato (HCO 3 - ), anion gap (AG), diferencia de iones fuertes (SID) y concentración total de ácidos débiles no volátiles (A T ). Por otro lado, en los grupos de la primera fase de este estudio: Control, Acidosis Metabólica, Acidosis Respiratoria, Alcalosis Metabólica y Alcalosis Respiratoria, se determina ron además: fósforo inorgánico (P), magnesio total (Mg) y albúmina plasmática (Alb). F.1. PARAMETROS MEDIDOS. F.1.1. pH, PCO 2 , PO 2 , Na + , K + , Ca 2+ y Cl - . La determinación de estos parámetros se realizó inmediatamente después del final de cada experimento , transcurriendo como máximo 3 horas desde la toma de las muestras. El contenido de las jeringuillas, tras extraerlas del hielo, se homogeneizó mediante agitación suave de las mismas. Seguidamente, se procedió a medir estos parámetros en un gasómetro - anali zador de electrolitos (Ciba - Corning Mod. 850 Chiron Diagnostics, Madrid, España). Este instrumento incorpora una serie de electrodos en batería que permite la medición, en una cámara termostatizada a 37º C, de todos estos parámetros. F.1.2. Fósforo inor gánico (P) La cuantificación de los niveles de fósforo inorgánico se llevó a cabo mediante un método colorimétrico (Phosphorus inorganic, Procedure Nº 360 - UV, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, Estados Unidos), basado en la siguiente reacción: III Material y Métodos 139 Fósforo ino rgánico + Acido Sulfúrico + Molibdenato de Amonio Complejo no reducido de Fosfomolibdenato de Amonio. La reacción del fósforo inorgánico con el molibdenato de amonio, en presencia de ácido sulfúrico, produce un complejo de molibdenato de fósfor o no reducido. La absorbancia de este complejo, determinada con un espectrofotómetro (Beckman DU - 64 Spectrophotometer) a longitud de onda λ= 340 nm, es directamente proporcional a la concentración de fósforo inorgánico presente en la muestra. F.1.3. Magne sio total (Mg) La cuantificación de los niveles de magnesio total se llevó a cabo mediante un método colorimétrico (Magnesium, Procedure Nº. 595, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, Estados Unidos). La técnica utilizada en este trabajo se basa en la siguien te reacción: Calmagita + Magnesio Complejo Calmagita - Magnesio La formación del compuesto Calmagita -Magnesio da lugar a la aparición de un complejo de color rosáceo. La absorbancia de este complejo, determinada con un espectrofotómetro (Beck man DU - 64 Spectrophotometer) a longitud de onda λ= 520 nm, es directamente proporcional a la concentración de magnesio presente en la muestra. F.1. 4. Albúmina plasmática (Alb) La cuantificación de los niveles de albúmina plasmática se llevó a cabo media nte un método colorimétrico (Albumin BCG, Procedure Nº 631, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, Estados Unidos), basado en la unión cuantitativa del bromocresol verde con la albúmina, formando un complejo de color verde azulado intenso, que presenta una abso rbancia máxima a 628 nm de longitud de onda. De esta manera, utilizando un III Material y Métodos 140 espectrofotómetro (Beckman DU - 64 Spectrophotometer) con una fuente de luz visible a esta longitud de onda, obtenemos los niveles de absorbancia, que son directamente proporcionales a la concentración de albúmina presente en la muestra. F.1.5. Hormona paratiroidea (PTH) La concentración de PTH presente en las muestras se determinó utilizando un ensayo inmunorradiométrico (IRMA) para cuantificación de PTH intacta humana (Allegro Int act - PTH, Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA, Estados Unidos), que ha sido previamente validado para la medición de PTH canina. 493,494 Esta técnica se basa en la utilización de dos anticuerpos dirigidos frente a distintas porciones de l a molécula de PTH. Por este procedimiento, la muestra que contiene PTH se incuba simultáneamente con un anticuerpo preadsorbido en bolas de poliestireno, el cual reacciona con las regiones media y carboxi - terminal (39 - 84) de la molécula de PTH, y con otro anticuerpo marcado con I 125 , que se adhiere a la región amino - terminal (1 - 34) de la molécula de PTH. Las moléculas de PTH intacta contenidas en la muestra se unen inmunológicamente a los dos anticuerpos para formar un “complejo sandwich”: Bola anti - PTH (3 9 - 84) ---- molécula de PTH intacta (1 - 84) ---- I 125 anti - PTH (1 - 34) La concentración de PTH presente en las muestras analizadas se cuantificó mediante una curva estándar. Esta se realizó representando en una escala logarítmica el valor medio de cuentas po r minuto (cpm) de cada estándar frente a la concentración de PTH respectiva. La concentración de PTH de las muestras se calculó directamente, interpolando en la curva estándar el número de cpm obtenido al ensayar cada muestra. III Material y Métodos 141 F.2. PARAMETROS CALCULADO S. A partir de estos parámetros medidos se obtuvieron una serie de parámetros calculados que nos ayudarán para el análisis del estado ácido - base. F.2.1. Bicarbonato (HCO 3 - ). La concentración de bicarbonato real en sangre se ha calculado a partir de la e cuación de Hendersonn –Hasselbach, siguiendo las recomendaciones del National Comitee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS), según la siguiente fórmula: log HCO 3 - = pH + log PCO 2 x 0.0307 – 6.105 F.2.2. A nion gap (AG). El anion gap se ha calculado a p artir de la diferencia entre los cationes y aniones más abundantes en la sangre, utilizando esta fórmula: AG = (Na + + K + ) – (Cl - + HCO 3 - ) F.2.3. Diferencia de iones fuertes (SID). Este parámetro, referido al análisis cuantitativo del estado ácido base, se ha calculado según el método descrito por Fencl y Leith: 175 SID = (Na + + K + ) – Cl - III Material y Métodos 142 F.2.4. Concentración total de ácidos débiles no volátiles (At). La cantidad teórica de ácidos débiles no volátiles totales se ha calculado utilizando la siguiente expresión matemática: 480 At = Alb (1.23 pH – 6.31) + P (0.309 pH – 0.469) 10 30.97 Donde Alb y P son la concentración plasmática de albúmina y fósforo respectivamente. III Material y Métodos 143 G. ANALISIS ESTADISTICO El estudio estadístico de los da tos obtenidos en este trabajo se realizó con el programa informático SPSS versión 8.0. (Microsoft Corporation, Estados Unidos) Para la comparación de tres o más muestras dentro de un mismo grupo se usó el análisis de varianza (ANOVA). Si el test ANOVA mos traba diferencias estadísticamente significativas, posteriormente se aplicaba un test post - hoc, la prueba Fisher LSD, para determinar diferencias entre grupos. Se consideraron significativos aquellos valores de p < 0.05. Para la comparación entre muestras pertenecientes a los diferentes grupos de estudio, en el mismo intervalo de tiempo, se utilizó una prueba t de Student. El nivel de significación estadística se fijó en p < 0.05. Para los estudios de correlación se ha utilizado el procedimiento de correl ación de Pearson. La contribución de las variables independientes de análisis cuantitativo del estado ácido - base a la varianza de la variable PTH fue estimada mediante un análisis de regresión múltiple usando el procedimiento de “stepwise”. Todos los res ultados se presentan como media ± error estándar (x ± ES). III Material y Métodos 144 H. DISEÑO Y PRESENTACION GRAFICA Para la redacción de este trabajo se ha utilizado la versión 7.0 del programa Microsoft Word (Microsoft Corporation, Estados Unidos). Las ilustraciones y representaciones gráficas se han realizado con el programa Power Point versión 2000 (Microsoft Corporation, Estados Unidos ). El texto y las representaciones gráficas se han imprimido con una impresora Laserjet 4L (Hewlett Packard, Boise, ID, Estados U nidos). Todos los programas informáticos utilizados para la elaboración de este trabajo se ejecutaron con un ordenador compatible Pentium I. IV Resultados 145 RESULTADOS IV Resultados 146 Seguidamente, se presentan los resultados, ordenados por grupos, obtenidos en cada una de las fases que incluye el protocolo experimental. A. PRIMERA FASE: MODIFICACION DEL ESTADO ACIDO - BASE CON CONTROL DE LA CALCEMIA Grupo I : Control Los resultados de las experiencias realizadas con el Grupo I aparecen recogidos en la Figura 22 y en la Tabla 2. En estos animales, a los que solamente se les infundió solución salina isotónica, no se produjeron modificaciones significativas de l pH, obteniéndose a lo largo de todo el experimento valores similares a los basales (7.41 ± 0.01). Durante los primeros 60 minutos de la experiencia, los niveles de Ca 2+ permanecieron invariables, con fluctuaciones inferiores a 0.02 mmol/l, sin que se d etectaran diferencias estadísticamente significativas con respecto a los basales (1.24 ± 0.01 mmol/l). A partir del minuto 60, con la infusión de EDTA, se produjo un descenso progresivo y lineal de Ca 2+ durante media hora, hasta alcanzar valores de 0.75 ± 0.03 mmol/l en el minuto 90. Durante los últimos 30 minutos, la calcemia se mantuvo estabilizada en concentraciones similares a las obtenidas en el minuto 90. La concentración plasmática de PTH se mantuvo estable durante la primera hora del estudio en va lores similares a los basales (18.5 ± 4.5 pg/ml). La estimulación producida por la hipocalcemia dio lugar a un incremento en los niveles de PTH, obteniéndose un valor máximo de 249.6 ± 30.0 pg/ml. La concentración de PTH permaneció estabilizada entre los minutos 90 y 120. IV Resultados 147 Ca (mM)2+ 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 pH 0 30 60 90 1207.2 7.3 7.4 7.5 7.6 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) 0 30 60 90 1200 100 200 300 Figura 22 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del Grupo I: Control ( ). IV Resultados 148 Las concentraciones de los principales electrólitos del plasma: bicarbonato (HCO 3 - ) sodio (Na + ), potasio (K + ) y cloro (Cl -), aparecen reflejados en la Tabla 2. Como puede observarse, sus valores no sufrieron variaciones importantes a lo largo de la experiencia. Los niveles de bicarbonato oscilaron alrededor de 21 mEq/l durante toda la experiencia, sin que en nin gún momento se detectaran diferencias significativas con respecto al basal (21.6 ± 0.7 mEq/l). La natremia y la cloremia, cuyos niveles basales fueron de 142.2 ± 1.4 y 109.0 ± 1.2 mEq/l, respectivamente, se mantuvieron prácticamente invariables en las dos horas de experimento, con fluctuaciones inferiores a 1 mEq/l. Por lo que refiere al K +, su concentración basal (4.1 ± 0.1 mEq/l) experimentó un pequeño aunque progresivo descenso a lo largo de la experiencia. La disminución de la potasemia comenzó a ser estadísticamente significativa a partir del minuto 60 y el nivel más bajo de K + se registró a partir del minuto 90 (3.5 ± 0.1 mEq/l). Finalmente, no se detectaron cambios destacables en el anion gap , cuyos valores se mantuvieron durante todo el experime nto alrededor de 15 mEq/l. IV Resultados 149 TIEMPO (minutos) HCO 3 - (mEq/l) Na + (mEq/l) K + (mEq/l) Cl - (mEq/l) AG (mEq/l) - 15 21.3 ± 1.1 141.9 ± 2.0 4.2 ± 0.1 109.4 ± 1.5 14.5 ± 1.0 - 10 21.2 ± 0.8 141.8 ± 1.4 4.1 ± 0.1 108.4 ± 1.3 16.0 ± 0.8 - 5 21.6 ± 0.7 142.1 ± 1.3 4.1 ± 0.1 108.7 ± 1.1 15.4 ± 0.8 0 21.6 ± 0.7 142.2 ± 1.4 4.1 ± 0.1 109.0 ± 1.2 15.3 ± 0.8 10 21.6 ± 0.8 142.6 ± 1.1 4.1 ± 0.1 109.0 ± 1.1 15.5 ± 0.8 20 21.6 ± 0.7 142.7 ± 1.2 4.0 ± 0.1 109.0 ± 1.1 15.4 ± 0.6 30 21.4 ± 0.7 142 .6 ± 1.3 4.0 ± 0.1 109.1 ± 1.0 15.8 ± 0.9 40 21.4 ± 0.7 142.7 ± 1.4 4.0 ± 0.1 109.4 ± 1.1 15.4 ± 0.9 50 21.2 ± 0.7 142.6 ±1.2 3.9 ± 0.1 109.5 ± 1.0 15.5 ± 0.8 60 21.0 ± 0.7 142.6 ±1.3 3.9 ± 0.1* 109.5 ± 1.0 15.6 ± 0.8 65 20.3 ± 0.6 141.7 ± 0.9 3. 9 ± 0.1* 108.8 ± 1.1 16.1 ± 0.9 70 20.7 ± 0.7 143.0 ± 1.2 3.8 ± 0.1* 109.5 ± 1.1 16.2 ± 0.7 75 19.9 ± 0.6 141.7 ± 0.9 3.7 ± 0.1* 109.1 ± 1.1 15.8 ± 0.8 80 20.2 ± 0.7 142.9 ± 1.3 3.6 ± 0.1* 109.2 ± 1.0 16.7 ± 0.9 85 19.4 ± 0.6 141.9 ± 1.0 3.6 ± 0.1* 108 .9 ± 1.3 16.6 ± 1.0 90 19.7 ± 0.7 143.1 ± 1.3 3.5 ± 0.1* 108.9 ± 1.0 17.4 ± 1.0 100 20.5 ± 1.1 143.0 ± 1.8 3.5 ± 0.1* 108.7 ± 1.3 16.4 ± 1.0 110 20.4 ± 1.0 142.9 ± 1.9 3.5 ± 0.1* 109.3 ± 1.4 15.8 ± 1.1 120 20.3 ± 1.0 142.4 ± 1.7 3.5 ± 0.1* 108.9 ± 1.3 15.7 ± 1.2 Tabla 2 . Valores (media – ES) de bicarbonato (HCO 3 - ), sodio (Na + ), potasio (K + ), cloro (Cl -) y anion gap (AG) del Grupo I: Control. * p< 0,05 respecto del valor basal medio (ANOVA) IV Resultados 150 La Tabla 3 recoge los valores de las tres variables independi entes que se usan en el análisis físico - químico del estado ácido - base: presión parcial de CO 2 (PCO 2 ), diferencia de iones fuertes (SID) y ácidos debiles no volátiles (At); así como la presión parcial de oxígeno (PO 2 ) y la concentración plasmática de albúmi na (Alb). Ninguna de las variables independientes que determinan el estado ácido - base sufrió modificaciones significativas a lo largo de la experiencia en los perros del grupo Control. Los niveles de PCO 2 se mantuvieron alrededor de sus niveles basales ( 34.7 ± 1.0 mmHg) , con pequeñas fluctuaciones que nunca fueron superiores a 2 mmHg. Los valores de SID permanecieron estables en un margen muy estrecho, en torno a 36 mEq/l, con oscilaciones inferiores a 1.5 mEq/l. La concentración de At arrojó unos va lores basales de 8.4 ± 0.4 mEq/l y se mantuvo estable durante toda la experiencia. En el caso de la PO 2, los niveles basales, que fueron cercanos a 100 mm de Hg, fluctuaron muy poco a lo largo del estudio. Aunque al final del experimento se registraron v alores de PO 2 ligeramente elevados, no existían diferencias estadísticamente significativas. La concentración de albúmina plasmática en los perros de este grupo no sufrió cambios significativos a lo largo del experimento, con valores que se oscilaron entr e 2.2 y 2.5 g/dl. IV Resultados 151 TIEMPO (minutos) PO 2 (mmHg) PCO 2 (mmHg) SID (mEq/l) At (mEq/l) Alb (g/dl) - 15 102.4 ± 4.4 34.3 ± 1.7 35.6 ± 1.9 9.2 ± 0.7 2.6 ± 0,2 - 10 98.1 ± 6.5 34.2 ± 1.2 37.0 ± 1.4 8.8 ± 0.5 2.5 ± 0.1 - 5 96.7 ± 5.6 34.7 ± 1.0 36.8 ± 1.2 8.7 ± 0.6 2.5 ± 0.1 0 97.9 ± 5.8 34.7 ± 1.0 36.7 ± 1.4 8.4 ± 0.4 2.3 ± 0.1 10 98.5 ± 6.1 34.8 ± 0.9 36.9 ± 1.2 8.4 ± 0.4 2.3 ± 0.1 20 97.0 ± 5.1 35.3 ± 1.0 36.8 ± 1.2 8.7 ± 0.6 2.5 ± 0.2 30 97.7 ± 4.9 35.3 ± 1.0 37.0 ± 1.4 8.1 ± 0.5 2.2 ± 0.1 40 94.4 ± 5.6 35.3 ± 1.0 36.6 ± 1.4 8.3 ± 0.5 2.2 ± 0.1 50 97.4 ± 6.4 35.4 ± 1.0 36.5 ± 1.3 8.5 ± 0.4 2.4 ± 0.1 60 99.0 ± 5.9 35.1 ± 1.0 36.4 ± 1.4 8.3 ± 0.5 2.3 ± 0.1 65 104.1 ± 6.0 34.5 ± 1.1 36.1 ± 1.1 8.2 ± 0.5 2.2 ± 0.1 70 101.9 ± 5. 9 34.7 ± 1.0 36.7 ± 1.2 8.6 ± 0.6 2.4 ± 0.2 75 105.4 ± 5.2 34.5 ± 1.1 35.5 ± 1.1 8.4 ± 0.5 2.4 ± 0.4 80 105.4 ± 5.3 34.4 ± 1.0 36.6 ± 1.3 8.3 ± 0.5 2.3 ± 0.1 85 105.5 ± 4.5 34.2 ± 1.2 35.8 ± 1.2 7.9 ± 0.6 2.2 ± 0.2 90 106.9 ± 5.2 34.7 ± 1.0 37.0 ± 1.5 7.9 ± 0.5 2.2 ± 0.2 100 108.0 ± 6.1 35.6 ± 1.2 36.7 ± 2.1 8.6 ± 0.9 2.5 ± 0.3 110 106.6 ± 5.1 35.6 ± 1.0 36.1 ± 2.3 8.4 ± 0.8 2.4 ± 0.2 120 107.4 ± 5.2 35.2 ± 1.0 35.9 ± 2.2 8.0 ± 0.6 2.3 ± 0.2 Tabla 3 : Valores (media – ES) de PO 2 , PCO 2 , diferencia d e iones fuertes (SID), ácidos débiles no volátiles (At) y albúmina plasmática (Alb) del Grupo I: Control. IV Resultados 152 Grupo II: Acidosis Metabólica En este grupo se indujo, como se observa en la Figura 23, un descenso progresivo del pH a lo largo de las dos horas d e la experiencia. Así, partiendo de un valor basal medio de 7.39 ± 0.01, durante la primera hora el pH descendió hasta 7.19 ± 0.01. Posteriormente, el pH continuó descendiendo durante la segunda hora, alcanzando un valor mínimo de 7.07 ± 0.02, en el minuto 120. Los valores basales medios de pH en este grupo no difirieron de los observados en el grupo Control. A partir del minuto 10, todos los valores de pH registrados en el grupo de Acidosis Metabólica fueron significativamente inferiores a los del grupo Co ntrol. Gracias a la infusión de pequeñas cantidades de EDTA, la concentración de Ca 2+ basal se mantuvo estable, en niveles de 1.23 ± 0.01 mmol/l, durante los 60 primeros minutos del experimento. Además, estos niveles de calcemia son similares a los del g rupo Control. Al aumentar la cantidad de EDTA infundido, se obtuvo un descenso de Ca 2+ de igual magnitud que el del grupo Control, alcanzándose una calcemia de 0.76 ± 0.03 mmol/l en el minuto 90. Los niveles de Ca 2+ se mantuvieron estabilizados entre los m inutos 90 y 120 en niveles similares a los del Grupo Control. La concentración plasmática de PTH, cuyos niveles basales (26.7 ± 4.7 pg/ml) no eran distintos de los del grupo Control, sufrió un incremento significativo a partir del minuto 10, alcanzando u na concentración de 166.9 ± 25.9 pg/ml en el minuto 60. La hipocalcemia incrementó la PTH a unos niveles aún más elevados, obteniéndose un valor máximo de 480.3 ± 44.3 pg/ml, que prácticamente duplicaba la concentración máxima de PTH encontrada en el Grupo Control. Todos los valores de PTH registrados en el grupo de Acidosis Metabólica entre los minutos 10 y 120 fueron mayores que los del grupo Control. IV Resultados 153 pH 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) 0 30 60 90 1200 200 400 600 Ca (mM) 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 2+ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** Figura 23 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del Gru po II: Ac. Metabólica ( ). * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control ( ) en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 154 Los niveles basales de HCO 3 - , Na + , K + y Cl - del grupo de Acidosis Metabólica fueron similares a los del grupo Control (Tabla 4). La concentración basal media de bicarbonato (19.9 ± 0.6 mEq/l) descendió progresivamente a lo largo de la experiencia, obteniéndose, a partir del minuto 10, valores significativamente inferiores a los del grupo Control. La concentración plasmática de bicarbo nato registrada en los minutos 60 y 120 fue 12.6 ± 0.5 y 9.4 ± 0.8 mEq/l, respectivamente. La natremia y la potasemia no sufrieron variaciones importantes a lo largo del tiempo de experimento y se mantuvieron en torno a los valores iniciales de 142.2 ± 1. 2 y 4.0 ± 0.1 mEq/l, respectivamente. Sin embargo, la concentración plasmática de Cl - aumentó, desde un nivel basal de 112.8 ± 1.0 mEq/l, hasta alcanzar 118.3 ± 0.9 mEq/l, al final del experimento. Los niveles de Cl - registrados durante toda la experienc ia fueron significativamente superiores a los encontrados en el grupo Control. El anion gap no mostró cambios notables a lo largo del experimento, y en ningún momento sus valores fueron diferentes significativamente de los recogidos en el grupo Control. IV Resultados 155 TIEMPO (minutos) HCO 3 - (mEq/l) Na + (mEq/l) K + (mEq/l) Cl - (mEq/l) AG (mEq/l) - 15 20.0 ± 0.6 142.3 ± 1.3 4.1 ± 0.1 111.8 ± 0.7 14.8 ± 0.8 - 10 19.8 ± 0.5 142.4 ± 1.3 4.1 ± 0.1 111.7 ± 0.7 15.2 ± 0.7 - 5 19.8 ± 0.5 142.7 ± 1.4 4.1 ± 0.1 11 2.1 ± 0.7 15.1 ± 0.8 0 19.8 ± 0.6 142.4 ± 1.4 4.1 ± 0.1 112.8 ± 1.0 14.1 ± 1.7 10 17.8 ± 0.5* 142.2 ± 1.2 4.0 ± 0.1 113.3 ± 0.8* 15.6 ± 0.8 20 16 6 ± 0.5* 142.2 ± 1.2 4.1 ± 0.1 114.1 ± 0.8* 16.0 ± 0.8 30 15.5 ± 0.5* 141.9 ± 1.3 4.0 ± 0.1 115.2 ± 0.9* 15.6 ± 0.9 40 14.4 ± 0.5* 141.7 ± 1.3 4.0 ± 0.1 115.7 ± 0.9* 16.1 ± 0.8 50 13.4 ± 0.5* 141.5 ± 1.2 4.0 ± 0.1 116.1 ± 0.8* 16.6 ± 0.9 60 12.6 ± 0.5* 141.6 ± 1.1 4.0 ± 0.1 117.3 ± 0.9* 16.2 ± 0.9 65 12.4 ± 0.5* 141.4 ± 1.0 4.0 ± 0.1 117.3 ± 0.8* 16.2 ± 0 .9 70 11.9 ± 0.5* 141.0 ± 1.0 3.9 ± 0.1 116.7 ± 0.8* 16.7 ± 0.9 75 11.6 ± 0.5* 140.8 ± 1.0 3.8 ± 0.1 116.7 ± 1.0* 16.9 ± 0.9 80 11.3 ± 0.6* 141.5 ± 1.0 3.9 ± 0.1 117.0 ± 0.8* 17.4 ± 0.9 85 10.9 ± 0.6* 141.3 ± 1.0 3.8 ± 0.1 117.0 ± 0.8* 17.6 ± 0.8 90 1 0.6 ± 0.6* 141.3 ± 0.9 3.8 ± 0.1 117.1 ± 0.8* 17.8 ± 0.9 100 10.0 ± 0.8* 142.0 ± 1.1 4.1 ± 0.2 117.9 ± 0.8* 18.7 ± 1.0 110 9.7 ± 0.8* 140.9 ± 0.8 4.3 ± 0.3 118.0 ± 0.7* 18.0 ± 1.1 120 9.4 ± 0.8* 139.9 ± 0.9 4.6 ± 0.4 118.3 ± 0.9* 17.5 ± 0.8 Tabla 4: Valores (media – ES) de bicarbonato (HCO 3 - ), sodio (Na + ), potasio (K + ), cloro (Cl -) y anion gap (AG) del Grupo II: Acidosis Metabólica. * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control, en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 156 Al estudiar las variables indepe ndientes que determinan el estado ácido - base se observa que los niveles de PCO 2 y At se mantuvieron prácticamente invariables a lo largo de la Acidosis Metabólica. Ni los valores basales de estos parámetros ni ninguno de los registrados a lo largo de la ex periencia diferían significativamente de los del grupo Control (Tabla 5). Por el contrario, el SID sufrió modificaciones significativas en los perros sometidos a Acidosis Metabólica. Los valores basales medios de SID, 33.8 ± 1.6 mEq/l, no diferían signif icativamente de los del grupo Control. Durante las dos horas de experimento se produjo un descenso significativo de SID, alcanzando valores de 27.0 ± 0.5 mEq/l en el minuto 120. Todos los valores de SID registrados entre los minutos 10 y 120 fueron signifi cativamente más bajos que los del grupo Control. Los niveles basales medios de presión parcial de oxígeno (PO 2 ), que estaban un poco por encima de los 100 mm de Hg, se mantuvieron prácticamente constantes durante toda la experiencia. Ninguno de los valore s de PO 2 registrados en este grupo difería significativamente de los del grupo Control. En cuanto a la albúmina plasmática, también se observaron valores prácticamente idénticos a los del grupo Control. Los niveles de Alb se mantuvieron en torno a los 2.5 g/dl a lo largo de todo el experimento con fluctuaciones inferiores a 0.2 g/dl. IV Resultados 157 TIEMPO (minutos) PO 2 (mmHg) PCO 2 (mmHg) SID (mEq/l) At (mEq/l) Alb (g/dl) - 15 108.1 ± 9.4 34.0 ± 1.3 34.8 ± 0.8 8.9 ± 0.4 2.5 ± 0.1 - 10 104.9 ± 6.5 34.3 ± 1.3 34.9 ± 0.9 9.0 ± 0.5 2.6 ± 0.2 - 5 97.8 ± 12.4 34.0 ± 1.3 34.9 ± 0.9 9.6 ± 0.4 2.7 ± 0.1 0 108.8 ± 8.6 33.9 ± 1.3 33.8 ± 1.6 9.1 ± 0.3 2.5 ± 0.1 10 107.9 ± 7.1 35.8 ± 1.1 33.3 ± 0.8* 8.8 ± 0.4 2.6 ± 0.1 20 108.5 ± 8.3 35.6 ± 1.3 32.5 ± 0.9* 8.3 ± 0.4 2.4 ± 0.1 30 109.5 ± 10.2 35.5 ± 1.3 31.0 ± 0.8* 8.6 ± 0.5 2.5 ± 0.2 40 114.7 ± 12.1 34.6 ± 1.4 30.5 ± 0.8* 8.7 ± 0.3 2.6 ± 0.1 50 115.3 ± 11.3 34.3 ± 1.4 29.9 ± 0.8* 8.4 ± 0.5 2.5 ± 0.2 60 116.6 ± 12.0 33.5 ± 1.3 28.8 ± 0.9* 8.4 ± 0.5 2.5 ± 0.1 65 10 9.1 ± 5.1 33.4 ± 1.2 28.5 ± 0.7* 8.0 ± 0.3 2.4 ± 0.1 70 111.8 ± 5.8 32.9 ± 1.1 28.6 ± 0.7* 7.8 ± 0.5 2.3 ± 0.1 75 105.2 ± 12.5 33.2 ± 1.2 28.4 ± 0.6* 8.1 ± 0.4 2.5 ± 0.1 80 115.6 ± 5.9 32.6 ± 1.1 28.7 ± 0.8* 7.7 ± 0.4 2.4 ± 0.1 85 117.6 ± 8.6 32.3 ± 1. 3 28.5 ± 0.6* 7.5 ± 0.3 2.3 ± 0.1 90 118.0 ± 9.2 32.7 ± 1.2 28.4 ± 0.7* 7.4 ± 0.4 2.3 ± 0.1 100 111.3 ± 6.0 33.2 ± 1.5 28.7 ± 1.0* 7.5 ± 0.4 2.5 ± 0.1 110 111.4 ± 6.6 33.0 ± 1.5 27.7 ± 0.8* 7.3 ± 0.4 2.4 ± 0.2 120 113.6 ± 7.8 33.1 ± 1.5 27.0 ± 0.5* 7.2 ± 0.3 2.4 ± 0.2 Tabla 5 : Valores (media – ES) de PO 2 , PCO 2 , diferencia de iones fuertes (SID), ácidos débiles no volátiles (At) y albúmina plasmática (Alb) del Grupo II: Acidosis Metabólica. * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control, en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 158 Grupo III: Acidosis Respiratoria Los valores basales de pH en el grupo de Acidosis Respiratoria, 7.41 ± 0.01, fueron similares a los del grupo Control (Figura 24). A partir del minuto 10 se produjo un descenso significativo de pH, al canzando valores de 7.19 ± 0.01, a los 60 minutos, y de 7.09 ± 0.03, a los 120 minutos. Todos los valores de pH registrados entre los minutos 10 y 120 fueron significativamente inferiores a los del grupo Control. Al igual que en el Grupo II, gracias a l a infusión de una pequeña cantidad de EDTA, la concentración plasmática de Ca 2+ permaneció prácticamente constante durante los 60 primeros minutos, en niveles cercanos a los basales, 1.24 ± 0.02 mmol/l. Durante los siguientes 30 minutos, se produjo una caí da de Ca 2+ del orden de 0.51 mmol/l, manteniéndose la calcemia estabilizada, alrededor de 0.7 mmol/l, desde el minuto 90 hasta el final de la experiencia. A lo largo de todo el experimento, no se detectaron diferencias significativas en la calcemia entre e l grupo de Acidosis Respiratoria y el grupo Control. Los niveles basales de PTH, 20.9 ± 3.7 pg/ml, fueron similares a los del grupo Control. A partir del minuto 10, la concentración plasmática de PTH se elevó progresivamente hasta el minuto 60, alcanzand o valores de 101.3 ± 10.2 pg/ml. Durante esta primera hora, los niveles de PTH registrados en el grupo de Acidosis Respiratoria fueron significativamente más altos que los del grupo Control. Durante el periodo de hipocalcemia, la concentración plasmática d e PTH en el grupo de Acidosis Respiratoria continuó siendo significativamente más alta que la del grupo Control hasta el minuto 75, momento en el que se alcanza la concentración máxima de PTH, 286.5 ± 28.2 pg/ml. A partir de este instante, los niveles de PTH comenzaron a descender, estabilizándose en valores muy similares a los del grupo Control. IV Resultados 159 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca (mM)2+ 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) 0 30 60 90 1200 100 200 300 ****** ****** *** * * * ***** * pH Figura 24 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del Grupo III: Acidosis Respiratoria ( ). * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control ( ), al mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 160 A diferencia de lo que sucedía en el grupo anterior, en los perros sometidos a Acidosis Respiratoria no se han detectado cambios significativos en la concentración plasmática de HCO 3 - (Tabla 6). Los niveles basales de bicarbonato, 20.6 ± 0.7 mEq/l, sufrieron una pequeña elevación al inducir Acidosis Respiratoria y permanecieron en niveles cercanos a los 22 mEq/l durante toda la experiencia, aunque como ya se ha comentado no existen d iferencias estadísticamente significativas. El perfil electrolítico del plasma no sufrió variaciones significativas a lo largo de las dos horas en Acidosis Respiratoria. Los valores basales de Na + (142.4 ± 1.0 mEq/l), K + (4.2 ± 0.1 mEq/l) y Cl - (109.0 ± 0 .8 mEq/l) se mantuvieron prácticamente invariables a lo largo de la experiencia, y en ningún punto difirieron significativamente de los registrados en los perros del grupo Control. Finalmente, tampoco se detectaron cambios en el anion gap de los perrros sometidos a Acidosis Respiratoria. Durante las dos horas de experimento, los valores de este parámetro se mantuvieron en niveles cercanos a los basales (17.0 ± 1.0 mEq/l). Además, estos niveles de anion gap no diferían significativamente de los del grupo C ontrol. IV Resultados 161 TIEMPO (minutos) HCO 3 - (mEq/l) Na + (mEq/l) K + (mEq/l) Cl - (mEq/l) AG (mEq/l) - 15 21.4 ± 1.6 141.3 ± 0.9 4.2 ± 0.1 108.4 ± 0.8 15.8 ± 1.3 - 10 20.4 ± 0.6 141.7 ± 0.9 4.3 ± 0.1 108.5 ± 0.8 17.1 ± 0.9 - 5 20.4 ± 0.6 142.5 ± 0.8 4.3 ± 0.1 108.9 ± 1.0 17.4 ± 1.0 0 20.6 ± 0.7 142.4 ± 1.0 4.2 ± 0.1 109.0 ± 0.8 17.0 ± 1.0 10 22.3 ± 0.8 143.9 ± 1.1 4.2 ± 0.1 108.3 ± 0.7 17.5 ± 1.2 20 22.7 ± 0.7 144.1 ± 1.5 4.2 ± 0.1 108.4 ± 0.9 17.3 ± 1.8 30 23.0 ± 0.7 144.4 ± 1.3 4.1 ± 0.1 108.9 ± 0. 8 16.6 ± 1.5 40 22.9 ± 0.7 144.2 ± 1.5 4.2 ± 0.2 108.5 ± 1.0 17.0 ± 1.8 50 23.1 ± 0.6 145.0 ± 1.4 4.1 ± 0.1 109.0 ± 0.8 17.1 ± 1.8 60 23.0 ± 0.7 143.9 ± 1.7 4.2 ± 0.2 108.7 ± 0.8 16.4 ± 2.0 65 22.8 ± 0.6 144.3 ± 1.7 4.2 ± 0.2 108.0 ± 0.9 17.6 ± 1.8 70 22.7 ± 0.6 144.5 ± 1.6 4.1 ± 0.2 108.4 ± 0.8 17.6 ± 1.8 75 22.3 ± 0.6 144.3 ± 1.7 4.1 ± 0.2 107.9 ± 0.7 18.2 ± 1.8 80 22.2 ± 0.6 144.7 ± 1.8 4.1 ± 0.2 107.9 ± 0.9 18.6 ± 2.0 85 22.0 ± 0.6 144.6 ± 1.6 4.0 ± 0.2 107.4 ± 0.8 19.1 ± 2.0 90 21.9 ± 0.6 144. 9 ± 1.7 3.9 ± 0.2 107.5 ± 0.7 19.4 ± 2.0 100 22.2 ± 0.5 144.4 ± 1.8 3.9 ± 0.2 106.7 ± 0.8 19.4 ± 2.1 110 22.1 ± 0.6 144.8 ± 1.9 4.0 ± 0.3 107.3 ± 0.9 19.4 ± 2.4 120 22.1 ± 0.6 144.5 ± 2.4 4.0 ± 0.3 107.0 ± 0.8 19.4 ± 2.9 Tabla 6: Valores (media – ES) de bicarbonato (HCO 3 - ), sodio (Na + ), potasio (K + ), cloro (Cl - ) y anion gap (AG) del Grupo III: Acidosis Respiratoria. IV Resultados 162 Al analizar la evolución de las variables independientes que determinan el estado ácido - base en los perros sometidos a Acidosis Respira toria (Tabla 7), se observaron cambios significativos en los niveles de PCO 2 . Partiendo de una presión parcial media de 33.3 ± 1.1 mmHg, que fue similar a la registrada en el grupo Control, se produjo un incremento progresivo de PCO 2 hasta alcanzar nivele s de 75.3 ± 4.6 mmHg, al final del experimento. Todos los valores de PCO 2 registrados entre los minutos 10 y 120 fueron significativamente más altos que los del grupo Control. Las otras dos variables independientes, SID y At, se mantuvieron estabilizadas en valores cercanos a los basales (37.6 ± 1.5 y 8.8 ± 0.4 mEq/l , respectivamente) durante la Acidosis Respiratoria y no presentaron diferencias significativas con respecto al grupo Control. Los niveles de PO 2 en estos perros fueron similares a los del grupo Control, oscilando entre 100 y 110 mmHg a lo largo del experimento. Estas pequeñas fluctuaciones de PO 2 no dieron lugar a cambios estadisticamente significativos. La concentración basal media de albúmina en los perros sometidos a Acidosis Respirator ia fue 2.4 ± 0.1 g/dl, y se mantuvo prácticamente constante durante todo el experimento, sin que se detectaran diferencias significativas con respecto al grupo Control. IV Resultados 163 TIEMPO (minutos) PO 2 (mmHg) PCO 2 (mmHg) SID (mEq/l) At (mEq/l) Alb (g/dl ) - 15 106.8 ± 5.8 32.5 ± 0.8 37.2 ± 1.1 8.7 ± 0.3 2.4 ± 0.1 - 10 105.7 ± 6.4 33.0 ± 0.8 37.4 ± 1.3 8.7 ± 0.4 2.4 ± 0.1 - 5 103.6 ± 5.3 33.0 ± 0.9 37.9 ± 1.5 8.7 ± 0.4 2.4 ± 0.1 0 103.2 ± 4.9 33.3 ± 1.1 37.6 ± 1.5 8.8 ± 0.4 2.4 ± 0.1 10 96.4 ± 6.8 48.3 ± 1.6* 39.8 ± 1.4 7.9 ± 0.4 2.3 ± 0.1 20 103.1 ± 4.9 53.1 ± 1.6* 39.9 ± 2.0 8.5 ± 0.5 2.4 ± 0.1 30 104.7 ± 4.0 56.0 ± 2.3* 39.6 ± 1.7 8.3 ± 0.6 2.4 ± 0.2 40 107.9 ± 4.8 58.0 ± 2.4* 39.8 ± 2.0 8.2 ± 0.4 2.3 ± 0.1 50 108.3 ± 4.7 60.7 ± 2.6* 40.1 ± 1.9 8 .3 ± 0.3 2.4 ± 0.1 60 110.1 ± 5.5 61.1 ± 2.4* 39.4 ± 2.1 8.3 ± 0.3 2.4 ± 0.1 65 109.4 ± 5.3 63.3 ± 2.9* 40.4 ± 2.0 8.4 ± 0.4 2.4 ± 0.1 70 109.5 ± 5.4 63.9 ± 2.9* 40.2 ± 2.0 7.8 ± 0.3 2.2 ± 0.1 75 110.5 ± 4.8 64.4 ± 2.9* 40.5 ± 1.9 8.3 ± 0.4 2.4 ± 0.1 80 109.6 ± 4.9 65.8 ± 3.3* 40.9 ± 2.3 8.2 ± 0.3 2.4 ± 0.1 85 106.5 ± 5.4 67.6 ± 3.1* 41.1 ± 2.1 7.9 ± 0.5 2.3 ± 0.1 90 105.6 ± 4.9 69.0 ± 3.6* 41.3 ± 2.2 7.9 ± 0.6 2.4 ± 0.2 100 104.3 ± 7.0 72.9 ± 3.6* 41.6 ± 2.1 7.8 ± 0.4 2.4 ± 0.1 110 108.1 ± 9.8 72. 8 ± 3.4* 41.5 ± 2.3 7.2 ± 0.5 2.1 ± 0.2 120 102.0 ± 6.7 75.3 ± 4.6* 41.5 ± 2.9 7.0 ± 0.3 2.2 ± 0.1 Tabla 7 : Valores (media – ES) de PO 2 , PCO 2 , diferencia de iones fuertes (SID), ácidos débiles no volátiles (At) y albúmina plasmática (Alb) del Grupo III : Acidosis Respiratoria. * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control, en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 164 Al realizar controles de la concentración plasmática de magnesio (Mg) en los grupos de Acidosis (Grupos II y III), se observó que ésta descendía si gnificativamente en el transcurso de los experimentos. Como puede apreciarse en la Figura 25, durante los primeros 60 minutos, la disminución en la magnesemia fue del orden de 0.3 mEq/l en el grupo de Acidosis Metabólica, y algo menor en el grupo de Acidos is Respiratoria. Durante la segunda hora, se produjo un mayor descenso en la concentración plasmática de Mg, hasta niveles por debajo de 0.5 mEq/l en ambos grupos de Acidosis. En el grupo Control la magnesemia permaneció estable durante la primera hora de la experiencia y durante el periodo de hipocalcemia (minutos 60 a 120), a medida que se infudía EDTA para disminuir la calcemia, se observó un descenso en la concentración plasmática de magnesio similar al detectado en los grupos de Acidosis. El Mg es un catión divalente que puede estimular al receptor de calcio y, de este modo, regular la secreción de PTH. Aunque, en base a los datos recogidos en la bibliografía, la influencia del Mg sobre la secreción de PTH parece ser muy inferior a la del Ca 2+ , result a obligado controlar el posible efecto de la hipomagnesemia sobre la secreción de PTH en los perros sometidos a acidosis. Para ello, fue necesario estudiar nuevos grupos de perros Control y de Acidosis Metabólica y Respiratoria, modificando el protocolo e xperimental, con el fin de controlar los niveles plasmáticos de Mg (mediante la infusión i.v. de sulfato de magnesio). A continuación se presentan los resultados obtenidos en una serie adicional de experimentos en los que se mantuvo constante la concent ración plasmática de Mg. Dado que el control de la magnesemia no influyó en los parámetros que determinan el estado ácido -base, con el fin de evitar reiteraciones, sólo se presentan los resultados de pH, Ca 2+ , Mg y PTH. IV Resultados 165 TIEMPO ( min ) Mg ( mEq /l) 0 30 60 90 120 1.5 2.0 1.0 0.5 TIEMPO ( min ) 0 30 60 90 120 1.5 2.0 1.0 0.5 Mg ( mEq /l) ** * * * * * A B Figura 2 5 . Niveles de magnesio total (Mg) en los grupos Control ( ), Acidosis Metabólica ( ) y Acidosis Respiratoria ( ). *p < 0.05 respecto del grupo Control en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 1 66 Grupo IIB. Acidosis Metabólica con Clamp de Magnesi o En la Figura 26 puede observarse que la evolución de los valores de pH de estos perros fue similar a la obtenida sin control de Mg. En el grupo de Acidosis Metabólica el pH descendió de manera significativa, con respecto al grupo Control, alcanzando val ores en torno a 7.20 en la primera hora de experimento. Durante la segunda hora el pH continuó disminuyendo hasta niveles cercanos a 7.10. En el grupo Control el pH se mantuvo estable durante toda la experiencia en valores cercanos a 7.40. Durante la pr imera hora de experimento, tanto en el grupo Control como en el de Acidosis Metabólica, la calcemia permaneció estabilizada en valores muy próximos a los basales. Durante los siguientes 30 minutos se produjo un descenso de Ca 2+ prácticamente idéntico en am bos grupos y, finalmente, en la última media hora, el calcio se mantuvo en niveles cercanos a 0.80 mmol/l. En lo referente al Mg, gracias a la administración de una solución de MgSO 4 , la magnesemia se mantuvo prácticamente constante durante todo el experim ento, tanto en el grupo Control como en el de Acidosis Metabólica. Ninguno de los valores de Mg medidos en estos experimentos fue significativamente diferente de la magnesemia basal del grupo Control, 1.31 ± 0.04 mEq/l. En el grupo Control, los niveles de PTH, tanto en normo - como en hipocalcemia, fueron prácticamente idénticos a los que se obtuvieron sin controlar el Mg. En el grupo de Acidosis Metabólica con el Mg clampado, la disminución del pH dio lugar a un incremento en la concentración de PTH que al canzó valores significativamente más altos que los del grupo Control. No obstante, en este caso, la concentración de PTH en normocalcemia sólo se elevó hasta niveles 91.8 ± 18.7 pg/ml, en el minuto 60. Durante la estimulación hipocalcémica la PTH alcanzó u nas concentraciones plasmáticas muy superiores a las del grupo Control, con valores máximos de 442.6 ± 53.6 pg/ml, en el minuto 85. IV Resultados 167 pH 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca 2+ (mM) Mg ( mEq /l) 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 0.5 1 1.5 2 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) 0 30 60 90 1200 100 200 300 400 500 * ** ** * * * ***** * * * * * * * * ** * * * * * * * Figura 26. . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ), Magnesio total (Mg) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del G rupo IIB: Acidosis Metabólica con clamp de Mg ( ). * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control ( ) en el mismo tiempo (t - test no pareado). Mg grupo IIB Mg grupo Control IV Resultados 168 Grupo IIIB. Acidosis Respiratoria con Clamp de Magnesio La evolución de los valores de pH de este nuevo grup o de Acidosis Respiratoria fue prácticamente idéntica a la descrita en el Grupo III (sin control de Mg). Los valores de pH descendieron de manera significativa, con respecto al grupo Control, alcanzando valores en torno a 7.2 en la primera hora de experime nto, y reduciéndose un poco más a lo largo de la segunda hora (Figura 27). Tanto en el grupo de Acidosis Respiratoria como en el Control, los niveles del Ca 2+ se mantuvieron constantes durante la primera hora de clamp normocalcémico, entre 1.20 y 1.25 m mol/l. En la siguiente hora, se produjo un descenso en la calcemia de la misma magnitud en ambos grupos. De igual manera, la magnesemia se mantuvo constante tanto en el grupo Control como en el de Acidosis Respiratoria, gracias a la administración de una s olución de MgSO 4. Ninguno de los valores de Mg registrado en ambos grupos difiere significativamente de la magnesemia basal del grupo Control, 1.31 ± 0.04 mEq/l. Durante la primera hora de experimento, la concentración de PTH en el grupo de Acidosis Respi ratoria con clamp de Mg, se vio incrementada significativamente con respecto a los niveles del grupo Control, registrándose en el minuto 60 valores de 77.4 ± 21.6 pg/ml. En la fase de hipocalcemia, la concentración máxima de PTH alcanzada en este grupo de Acidosis Respiratoria fue de 266.6 ± 36.9. Estos niveles de PTH máxima no difirieron significativamente de los del grupo Control. IV Resultados 169 pH 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca 2+ (mM) Mg ( mEq /l) 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 0.5 1 1.5 2 PTH ( pg /ml) TIEMPO ( min ) 0 30 60 90 1200 100 200 300 * * ***** * * * * * * * * * * * * * * * * Figura 27 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ), Magnesio total (Mg) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros d el Grupo IIIB: Acidosis Respiratoria con clamp de Mg ( ). * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control ( ) en el mismo tiempo (t - test no pareado). Mg grupo IIIB Mg grupo Control IV Resultados 170 Grupo IV: Alcalosis Metabólica En este grupo, la administración de bicarbonato sódico produjo un inc remento significativo del pH, que alcanzó valores de 7.61 ± 0.01 en el minuto 60 y de 7.69 ± 0.02 al final del experimento (Figura 28). A pesar del aumento del pH, la concentración basal de Ca 2+ (1.22 ± 0.01 mmol/l) se mantuvo constante durante la primer a hora del experimento, gracias a la infusión de una solución Cl 2 Ca. Durante este periodo los valores de Ca 2+ sufrieron oscilaciones inferiores a 0.01 mmol/l y no se observaron cambios significativos con respecto de los del grupo Control. También, durante la fase hipocalcémica (2ª hora) los niveles de Ca 2 evolucionaron de forma similar a los de el grupo Control, lográndose una concentración mínima de Ca 2+ de 0.78 ± 0.03 mmol/l. En estos animales, al contrario de lo que ocurría en los grupos de Acidosis, l os niveles de PTH se redujeron progresivamente a medida que subía el pH. La concentración basal de PTH, 26.3 ± 5.2 pg/ml, disminuyó hasta alcanzar valores de 5.6 ± 0.8 pg/ml, en el minuto 60. Todos los valores de PTH registrados entre los minutos 20 y 60 f ueron significativamente inferiores a los del grupo Control. Durante la segunda hora de experimento, la elevación en los niveles de PTH inducida por la hipocalcemia se produjo de forma más lenta en el grupo de Alcalosis Metabólica que en el grupo Control, aunque posteriormente alcanzó valores máximos de PTH (232 ± 31.6 pg/ml) muy similares a los del grupo Control. IV Resultados 171 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca (mM)2+ 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 25 50 0 30 00 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) PTH ( pg /ml) 100 200 300 60 90 120 * * ***** * * * * * * * * * * * * * * * ** pH Figura 28 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del Grupo IV: Alcalosis Metabólica ( ). * p<0.05 con respecto al grupo Control ( ) en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 172 La concentración plasmática de bicarbonato, como se observa en la Tabla 8, aumentó progresivamente en el grupo de Alcalosis Metabólica a lo largo del experimento. Los niveles basales de bicarbonato, 20.3 ± 0.8 mEq/l, se elevaron hasta alcanzar valores de 52.7 ± 1.1 mEq/l, en el minuto 120. Todos los valores de bicarbonato registrados a partir del minuto 10 fueron significativamente más elevados en el grupo de Alcalosis Metabólica que en el Grupo Control. En cuanto a los electrólitos, es necesario reseñar que el Na + experimentó una elevación muy similar a la del bicarbonato. Así, la natremia, partiendo de unos niveles basales de 142.4 ± 0.5 mEq/l, se elevó significativa mente a partir del minuto 10 hasta alcanzar valores de 172.6 ± 1.0 mEq/l, al final de los experimentos. Por otro lado, tanto el K + como el Cl - experimentaron un pequeño descenso en el transcurso de la experiencia. La potasemia descendió desde 4.2 ± 0.1 has ta 2.9 ± 0.1 mEq/l; mientras que la cloremia se redujo desde 110.0 ± 1.0 hasta 105.4 ± 1.2 mEq/l. El descenso de la potasemia en el grupo de Alcalosis Metabólica fue significativo a partir del minuto 10, mientras que la disminución de la cloremia tan sólo adquirió significación estadística a partir del minuto 50 de experimento. Dado que los cambios de bicarbonato y de sodio fueron de similar magnitud, los valores de anion gap permanecieron prácticamente constantes a lo largo de la experiencia, sin que apar ecieran desviaciones significativas con respecto al basal (16.2 ± 0.9 mEq/l). IV Resultados 173 TIEMPO (minutos) HCO 3 - (mEq/l) Na + (mEq/l) K + (mEq/l) Cl - (mEq/l) AG (mEq/l) - 15 20.5 ± 0.7 141.5 ± 0.4 4.2 ± 0.1 110.2 ± 1.0 15.1 ± 0.9 - 10 20.3 ± 0.8 141.7 ± 0 .4 4.2 ± 0.1 109.8 ± 1.0 15.9 ± 0.6 - 5 20.3 ± 0.8 142.0 ± 0.5 4.2 ± 0.1 110.0 ± 1.0 16.0 ± 0.9 0 20.3 ± 0.8 142.4 ± 0.5 4.2 ± 0.1 110.0 ± 0.9 16.2 ± 0.9 10 27.3 ± 0.9* 147.3 ± 0.4* 3.8 ± 0.1* 109.3 ± 0.9 14.7 ± 0.8 20 30.8 ± 0.8* 149.0 ± 0.4* 3.6 ± 0.1 * 108.2 ± 0.8 14.0 ± 0.9 30 33.8 ± 0.8* 151.3 ± 0.4* 3.4 ± 0.1* 107.5 ± 0.7 13.7 ± 0.9 40 35.5 ± 1.1* 152.7 ± 0.6* 3.4 ± 0.1* 107.0 ± 0.9 13.4 ± 0.9 50 38.5 ± 0.9* 155.0 ± 0.6* 3.3 ± 0.1* 106.4 ± 0.7* 13.2 ± 1.1 60 40.7 ± 0.7* 157.5 ± 0.4* 3.2 ± 0.1* 1 06.0 ± 0.7* 14.2 ± 1.0 65 41.0 ± 0.9* 157.6 ± 0.6* 3.1 ± 0.1* 106.0 ± 1.1* 13.8 ± 1.0 70 42.4 ± 0.9* 159.2 ± 0.6* 3.1 ± 0.1* 105.8 ± 0.7* 14.2 ± 0.8 75 42.3 ± 0.9* 160.0 ± 0.9* 3.0 ± 0.1* 105.8 ± 1.0* 15.0 ± 1.0 80 43.8 ± 0.9* 161.5 ± 0.8* 3.1 ± 0.1* 1 05.3 ± 0.7* 15.6 ± 0.9 85 43.7 ± 1.0* 161.7 ± 1.1* 2.9 ± 0.1* 105.5 ± 1.1* 16.3 ± 1.2 90 45.5 ± 1.0* 163.7 ± 1.0* 2.9 ± 0.1* 105.0 ± 0.8* 16.8 ± 1.0 100 49.0 ± 0.9* 168.0 ± 0.6* 2.9 ± 0.1* 105.4 ± 1.0* 17.3 ± 1.3 110 50.8 ± 0.9* 170.9 ± 0.9* 2.9 ± 0.1* 105.6 ± 1.2* 18.0 ± 1.3 120 52.7 ± 1.1* 172.6 ± 1.0* 2.9 ± 0.1* 105.4 ± 1.2* 18.5 ± 1.5 Tabla 8: Valores (media – ES) de bicarbonato (HCO 3 - ), sodio (Na + ), potasio (K + ), cloro (Cl -) y anion gap (AG) del Grupo IV: Alcalosis Metabólica. * p<0.05 con resp ecto al grupo Control en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 174 Al analizar las variaciones que sufren las variables independientes del estado ácido - base en los perros sometidos a Alcalosis Metabólica (Tabla 9), se observó un incremento en los valores de PCO 2 . A pesar de que en estos perros la ventilación se mantuvo constante, se produjo una elevación significativa de PCO 2 , que evolucionó desde unos niveles basales de 34.1 ± 1.0 mmHg hasta 45.1 ± 1.7 mmHg, al final del experimento. Como cabía esperar, la va riable independiente que se altera de forma más marcada es el SID. Este parámetro experimentó un notable incremento a lo largo de la experiencia. Así, partiendo de niveles basales de 36.7 ± 1.0 mEq/l, que no difieren significativamente de los del grupo Con trol, el SID se fue elevando progresivamente hasta alcanzar valores finales que prácticamente duplican los basales (71.1 ± 0.5 mEq/l). Todos los valores de SID registrados a partir del minuto 10 fueron significativamente más altos que los del grupo Contro l. La concentración de ácidos débiles no volátiles (At) no experimentó grandes variaciones en los perros sometidos a Alcalosis Metabólica. Aunque no se detectó una tendencia a la elevación de At, de forma puntual, se registraron 2 valores significativamen te más elevados. Finalmente, ni los valores de PO 2 y ni la concentración de albúmina experimentaron cambios significativos a lo largo de los experimentos. IV Resultados 175 TIEMPO (minutos) PO 2 (mmHg) PCO 2 (mmHg) SID (mEq/l) At (mEq/l) Alb (g/dl) - 15 109.0 ± 6.7 34.4 ± 0.9 35.8 ± 1.2 9.5 ± 0.4 2.8 ± 0.1 - 10 110.1 ± 7.2 34.1 ± 0.9 36.5 ± 1.0 8.8 ± 0.3 2.5 ± 0.1 - 5 106.7 ± 6.2 33.9 ± 0.9 36.5 ± 1.2 9.0 ± 0.4 2.5 ± 0.1 0 107.6 ± 5.9 34.1 ± 1.0 36.7 ± 1.0 8.7 ± 0.5 2.5 ± 0.1 10 105.3 ± 5.5 38.0 ± 1.1* 42 .2 ± 1.0* 9.0 ± 0.3 2.5 ± 0.1 20 108.4 ± 6.4 38.7 ± 1.3* 44.6 ± 1.0* 9.3 ± 0.4 2.5 ± 0.1 30 106.0 ± 6.3 39.4 ± 1.2* 47.2 ± 1.1* 9.3 ± 0.5 2.5 ± 0.2 40 104.9 ± 6.5 40.0 ± 1.2* 49.4 ± 1.1* 9.5 ± 0.4 2.5 ± 0.1 50 104.5 ± 7.0 41.1 ± 1.2* 51 .8 ± 1.1* 9.3 ± 0.3 2.4 ± 0.1 60 108.4 ± 8.7 42.5 ± 1.2* 54.8 ± 0.9* 9.4 ± 0.4 2.4 ± 0.1 65 108.6 ± 7.4 42.5 ± 1.4* 54.7 ± 0.9* 9.1 ± 0.3 2.3 ± 0.1 70 105.9 ± 7.9 42.2 ± 1.0* 56.5 ± 0.8* 9.2 ± 0.4 2.3 ± 0.1 75 112.5 ± 9.4 43.2 ± 1.3* 57 .3 ± 1.1* 9.4 ± 0.6 2.4 ± 0.2 80 106.1 ± 8.7 43.2 ± 1.0* 59.2 ± 1.0* 9.8 ± 0.4* 2.5 ± 0.1 85 106.0 ± 8.6 43.2 ± 1.2* 59.8 ± 1.3* 8.9 ± 0.2 2.2 ± 0.1 90 103.7 ± 8.2 44.9 ± 1.2* 62.0 ± 1.1* 9.3 ± 0.3* 2.4 ± 0.1 100 94.2 ± 8.9 45.1 ± 1. 5* 66.2 ± 0.7* 9.1 ± 0.4 2.3 ± 0.1 110 96.0 ± 9.6 45.0 ± 1.7* 68.9 ± 0.4* 9.7 ± 0.5 2.4 ± 0.1 120 95.1 ± 8.9 45.1 ± 1.7* 71.1 ± 0.5* 9.3 ± 0.5 2.3 ± 0.1 Tabla 9 : Valores (media – ES) de PO 2 , PCO 2 , diferencia de iones fuertes (SID), ácido s débiles no volátiles (At) y albúmina plasmática (Alb) del Grupo IV: Alcalosis Metabólica. * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control, en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 176 Grupo V: Alcalosis Respiratoria En los perros de este grupo, el pH sanguíneo se incrementó de forma significativa con respecto al grupo Control. Así, partiendo de un valor basal de 7.38 ± 0.02 se alcanzaron niveles de 7.59 ± 0.02, en la primera hora de los experimentos, y de 7.63 ± 0.02, al final de los mismos. Desde el minuto 10 has ta el final de la experiencia los valores de pH fueron significativamente más elevados que los del grupo Control (Figura 29). La infusión de una pequeña cantidad de Cl 2 Ca consiguió mantener la concentración de Ca 2+ prácticamente constante durante la prime ra hora, en niveles muy cercanos a los basales (1.23 ± 0.01 mmol/l). En la segunda hora, se produjo un descenso de Ca 2+ prácticamente idéntico al observado en el grupo Control. La concentración mínima de Ca 2+ , 0.79 ± 0.02 mmol/l, se mantuvo estable desde el minuto 90 hasta el final de la experiencia. Al igual que en el resto de los grupos, no se detectaron diferencias significativas con respecto al grupo Control en los niveles de Ca 2+ de los perros sometidos a Alcalosis Respiratoria. La concentración plas mática de PTH se redujo de forma considerable justo después de iniciarse el protocolo de Alcalosis Respiratoria. Así, partiendo de una concentración basal media de 26.9 ± 7.1 pg/ml, que no presentaba diferencias significativas respecto de la del grupo Cont rol, los niveles de PTH prácticamente llegaron a suprimirse, alcanzando una concentración de 1.8 ± 0.6 pg/ml en el minuto 60. Todos los valores de PTH registrados durante la primera hora fueron significativamente más bajos en el grupo de Alcalosis Respira toria que en el grupo Control. Durante el periodo de hipocalcemia, en el grupo de Alcalosis Respiratoria, los niveles de PTH se mantuvieron por debajo de los del grupo Control hasta el minuto 90. En este punto se alcanzó la concentración máxima de PTH, 20 9.6 ± 26.1 pg/ml, la cual no difiere significativamente de la del grupo Control. IV Resultados 177 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca (mM) 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 2+ 0 300 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) PTH ( pg /ml) 100 200 60 90 120 300 0 25 50 * * * ******* * * * * * * * * * * * * * * * pH Figura 29 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del Grupo V: Alcalosis Respiratoria ( ). * p<0.05 con respecto al Grupo I: Co ntrol ( ) en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 178 En la Tabla 10 se observa que en los perros sometidos a Alcalosis Respiratoria se produjo un descenso en los niveles plasmáticos de bicarbonato. La bicarbonatemia se redujo, desde unos niveles basales d e 19.9 ± 1.0 mEq/l, hasta 11.3 ± 0.9 mEq/l, al final de los experimentos. Todos los valores de bicarbonato registrados a partir del minuto 10 fueron significativamente más bajos que los del grupo Control. La concentración plasmática del resto de los elect rólitos no manifestó grandes variaciones a lo largo de los experimentos. Aunque se registraron diferencias significativas con respecto al grupo Control, la disminución en la natremia fue muy moderada. El descenso de sodio con respecto a los niveles basales , 140.3 ± 1.0 mEq/l, no fue significativo y nunca fue superior a 1.5 mEq/l. En cuanto al K + , sus niveles presentaron una tendencia levemente descendente, muy similar a la observada en los perros del grupo Control (desde un valor basal de 4.2 ± 0.1 mEq/l hasta 3.4 ± 0.1 mEq/l), presentando diferencias significativas respecto de esos valores basales desde el minuto 40. Con respecto al Cl - , se registró una pequeña aunque progresiva elevación en su concentración plasmática respecto de los valores basales, per o no se llegaron a alcanzar valores significativamente superiores a los medidos en el grupo Control. Finalmente, debido a que el descenso de bicarbonato que se produjo en este grupo fue de mayor magnitud que el aumento de Cl - , el anion gap sufrió un lige ro aumento a lo largo del experimento. Esta elevación del anion gap presenta significación estadística, con respecto a los niveles del grupo Control, a partir del minuto 50 de la experiencia. IV Resultados 179 TIEMPO (minutos) HCO 3 - (mEq/l) Na + (mEq/l) K + (mEq/ l) Cl - (mEq/l) AG (mEq/l) - 15 19.9 ± 1.0 140.1 ± 0.6 4.3 ± 0.1 108.4 ± 0.8 16.1 ± 0.9 - 10 19.9 ± 1.0 140.6 ± 0.7 4.2 ± 0.1 108.7 ± 0.8 16.2 ± 0.7 - 5 19.9 ± 0.9 140.7 ± 0.6 4.2 ± 0.1 108.8 ± 1.0 16.2 ± 0.7 0 19.9 ± 1.0 140.3 ± 0.7 4.2 ± 0.1 108.5 ± 0. 8 16.0 ± 0.6 10 18.4 ± 0.7* 140.0 ± 0.6 4.1 ± 0.1 109.7 ± 0.9 16.1 ± 0.5 20 17.5 ± 0.5* 139.4 ± 0.7* 4.1 ± 0.1 109.9 ± 1.0 16.1 ± 0.5 30 16.6 ± 0.5* 139.5 ± 0.6* 4.0 ± 0.1 110.1 ± 0.8 16.8 ± 0.5 40 15.9 ± 0.5* 139.3 ± 0.6* 4.0 ± 0.1 110.1 ± 0.8 17.1 ± 0.3 50 15.1 ± 0.5* 139.2 ± 0.5* 3.9 ± 0.1 110.5 ± 0.9 17.5 ± 0.5* 60 14.5 ± 0.5* 139.0 ± 0.6* 3.9 ± 0.1 110.6 ± 0.8 17.7 ± 0.6* 65 13.9 ± 0.5* 139.2 ± 0.7* 3.9 ± 0.1 110.5 ± 0.9 18.7 ± 0.6* 70 13.7 ± 0.5* 139.6 ± 0.5* 3.8 ± 0.1 111.0 ± 0.8 18.6 ± 0.6* 75 13.3 ± 0.5* 139.5 ± 0.5 3.7 ± 0.1 111.2 ± 1.0 18.7 ± 0.8* 80 13.0 ± 0.5* 139.1 ± 0.5* 3.6 ± 0.1 110.9 ± 0.8 18.8 ± 0.7* 85 12.6 ± 0.6* 139.4 ± 0.7 3.6 ± 0.1 110.9 ± 0.8 19.5 ± 0.4* 90 12.4 ± 0.5* 139.6 ± 0.7* 3.5 ± 0.1 111.1 ± 1.0 19.6 ± 0.7* 100 12.1 ± 0.7* 140.4 ± 0.7 3.4 ± 0.1 112.1 ± 0.9 19.7 ± 1.1* 110 11.7 ± 0.8* 140.4 ± 0.5 3.4 ± 0.1 112.6 ± 0.9 19.5 ± 1.3* 120 11.3 ± 0.9* 140.6 ± 0.6 3.4 ± 0.1 113.1 ± 0.7 19.5 ± 1.5* Tabla 10: Valores (media – ES) de bicarbonato (HCO 3 - ), sodio (Na + ), p otasio (K + ), cloro (Cl -) y anion gap (AG) del Grupo V: Alcalosis Respiratoria. * p<0.05 con respecto al grupo Control en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 180 Como observamos en la Tabla 11, se produjo una reducción considerable de los niveles de PCO 2 a lo largo de los experimentos. La presión parcial de PCO 2 bajó de forma progresiva desde 34.0 ± 0.7 mmHg, en situación basal, hasta 11.0 ± 0.9 mmHg, en el minuto 120. Los niveles de PCO 2 fueron significativamente inferiores a los del grupo Control a partir de l minuto 10. El SID experimentó un ligero descenso a lo largo de la experiencia, obteniéndose valores significativamente inferiores a los del grupo Control a partir del minuto 20. No obstante, la disminución de SID es bastante moderada, no superando en n ingún caso los 5 mEq/l. No se han encontrado variaciones significativas en los niveles de At a lo largo de los experimentos. Los valores de este parámetro experimentaron pequeñas fluctuaciones alrededor de sus niveles basales, 8.5 ± 0.4 mEq/l; sin embarg o, al final de los experimentos se constató un leve descenso del At respecto de estos valores basales. La cuantificación de la PO 2 en la sangre arterial de los perros sometidos a Alcalosis Respiratoria permitió obtener unos niveles basales cercanos a 100 mm de Hg, similares a los recogidos en el grupo Control. En el transcurso de los experimentos se observó una moderada elevación de PO 2 que tan sólo arrojó significación estadística en el minuto 40 de la experiencia. Al igual que ocurrió en los demás grupo s estudiados con anterioridad, la concentración de albúmina plasmática en los perros sometidos a Alcalosis Respiratoria permaneció prácticamente invariable a lo largo del las dos horas de experimento, fluctuando entre 2.5 y 2.3 g/dl. IV Resultados 181 TIEMPO (minutos) P O 2 (mmHg) PCO 2 (mmHg) SID (mEq/l) At (mEq/l) Alb (g/dl) - 15 93.3 ± 6.7 34.4 ± 0.8 36.0 ± 1.0 9.1 ± 0.5 2.6 ± 0.1 - 10 92.5 ± 6.1 34.3 ± 0.8 36.1 ± 0.9 9.0 ± 0.4 2.5 ± 0.1 - 5 93.3 ± 6.3 34.2 ± 0.7 36.1 ± 0.9 9.0 ± 0.4 2.5 ± 0.1 0 94.2 ± 6.3 34 .0 ± 0.7 35.9 ± 0.8 8.5 ± 0.4 2.4 ± 0.1 10 109.3 ± 8.2 24.5 ± 1.2* 34.4 ± 0.8 9.4 ± 0.5 2.5 ± 0.1 20 111.2 ± 8.0 22.0 ± 1.0* 33.6 ± 0.7* 9.1 ± 0.4 2.4 ± 0.1 30 109.1 ± 5.3 20.0 ± 0.9* 33.4 ± 0.6* 9.4 ± 0.4 2.5 ± 0.1 40 111.3 ± 5.3* 19.2 ± 1.4* 33.0 ± 0 .6* 9.2 ± 0.5 2.5 ± 0.1 50 109.3 ± 6.9 16.7 ± 0.5* 32.6 ± 0.6* 9.2 ± 0.4 2.5 ± 0.1 60 110.6 ± 6.2 15.6 ± 0.5* 32.2 ± 0.6* 8.9 ± 0.4 2.4 ± 0.1 65 114.2 ± 7.4 14.7 ± 0.4* 32.6 ± 0.5* 8.9 ± 0.3 2.4 ± 0.1 70 111.6 ± 7.2 14.3 ± 0.3* 32.3 ± 0.4* 8.7 ± 0.5 2. 4 ± 0.1 75 114.1 ± 7.0 13.8 ± 0.4* 31.9 ± 0.7* 8.4 ± 0.4 2.3 ± 0.1 80 118.8 ± 6.9 13.4 ± 0.3* 31.8 ± 0.6* 8.9 ± 0.3 2.5 ± 0.1 85 118.6 ± 7.7 13.0 ± 0.4* 32.1 ± 0.4* 8.3 ± 0.3 2.3 ± 0.1 90 116.0 ± 6.2 12.9 ± 0.4* 32.0 ± 0.5 * 8.3 ± 0.3 2.4 ± 0.1 100 121 .9 ± 6.6 12.3 ± 0.6* 31.7 ± 0.7* 8.0 ± 0.4 2.3 ± 0.1 110 122.1 ± 6.7 11.6 ± 0.7* 31.2 ± 0.8* 7.8 ± 0.4 2.3 ± 0.1 120 122.4 ± 7.6 11.0 ± 0.9* 30.8 ± 0.9* 7.8 ± 0.4 2.3 ± 0.1 Tabla 11 : Valores (media – ES) de PO 2 , PCO 2 , diferencia de iones fuertes (SID) , ácidos débiles no volátiles (At) y albúmina plasmática (Alb) del Grupo V: Alcalosis Respiratoria. * p<0.05 con respecto al Grupo I: Control, en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 182 Al analizar los valores de la Tabla 8, se aprecia que en los perros somet idos a Alcalosis Metabólica se produjeron notables incrementos en las concentraciones plasmáticas de bicarbonato y de sodio. Estos cambios iónicos, consecuencia de la infusión intravenosa de gran cantidad de NaHCO 3 , eran previsibles y necesarios para produ cir el incremento de pH sanguíneo deseado. Sin embargo, la gran elevación de Na + y de HCO 3 - en los perros con Alcalosis Metabólica, también dio lugar a un notable aumento de la osmolaridad plasmática. En la Figura 30 se presenta la la evolución de la natr emia, a lo largo del tiempo, en los grupos Control, Alcalosis Metabólica y Alcalosis Respiratoria. Como se aprecia, en el grupo de Alcalosis Metabólica se produjo un incremento en los niveles plasmáticos de Na + que determinó una elevación en la osmolaridad del plasma de aproximadamente 60 mOsmol/l. Aunque la relación entre osmolaridad plasmática y secreción de PTH es un tema controvertido y poco estudiado, existen referencias bibliográficas que sugieren que los cambios de osmolaridad y de fuerza iónica pue den influir en la secreción de PTH. Por ello, nos pareció importante descartar la interferencia de este fenómeno en nuestro estudio. Con este objetivo, se diseñó un nuevo grupo experimental en el que se elevase la osmolaridad plasmática, incrementando los niveles de Na + igual que en el grupo de Alcalosis Metabólica, sin que se produjeran cambios en el pH sanguíneo. De esta forma se puede estudiar la respuesta de las glándulas paratiroides a una situación de hipertonicidad plasmática y diferenciarla del ef ecto de la Alcalosis Metabólica. IV Resultados 183 TIEMPO ( min ) 0 30 60 90 120110 130 150 170 190 Na + ( mEq /L) TIEMPO ( min ) Na + ( mEq /L) 0 30 60 90 120110 130 150 170 190 * * * * ***** * *** ** Osm = 60 mOsm /l Osm = 0 mOsm /l A B Figura 30. A. Niveles de Na + en el grupo Control ( ) y en el grupo Alcalosis Metabólica ( ). B Niveles de Na + en el grupo Control ( ) y en el grupo Alcalosis Respiratoria ( ). * p< 0.05 respect o del grupo Control en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 184 Grupo VI: Control Hiperosmolar Al realizar experimentos preliminares en los que se infundió solución hipertónica de NaCl, se observó que el pH sufría una ligero descenso a lo largo de las dos ho ras de la experiencia. Por ello fue necesario modificar esta solución hipertónica, adicionando una pequeña cantidad de NaHCO 3 , con el fin de prevenir el descenso del pH sanguíneo. De esta forma, como se aprecia en la Figura 31, se consiguió que el pH se m antuviera estable durante todo el experimento. Además, los niveles de pH del Grupo VI no mostraron diferencias significativas con respecto al grupo Control en ningún punto del experimento. En este grupo, los valores basales de Ca 2+ fueron 1.21 ± 0.02 mmo l/l. Gracias a la infusión de una solución de Cl 2 Ca se mantuvieron estables durante la primera hora del experimento, mostrando fluctuaciones inferiores a 0.02 mmol/l. El descenso de Ca 2+ durante la siguiente hora fue muy similar a la producida en el grupo Control. Los valores de Ca 2+ registrados en los perros del Grupo VI no mostraron diferencias significativas respecto del grupo Control . En cuanto a la PTH, durante la primera hora de clamp normocalcémico, se observó un ligero incremento en su concentrac ión plasmática. El aumento en los niveles de PTH del grupo Control Hiperosmolar es significativo, comparado con el grupo Control Normosmolar, en los minutos 50 y 60 del experimento. A partir del minuto 60, con la inducción de hipocalcemia, los niveles de P TH del Grupo VI evolucionaron de forma muy parecida a los del grupo Control, alcanzándose una concentración máxima de 228.3 ± 39.4 pg/ml. IV Resultados 185 Figura 31 . Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y Hormona Paratiroidea (PTH) en los perros del Grupo VI: Control H iperosmolar ( ). * p<0.05 con respecto al Grupo Control ( ) en el mismo tiempo (t - test no pareado). Ca (mM)2+ 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 25 50 0 300 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) PTH ( pg /ml) 100 200 60 90 0120 300 0 30 60 90 1207.2 7.3 7.4 7.5 7.6 pH ** IV Resultados 186 En la Figura 32 se presenta, de forma comparada, la evolución de las concentraciones plasmáticas de bicarbonato, sodio y PTH en el grupo de Alcalosis Metabólica y en el grupo Control Hiperosmolar. Los niveles de bicarbonato, que en el grupo de Alcalosis Metabólica ascendieron progresivamente hasta alcanzar niveles de 52.7 ± 1.1 mEq/l, se mantuvieron constantes en el grupo Control Hiperosmolar , fluctuando muy poco alrededor del nivel basal, 19.9 ± 0.7 mEq/l. La evolución de la natremia, por el contrario, es prácticamente idéntica en los dos grupos y no se aprecian diferencias significativas entre ambos. Partiendo de unos niveles basales muy similares: 141.0 ± 1.2 mEq/l, en el grupo Control Hiperosmolar, y 142.4 ± 0.5 mEq/l, en el grupo de Alcalosis Metabólica, los niveles de Na se elevaron hasta alcanzar en valores ligeramente superiores a 170 mEq/l. Durante el periodo de normocalcemia, la concentración plasmática de PTH cambió en direcciones opuestas en estos grupos. En el grupo de Alcalosis Metabólica, como ya se había descrito con anterioridad, los niveles de PTH experimentaron una reducción progresiva. En el grupo Control Hiperosmolar, p or el contrario, se observó una tendencia ascendente. Todos los valores de PTH registrados desde minuto 10 hasta el minuto 60 difirieron significativamente. En la fase hipocalcémica, la concentración de PTH en el grupo de Alcalosis Metabólica continuó sie ndo significativamente más baja que la del grupo Control Hiperosmolar hasta el minuto 85. A partir de este momento desaparecieron las diferencias registrándose una PTH muy similar en ambos grupos (232 ± 31.6 pg/ml y 228.3 ± 39.4 pg/ml). IV Resultados 187 0 30 60 90 1200 10 20 40 60 Na + ( mEq /L) 0 30 60 90 120 150 170 130 110 190 25 50 0 300 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) PTH ( pg /ml) 100 200 60 90 0120 300 ** * ******* * * * * * * * * * * * * * * * * Osm = 60 mOsm /l Bicarbonato ( mEq /L) Figura 32 . V alores de bicarbonato, sodio (Na + ) y Hormona Paratiroidea (PTH) del Grupo IV: Alcalosis Metabólica ( ) y del Grupo VI: Control Hiperosmolar ( ) * p<0.05 en el mismo tiempo (t - test no pareado) . IV Resultados 188 Finalmente, se presenta la evolución de los niveles de fósforo inorgánico a lo largo de los experimentos. Debido a su especial relevancia en la secreción de PTH, hemos preferido presentar los datos de fósforo independientemente del resto de los electrólitos. Así, en la Figura 33 aparecen los resulta dos de las mediciones de fósforo realizadas en los grupos de Acidosis y de Alcalosis comparados con el grupo Control. La concentración plasmática de fósforo inorgánico no sufrió modificaciones importantes en el grupo Control, manteniéndose estabilizada d urante toda la experiencia en niveles en torno a 3 mg/dl. Los niveles de fósforo también permanecieron estables en el grupo de Acidosis Metabólica, sin que se observaran diferencias significativas con respecto al Control. En el grupo de Acidosis Respirat oria se registró un ligero incremento de la fosforemia, midiéndose algunos valores por encima de 4 mg/dl. Esta elevación de fósforo sólo alcanzó significación estadística de forma transitoria en algunos momentos durante la fase de hipocalcemia. En el grup o de Alcalosis Metabólica los niveles de fósforo inorgánico permanecieron invariables durante toda la experiencia, situándose alrededor de 3 mg/dl, sin que se apreciaran diferencias significativas con respecto al grupo Control. En los perros sometidos a A lcalosis Respiratoria, por el contrario, se observó un descenso progresivo de la fosfatemia. Estos animales, que tenían unos niveles basales similares a los del grupo Control, 3.6 ± 0.3 mg/dl, experimentaron una disminución progresiva de la fosfatemia a lo largo de las dos horas de experimento, alcanzando un valor mínimo de 1.3 ± 0.3 mg/dl, a los 120 minutos. Todos los valores de fósforo registrados en el grupo de Alcalosis Respiratoria a partir del minuto 80 son significativamente más bajos que los del gr upo Control. IV Resultados 189 TIEMPO ( min ) F ó sf oro ( mg /dl) 0 30 60 90 1200 1 2 3 4 5 6 TIEMPO ( min ) F ó sf oro ( mg /dl) 0 30 60 90 1200 1 2 3 4 5 6 * * * * ** * * A B Figura 33. A. Valores de Fósforo en los grupos de Acidosis Metabólica: Grupo IIB ( ) Acidosis Respiratoria: Grupo IIIB ( ) y Control: Grupo I ( ) B. Valores de Fósforo en los grupos de Alcalosis Metabólica: Grupo IV ( ), Alcalosis Respiratoria: Grupo V ( ) y Control: Grupo I ( ), * p <0.05 respecto del grupo Control en el mismo tiempo (t - test no pareado). IV Resultados 190 A continuación, se resumen los resultados obtenidos al estudiar el efecto del pH sobre la secreción de PTH. Con e l fin de obtener una visión de conjunto, se presentan los datos de pH, Ca 2+ y PTH comparando el grupo Control con los dos grupos de Acidosis, por un lado, y el grupo Control con los dos grupos de Alcalosis, por otro. Como se observa en la Figura 34, el de scenso de pH fue prácticamente idéntico en los dos grupos de Acidosis. Los niveles basales de pH en ambos grupos no diferían de los del grupo Control, pero a partir del minuto 10 ya se observó un pH significativamente más bajo en los grupos de Acidosis. Lo s valores de pH en los grupos de Acidosis se situaron alrededor de 7.2, en el minuto 60, y de 7.1 en el minuto 120. No se observaron diferencias significativas en la concentración plasmática de Ca 2+ a lo largo de toda la experiencia. Durante la primera h ora la calcemia se mantuvo constante, en los niveles basales, tanto en el grupo Control como en los grupos de Acidosis (en estos últimos gracias a la infusión de EDTA). De la misma manera, la evolución de la calcemia durante la segunda hora de la experienc ia fue prácticamente idéntica en los tres grupos. Durante la primera hora de los experimentos (fase normocalcémica) se observó un incremento significativo en la concentración plasmática de PTH en los grupos de Acidosis. Los perros sometidos a Acidosis Met abólica y a Acidosis Respiratoria (con control de Mg) presentaron una concentración de PTH cercana a 100 pg/ml en normocalcemia. En esta fase no se apreciaron diferencias entre los dos tipos de acidosis. Durante la inducción de hipocalcemia, los niveles de PTH fueron muy similares en el Grupo Control y en el de Acidosis Respiratoria (alrededor de 250 pg/ml). En el grupo de Acidosis Metabólica, por el contrario, se registró una concentración de PTH significativamente más alta que en los otros dos grupos, ll egando a alcanzar valores de 450 pg/ml. IV Resultados 191 pH 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca 2+ (mM) 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) 0 30 60 90 1200 100 200 300 400 500 a a a a a a a a a a a a a a a aba b ab a b a a aaaaaa a b a b a b a b Figura 34. Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ) y PTH en los grupos de Acidosis Metabólica: Grupo IIB ( ), Acidosis Respiratoria: Grupo IIIB ( ) y Control: Grupo I ( ), a p <0.05 respecto del grupo C ontrol, b p<0.05 respecto del grupo de Acidosis Respiratoria, en el mismo tiempo (t - test no pareado) IV Resultados 192 Al igual que sucedía en los grupos de Acidosis, la evolución del pH fue muy parecida en los grupos de Alcalosis Metabólica y Alcalosis Respiratoria (Figura 35). En ambos casos se produjo un incremento de pH que fue estadísticamente significativo a partir del minuto 10. Los valores de pH continuaron ascendiendo durante toda la experiencia alcanzando niveles cercanos a 7.70 al final de la misma. La evolución d e la calcemia fue prácticamente idéntica en el grupo Control y en los dos grupos de Alcalosis. Durante la primera hora de los experimentos, la concentración Ca 2+ se mantuvo estabilizada en niveles basales tanto en el grupo Control como en los grupos de Alc alosis (en este caso gracias a la infusión simultánea de CaCl 2 ). Asimismo, los tres grupos experimentaron una reducción en la concentración de Ca 2+ muy parecida durante la segunda hora de la experiencia. Durante la fase normocalcémica se registró una dism inución significativa en la concentración plasmática de PTH en los grupos de Alcalosis. A partir del minuto 10, los niveles de PTH en el grupo de Alcalosis Metabólica y en el grupo de Alcalosis Respiratoria fueron significativamente más bajos que los del g rupo Control. La concentración plasmática de PTH llegó a disminuir por debajo de 5 pg/ml en los grupos de Alcalosis y el descenso de PTH fue más acusado en la Alcalosis Respiratoria. Durante la estimulación hipocalcémica, en la segunda hora de la experienc ia, los grupos de Alcalosis mostraron valores de PTH inferiores a los del grupo Control entre los minutos 60 y 80, aunque la secreción máxima de PTH, alcanzada a partir del minuto 90, fue muy parecida en los tres grupos. IV Resultados 193 25 50 0 20 400 0 100 200 300 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) PTH ( pg /ml) 60 80 100 120 0 30 60 90 1207 7.2 7.4 7.6 7.8 Ca (mM) 0 30 60 90 1200.6 0.8 1 1.2 1.4 2+ b b b b b b ab ab ab ab ab ab ab ab ababababababababababababab ab ab ab pH Figura 35. Valores de pH , Calcio iónico Ca 2+ y PTH en los grupos de Alcalosis Metabólica: Grupo IV ( ), Alcalosis Respiratoria: Grupo V ( ) y Control ( ). a p <0.05 respecto del grupo Alcalosis Metabólica, b p<0.05 respecto del grupo de Alcalosis Respiratoria, en el mismo tiempo (t - test no pareado) IV Resultados 194 Con el fin de relacionar la evolución de los distintos parámetros indicadores del estado ácido – base con la concentración de PTH encontrada, se han elaborado unas curvas pH - PTH y bicarbonato - PTH a partir de los valores extra polados gráficamente en cada uno de los perros en la fase de normocalcemia. Además de estas curvas, se presenta también una representación gráfica, en forma de nube de puntos, de la relación entre PTH y PCO 2, SID y At, así como una tabla donde se expresa l a relación de estas variables independientes con la PTH, a través de modelos de regresión múltiple. En la Figura 36 se representan las curvas pH - PTH y bicarbonato - PTH, diferenciadas en procesos metabólicos y respiratorios. El coeficiente de correlación d e Pearson muestra la existencia de una marcada correlación inversa entre la PTH y el pH en ambos tipos de procesos: r = - 0.710, p< 0.01 (metabólicos), y r= - 0.722 , p < 0.01 (respiratorios). Así, un desplazamiento del pH desde un nivel fisiológico (7.38 - 7. 42), en donde existen niveles de PTH entre 20 y 30 pg/ml, hacia el rango de acidosis (7.4 → 7.2) produce un incremento en la concentración de PTH hasta niveles cercanos a los 90 pg/ml, en ambos tipos de procesos. Esencialmente, un descenso del pH sanguíneo de 0.01 unidad equivale, aproximadamente, a un incremento de 5 pg/ml de PTH. De forma inversa, cuando se produce una elevación del pH, elevándose por encima del fisiológico, se produce una reducción considerable en la concentración de PTH en ambos tipos d e procesos, llegando prácticamente a suprimirse los niveles plasmáticos de esta hormona cuando se alcanza un pH de 7.6. En el caso de la curva bicarbonato -PTH, como vemos en la Figura 36B, existe una marcada diferencia entre las alteraciones del pH de or igen respiratorio y metabólico. En los procesos respiratorios la relación entre la PTH y el bicarbonato plasmático es similar a lo observado entre PTH y pH, una relación inversa con un coeficiente de correlación de Pearson r = - 0.565, p < 0.01. En cambio, en los procesos respiratorios encontramos que, a pesar de tener un rango de bicarbonato menor, existe una correlación directa entre la PTH y el bicarbonato (r = 0.537, p < 0.01). IV Resultados 195 pH PTH ( pg /ml) 7.2 7.3 7.4 7.5 7.60 20 40 60 80 100 120 Bicarbonato ( mEq /l) PTH ( pg /ml) 14 18 22 26 30 34 38 420 20 40 60 80 100 120 A B Figura 36. A. Curva pH - PTH en los proceso s metabólicos: Acidosis y Alcalosis Metabólica ( ) y en los procesos respiratorios: Acidosis y Alcalosis Respiratoria ( ) B. Curva bicarbonato -PTH en los procesos metabólicos: Acidosis y Alcalosis Metabólica ( ) y en los procesos respiratorios: A cidosis y Alcalosis Respiratoria ( ). IV Resultados 196 El análisis de la relación existente entre la PTH y los niveles de PCO 2 , muestra que en el caso de los procesos metabólicos (Figura 37A) no hay una correlación aparente entre dichas variables, fenómeno que se confi rma con el coeficiente de correlación de Pearson r = 0.026, p = 0.718. En el caso de los procesos respiratorios, en donde se dio un amplio rango de valores de PCO 2 , se observa que existe una relación directa muy clara entre la PTH y los niveles de PCO 2 p lasmáticos (coeficiente de correlación 0.752, p< 0.01) (Figura 37B). Así se obtienen los valores más elevados de PTH, hasta 160 pg/ml, con valores de PCO 2 por encima de 50 mm de Hg, y valores de PTH cercanos a 0 cuando los niveles de CO 2 se reducen por deb ajo de 25 mm de Hg. Esta correlación directa existe tanto en la Acidosis Respiratoria (r = 0.532, p < 0.01) como en la Alcalosis Respiratoria ( r = 0.721, p<0.01). IV Resultados 197 Figura 3 7 . A . Relación en forma de nube de puntos entre la PCO 2 y l a PTH en los procesos metabólicos: Acidosis Metabólica ( ) y Alcalosis Metabólica ( ). B . Relación en forma de nube de puntos entre la PCO 2 y la PTH en los procesos respiratorios: Acidosis Respiratoria ( ) y Alcalosis Respiratoira ( ) . r : coeficiente de correlación de Pearson. IV Resultados 198 Al relacionar mediante una correlación bivariable de Pearson las variables PTH y SID en los procesos metabólicos obtenemos un coeficiente r = 0.565, p < 0.01, lo que demuestra la existencia en este tipo de procesos de una relación inversa bastante fuerte entre ambas variables. Los niveles más elevados de PTH se alcanzan cuando se produce un descenso en el SID por debajo de 35 mEq/l, mientras que la concentración plasmática de PTH se acerca a cero cuando el SID se eleva por encima de 45 mEq/l, Figura 38A. Cuando se analiza esta misma correlación entre estas dos variables para los grupos con alteraciones respiratorias, aparece un correlación bastante más débil y en este caso positiva (r = 0.336, p < 0.01), es decir, exis te una correlación directa entre la PTH y el SID en los procesos respiratorios. Si se observa la representación gráfica de esta relación en la Figura 38B, vemos que, aunque existen una serie de puntos pertenecientes a la acidosis respiratoria que parecen e star fuera de la tendencia general, la mayoría de los puntos con unos niveles más bajos de PTH se corresponden con valores de SID por debajo de los niveles fisiológicos. IV Resultados 199 Figura 3 8 . A . Relación en forma de nube de puntos entre e l SID (diferencia de iones fuertes) y la PTH en los procesos metabólicos: Acidosis Metabólica ( ) y Alcalosis Metabólica ( ) . B . Relación en forma de nube de puntos entre la SID y la PTH en los procesos respiratorios: Acidosis Respiratoria ( ) y A lcalosis Respiratoria ( ). r : coeficiente de correlación de Pearson. IV Resultados 200 Si se observa la Figura 39, en donde están expresadas gráficamente la relación entre la concentración de PTH y los niveles de ácidos débiles totales no volátiles (At), veremos que, a parentemente, la tendencia de los puntos no muestra una relación evidente entre ambas variables, tanto en los procesos metabólicos como en los respiratorios. Cuando se analiza la correlación entre estas dos variables obtenemos unos coeficientes de correla ción reducidos, que son muy parecidos en ambos tipos de procesos (r = - 0.267, p < 0.01 en los procesos metabólicos, r = - 0.318, p < 0.01). Estos coeficientes, aunque son significativos debido al elevado número de casos, indican una relación inversa bastan te débil entre la PTH y el At. IV Resultados 20 1 Figura 39 . A . Relación en forma de nube de puntos entre la At (concentración total de ácidos débiles no volátiles) y la PTH en los procesos metabólicos: Acidosis Metabólica ( ) y Alcalosis M etabólica ( ) . B . Relación en forma de nube de puntos entre la At y la PTH en los procesos respiratorios: Acidosis Respiratoria ( ) y Alcalosis Respiratoira ( ) . r : coeficiente de correlación de Pearson. IV Resultados 202 En la tabla 12 se expresa la relación entr e las variables independientes del análisis cuantitativo del estado ácido -base con los niveles de PTH en cada uno de los grupos estudiados en esta fase, a través de modelos de regresión múltiple. De esta manera se intenta analizar la contribución individua l de cada una de estas variables en las varianza de PTH. Mediante el procedimiento de regresión múltiple “stepwise” se obtiene en el grupo de Acidosis Metabólica un modelo donde las variables SID, PCO 2 y At explican estadísticamente el 44.1 % de la varia nza de la PTH, de la cuál el 33.8 % se debe al SID, y el resto se reparte entre At (10.6 %) y PCO 2 (1 %). En el grupo de Acidosis Respiratoria obtenemos un modelo donde la PCO 2 explica la mayor parte de la variación de PTH (37.5 %), y después está el SI D con un 25.4 % y sólo un 1 % para el At. Al aplicar este análisis de regresión múltiple en la Alcalosis Metabólica, observamos que las variables SID, PCO 2 y At predicen el 38 % de la variación de PTH, siendo el SID la más importante (37.7 %), mientras q ue PCO 2 y At apenas influyen. Por último, en el grupo de Alcalosis Respiratoria la regresión múltiple revela que el 59.7 % de la variación de PTH se explica por la variables independientes del análisis cuantitativo del estado ácido base. En este caso, la PCO 2 es la variable que predice la mayor parte de esa variación (50.6 %), después está la variable SID (8.1 %) y de nuevo la variable At es la que menos aporta al modelo (1 %). La significación de este análisis mediante ANOVA fue en Acidosis Metabólica F = 4.443, p<0.001; en Acidosis Respiratoria F=25.582, p<0.001; en Alcalosis Metabólica F=17.557, p<0.001 y en Alcalosis Respiratoria F=35.567, p<0.001. IV Resultados 203 GRUPO Variable Coeficientes ± ES Valor t P R 2 Cambio R 2 AC IDOSIS METAB. (Constante) 1045.421 ± 120.080 8.706 0.000 SID - 21.771 ± 3.031 7.182 0.000 0.338 0.338 At - 41.794 ± 8.469 - 4.935 0.000 0.444 0.106 PCO 2 4.550 ± 2.947 1.544 0.125 0.441 0.010 ACIDOSIS RESPIR. (Constante) 242.185 ± 74.731 3.421 0.002 PCO2 2.834 ± 0.344 8 .238 0.000 0.375 0.375 SID - 6.900 ± 1.243 - 5.553 0.000 0.612 0.254 At - 6.108 ± 5.180 - 1.179 0.245 0.616 0.012 AL CALOSIS METAB. (Constante) 58.388 ± 15.127 3.860 0.000 SID - 1.294 ± 0.233 - 5.542 0.000 0.377 0.377 PCO 2 0.210 ± 0.345 0.610 0.543 0. 378 0.001 At 0.627 ± 1.165 0.539 0.592 0.380 0.002 ALCALOSIS RESPIR. (Constante) - 56.70 ± 10.779 - 5.360 0.000 PCO 2 0.700 ± 0 .151 4.641 0.000 0.506 0.506 SID 1.084 ± 0.449 2.415 0.018 0.587 0.081 At 1.177 ± 0.889 1.324 0.190 0.597 0.010 Tabla 12. Análisis de regresión múltiple (“stepwise”) en cada uno de los grupos, para analizar la contribución individual de cada una de las variables independientes del análisis cuantitativo del estado ácido - base en las varianza de la PTH. La significación de este análisis mediante ANOVA fue: en Acidosis Metabólica F= 4.443, p<0.001; en Acidosis Respiratoria F=25.582, p<0.001; en Alcalosis Metabólica F=17.557, p<0.001 y en Alcalosis Respiratoria F=35.567, p<0.001. IV Resultados 204 En la Figura 40 se re presentan las curvas Ca 2+ - PTH obtenidas en el grupo Control con los grupos de Acidosis (Figura 40A) y de Alcalosis (Figura 40B). En situación de normocalcemia, Ca 2+ =1.20 -1.25 mM, la concentración de PTH fue significativamente más elevada en los grupos de Acidosis (Metabólica y Respiratoria) que en el grupo Control. En el rango de Ca 2+ comprendido entre 1.15 y 0.8 mmol/l, los niveles de PTH en el grupo de Acidosis Metabólica fueron significativamente mayores que los del grupo Control y que los del grupo d e Acidosis Respiratoria, llegando a alcanzar una concentración máxima de 459.5 ± 62.0 pg/ml. Los niveles de PTH correspondientes al grupo de Acidosis Respiratoria se encuentran también por encima de los del grupo Control, aunque las diferencias de PTH entr e ambos grupos se reducen cuando se alcanzan niveles bajos de Ca 2+ , llegando a igualarse cuando la calcemia desciende por debajo de 0.9 mmol/l. Los grupos de Alcalosis Metabólica y Respiratoria presentaron una concentración de PTH significativamente meno r a la del grupo Control a niveles fisiológicos de Ca 2+ (1.20 mM). A lo largo de la mayor parte de la curva Ca 2+ -PTH, en un rango de Ca 2+ comprendido entre 1.2 y 0.9 mmol/l, los niveles de PTH fueron muy parecidos en los dos grupos de Alcalosis y significa tivamente inferiores a los del grupo Control. Finalmente, en los niveles más bajos de Ca 2+ (0.8 mmol/l) la concentración de PTH en los tres grupos fue prácticamente idéntica: 227 ± 17 pg/ml (Control), 229 ± 32 pg/ml (Alcalosis Metabólica) y 230 ± 27 pg/ml (Alcalosis Respiratoria). IV Resultados 205 PTH ( pg /ml) 0 100 200 300 400 500 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 Ca (mM)2+ PTH ( pg /ml) 100 0 150 50 200 250 300 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 Ca (mM)2+ ab ab ab abab abab ab a a A B c c c c c c Figura 40. A. Curva Ca 2+ -PTH en los grupos de Acidosis Metabólica ( ), Acidosis Respiratoria ( ) y Control ( ), a p <0.05 respecto del grupo Control, b p<0.05 respecto del grupo de Acidosis Respiratoria, en e l mismo tiempo (t - test no pareado). B. Curva Ca 2+ - PTH en los grupos de Alcalosis Metabólica ( ), Alcalosis Respiratoria ( ) y Control ( ), c p <0.05 respecto del grupo Alcalosis Metabólica y Respiratoria, en el mismo tiempo (t - test no pareado ). IV Resultados 206 SEGUNDA FASE: MODIFICACIÓN DEL ESTADO ACIDO - BASE SIN CONTROL DE CALCIO En esta fase se utilizó un único grupo de 7 animales a los que se les indujo Acidosis Metabólica durante una hora sin controlar el Ca 2+ . De esta forma se pretendía comprobar si el d escenso del pH se veía acompañado de una elevación de los niveles de PTH, a pesar del incremento del Ca 2+ que se produciría con pH bajo. Como se observa en la Figura 41, los valores de pH de este grupo descendieron de forma significativa, desde unos nivel es basales de 7.41 ± 0.03, hasta llegar a un pH de 7.18 ± 0.02 al final del experimento. El descenso del pH sanguíneo produjo un aumento progresivo de los niveles de Ca 2+ , que fue superior a 0.1 mM, pasando de unos niveles basales de 1.25 ± 0.02 mmol/l a 1.37 mmol/l, al final de los experimentos. Es interesante señalar que el incremento del Ca 2+ no es completamente lineal, apareciendo un pequeño escalón entre el minuto 20 y 30, donde parece darse un descenso parcial de la calcemia. En cuanto a los niveles de Mg, como puede apreciarse en esta misma figura, permanecieron invariables y similares a los basales durante todo el experimento. La concentración del PTH de este grupo de perros también se elevó significativamente, a pesar del aumento de Ca 2+ . La conce ntración basal de PTH, 22.8 ± 4.9 pg/ml, se incrementó hasta alcanzar un máximo de 49.4 ± 10.3 pg/ml, en el minuto 30. A partir de este momento y hasta el final de la experiencia se registró un descenso en los niveles de PTH, aunque permanecieron siempre p or encima de los basales. IV Resultados 207 pH 0 20 40 607.1 7.2 7.3 7.4 7.5 Ca 2+ (mM) Mg ( mEq /l) 0 20 40 601.2 1.3 1.4 0.5 1 1.5 2 TIEMPO ( min ) PTH ( pg /ml) 0 20 40 6015 25 35 45 55 65 * * * * * * * * ** * * * * Figura 41. Valores de pH, Calcio iónico (Ca 2+ ), magnesio total (Mg ) y Hormona paratiroidea (PTH) en el grupo de Acidosis Metabólica sin control del Ca 2+ ( ). * p < 0.05 respecto de los valores basales (ANOVA). IV Resultados 208 TERCERA FASE: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL ESTADO ACIDO - BASE EN EL METABOLISMO DE LA PTH. En la Figura 42 aparecen reflejadas la curvas de desaparición de la hormona paratiroidea en los distintos grupos experimentales. Los valores de PTH se expresan en % d e la concentración de PTH registrada en el minuto 90 de experimento, que en la mayoría de los grupos coincide con el valor máximo de PTH. Como se ha descrito en el apartado de Material y Métodos, la paratiroidectomía se realizó en el minuto 90. A partir d el momento en que se extirparon las glándulas paratiroides, la concentración plasmática de PTH fue descendiendo rápidamente en todos los animales. En los grupos de Acidosis (Figura 42A), los niveles de PTH permanecieron siempre algo más elevados que en el grupo Control, observándose diferencias significativas. Además, los valores de PTH post - paratiroidectomía también fueron significativamente más elevados en el grupo de Acidosis Metabólica que en el de Acidosis Respiratoria. Esto indica que en los grupos d e Acidosis, especialmente en el de Acidosis Metabólica, el ritmo metabólico de la PTH es inferior al del grupo Control. En ambos grupos de Alcalosis (Figura 42B), el descenso en los niveles de PTH registrado tras realizar la paratiroidectomía fue práctica mente idéntico al del grupo Control, no apreciándose diferencias significativas en ninguno de los tiempos estudiados. Es decir, el ritmo metabólico de la PTH no parece alterarse con los protocolos de Alcalosis. IV Resultados 209 Tiempo ( mi n ) PTH (%) 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 0 - 5 - 1 0 - 15 0 20 40 60 80 PTX 120 100 Tiempo ( mi n ) PTH (%) 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 0 - 5 - 1 0 - 15 0 20 40 60 80 100 PTX ab ab a ab ab ab a ab ab A B Figura 4 2 . A . Valores d e PTH (% del valor obtenido en el min. 90 de experimento) en los grupos de Acidosis Metabólica ( ), Acidosis Respiratoria ( ) y Control ( ) . B . Valores de PTH (% del valor obtenido en el min. 90 de experimento) en los grupos de Alcalosis Me t abólica ( ), Alcalosis Respiratoria ( ) y Control ( ). a p<0.05 respecto del Control, b p<0.05 respecto de acidosis respiratoria ( t - test no pareado). IV Resultados 210 Como se ha visto en la Figura 42, la curva de desaparición de la PTH en los distintos grupos se ajusta a una ecuación del tipo: C t = C o x e – kt , donde C t es la concentración en un tiempo determinado, C o es la concentración inicial y k es una constante que determina el ritmo de desaparición. A partir de esa constante (k) se puede calcular el tiempo de vida media (T 1/2 ) de la PTH mediante esta expresión: T 1/2 = ln2/k. Este parámetro es el que mejor define la cinética que sigue una determinada sustancia en el organismo y por lo tanto nos da idea del ritmo al que se metaboliza dicha sustancia. Al aju star los datos experimentales de cada uno de los grupos estudiados a esta ecuación se obtuvieron los siguientes coeficientes de regresión (media ± ES): r 2 = 0.904 ± 0.018, en grupo Control; r 2 = 0.934 ± 0.010, en Acidosis Metabólica; r 2 =0.910 ± 0.016, e n Acidosis Respiratoria; r 2 = 0.828 ± 0.040, en Alcalosis Metabólica; y r 2 = 0.888 ± 0.033, en Alcalosis Respiratoria. El tiempo de vida media más elevado se registró en el grupo de Acidosis Metabólica, 9.71 ± 0.57 min. Este valor difiere significativam ente del encontrado en el grupo Control, que es de 6.97 ± 0.54 min. En el grupo de Acidosis Respiratoria se registró un valor intermedio de T 1/2 , 8.24 ± 0.37 min., que no presenta diferencias significativas con respecto a los otros grupos (Control y Acidos is Metabólica). Estos resultados están en consonancia con los datos sobre la curva de desaparición de la PTH que comentamos anteriormente, y reflejan que existe un cierto enlentecimiento en el metabolismo de la PTH con la Acidosis Metabólica. Por otra par te, los valores de tiempo de vida media en los grupos de alcalosis son muy similares al calculado para el grupo Control, 7.05 ± 0.36 min. para Alcalosis Respiratoria, y 8.29 ± 0.59 min. en el grupo de Alcalosis Metabólica (Tabla 13), sin que existan difere ncias significativas entre ellos. Estos datos reafirman la similitud observada en las curvas de desaparición de PTH entre los grupos de Alcalosis. IV Resultados 211 GRUPO r 2 k (min - 1 ) T 1/2 (min) CONTROL ACIDOSIS MET. ACIDOSIS RES. 0.908 ± 0.018 0.934 ± 0.010 0 .910 ± 0.016 0.1018 ± 0.0075 0.0726 ± 0.0049 a 0.0849 ± 0.0039 6.97 ± 0.54 9.71 ± 0.57 a 8.24 ± 0.37 CONTROL ALCALOSIS MET. ALCALOSIS RES. 0.908 ± 0.018 0.828 ± 0.040 0.888 ± 0.033 0.1018 ± 0.0075 0.0857 ± 0.0074 0.0993 ± 0.0048 6.97 ± 0.54 8.29 ± 0.59 7.05 ± 0.36 Tabla 13. Valores del coeficiente de regresión ( r 2); constante de la ecuación exponencial ( k) y tiempo de vida media ( T 1/2 ), en los grupos Control, Acidosis Metabólica y Acidosis Respiratoria y en los grupos de Alcalo sis Metabólica y Alcalosis Respiratoria. a p<0.05 respecto del grupo Control. IV Resultados 212 Para determinar si el aumento del tiempo de vida media de la PTH durante la acidosis metabólica pudiera ser responsable del incremento en la concentración plasmática de PTH o bservado en este grupo, se calculó el ritmo de secreción de PTH. Para ello, a partir de la ecuación anteriormente citada, C t = C o x e – Kt , se calculó la cantidad de PTH secretada en la unidad de tiempo por las glándulas paratiroides en cada uno de los grupo s. Esto se hizo asumiendo que la cantidad de PTH secretada es idéntica a la metabolizada, cuando se analiza en un periodo donde la concentración de PTH no varía (“steady state conditions”). De este modo, se seleccionó en cada uno de los perros estudiados e n esta fase un periodo de tiempo entre los minutos 30 y 60 en donde la PTH fuese estable (esto es en donde no existieran diferencias significativas en la concentración de PTH en 3 mediciones consecutivas). En este periodo, la cantidad de PTH secretada es, por definición, igual a la cantidad de PTH metabolizada (y esta última se conoce a partir de los datos de la curva de desaparición). Esto es lo que se expresa gráficamente en la Figura 43A, donde se ve que la cantidad de PTH secretada en el grupo de Acid osis Metabólica (2.54 ± 0.45 pg/ml/min) es significativamente superior a la que presenta el grupo Control (0.80 ± 0.16 pg/ml/min). El valor obtenido para el grupo de Acidosis Respiratoria (2.60 ± 0.48 pg/ml/min) también es significativamente más elevado qu e el del grupo Control. En cuanto a los grupos de Alcalosis, resulta evidente tras observar la Figura 43B que, en estos perros, la cantidad de PTH secretada está significativamente reducida con respecto del grupo Control, llegando prácticamente a suprimi rse. IV Resultados 213 PTH secretada ( pg /ml/ min ) CONTROL ALC.RES. ALC.MET.0 1 2 3 PTH secretada ( pg /ml/ min ) CONTROL AC.RES. AC.MET.0 1 2 3 a a a ab A B Figura 43 . A . Valores de PTH secretada en el tiempo calculados en situación de normocalcemia, en los grupos Control, Acidosis Respiratoria y Acidosis Metabólica. B . Valores de PTH secretada en el tiempo calculados en situación de normocal cemia, en los grupos Control, Alcalosis Respiratoria y Alcalosis Metabólica. a p<0.05 respecto del grupo Control, b p<0.05 respecto del grupo de Alcalosis Respiratoria. IV Resultados 214 Dado que todos los cálculos sobre metabolismo, anteriormente expresados, se han realiza do tomando como base las curvas de desaparición de la PTH estudiada en los perros en una situación de hipocalcemia (a partir del minuto 90) y pensando que el ritmo metabólico de la PTH pueda modificarse según los niveles de Ca 2+ , nos parece oportuno volver a realizar los cálculos del ritmo secretorio de la PTH en cada uno de los grupos durante la hipocalcemia. Para ello, al igual que describimos anteriormente, en cada uno de los perros elegimos un periodo de tiempo en hipocalcemia donde la concentración de PTH fuese estable. A continuación se calculó la PTH metabolizada en ese tiempo, que teóricamente debe ser igual a la PTH secretada. Como se muestra en la Figura 44A, el ritmo secretorio en el grupo de Acidosis Metabólica (14.2 ± 1.3 pg/ml/min) fue signific ativamente superior (p<0.01) al del Control (7.6 ± 0.6 pg/ml/min) y al de Acidosis Respiratoria (8.2 ± 0.7) En el caso de los grupos de Alcalosis los cálculos de la PTH secretada en el periodo de normocalcemia presentaban la dificultad añadida del manejo de valores muy bajos, incluso de cero, lo que añade un argumento más para volver a hacer esos cálculos durante la hipocalcemia. El resultado lo expresamos en la Figura 44B, en donde se observa que tanto los valores de PTH secretada en el grupo de Alcalosis Metabólica (6.7 ± 0.6 pg/ml/min) como los hallados en el grupo de Alcalosis Respiratoria (6.6 ± 0.8 pg/ml/min) no difieren significativamente del grupo Control. IV Resultados 215 PTH secretada ( pg /ml/ min ) CONTROL AC.RES. AC.MET.0 5 10 15 ab PTH secretada ( pg /ml/ min ) CONTROL ALC.RES. ALC.MET.0 5 10 15 A B Figura 44. A . Valores de PTH secretada en el tiempo calculados en situación de h ipocalcemia, en los grupos Control, Acidosis Respiratoria y Acidosis Metabólica. B . Valores de PTH secretada en el tiempo calculados en situación de hipocalcemia, en los grupos Control, Alcalosis Respiratoria y Alcalosis Metabólica. a p<0.05 respecto del grupo Control, b p<0.05 respecto del grupo de Acidosis Respiratoria. V Discusión 217 V. DISCUSION V Discusión 218 El presente trabajo se planteó para estudiar el efecto del pH sobre la secreción de hormona paratiroidea (PTH) a través de estudios in vivo en perros anestesiados. Los resultados obtenidos demuestran claramente la existencia de u n efecto del pH sobre la secreción de PTH: la secreción de PTH se estimula en acidosis y se inhibe en alcalosis, independientemente de los niveles de calcio iónico y magnesio plasmáticos. La discrepancia que existe entre los distintos resultados obtenidos hasta ahora en el estudio del efecto del pH sobre la secreción de PTH refleja la gran dificultad que entraña aislar el efecto del pH en un estudio in vivo . Esta dificultad se puede constatar en las diferentes fases de las que consta nuestro trabajo. En la realización de cada una de estas fases hemos conseguido depurar el efecto del pH en una situación in vivo similar a la fisiológica, a través de un estricto y laborioso control de las variables que regulan la respuesta de las glándulas paratiroides, como s on el calcio iónico y el magnesio. Por medio de la infusión de pequeñas cantidades de EDTA y CaCl 2 , se ha conseguido mantener los niveles de calcio iónico constantes, a pesar de los cambios del pH , y, por otra parte, modificar de forma controlada la conce ntración de calcio iónico al mismo tiempo que se provocaron cambios en el estado ácido - base. Asimismo, para descartar la interferencia de los cambios de la magnesemia en nuestros resultados, también se han controlado y mantenido constantes los niveles de e ste ion por medio de la infusión de reducidas cantidades de sulfato magnésico. Además, al plantear los estudios de forma aguda (con una duración máxima de 2 horas), se evita la interferencia de otras variables como la producción de CTR, ya que no da tiempo a que se produzcan los posibles efectos inhibitorios del pH sobre la enzima 1 α hidroxilasa renal. Por otra parte, al realizar experimentos agudos también se han previsto las fluctuaciones de la fosfatemia y otras variaciones derivadas de los cambios compe nsatorios renales que suelen aparecer más tarde en el curso de una alteración del equilibrio ácido - base. Se debe resaltar que en todos los grupos de perros utilizados en este trabajo se administró, a través del aire inspirado, una cantidad de O 2 suficie nte para conseguir que V Discusión 219 los niveles de O 2 en sangre arterial fueran lo más parecido a una situación fisiológica, en la que el perro estuviera respirando voluntariamente, esto es una PO 2 en sangre arterial cercana a 100 mm de Hg. Como observamos en los resul tados, los valores de PO 2 se mantuvieron estables a lo largo del tiempo, con pequeñas desviaciones en torno a los 100 mm de Hg. Del mismo modo, gracias a la monitorización continua de cada uno de los perros, se comprobó que la presión arterial permaneció e stable a lo largo de los experimentos, con valores de 80 ± 2 mm de Hg para la presión arterial diastólica, y de 150 ± 3 mm de Hg para la presión arterial sistólica. Por lo tanto, los animales de los distintos grupos se mantuvieron con una buena oxigenación sanguínea y una presión arterial adecuada, con lo que se excluye la existencia de hipoxemia. Esta afirmación se ve reforzada por los resultados obtenidos al medir los niveles de lactato plasmático (en experimentos preliminares donde se ultimaron cada uno de los protocolos utilizados en este estudio), en los que se pudo observar que este parámetro no experimentó cambios significativos. También hay que señalar que los niveles de albúmina plasmática fueron estables y dentro del rango fisiológico descrito e n la bibliografía. Para la consecución de los objetivos planteados en este estudio hemos utilizado al perro como animal de experimentación. Este animal presenta una serie de características que lo convierten en un animal de experimentación idóneo. Las pr incipales ventajas de usar un modelo experimental canino son: a) El metabolismo fosfocálcico canino es muy similar al humano. 5 b) La homeostasis ácido - base en la especie canina se controla igual que en los humanos y el perro ha servido en muchas ocasion es como modelo para el estudio de la fisiología de muchos procesos relacionados con el equilibrio ácido - base. 2,433 V Discusión 220 c) El perro de tamaño medio posee suficiente volemia como para permitir la toma seriada de muestras de sangre en las que se puedan medir to dos los parámetros objeto de estudio. e) La PTH canina se puede medir fácilmente utilizando el mismo ensayo que mide PTH intacta humana. 130,131,493,494 Además, nuestro grupo de investigación tiene amplia experiencia en el uso del perro como animal de ex perimentación para estudiar la secreción de hormona paratiroidea. 3,5,163,164,305,439, Así, anteriormente hemos utilizado este modelo experimental en estudios sobre: a) fisiología del metabolismo mineral en perros adultos y seniles, 5 b) histéresis de la cur va PTH - Ca durante hipocalcemia, 3 c) efecto de la hipercalcemia sobre la secreción de PTH, 439 d) secreción de PTH durante “clamps” hipocalcémicos 164 y e) efecto de la hiperfosfatemia en la secreción de PTH. 163 Aparte de las ventajas que plantea la utiliza ción del perro como animal de experimentación, hay que subrayar que las repercusiones clínicas de nuestros resultados tienen un especial interés para la medicina veterinaria canina. Como se describe en la bibliografía, el perro, al igual que los humanos, s ufre importantes cambios en el metabolismo fosfocálcico con el envejecimiento que conducen a procesos de desmineralización ósea. Estas alteraciones óseas pueden agravarse cuando coexisten con alteraciones del equilibrio ácido - base como la acidosis metabóli ca . 5,344,378 Las alteraciones del equilibrio ácido - base relacionadas con enfermedades renales son muy comunes en los perros, especialmente en perros viejos. De hecho, la insuficiencia renal crónica representa la segunda causa de muerte canina no accidental . 279 A continuación, se procede a discutir los resultados obtenidos. La discusión se desglosará por los objetivos planteados en cada una de las fases de este estudio. V Discusión 221 FASE 1: MODIFICACION DEL ESTADO ACIDO - BASE CON CONTROL DE LA CALCEMIA. ACIDOSIS Los resultados obtenidos en esta primera fase ponen de manifiesto que la disminución del pH ejerce un efecto estimulante sobre la secreción de PTH en perros. Se distingue también una importante diferenciación del efecto que produce la acidosis dependiendo del origen metabólico (disminución en la concentración de bicarbonato plasmático) o respiratorio (aumentos en la PCO 2 ). Así, se observa que el estímulo provocado por la acidosis metabólica fue muy superior al de la acidosis respiratoria cuando se produjo un d escenso en la concentración de Ca 2+ . Además, en la acidosis metabólica se obtuvieron unos niveles de PTH máximos muy por encima de los controles, que por otra parte mostraban niveles dentro del rango normal obtenido por otros autores al estudiar la dinámic a de secreción de PTH en perros. 3,131,150 Durante las 3 últimas décadas se han realizado numerosos estudios, en pacientes humanos y animales, que han intentado demostrar una relación directa entre la acidosis metabólica y la secreción de PTH. 1,22,25,37,4 0,53,92,93,111,123,135,185,206,215,244,254,275,291,299,313,379,381, 382, 400, 444,502,509,520,521 En la mayoría de estos trabajos no se han encontrado cambios significativos en la concentración plasmática de PTH en una situación de acidosis. Algunos auto res incluso han reportado niveles descendidos de esta hormona en acidosis. 1,37,92,206,254,275,313,381, 400,509,520 Por el contrario, otros estudios han sugerido la existencia de una elevación en los niveles de PTH en situaciones donde existe un estado de acidosis. 53,135,502,379 Algunos autores han predicho un efecto estimulador de la acidosis sobre la secreción de PTH al observar V Discusión 222 que, en pacientes en diálisis y prediálisis con hiperparatiroidismo secundario, se producía una reducción de los niveles de PTH cuando se corregía la acidosis metabólica. 215,291,310 La disparidad de resultados encontrada en la bibliografía puede estar relacionada con el hecho de que, in vivo, los cambios del pH influyen en numerosas variables que, a su vez, modifican la secreción y síntesis de PTH. Se conoce que la acidosis ejerce las siguientes modificaciones sobre el metabolismo mineral: a) Aumento del calcio iónico, debido a que se reduce la proporción de este catión unido a la albúmina aumentando su forma libre en el plasma. 458 b) Incremento en la excreción urinaria de calcio, que tiende a reducir la calcemia. 121,135,238,295,444 c) Descenso en la producción de calcitriol, lo que influye sobre la secreción de PTH directamente, favoreciendo la proliferación celular paratiro idea, e indirectamente, propiciando hipocalcemia. 92,122,195,272,311 d) Aumento en la resorción mineral por un efecto directo sobre el hueso, independiente de la acción hormonal, lo que tiende a incrementar la calcemia y la fosfatemia. 106,115 e) Aumento de la excreción urinaria de fosfato y magnesio. 288,249 Todos estos cambios se acentúan cuando se trata de procesos crónicos, en los que hay tiempo para que acontezcan procesos compensatorios. Así, en muchos de los trabajos citados anteriormente en dond e se intentaba relacionar ambos tipos de acidosis con los niveles de PTH, se produjeron cambios en los niveles sanguíneos de calcio, fosfato y/o magnesio, 34,53,121,135,272,276,379 modificaciones en la excreción urinaria de fósforo, calcio y magnesio, 121,13 5,238,249,272,288,295,486 alteraciones en el metabolismo del calcitriol, 92,122,195,272, V Discusión 223 311 modificaciones en la respuesta renal o esquelética a la acción de la PTH, 39,40,275 variaciones en la capacidad de neutralización de ácidos del riñón 249 y cambios e n el flujo de calcio entre el hueso y el espacio extracelular 106,115 Todos estos efectos colaterales inducidos por los cambios del pH han hecho difícil identificar una posible acción directa de la acidosis metabólica y respiratoria sobre la secreción de PTH. Además, en los estudios más antiguos existía una complicación añadida: la imposibilidad para cuantificar de forma específica la PTH intacta, ya que hasta finales de los años 80 no estuvo disponible este ensayo. Los estudios más alejados en el tiempo , como el de Wachman et al ., 502 tenían la dificultad de no disponer de un ensayo para medir PTH intacta, aunque estos autores ya intuyeron un aumento en la secreción de PTH cuando detectaron un incremento de la actividad ósea en individuos sanos durante la acidosis metabólica. El aumento de PTH estaría dirigido primariamente a la liberación de tampones fosfato desde el hueso para controlar el exceso de H + . Más tarde , cuando se pudieron medir los niveles de PTH intacta, muchos de los estudios que se realiza ron sobre acidosis y elevación de PTH no pudieron relacionar directamente ambos procesos por la existencia de cambios en los niveles de calcio y fósforo séricos. Por ello, la mayoría de los autores atribuyeron como responsables de los cambios de PTH a las variaciones de la calcemia y la fosfatemia, provocadas fundamentalmente por los efectos de la acidosis sobre el riñón y sobre el hueso. En 1975 Coe et al. , 135 que provocaron acidosis aguda a humanos sanos mediante la administración de ClNH 4 + , observaron un ligero aumento de PTH, que relacionaron con un descenso de calcio y aumento de fosfato séricos. Cuando establecieron un proceso crónico de acidosis, el aumento de PTH que observaron fue más evidente, pero V Discusión 224 concluyeron que este incremento fue provocado po r un balance negativo de calcio total, derivado de la hipercalciuria. Scott et al . 444 también observaron un aumento en la concentración de PTH con la acidosis metabólica en un estudio realizado en corderos en crecimiento, a los que infundieron durante 4 horas una solución de HCl. Del mismo modo que los autores anteriores, relacionaron el aumento de los niveles de PTH con el descenso del calcio en el plasma provocado por la hipercalciuria. Estos autores sugirieron que la hipercalciuria puede deberse a que la acción anticalciúrica de la PTH en el riñón está alterada en una situación de acidosis. Esta misma idea había sido apuntada anteriormente por Batlle et al. 37 en 1982, al obtener resultados similares a los anteriores en perros sometidos a acidosis metab ólica crónica Otros autores han explicado los efectos de la acidosis metabólica sobre los niveles de PTH a través de fenómenos relacionados con el hueso. Así, hay trabajos en humanos en los que se relaciona el hecho de que los niveles de PTH bajen o no se modifiquen durante la acidosis con la existencia de cambios en la calcemia y fosfatemia provocados por un aumento de la resorción ósea. 1,509 Existen también estudios en animales, sometidos a acidosis metabólica, en los no se observan cambios en los niv eles de PTH relacionados con la acidosis, debido a un incremento en los niveles de calcio, que se supone originado por una acelerada desmineralización ósea. 92,254 Beck et al. , 40 en estudios con ratas, y posteriormente numerosos trabajos de Bushinsky et a l. , 93,111 utilizando cultivos de tejido óseo, ponen de manifiesto la acción sinérgica de la PTH y la acidosis sobre el hueso. Ambos procesos actúan potenciando la salida de minerales desde el hueso por un estímulo de la resorción ósea. Por lo tanto, estos autores establecen una conexión importante entre la PTH y la acidosis. V Discusión 225 Paillard M. y Bichara M. avanzaron a partir de sus estudios iniciales en 1989 sobre los efectos de las hormonas peptídicas en el control renal del estado ácido - base, 382 y consiguieron, un año después, demostrar una elevación significativa en los niveles de PTH en ratas a las que se les provocó acidosis metabólica aguda administrando una solución de HCl. 53 Según estos autores, el aumento de PTH que observaron estaba relacionado directame nte con la [H + ] y era independiente del calcio. No obstante, conviene resaltar que no consiguieron evitar cambios considerables del calcio iónico durante la acidosis. Aunque éste es el trabajo que más claramente sugiere un efecto estimulante de la acidosis aguda sobre la secreción de PTH, no se puede concluir a partir de sus resultados que el efecto de la acidosis sobre los niveles de PTH fuera debido a una acción directa sobre las glándulas paratiroides, ya que no se consiguió controlar con precisión los n iveles de Ca 2+ extracelular. En la bibliografía existen una serie de trabajos que pretendieron demostrar el efecto de la acidosis sobre los niveles de PTH de forma indirecta. En individuos que padecían una acidosis metabólica debido a una insuficiencia renal crónica intentaron ver si la corrección de esta alteración del pH modificaba los niveles de PTH. Así, en varios estudios llevados a cabo en pacientes dializados o urémicos en prediálisis, se observó una estabilización en los niveles de PTH, e incl uso una reducción en la concentración plasmática de esta hormona, cuando a los pacientes se les corrigió la acidosis aumentando la adición de bicarbonato en la solución de diálisis o infundiéndoles una solución de bicarbonato. 215,291,310 Este hecho sugier e, de forma indirecta, que la acidosis metabólica que sufrían estos pacientes estaba contribuyendo a elevar los niveles de PTH. Por otra parte, existen varios estudios recientes en pacientes en diálisis, en los que no se observaron variaciones en la concen tración de PTH cuando se modificó la concentración de bicarbonato en la solución de dializado. 315,381,400,520 Ouseph et al . 381 sugieren que la ausencia de respuesta de la PTH a las correcciones de bicarbonato se puede explicar debido a que es el pH , y no l os niveles de bicarbonato, el que estimula a las glándulas V Discusión 226 paratiroides (estos pacientes tenían un pH sérico normal a pesar de tener descendidos los niveles de bicarbonato y de PCO 2 ). Aunque parezca ya bastante dispar la información obtenida en la biblio grafía sobre el efecto de la acidosis sobre la secreción de PTH, aún se puede añadir más polémica sobre este tema si se analizan los resultados de un interesante estudio de Oster et al . 379 realizado en perros sanos. En este trabajo se pone de manifiesto qu e los cambios de los niveles de PTH con la acidosis dependen del tipo de ácido que origine el descenso del pH. Según estos autores, el anión que acompaña al ácido tiene una gran importancia en las alteraciones que se dan en el metabolismo fosfocálcico por efecto de la acidosis. Así, cuando infundieron HCl y ácido metilmalónico a los perros obtuvieron un incremento en Ca 2+ y P, y un descenso del Mg que fue, según los autores, lo que determinó una elevación en la concentración de PTH; mientras que cuando infu ndieron ácido láctico, los perros experimentaron un descenso en los niveles de PTH debido al aumento en la concentración de Ca 2+ y Mg y al descenso de P. Los efectos de la acidosis respiratoria sobre el metabolismo fosfocálcico y la secreción de PTH, han sido estudiados por Canzanello et al. 121 En este trabajo, se sometió a un grupo de perros a acidosis respiratoria crónica colocándolos en un ambiente con alta concentración de CO 2 . A pesar de ser un protocolo de acidosis respiratoria crónica, los autores o btuvieron datos a las dos horas de estudio. En este intervalo de tiempo de 2 horas, igual al tiempo total de nuestros experimentos, consiguieron establecer una elevación de la PCO 2 (desde 35 hasta 80 mm de Hg) similar a la obtenida por nosotros en el grupo de perros de Acidosis Respiratoria, con un descenso del pH (desde 7.38 hasta 7.17) también muy parecido al que conseguimos con nuestro protocolo. Esto produjo una elevación de 0.1 mmol/l en el Ca 2+ , sin que se observaran cambios en los niveles de PTH. De forma teórica, una elevación de esta magnitud en el Ca 2+ debería producir una reducción importante en los niveles de PTH. Este dato tan importante, que Canzanello et al. 121 pasaron por alto, sugiere la existencia de una posible estimulación de V Discusión 227 las glándula s paratiroides con la acidosis respiratoria, puesto que debe existir un estímulo que obviara el fuerte efecto inhibidor que la subida de calcio iónico produce sobre estas glándulas. En los primeros perros a los que se sometió a los protocolos de acidosis (Grupos II y III) se observó un incremento de PTH con respecto al grupo Control desde el momento en que se inició el descenso del pH. En estos grupos, dicho efecto estimulador fue de diferente magnitud en la acidosis metabólica y respiratoria, también des de el inicio del protocolo de acidosis, durante la fase de normocalcemia. Después, cuando se realizaron las mediciones del magnesio, pudo comprobarse que existía una caída significativa de este catión, que podía afectar a los niveles de PTH. Ciertamente as í sucedía, pues al corregir los niveles de magnesio en los nuevos grupos de acidosis (IIB y IIIB), mediante la infusión de sulfato magnésico, se obtuvieron niveles de PTH similares en ambos tipos de acidosis en el periodo de normocalcemia. Sin embargo, en estos dos nuevos grupos en donde se controlaron los niveles de magnesio, siguen existiendo enormes diferencias en la máxima respuesta de PTH a la hipocalcemia, obteniendo niveles de PTH mucho más elevados en el grupo de Acidosis Metabólica que en el de Ac idosis Respiratoria. Así se confirma la diferencia de efectos que los dos tipos de acidosis ejercen sobre las glándulas paratiroides (en una situación de normocalcemia, cuando existe un magnesio descendido, y también durante la hipocalcemia, a pesar de que los niveles de magnesio no cambien). El descenso de magnesio observado durante la inducción de acidosis metabólica y respiratoria sólo se produjo cuando se infundió EDTA para controlar la calcemia. En los estudios realizados durante la segunda fase de es te trabajo, donde se indujo acidosis metabólica aguda sin infundir EDTA, no se observó descenso en los valores de magnesio, a pesar de que la caída de pH fue similar a la observada en los grupos de acidosis de la primera fase. De este modo, parece evidente que la hipomagnesemia observada durante la acidosis fue causada por la infusión de EDTA. V Discusión 228 En otros estudios en los que se indujo acidosis metabólica mediante la infusión de HCl se encontró un descenso en los niveles de magnesio en perros, 379 pero no en r atas. 53 En el estudio de Oster et al. 379 también se observó un descenso en la concentración plasmática de magnesio en los perros de su grupo control, que sólo recibieron cloruro sódico. Además, en otro grupo de perros a los que le indujeron acidosis metabó lica aguda mediante la administración de ácido láctico, los niveles de magnesio estaban por encima de los del grupo control. En un estudio realizado en humanos, a los que provocaron una acidosis metabólica infundiéndoles NH 4 Cl, se comprobó que en una situa ción aguda no se produjeron cambios en los niveles de magnesio, mientras que en un proceso crónico aparecía una pequeña caída de este catión. 135 Este fenómeno no ocurrió en ratas acidóticas que recibieron también NH 4 Cl en su dieta durante 3 y 9 días. 195 En un estudio de acidosis respiratoria aguda en el perro no se describieron cambios en el magnesio sérico, mientras que los niveles de este catión se incrementaron un poco cuando el proceso se prolongaba por más de 24 horas. 121 Es importante destacar el he cho de que, tanto en el grupo Control, como en los de Acidosis, la hipomagnesemia existente durante la fase de hipocalcemia no representa un estímulo añadido a la secreción de PTH, ya que al corregir la caída de magnesio no se modifican los niveles máximos de PTH. Este hecho refuerza la tesis de que existe una diferencia importante en la capacidad de ambos cationes para actuar sobre la secreción de PTH, de manera que en una situación de hipocalcemia aguda el descenso en los niveles de magnesio no supone un mayor estímulo para la secreción de PTH. Por otro lado, la diferencia en los niveles de PTH observada en los grupos de perros de Acidosis Metabólica (Grupo II y Grupo IIB) durante el clamp normocalcémico, dependiendo de que se controlen o no los nivel es de Mg, pone de manifiesto la importancia de este catión en la dinámica de secreción de las glándulas paratiroides. V Discusión 229 A partir de estos datos se reafirman varias ideas acerca del efecto del calcio y magnesio sobre la secreción de PTH: a) ambos cationes ( Ca 2+ y Mg 2+ ) actúan sobre la célula paratiroidea, b) el efecto del calcio es más potente que el del magnesio, y c) en presencia de máxima estimulación hipocalcémica, no se aprecia efecto del magnesio sobre la secreción de PTH. El efecto estimulador de la hipomagnesemia sobre la secreción de PTH ha sido descrito anteriormente en numerosas ocasiones por diferentes autores, 83,87,220,431,455 pero no existe uniformidad sobre la magnitud e importancia de este efecto. Además, no existe ningún estudio in vivo en donde se compruebe la influencia de los cambios agudos de magnesio sobre la secreción de PTH. Por otra parte, se ha comprobado que una deficiencia crónica en el magnesio está asociada a un descenso en la secreción de PTH y a la aparición de resistencias a la acción de la PTH. 7,170,190,431,432 A la vista de nuestros resultados, parece evidente la necesidad de realizar nuevos estudios para aclarar el papel del Mg sobre la secreción de PTH. Especialmente, en estados patológicos en donde pueden coexistir altera ciones en la magnesemia con desequilibrios ácido -base, como la acidosis metabólica. Las diferencias entre los efectos de la acidosis, dependiendo de que tenga un origen metabólico o respiratorio, son de interés y han sido descritas con anterioridad a niv el renal y óseo. En un estudio en ratas, se comprobó que la excreción renal de calcio, fósforo y magnesio, era diferente dependiendo del tipo de acidosis. Los autores concluyeron que el manejo renal de estos iones no depende únicamente del pH sanguíneo, s ino que también influyen las causas que determinan el cambio de pH. 288 Además, numerosos estudios in vivo e in vitro han constatado esta diferencia de efectos entre ambos tipos de acidosis a nivel óseo. 93,94,95,96,97,98,100,103,104,105,106,109,110,113,114 Algunos autores han descrito que la liberación de búferes óseos como el carbonato, y otros iones como Ca 2+ , Na + y K + es de distinta magnitud cuando se somete al hueso a una acidosis metabólica o respiratoria. 98,106 Incluso se ha demostrado que los mecanism os celulares V Discusión 230 óseos que median los efectos que la acidosis metabólica ejerce sobre el hueso no actúan en la acidosis respiratoria. 100,114 Estas diferencias en las acciones de ambos tipos de acidosis sobre el hueso podrían tener conexión con nuestros resulta dos. Como se ha descrito en el apartado de Material y Métodos, la cantidad de EDTA administrada para mantener invariable la calcemia fue mucho mayor en Acidosis Metabólica que en la Respiratoria, a pesar de que los cambios del pH fueron similares en ambos grupos. Esto sugiere que ambos tipos de acidosis no tienen la misma capacidad de extraer calcio del hueso. La necesidad de infundir EDTA en acidosis, para mantener la concentración de calcio iónico, está en consonancia con estudios previos en los que se h a observado una elevación en la concentración plasmática de calcio iónico en las acidosis metabólica y respiratoria agudas. 53,121,379 El incremento del calcio iónico sérico es debido a un aumento del flujo de calcio desde el hueso 108 y a una reducción de l a unión del calcio a la albúmina. 458 Aunque nuestro estudio no permite la completa diferenciación entre estas dos posibilidades, a la vista de los datos de infusión de EDTA, parece que la diferencia entre los dos tipos acidosis debe estar relacionada con u na mayor capacidad de la acidosis metabólica para extraer calcio del hueso. Un elemento importante del metabolismo mineral del que hasta ahora no se había discutido es el fósforo. En nuestros experimentos no se producen cambios importantes en los niveles de fósforo. Concretamente, en los grupos de acidosis se detectó una pequeña elevación transitoria de la fosfatemia sólo en la acidosis respiratoria. En consonancia con nuestros resultados, estudios previos en los que se indujo acidosis metabólica aguda no encontraron cambios destacables en los niveles de fósforo inorgánico sérico. 53,379 El incremento del fósforo inorgánico plasmático con la hipercapnia (acidosis respiratoria) aguda observado en nuestros experimentos es similar al descrito por otros V Discusión 231 autores . 121,218,508 En el estudio de Canzanello et al ., 121 en donde se analiza el efecto de la acidosis respiratoria crónica sobre la excreción urinaria de calcio en el perro, se observó un aumento de fosfatemia de 0.5 mmol/l respecto del control a las dos horas de instaurarse el protocolo de acidosis respiratoria. En el trascurso de este estudio se apreció que la hiperfosfatemia era un fenómeno transitorio, que los autores no consideraron relevante y por ello no trataron de explicar los posibles mecanismos que lo determinaban. Algunos estudios han descrito que la acidosis puede incrementar la liberación de fósforo inorgánico desde el espacio intracelular, lo que contribuiría a incrementar la concentración plasmática del mismo. 34,50 El aumento de la salida de fósfo ro de la célula parece mediado por el descenso del pH, que inhibe la glicólisis intracelular y provoca un aumento en la degradación de compuestos con fosfato orgánico en el interior de la célula. 50 Por otra parte, hay que considerar que el incremento en lo s niveles de PTH que acompaña a la acidosis tiene un efecto hipofosfatémico y puede explicar el hecho de que en el grupo de Acidosis Metabólica no se observara un incremento en los niveles plasmáticos de fósforo inorgánico. Es improbable que el pequeño y transitorio incremento en los niveles de fosfatemia observado en la Acidosis Respiratoria representara un estímulo significativo para la secreción de PTH; de acuerdo a los datos de Estepa et al. , 163 estos niveles de fósforo plasmáticos son insuficientes p ara estimular la secreción de PTH. Con respecto al análisis de los cambios electrolíticos, es interesante resaltar que los valores del grupo Control presentaron unos niveles dentro del rango normal descrito en la bibliografía y similares a los obtenidos en perros en anteriores trabajos realizados en nuestro laboratorio. 4,165,166,171,265,308,519 En el grupo Control sólo se observó una leve caída de la potasemia que pudo ser causada por un efecto dilucional, puesto que, para evitar cambios de volumen entre grupos, fue necesario administrar solución salina a los controles. Es interesante resaltar que no es posible atribuir la disminución de K + a un aumento del pH, porque el pH no cambió en este grupo. Tampoco puede atribuirse este V Discusión 232 hecho a un efecto de la ane stesia, pues el bloqueante muscular (bromuro de pancuronio) es el único fármaco que podría afectar a los niveles de potasio, pero actuaría aumentando sus niveles plasmáticos, es decir justo lo contrario a lo observado. 58 El único cambio destacable a niv el electrolítico que se produjo en el grupo de Acidosis Metabólica fue el descenso de bicarbonato. Este hecho era predecible puesto que al infundir un ácido, como el HCl, se consume gran cantidad del buffer bicarbonato para neutralizar el exceso de hidroge niones que se le administra al individuo. Al mismo tiempo se produjo una elevación de Cl - , la cual también es una lógica consecuencia de la infusión del citado ácido. El grupo de Acidosis Respiratoria experimentó muy poca variación en los niveles de los principales electrólitos, que se mantuvieron siempre dentro del rango normal. Tan sólo se observó una pequeña elevación en los niveles de bicarbonato que está relacionada con el aumento de la PCO 2 . Esta elevación en los niveles de bicarbonato, en una situa ción de hipercapnia aguda está descrita en la bibliografía, y resulta de la disociación del ácido carbónico (formado previamente por la hidratación del CO 2 ), que genera nuevos iones bicarbonato y, al mismo tiempo, libera H + , que se combinan con otros tampo nes distintos del bicarbonato (hemoglobina, otras proteínas plasmáticas y búferes intracelulares). 350 En general, en la bibliografía se comenta que los cambios en el bicarbonato suelen ser pequeños, pero se ha descrito que el bicarbonato puede elevarse en una acidosis respiratoria aguda en una proporción de 1 mEq/l por cada 10 mm de Hg de aumento de PCO 2 , fluctuando en humanos desde 24 mEq/l hasta un nivel máximo de 30 mEq/l. 350,421 El análisis cuantitativo del estado ácido base en cada uno de los grupos s e hará discutiendo de forma individualizada las variaciones en las variables independientes: diferencia de iones fuertes (SID), presión parcial de CO 2 (PCO 2 ) y ácidos débiles no volátiles (At). V Discusión 233 En el caso del grupo control los valores de PCO 2 , SID y At pe rmanecieron invariables a lo largo de los experimentos, y sus valores están en consonancia con los descritos en perros tanto en la bibliografía consultada, como con los obtenidos en nuestro laboratorio en anteriores trabajos. 4,165,171,519 En el grupo de Acidosis Metabólica se produjo un descenso del SID, como consecuencia del ingreso en estos perros de un anión fuerte: el Cl - (por la infusión de HCl). Dicho anión se elevó en el plasma de estos animales en magnitud muy parecida a como descendió el SID, lo cual es lógico si pensamos que no hubo variación significativa en los niveles de cationes fuertes (Na + y K +). Esto se correspondería con una situación de acidosis metabólica hiperclorémica. Como los perros estuvieron sometidos a ventilación controlada, se impidió la compensación respiratoria, que daría lugar a un descenso de la PCO 2 . Como se ha descrito anteriormente, los niveles de PCO 2 no se modificaron en este grupo a lo largo de las dos horas de experimento. En el caso del grupo de Acidosis Respirator ia, el único cambio destacable fue una elevación considerable de la PCO 2 , que por otra parte era lo que se pretendía al disminuir en este grupo el ritmo y el volumen ventilatorio. Este acúmulo de CO 2 fue lo que provocó el descenso del pH. En estos animales se produjo una pequeña compensación metabólica que se manifiesta en la elevación del SID. El incremento de SID, que no llegó a ser significativo, viene a ser el reflejo de un pequeño aumento en los niveles de Na + y un cierto descenso del anión cloro. En cuanto a la tercera variable independiente, At, aunque tiene poco peso en una situación en donde no se modifican los niveles de proteínas plasmática, hay que reseñar que esta variable presenta en los grupos de Acidosis una leve caída de sus niveles durant e la fase de hipocalcemia (minuto 60 al 120). Dado que la concentración de albúmina plasmática se mantuvo prácticamente invariable en estos grupos, esta pequeña caída del V Discusión 234 At debe ser reflejo de un descenso relativo en los niveles de fósforo, hecho que se a precia en los grupos de Acidosis durante la fase de hipocalcemia. Mediante el estudio de regresión lineal multivariable se ha planteado un modelo donde la variación de PTH se explica por cambios en las variables independientes que determinan el estado á cido - base (PCO 2 , SID y At). A partir de los datos de este estudio estadístico, se puede inferir que en cada grupo de Acidosis la variación de la PTH está determinada por variables distintas. Cuando se analiza un modelo de regresión lineal, se observa que e n el grupo de Acidosis Metabólica es el SID lo que está afectando principalmente a la PTH. Este resultado es razonable porque es el descenso de SID lo que provoca en este grupo la caída del pH. Del mismo modo, en el grupo de Acidosis Respiratoria, donde l a elevación de la PCO 2 provoca el descenso del pH, se obtiene un modelo donde la variable PCO 2 explica principalmente las variaciones de PTH. De modo que en los cambios de SID y CO 2, que se producen en Acidosis Metabólica y Acidosis Respiratoria, respecti vamente, se debe buscar el origen del estímulo en la secreción de PTH observado durante la acidosis. En conclusión, a partir de los resultados obtenidos en los grupos de acidosis se puede afirmar que existe una relación directa entre el descenso del pH y la secreción de PTH. Así se demuestra que, en una situación de normocalcemia, ambos tipos de acidosis ejercen un efecto estimulador directo sobre la secreción de PTH de la misma magnitud, y este estímulo determina, al cabo de una hora de acidosis, una el evación de los niveles de PTH hasta alcanzar valores 4 a 5 veces superiores a los normales. Además, se comprueba que la secreción máxima de PTH en respuesta a la hipocalcemia en Acidosis Metabólica es muy superior al Control y a Acidosis Respiratoria. Al c omparar los resultados entre los grupos de Acidosis con y sin control de Mg, se puede deducir que el estimulo provocado por la caída del Mg sobre los niveles de PTH es también superior en Acidosis Metabólica que en Acidosis Respiratoria. V Discusión 235 ALCALOSIS Los resultados obtenidos en los Grupos IV y V, en los que se sometió a los perros a protocolos de alcalosis metabólica y respiratoria, muestran la existencia de un potente efecto inhibidor de la alcalosis sobre la secreción de PTH, que es independiente del cal cio. El efecto inhibidor directo de la alcalosis sobre la secreción de PTH no había sido descrito con anterioridad. La información que se obtiene de la bibliografía respecto del efecto de la alcalosis sobre la secreción de PTH es ciertamente distinta a l a que muestran nuestros resultados. Debido al descenso de los niveles de Ca 2+ que provoca la alcalemia, la mayoría de los autores han descrito que la alcalosis representa un estímulo para las glándulas paratiroides, dando lugar a niveles elevados de PTH. 10 2,301,337 Sólo hemos encontrado un estudio antiguo en perros donde se consiguió evitar el descenso de Ca 2+ y la concentración de PTH no cambió, a pesar de la alcalosis. 337 La ausencia de inhibición durante la alcalosis metabólica encontrada por estos autor es puede ser debida a la diferente técnica utilizada para la cuantificación de PTH, ya que en esa fecha aún no existía un ensayo para medir PTH intacta. Nuestros datos podrían ayudar a explicar los resultados de algunos estudios en los que, tras la admin istración de sustancias alcalinizantes, se ha observado una notable reducción en los índices de función ósea y una estabilización, e incluso disminución, en los niveles de PTH en enfermos con osteodistrofia renal. 133,145,215,291,413 Estos estudios se reali zaron en enfermos con insuficiencia renal en prediálisis o dializados que sufrían hiperparatiroidismo secundario y, por lo tanto, presentaban elevados niveles de PTH con un alto índice de remodelación ósea. Cuando se les administró una mayor cantidad de álcali, oralmente o a través de la diálisis, se consiguió, en algunos casos, reducir los niveles de PTH y, en la mayoría de los individuos, se frenó la progresión de la osteítis fibrosa. V Discusión 236 Coen et al . 136 han descrito que el efecto beneficioso sobre el hueso d el tratamiento con calcitriol en pacientes con insuficiencia renal es mucho mayor cuando estos pacientes poseen niveles de bicarbonato más elevados y estables . En un estudio retrospectivo en pacientes con osteodistrofia renal, se observó que el grupo de en fermos con una concentración más elevada de bicarbonato en sangre presentaba una mejoría significativa de sus lesiones óseas, respecto al grupo con los niveles de bicarbonato descendidos. 136 Otros autores, en cambio, no han encontrado efectos beneficioso s sobre el hueso y sobre el grado de hiperparatiroidismo en enfermos renales que recibían un suplemento de sustancias alcalinizantes. En un estudio bastante antiguo realizado en pacientes con enfermedad renal, se afirmaba que la administración crónica de b icarbonato, paradójicamente, retardaba la resolución de los déficits esqueléticos de calcio que sufrían estos individuos. 301 En un trabajo más reciente, en el que se consiguió elevar los niveles de bicarbonato plasmático a pacientes en hemodiálisis utiliza ndo una técnica de biofiltración de acetato libre, dePreciguout et al . 400 no observaron reducción alguna en los niveles de PTH, ni cambios en la sensibilidad de las glándulas a los niveles de Ca 2+ . Del mismo modo, Ouseph et al ., 381 un año después, en 1996 , no consiguieron ver diferencias en la curva Ca 2+ - PTH entre dos grupos de pacientes hemodializados con distintos niveles de bicarbonato, aunque puntualizaron de forma acertada que sus pacientes presentaban distintos niveles de bicarbonato en sangre pero que el pH no se modificó, por lo que no descartaron la posibilidad de un efecto del pH sobre la función de las glándulas paratiroides. Para finalizar con este grupo de trabajos, hay que citar uno en el que no se encontraron modificaciones en los niveles de PTH, pero si se observó una elevación de los niveles de calcitriol circulante en pacientes hemodializados cuando aumentaron la cantidad de bicarbonato en la solución de dializado para corregir la acidosis metabólica. Los autores interpretaron el aumento d e CTR como resultado de un aumento en la actividad 1 α hidroxilasa renal que, aunque está muy reducida en este tipo de enfermos, se reactivó al corregir la acidosis metabólica. 315 Este aumento en la V Discusión 237 concentración de calcitriol podría justificar la mejora d e las alteraciones óseas descrita en algunos de los trabajos anteriormente citados. La bibliografia relacionada con los efectos de la hipocapnia sobre el metabolismo fosfocálcico es muy reducida. Algunos estudios, en los que se provocó hipocapnia aguda a ratas o a voluntarios humanos, han mostrado la existencia de un efecto bloqueante de la hipocapnia sobre la acción fosfatúrica de la PTH. 43,237,273,274,345,402 No obstante, Hoppe et al . 237 demostraron que el antagonismo frente a la acción fosfatúrica de la PTH sobre el riñón fue debido principalmente al descenso de la PCO 2 y no a la alcalemia concomitante. Krapf et al ., 273,274 en varios estudios realizados en voluntarios humanos a quienes se sometió a hipocapnia (mediante hiperventilación o mediante un am biente con bajo CO 2 ), también describieron la existencia de un bloqueo de la acción de la PTH sobre el riñón. Estos autores plantearon la existencia de una posible alteración en la secreción de PTH durante la alcalosis respiratoria crónica, ya que, a pesar de que existía un descenso significativo del Ca 2+ y un aumento del fósforo, no se producían cambios en los niveles de PTH. Es interesante resaltar que en la mayoría de estos estudios en hipocapnia aguda no se consiguió provocar una elevación del pH compar able a la alcanzada en nuestros grupos de perros sometidos a alcalosis respiratoria. Además, en ninguno de estos trabajos se controlaron los niveles de Ca 2+ . Para una misma elevación del pH, el efecto inhibidor sobre la secreción de PTH detectado en los g rupos de alcalosis durante la situación de normocalcemia fue de mayor intensidad cuando la alcalosis era de origen respiratorio (descenso de la PCO 2 ) que cuando tenía origen metabólico (aumento de bicarbonato). En la bibliografía no se recogen datos que a yuden a explicar el porqué de estas diferencias. Más adelante, y sirviéndonos de los resultados encontrados en el grupo Control Hiperosmolar, se expondrá un argumento para ello. V Discusión 238 En ambos grupos de alcalosis fue necesario infundir calcio para mantener con stantes los niveles de este ion en el plasma. El efecto hipocalcémico de la alcalosis ha sido descrito anteriormente en humanos y en animales. 102,273,304,371,388 T ambién en estudios in vitro, se ha comprobado la existencia de una relación lineal inversa en tre el pH y la concentración de Ca 2+ en un medio de cultivo a base de plasma sanguíneo. 243,341,492 En estos estudios in vitro se relaciona el descenso de calcio iónico con los cambios que el pH provoca en la unión de este ion a la albúmina y también con la formación de complejos con el bicarbonato. En nuestro estudio hay que destacar que la cantidad de Ca 2+ que fue necesario infundir en los perros sometidos a Alcalosis Metabólica fue mucho mayor que la requerida en el caso de los animales sometidos a Alcalo sis Respiratoria. Dado que no existían diferencias a lo largo de los experimentos en la concentración de albúmina plasmática, este hecho probablemente esté relacionado con la elevada concentración de bicarbonato existente en el grupo de Alcalosis Metabólic a, que formaría complejos con el calcio produciendo un descenso del Ca 2+ . En la alcalosis respiratoria por el contrario, la proporción de calcio unido al bicarbonato estaría disminuida, ya que existe un descenso de los niveles de bicarbonato en este grupo. Esta hipótesis está en consonancia con estudios in vitro en los que se ha visto que existe una relación inversa entre la concentración de Ca 2+ y la de bicarbonato, independientemente de la variación que sufre el Ca 2+ con cambios del pH. 243 Al analizar e l efecto de la alcalosis en una situación de hipocalcemia, se observó que la supresión en la secreción de PTH que existía durante normocalcemia desapareció, y se alcanzó en ambos grupos una secreción de PTH máxima que no difirió del grupo Control. Por lo t anto, parece que el potente efecto estimulador que la caída de Ca 2+ ejerce sobre las glándulas paratiroides hace que desaparezca el estado de inhibición provocado por una situación de pH elevado. Es interesante resaltar que, a pesar de que la alcalosis pro duce inhibición de la secreción de PTH, la respuesta secretora de PTH a un estímulo hipocalcémico subsiguiente no se altera. Este hecho contrasta con la respuesta secretora de PTH a la hipocalcemia cuando las glándulas paratiroides han V Discusión 239 estado previamente s ometidas a hipercalcemia. En nuestro laboratorio se han realizado estudios en animales donde se observó que la respuesta secretora de las glándulas paratiroides a la hipocalcemia se reducía considerablemente cuando previamente habían sido sometidas a un es tímulo inhibitorio, provocado por una hipercalcemia aguda. 36,439 La repuesta alterada de las glándulas paratiroides a la hipocalcemia puede estar causada por un aumento de la degradación intracelular de la PTH intacta, promovida por los altos niveles de C a 2+ extracelular. También es posible que la hipercalcemia aguda previa provoque la liberación, desde las células paratiroideas, de sustancias inhibidoras de la secreción de PTH. Incluso, cabría considerar la posibilidad de que las señales intracelulares de sencadenadas por la interacción de una elevada concentración de Ca 2+ con el CaR estén alteradas, de forma que después no exista una respuesta adecuada a la hipocalcemia. De cualquier manera, esta diferencia en la respuesta a la hipocalcemia en glándulas pr eviamente inhibidas por alcalosis o por hipercalcemia, nos lleva a pensar que los mecanismos que determinan la inhibición en la secreción de PTH por la alcalosis deben estar dirigidos por caminos muy diferentes de los que conducen la respuesta de las glánd ulas a una hipercalcemia aguda. Para descartar que el efecto inhibidor sobre la secreción de PTH que se observó en el grupo de perros sometidos a Alcalosis Metabólica durante la fase de normocalcemia fuese debido a cambios en la osmolaridad plasmática pro ducidos por la elevación en los niveles de Na +, se estudió la influencia de la elevación de la natremia (Grupo VI) sin modificar el pH. En este grupo se produjo una elevación en los niveles de Na + mediante la infusión de una solución de NaCl hipertónico, c on osmolaridad prácticamente idéntica a la solución de bicarbonato sódico infundida a los perros para inducir alcalosis metabólica. La concentración de PTH de este grupo, en donde subió progresivamente la natremia, no descendió, sino que, por el contrario, se elevó lentamente llegando a ser significativamente mayor que la del grupo Control, a pesar de que el Ca 2+ se mantuvo constante. Estos datos sirven para descartar que el efecto inhibidor en la secreción de V Discusión 240 PTH que se produce en la Alcalosis Metabólica ( infusión de bicarbonato sódico) fuese debido a la elevación de la natremia. Además, los datos obtenidos en este grupo, donde se provocó una elevación del Na + plasmático en más de 30 mmol/l, están en consonancia con los existentes in vitro , en los que se h a demostrado que el incremento en la osmolaridad y/o fuerza iónica ejerce un efecto estimulador sobre la secreción de PTH. 127,405 Chen et al ., 127 usando cultivos de células paratiroides bovinas dispersadas, obtuvieron una elevación en los niveles de PTH cu ando incrementaban la osmolaridad del medio de cultivo añadiendo tanto NaCl como sucrosa. A partir de estos datos, concluyeron que el efecto estimulante está causado por la elevación de la osmolaridad más que por los cambios de fuerza iónica. En cambio, Qu inn et al ., 405 también en estudios in vitro , han descrito un efecto estimulador sobre las células paratiroides, a través de acciones sobre el receptor de Ca 2+ , provocado por cambios de fuerza iónica en el medio de cultivo y que es independiente de la elev ación de la osmolaridad. En cualquier caso, nuestros resultados son compatibles con ambos estudios, dado que en el Grupo VI los cambios en la osmolaridad fueron provocados por la adición de una sal de Na +, que al mismo tiempo provoca un aumento de la fuerz a iónica. Estos resultados, según nuestro conocimiento, serían los primeros en evidenciar el efecto de la osmolaridad y/o fuerza iónica sobre las glándulas paratiroides in vivo . En los perros sometidos a Alcalosis Metabólica, la fosfatemia se mantuvo prácticamente constante en sus niveles basales, sin embargo, se detectó un descenso significativo del mismo en el trascurso de la Alcalosis Respiratoria. El descenso de los niveles plasmáticos de fosfato en una situación de alcalosis respiratoria aguda h a sido descrito ampliamente tanto en humanos como en animales (rata y perros). 64,266,345,507 Aunque los mecanismos no están del todo aclarados, la hipofosfatemia se debe principalmente a un desplazamiento del fosfato extracelular hacia el interior de las c élulas, especialmente a las musculares. La alcalinización intracelular V Discusión 241 estimula la glicólisis, lo que propicia la entrada de fosfato, nucleótidos de adenina y glucosa -6 fosfato. Al mismo tiempo, la hipofosfatemia parece estar relacionada parcialmente con l a acreción de este mineral al hueso, por efecto de la alcalemia. La repercusión del descenso en los niveles de fósforo sobre los niveles de PTH recogidos en el grupo de Alcalosis Respiratoria es, con toda probabilidad, insignificante, por dos razones: prim ero, porque aunque se ha demostrado que una gran elevación de los niveles de fósforo provoca un aumento en la secreción de PTH, 163 no se ha descrito nunca que una disminución aguda de la fosfatemia pueda producir una disminución en la secreción de PTH; seg undo, porque el descenso en los niveles de fosfato del grupo de Alcalosis Respiratoria adquirió significación estadística durante la segunda hora de experimento, fase en la que se estaba induciendo hipocalcemia, cuyo estímulo positivo sobre la secreción de PTH obviaría el posible efecto supresor de la hipofosfatemia. En el caso de los perros sometidos a protocolos de alcalosis existe una serie de variaciones en algunos electrólitos que conviene analizar. La elevación del bicarbonato y del Na + que se produj o en el grupo de Alcalosis Metabólica estaba lógicamente relacionada con la infusión en estos perros de bicarbonato sódico, por lo tanto, era algo que estaba previsto. Algo también previsible, que ha sido descrito ampliamente en anteriores estudios, tanto en animales, como en humanos, 350,421 es la caída de potasio que se produjo en el grupo de Alcalosis Metabólica y, en menor medida, en el de Alcalosis Respiratoria. La explicación es que parte del potasio extracelular pasaría al interior de la célula, dond e la concentración de hidrogeniones es baja. 350,421 Por otro lado, el descenso de Cl - que aconteció en el grupo de Alcalosis Metabólica no parece en consonancia con lo que teóricamente debiera suceder. Según la bibliografía, la deplección de Cl - provoca ría, a través de mecanismos principalmente renales, una alcalosis metabólica con aumento del bicarbonato. 350 En el grupo de Alcalosis Metabólica, donde existía un considerable elevación en los niveles de bicarbonato, la excreción renal de este ion debería acompañarse de una mayor reabsorción de Cl - a este V Discusión 242 nivel. Además, también debería producirse un intercambio de estos aniones a nivel celular. En definitiva, teóricamente, en la alcalosis metabólica debería producirse una elevación de los niveles de Cl - . El descenso de Cl -, y parte del descenso de K + que se produce en este grupo, podría deberse a un efecto dilucional en el plasma provocado por paso de líquido del espacio intracelular al extracelular, debido al aumento de osmolaridad en este último compartime nto. Un dato que podría apoyar esta idea del efecto dilucional, es que en el grupo de infusión de NaCl hipertónico donde se produce un aumento similar de la presión osmótica, existía también un descenso de K + y de Ca 2+ (aunque la disminución de Ca 2+ se evi tó infundiendo una pequeña cantidad de CaCl 2 ). El cambio electrolítico más significativo en el grupo de Alcalosis Respiratoria fue el descenso de bicarbonato. En la bibliografía se describe que, cuando se produce un descenso en los niveles de CO 2 , tiene lugar una disminución proporcional en la concentración de bicarbonato. Teóricamente, en un proceso agudo, el bicarbonato caería 2 mEq/l por cada 10 mm de Hg que descendiera la PCO 2 . En el caso de una situación de hipocapnia de más de dos horas de duración comienzan a funcionar fenómenos compensatorios renales, determinando una caída mayor de los niveles de bicarbonato, entre 4 y 5 mEq/l de bicarbonato por un descenso de 10 mm Hg de la PCO 2 . 350,421 Al observar nuestros datos, se aprecia que durante la primer a hora de experimento el descenso de bicarbonato con respecto a la caída de PCO 2 cumple de forma aproximada la relación descrita en la bibliografía para un proceso agudo. Sin embargo, durante la segunda hora, esta relación se parece mucho más a la descrita para un proceso crónico. Por lo tanto, esto nos lleva pensar que los fenómenos compensatorios renales aparecerían antes de dos horas en un proceso de hipocapnia aguda. Las pequeñas variaciones que sufren tanto la natremia como la cloremia en los perros sometidos a alcalosis respiratoria están en consonancia con los datos existentes en la bibliografía referidos a humanos y a perros. 350,421 A l igual que sucede en nuestro grupo V Discusión 243 de Alcalosis Respiratoria, se ha descrito una pequeña elevación del anion gap (A G) relacionada con el descenso del bicarbonato. 350 Por lo que se refiere a las variables independientes que definen el estado ácido - base en los grupos de perros sometidos a alcalosis, se discutirán los siguientes aspectos: La elevación del valor de SID que se produjo en la Alcalosis Metabólica en algo más de 30 mEq/l se correspondería prácticamente con el incremento observado en los niveles de Na +, catión fuerte que ingresó en estos perros a través de la infusión de bicarbonato sódico. Esta elevación del SID es lo que origina la alcalosis metabólica. En un proceso de alcalosis metabólica se produce una respuesta compensatoria del organismo que da lugar a elevación de la PCO 2 . Concretamente, se ha descrito que en un proceso agudo, existe una subida de PC O 2 de 6 mm de Hg por cada 10 mEq/l que se incrementa la concentración de bicarbonato. Esto ocurre en una situación en la que el individuo puede respirar de forma natural. En nuestro caso, al mantener fijo y constante el ritmo respiratorio a través de la ve ntilación mecánica, se deberían prevenir los cambios de PCO 2. Sin embargo, en nuestros datos se aprecia una ligera elevación de este parámetro. Las causas que pueden producir la elevación de la PCO 2 en una alcalosis metabólica son: a) generación de dióxido de carbono, a partir de la titulación del bicarbonato que ingresa en el organismo, por combinación con iones H + ; b) retención de CO 2 por compensación respiratoria, para amortiguar los efectos alcalinizantes del exceso de base. Dado que nuestros perros re cibieron ventilación controlada, la elevación en la PCO 2 debe estar relacionada con una mayor generación de CO 2 . Los cambios de PCO 2 debidos a modificaciones en la concentración plasmática de bicarbonato, han sido reportados anteriormente en otros estudios en perros con ventilación controlada. 2,201,433 En el caso de los perros del grupo de Alcalosis Respiratoria, en los cuales se estableció un aumento progresivo del ritmo y del volumen ventilatorio, aparecía una consecuente V Discusión 244 disminución de la PCO 2 . Del mis mo modo que se ha descrito anteriormente en la alcalosis metabólica, el organismo actúa en consecuencia ante esta nueva situación y, de forma compensatoria, se reducen las cargas positivas y se aumentan las negativas. Esto se puede apreciar en el descenso del SID que se observa en los perros hiperventilados. Este hecho se produce como consecuencia de un pequeño descenso del Na + y una elevación, más evidente, del Cl - plasmáticos. Los niveles de At se mantuvieron prácticamente invariables en los perros somet idos a Alcalosis Metabólica, sin embargo, en el grupo de Alcalosis Respiratoria el At presenta una tendencia descendente durante la segunda hora de experimento, lo que debe estar causado por la caída de la fosfatemia descrita en la hipocapnia. En los gru pos de Alcalosis la relación que se establece entre las variables del análisis cuantitativo del estado ácido - base (PCO 2 , SID y At) y los niveles de PTH, a través del análisis de regresión lineal, nos muestra la gran importancia de estas variables en los ca mbios de PTH. De manera que, en la Alcalosis Metabólica, el SID es la variable que con mayor peso determina los cambios que suceden en la concentración de PTH. En cuanto al grupo de Alcalosis Respiratoria es la PCO 2 la variable que influye más sobre los ca mbios de PTH. Por lo tanto, en los fenómenos de alcalosis, al igual que se describió en la acidosis, se deben considerar primariamente estas dos variables, SID y PCO 2 , para predecir los cambios en la concentración de PTH. Es interesante estudiar, de form a global, la relación entre las distintas variables dependientes (pH y bicarbonato) e independientes (PCO 2 , SID y At) del estado ácido - base y los niveles de PTH encontrados en los distintos grupos Acidosis y Alcalosis. En este sentido, los estudios de corr elación simple y análisis de regresión múltiple entre estas variables en normocalcemia, aportan datos interesantes para una mejor interpretación del efecto del pH sobre la secreción de PTH. Existe una marcada relación entre la PTH y el pH, variables que presentan uno de los coeficientes de correlación más altos cuando V Discusión 245 se estudia su evolución tanto en los procesos respiratorios como en los metabólicos. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de partida de este trabajo, que es la existencia de una conexión dire cta entre el estado ácido - base y la secreción de PTH, independiente del Ca 2+ . 53,381 Sin embargo, hay que reseñar que, según los estudios de correlación, también existe una relación importante entre los niveles de bicarbonato y la concentración de PTH en la s alteraciones ácido - base de origen metabólico, lo que haría más compleja la relación entre este tipo de alteraciones del equilibrio ácido base y la respuesta secretora de las glándulas paratiroides. En los procesos respiratorios existe también una relació n evidente entre los niveles de bicarbonato y la concentración de PTH, pero en este caso es de sentido contrario a la observada en los procesos metabólicos, esto dificulta enormemente establecer una relación única entre ambas variables, así como predecir variaciones en la concentración de PTH debidas a un cambio en el bicarbonato plasmático. Por otra parte, las relaciones que se establecen en el estudio de correlación simple y múltiple entre las variables independientes PCO 2 , SID y At y los niveles de PTH aportan una visión más detallada y original, ya que nunca antes se había descrito con la complejidad que se aborda en el presente trabajo. En el caso de las alteraciones respiratorias, los resultados de correlación simple y múltiple entre la PCO 2 y la PTH indican que los niveles de CO 2 son responsables primarios de las alteraciones que se observan en la respuesta secretora de las células paratiroideas. Esto estaría en consonancia con la idea que avanzaron otros autores cuando expusieron que las alteracion es que observaban en la excreción renal de fósforo en una situación de hipocapnia eran debidas a los cambios de PCO 2, más que a la elevación del pH sanguíneo. 237 Algo parecido a lo que hemos descrito con los niveles de PCO 2 podría decirse a partir de la relación existente entre los niveles de PTH y el SID en los procesos metabólicos, aunque en este caso la relación es inversa. En los procesos metabólicos suceden V Discusión 246 desplazamientos importantes del SID en un sentido u otro, como consecuencia de los cambios que acontecen en iones fuertes (Na + y Cl - ), que son los principales responsables de las variaciones del pH extracelular y, en consecuencia, de los cambios en la respuesta secretora de las glándulas paratiroides. La relación entre el SID y la PTH en los proces os respiratorios es de mucha menor entidad, y pensamos que no merece demasiada atención porque es reflejo de fenómenos compensatorios que acontecen paralelamente cuando se producen grandes cambios de PCO 2 En la relación entre At y PTH hay que considerar que en nuestros perros sólo existen pequeñas variaciones en los niveles de At, que se deben fundamentalmente a ligeros cambios de los niveles de fósforo. Así, las débiles correlaciones negativas que resultan entre los niveles de la PTH y esta variable del estado ácido - base no tienen otro sentido que la existencia de elevados niveles de PTH, coincidiendo con una tendencia descend ente en los niveles de fósforo. Del mismo modo, esto se refleja en los distintos modelos de regresión, donde la variable At present a muy poco valor para explicar la variación de PTH. Por lo tanto, a partir de nuestros resultados no se puede afirmar que cambios de At influyan significativamente sobre los niveles de PTH. En resumen, en base a nuestros datos de correlación simple y mú ltiple, se deduce que existe un clara relación ente el pH y la PTH que es común a ambos tipos de procesos (metabólicos y respiratorios). Al mismo tiempo se demuestra que, aunque los cambios en la concentración de PTH se pueden explicar en gran medida por e l pH, es importante tener en cuenta en cada situación en donde exista un desequilibrio ácido - base las variaciones que sufren las variables SID y PCO 2 . Además, es muy probable que la diferente repuesta secretora de las células paratiroideas, observada entre los procesos de origen respiratorio y metabólico, esté relacionada con efectos diferentes e independientes que producen los cambios en la PCO 2 y el SID en estas células (disyuntiva que discutiremos posteriormente cuando hablemos de los posibles mecanismos de acción del pH sobre las células paratiroideas). V Discusión 247 FASE 2: MODIFICACION DEL ESTADO ACIDO - BASE SIN CONTROL DE LA CALCEMIA Para evaluar el efecto de la acidosis metabólica sobre la secreción de PTH en una situación fisiológica, en la que se produciría una elevación del calcio iónico por el descenso del pH, establecimos una segunda fase de trabajo donde se indujo acidosis metabólica a perros sin controlar la subida de calcio iónico. En estos perros, a los que se infundía HCl durante 60 minutos al mismo ritm o utilizado en el grupo de perros de acidosis metabólica con control del calcio, se encontró un incremento significativo en la concentración de PTH a pesar de existir un aumento del calcio iónico superior a 0.1 mmol/l. Estos resultados refuerzan los ya pu blicados por otros autores que también obtuvieron elevaciones en los niveles de PTH, a pesar de producirse un incremento en la concentración de Ca 2+ plasmático, en animales (rata y perro) a los que se les inducía acidosis metabólica aguda administrando sol uciones de HCl. 53,379 La menor magnitud de la elevación de los niveles de PTH que encontramos en este grupo de perros, comparada con los resultados de PTH observados en la primera fase de este trabajo en el grupo de Acidosis Metabólica, demuestra la import ancia del control de los niveles de Ca 2+ para evidenciar el verdadero efecto del pH sobre las glándulas paratiroides, o al menos para observarlo en toda su magnitud. El aumento de los niveles de PTH pone de manifiesto que la acidosis metabólica puede per turbar notablemente el metabolismo mineral. Aparte de las alteraciones que la acidosis metabólica produce en la regulación de los niveles de Ca 2+ y fósforo, a través de acciones directas sobre riñón, hueso e intestino, nuestros resultados demuestran que ta mbién existe una acción directa de la acidosis metabólica sobre la PTH, una de las principales hormonas reguladoras del metabolismo mineral. Este efecto puede tener considerables consecuencias en el control de los niveles de Ca 2+ y de P. Estas consideracio nes deben ser tomadas con especial atención en individuos en los que pueden coexistir alteraciones en el metabolismo mineral con estados de acidosis metabólica, como es el caso de V Discusión 248 enfermos con insuficiencia renal. Resultados de algunos estudios en enfermos renales humanos han demostrado que cuando se establecen medidas adecuadas para controlar la acidosis metabólica se obtienen beneficios considerables en el metabolismo mineral, y esto está relacionado con el descenso en los niveles de PTH. 133,145,215,291,4 13 Pero este tipo de pacientes no es sólo frecuente en medicina humana, también se dan muchos casos de enfermedad renal en Medicina Veterinaria, sobre todo en las poblaciones seniles. En relación a esto, en estudios realizados en nuestro laboratorio se com probó que en perros seniles existía un incremento en los niveles de PTH que no estaba relacionado con alteraciones evidentes en los niveles de Ca 2+ o de P. 5 En estudios en medicina humana se ha descrito en individuos seniles una cierta tendencia a padecer acidosis metabólica, 188 aunque en Veterinaria no existen datos similares en perros seniles, se podría relacionar el aumento de PTH observado en edades avanzadas con este tipo de alteraciones del pH. La existencia, en este grupo de Acidosis Metabólica sin control de Ca 2+ , de unos niveles de magnesio invariables e iguales a los basales está en consonancia con lo descrito por otros autores que tampoco encontraron cambios de Mg cuando indujeron acidosis metabólica. 53,135,195 Además, este hecho demuestra que e l descenso en la concentración de magnesio que se produjo en los perros de los grupos de acidosis de la primera fase no estaba provocado por el descenso del pH (de la misma magnitud que en este grupo), sino que, como ya habíamos apuntado anteriormente, se trata de un efecto producido por la infusión de EDTA. Esta es una sustancia quelante que de forma indiscriminada se une al magnesio favoreciendo su eliminación renal, igual que lo hace con el calcio, ya que son cationes divalentes de similares característi cas. V Discusión 249 FASE 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL ESTADO ACIDO - BASE EN EL METABOLISMO DE LA PTH. Para estudiar si el efecto del pH sobre los niveles de PTH observado durante la primera fase de estudio se debía a cambios en el metabolismo de la PTH, se eva luó la desaparición de esta hormona en el plasma después de realizar una tiroparatiroidectomía en perros sometidos a cada uno de los protocolos utilizados en la primera fase de trabajo. La tiroparatiroidectomía se llevó a cabo inmediatamente después de la inducción de hipocalcemia (min 90) cuando los niveles de PTH estaban elevados. De esta manera, se pudo hacer un estudio temporal más amplio (al partir de niveles elevados de PTH, se pudo obtener un número mayor de muestras). A partir de estas curvas de d esaparición se comprobó que la vida media de PTH en los perros era bastante corta y muy similar en todos los grupos excepto en el grupo de Acidosis Metabólica. La reducida vida media de la PTH intacta que observamos en nuestros perros está en consonancia c on los datos existentes en humanos 63,159,182 y en animales 69,184,448 El metabolismo periférico de la PTH intacta circulante que tiene lugar en los tejidos está determinado por un rápido aclaramiento y proteólisis de la hormona, y se lleva a cabo princi palmente en el hígado y en los riñones. 68,148,223,322,361,392,447 Algunos autores han sugerido que ciertas condiciones metabólicas pueden determinar un cambio fisiológico en el metabolismo periférico de la PTH. A pesar de que no existen datos específicos en la bibliografía que describan cambios en el metabolismo de la PTH en situaciones donde está alterado el pH, nos pareció oportuno comprobar si la existencia de este tipo de alteraciones en el equilibrio ácido - base podrían modificar el metabolismo de la PTH y si ésto pudiera afectar de forma importante los niveles de PTH intacta circulantes. Efectivamente, observamos que el metabolismo de esta hormona V Discusión 250 estaba algo retrasado en una situación de acidosis metabólica comparado con del grupo Control, que repres enta una situación fisiológica. Este enlentecimiento del metabolismo periférico durante la acidosis metabólica podría estar relacionado con una mayor carga metabólica para los riñones, que tienen que neutralizar y eliminar sustancias ácidas de forma forzad a. Según este razonamiento, en ambos procesos metabólicos (alcalosis y acidosis) debería existir un cierto retraso en el metabolismo de la hormona al menos por parte del sistema renal, y de acuerdo con ello si nos fijamos bien podemos comprobar que el segu ndo tiempo de vida media más elevado es el del grupo de Alcalosis Metabólica, aunque no llega a ser significativamente mayor que el del grupo Control, datos que apoyarían esta hipótesis. Existen estudios que han descrito cambios en el metabolismo de la P TH cuando se modifica la concentración extracelular de calcio, 119,147,150,240 aunque otros autores no han encontrado una regulación evidente del metabolismo de la PTH por el calcio. 69,149,184,360 Como nuestros estudios del metabolismo de la PTH se realizar on durante el periodo de hipocalcemia, y dado que los niveles de Ca 2+ pudieran influir en el ritmo del metabolismo periférico de esta hormona, consideramos que lo más correcto era realizar los cálculos del ritmo de secreción durante ese período en hipocalc emia. No obstante, estos cálculos también se realizaron con los datos registrados durante la normocalcemia. Como ya se describió en el apartado de resultados, los cálculos del ritmo de secreción están basados en la ecuación de la curva exponencial (Ct = C o x e - kt ) que describe el ritmo metabólico de PTH en cada una de las situaciones estudiadas en la primera fase de nuestro estudio. De modo que en un período determinado en el que se conocen la concentración inicial (Co) y final (Ct) de PTH se puede calcula r de forma sencilla los cambios en la concentración de PTH plasmática causados por el metabolismo periférico de la hormona. Además, si se elige un espacio de tiempo donde la concentración plasmática de PTH no se modifique, se puede asumir que toda la hormo na secretada en ese período se ha metabolizado. En base a este razonamiento calculamos, en cada una de V Discusión 251 las situaciones, la cantidad de PTH secretada. Los resultados obtenidos en estos cálculos demuestran que, a pesar de que existía una elevación de la vida media en el grupo de acidosis metabólica, el incremento en los niveles de PTH intacta registrados en este grupo no se debía únicamente a la reducción en el metabolismo de la hormona, sino que, como se ilustra en las Figuras 19 y 20, durante la acidosis me tabólica, tanto en una situación de normocalcemia como en hipocalcemia, la PTH secretada estaba incrementada significativamente. Por tanto, el incremento en la concentración de PTH que se observó en ambos tipos de acidosis en normocalcemia así como los ele vados niveles de esta hormona registrados en el grupo de Acidosis Metabólica en hipocalcemia no se pueden atribuir únicamente a cambios en el metabolismo periférico de la PTH. Del mismo modo, los cambios en el metabolismo de PTH no podrían justificar la re ducción en la concentración plasmática de dicha hormona en los grupos de perros sometidos a alcalosis. V Discusión 252 MECANISMOS DE ACCION POR LOS QUE CAMBIOS DEL PH AFECTAN LA SECRECION DE PTH Los resultados obtenidos en este trabajo muestran la existen cia de un efecto de los cambios del pH sobre la secreción de PTH, de manera que cuando desciende el pH se observa un aumento de los niveles de PTH y con la elevación del pH la concentración plasmática de PTH disminuye. Si excluimos la existencia, poco prob able durante nuestros experimentos, de modificación en la masa de las glándulas paratiroides, estos cambios en los niveles de PTH circulante pueden ser el resultado de varios mecanismos: 1) Cambios en la producción de PTH, aumentando o disminuyendo individ ualmente en cada una de las células, asumiendo que todas las células respondan a los estímulos del pH; 2) Modificaciones en el porcentaje de células paratiroides que secretan PTH, considerando que normalmente no todas las células paratiroideas están activa s; 485 3) Movilización de gránulos de PTH desde las reservas, obteniendo un pool de donde puede liberarse rápidamente más PTH. 420 De cualquier manera, conviene señalar que cada una de estas posibilidades no excluye a las otras, de forma que el resultado fin al podría ser la suma de varios de estos fenómenos. Los mecanismos por los que los cambios de pH actúan sobre la secreción de PTH no se pueden determinar con precisión a partir de los resultados de este estudio. No obstante, podemos intentar establecer al gunas conjeturas razonables. En principio, es lógico pensar que los efectos descritos estén relacionados con cambios en el pH del líquido extracelular y que, posiblemente, se deban a una acción sobre el receptor de Ca 2+ (CaR). Los cambios del pH en el medi o extracelular pueden inducir cambios conformacionales del CaR que alteren la respuesta de esta proteína de membrana a los niveles plasmáticos de Ca 2+ . Una idea similar fue apuntada anteriormente por Graham et al. 215 a partir de los resultados de un estudi o donde observaron que la relación Ca 2+ - PTH se modificaba al corregir las alteraciones del pH en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Esta hipótesis estaría basada en la teoría “alfastat “ para la regulación del balance ácido - base, según la V Discusión 253 cu al el control de la concentración de H + está encaminado a mantener constante la carga de las proteínas y su ionización. 411 De este modo, los cambios en el pH podrían influir sobre algunas proteínas que actúan como receptores de membrana, induciendo modific aciones en su conformación. Estos cambios en la estructura cuaternaria de las proteínas son debidos a la protonación de grupos imidazoles de los residuos de histidina, grupos que poseen un pK que es susceptible a cambios en un rango de pH cercano al fisiol ógico. Conviene resaltar que el CaR contiene varios aminoácidos histidina en su dominio extracelular, que serían susceptibles de experimentar las modificaciones anteriormente descritas. Además de los cambios de pH, factores como la temperatura, la osmolari dad y la concentración de iones fuertes (SID) pueden alterar la carga de esas proteínas independientemente. 352 Además de la acción sobre el CaR, no se pueden descartar otros posibles mecanismos por los que el cambio de pH extracelular, directamente o bie n a través de efectos adicionales de SID, PCO 2 y At, actúe sobre las células paratiroideas. Estos mecanismos adicionales pueden ser debidos a interferencias en alguna o varias de las vías de señalización intracelular que hasta ahora se conocen en estas cél ulas: vía fosfolipasa C - inositolfosfatos, vía fosfolipasa A - ácido araquidónico, vía adenilato ciclasa – AMPc y vía Ca 2+ intracelular. Se sabe que los mecanismos de señalización intracelular en estas células son críticos para coordinar la secreción de P TH. 484,46 Por otra parte, se ha comprobado que los cambios del pH intracelular pueden afectar a la capacidad de modular la señalización intracelular en las células paratiroideas. 90 De esta manera, es razonable pensar que los cambios de pH a nivel extracelu lar puedan afectar de algún modo a esas vías de señalización intracelular modificando la secreción de PTH. En numerosos estudios sobre distintos tipos de células se ha descrito que el Ca 2+ intracelular actúa como mediador de señales intracelulares provocad as por los cambios del pH extra e intracelular. 90,209,357,366,471,475,497 Con gran probabilidad, este tipo de señales intracelulares mediadas por Ca 2+ podrían estar involucradas en la respuesta secretora de las células paratiroideas a acidosis y a alcalosi s. V Discusión 254 No existen datos suficientes en nuestros resultados para establecer el mecanismo de la diferente respuesta secretora de las glándulas paratiroides a las alteraciones del pH según se trate de procesos metabólicos o respiratorios. Sin embargo, si analiza mos las peculiaridades que caracterizan ambos tipos de alteraciones del pH, podemos obtener información suficiente para plantear posibles mecanismos que expliquen tales diferencias. Los procesos metabólicos y respiratorios difieren, fundamentalmente, en el gradiente de pH que se establece entre el exterior y el interior de la célula. 234 En los procesos metabólicos existe un gradiente de pH alto (por ejemplo, en acidosis metabólica el descenso de pH extracelular, debido al descenso de SID, es relativamente m ayor que el que se produce en el interior de la célula). 250 Este hecho estaría también en la línea de algunas teorías sobre el efecto del pH en los quimiorreceptores celulares, que postulan que el estímulo que éstos captan está relacionado con un gradiente de H + a través de la membrana celular. 451 En los procesos respiratorios, sin embargo, el gradiente es más bajo (así en el caso de una acidosis respiratoria el descenso del pH intracelular es similar al extracelular, debido a la gran capacidad de difusión del CO 2 ). La elevación aguda de la PCO 2 (acidosis respiratoria) causa un incremento en la concentración de H + y una rápida formación de pequeñas cantidades de carbamatos; estos cambios tendrían lugar en ambas partes de la membrana por igual, y por ello pod rían modificar la conformación, tanto de las proteínas extra, como intracelulares. Esta diferencia entre los cambios de pH extra e intracelulares podría justificar las diferencias encontradas entre la Acidosis Metabólica y la Acidosis Respiratoria en una s ituación de hipocalcemia, así como la diferente inhibición detectada entre la Alcalosis Respiratoria y la Alcalosis Metabólica en normocalcemia. La diferencia de efectos encontrada entre ambos tipos de alcalosis sobre la secreción de PTH puede ser también el reflejo de una combinación de mecanismos. En los resultados recogidos en el grupo Control Hiperosmolar durante la normocalcemia se observa una elevación en la concentración de PTH. En el grupo de Alcalosis Metabólica, donde existe una elevación de los niveles plasmáticos de Na + de igual magnitud a la producida en el V Discusión 255 grupo Control Hiperosmolar, se deben producir dos efectos diferentes: un efecto inhibidor del alto pH y un efecto estimulante producido por la elevación de Na + (aumento de la osmolaridad y/o fuerza iónica), y como resultado final se obtiene un efecto inhibidor sobre la secreción de PTH más moderado que en la Alcalosis Respiratoria. Por otra parte, conviene resaltar que el efecto inhibidor que la Alcalosis Respiratoria produce sobre la secre ción de PTH es muy potente, reduciéndose los niveles de esta hormona hasta suprimirse totalmente. Este grado de supresión no se llega a obtener en una situación de máxima inhibición por alto calcio, 439 lo que nos lleva a pensar que durante una alcalosis re spiratoria aguda existen alteraciones en los mecanismos de secreción de la hormona que producen un bloqueo completo de la secreción de PTH. Todos los mecanismos expuestos hasta ahora se pueden considerar de igual modo, tanto en una situación de normocalc emia, como en hipocalcemia. Sin embargo, los resultados obtenidos durante la hipocalcemia demuestran que el fuerte efecto estimulante del bajo calcio sobre la células paratiroideas prevalece sobre los demás fenómenos que acontecen en la célula debidos a lo s cambios del pH extracelular. Así, la respuesta secretora encontrada en los grupos de Acidosis Respiratoria, Alcalosis Respiratoria y Alcalosis Metabólica durante la hipocalcemia no difiere de la recogida en el grupo Control. En el caso de la Acidosis Met abólica, la gran elevación de los niveles de PTH máximos observados en hipocalcemia debe ser considerada separadamente y como fruto de un fenómeno secretagogo adicional. Este efecto secretagogo de la acidosis metabólica sobre las glándulas paratiroides en una situación de máxima estimulación no es del todo novedoso. En estudios recientes, se ha observado que determinadas situaciones y/o sustancias pueden incrementar la secreción máxima de PTH durante la hipocalcemia. De forma similar a lo que ocurre con nu estros resultados en acidosis metabólica, se ha comprobado que la infusión de péptido relacionado con la PTH (PTHrP) durante la inducción de hipocalcemia incrementa marcadamente la respuesta de PTH a la V Discusión 256 hipocalcemia. 298 En pacientes con hiperparatiroidismo primario también se ha observado que la reducción de los niveles de calcio iónico hasta los valores normales, mediante la administración de bifosfonato durante 5 a 10 días, produjo una respuesta de PTH máxima a hipocalcemia por encima del doble de la obse rvada en la situación inicial. 316 Además, esta situación no es exclusiva para la PTH y el calcio. Existen otras sustancias secretagogas que pueden potenciar la secreción de una hormona por encima de lo que lo hace el sustrato que normalmente regula dicha h ormona. Un estudio reciente ha mostrado que cuando se infundía glucagón - like peptide - 1 (GLP - 1) y arginina la secreción de insulina se incrementó por encima de lo observado con el estímulo de la glucosa. 192 Se debe resaltar el hecho de que el efecto estim ulante adicional en la secreción de PTH (efecto secretagogo) producido por la acidosis metabólica no sólo apareció en una situación de hipocalcemia, sino que también sucedió en hipomagnesemia. Si se observan los resultados recogidos durante la normocalcemi a en los grupos iniciales de Acidosis sin corrección del Mg, encontramos que el descenso de Mg produjo un estímulo adicional sobre la secreción de PTH en el grupo de Acidosis Metabólica, estímulo que no se observó en la Acidosis Respiratoria. Este hallazgo apuntaría hacia el CaR (receptor capaz de sensar cambios de ambos cationes divalentes: Ca 2+ y Mg 2+ ) como responsable del efecto secretagogo adicional encontrado en la Acidosis Metabólica. Por todo lo expuesto hasta aquí, parece evidente la necesidad de realizar estudios adicionales para esclarecer los mecanismos de acción responsables de los efectos del pH sobre la secreción de PTH. En las Figuras 45, 46, 47, 48 y 49 se muestra una representación gráfica de los posibles mecanismos de acción que median el efecto del pH sobre las células paratiroideas. V Discusión 257 FIGURA 45 . Esquema de los mecanismos de acción propuestos en las células paratiroideas en una situación sin cambios en el pH (Control). Se observa que en normocalcemia la mayoría de los receptores de C a 2+ (CaR) están interaccionando con su agonista, el ion Ca 2+ ( ). La señal que recibe la célula de sus receptores indica que existen niveles adecuados de Ca 2+ en el plasma. La célula responde secretando unos niveles basales de PTH, suficientes para mantene r esa situación de normocalcemia. En el supuesto de que la concentración de extracelular de Ca 2+ descienda marcadamente, la mayoría de los CaR se encontrarán libres, sin interaccionar con el Ca 2+ . Esta circunstancia es percibida por la célula que responder á aumentando la secreción de PTH, hasta alcanzar unos niveles máximos, con los que se intentará recuperar la concentración plasmática de Ca 2+ . PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaR CaR PTH PTH NORMOCALCEMIA CaR CaR CaR HIPOCALCEMIA CaR + PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaRCaR CaR CaR PTH PTH NORMOCALCEMIA CaR CaR CaRCaR HIPOCALCEMIA CaR + V Discusión 258 FIGURA 46 . Esquema de los mecanismos de acción propuestos en las células paratiroides en una situación de Ac idosis Metabólica. Ca 2+ ( ) En Acidosis Metabólica el descenso de SID produce una disminución del pH que será más acusada en el espacio extracelular que en el interior de la célula. El descenso de pH extracelular determinaría cambios en la conformació n del CaR que dificultarían su interacción con el Ca 2+ . Por ello, en una situación de normocalcemia, a pesar de que existen un gran número de iones Ca 2+ capaces de unirse a su receptor, su unión se vería alterada por el bajo pH. Así, lo que la célula sensa ría con sus receptores es una situación de “hipocalcemia relativa”, a la que responde secretando una cantidad suficiente de PTH para recuperarse de esa “hipocalcemia”. Por lo tanto, la respuesta secretora de la célula será superior a la que se observa en u na situación basal. Cuando la concentración de Ca 2+ extracelular es muy baja, la célula tendrá muy pocos CaR ocupados por Ca 2+ y responderá con una secreción máxima de PTH. Pero en este caso, debido al efecto combinado del bajo Ca 2+ y del gradiente de pH (entre el espacio extra e intracelular) sobre el CaR, existirá un estímulo añadido en la célula que determina una secreción de PTH por encima de la máxima respuesta observada en hipocalcemia a pH fisiológico (7.4). Además de potenciar la respuesta se cretora de PTH en la hipocalcemia, la Acidosis Metabólica también incrementa la secreción de PTH cuando existe hipomagnesemia. El hecho de que la respuesta secretora de PTH a la disminución de los cationes divalentes (Ca 2+ y Mg 2+ ) se vea potenciada en una situación de Acidosis Metabólica, sugiere que en dicho efecto puede estar implicado el CaR. V Discusión 259 ACIDOSIS METABOLICA NORMOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH pH pH SID CaR CaR CaR CaR HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaR CaR CaR Ca 2+ Mg 2+ + pH pH SID ACIDOSIS METABOLICA NORMOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH pH pH SID pH pH SID SID CaR CaR CaR CaR HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaR CaR CaR Ca 2+ Mg 2+ + Ca 2+ Mg 2+ + pH pH SID V Discusión 260 FIGURA 47 . Esquema de los mecanismos de acción propuestos en las células paratiroides en una situación de Alcalosis Metabólica. Ca 2+ ( ) El au mento de SID que se produce en Alcalosis Metabólica determina un aumento del pH, de mayor magnitud en el espacio extracelular. Este cambio de pH provocaría cambios en la conformación de CaR que potenciarían su afinidad por el Ca 2+ , de manera, que cuando lo s niveles de Ca 2+ plasmático son normales, la mayoría de los receptores (CaR) se unirían fuertemente con su agonista (Ca 2+ ). Esta situación provocará una fuerte señal inhibitoria en la célula, que reducirá la secreción de PTH. Al mismo tiempo, en Alcalosis Metabólica existe un ambiente extracelular con elevada concentración de iones Na + , que van a interaccionar también con el CaR estimulando la secreción de la célula. Por lo tanto, el resultado final sería que la célula paratiroidea secreta PTH, pero en ca ntidad muy reducida. Cuando la concentración extracelular de Ca 2+ desciende mucho, a pesar de que esté potenciada la unión de este catión con su receptor, la mayoría de los CaR quedarán libres y se producirá un fuerte estímulo sobre la célula, que respond erá con una secreción máxima de PTH. V Discusión 261 ALCALOSIS METABOLICA NORMOCALCEMIA PTH HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR Na + Na + Na + Na + Na + Na + Na + Na + pH pH SID pH pH SID ALCALOSIS METABOLICA NORMOCALCEMIA PTH HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaRCaR CaR CaR CaR CaR CaR Na + Na + Na + Na + Na + Na + Na + Na + pH pH SID SID pH pH SID SID V Discusión 262 FIGURA 48 . Esquema de los mecanismos de acción propuestos en las células paratiroides en una situación de Acidosis Respiratoria. Ca 2+ ( ) En Acidosis Respiratoria el acúmulo de CO 2 provoca una caída del pH, que es similar en el espacio extra e intracelular. El descenso del pH, al igual que en la Acidosis Metabólica, alteraría la conformación del receptor de Ca 2+ (CaR) dificultando la interacción de éste con su agonista. Con estas alteraciones , a pesar de existir numerosos iones Ca 2+ , la célula no sería capaz de captarlos bien y aumentaría la secreción de PTH en normocalcemia. Al producirse una hipocalcemia severa, los receptores se ven mínimamente ocupados, lo que se traduce en una máxima resp uesta secretora de la célula. V Discusión 263 ACIDOSIS RESPIRATORIA NORMOCALCEMIA HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTHPTH PTHPTH PTHPTH PTHPTH PTH CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR CO 2 pH pHpH CO 2 pH pHpH ACIDOSIS RESPIRATORIA CaRCaR CaR CaR CaR V Discusión 264 FIGURA 49 . Esquema de los mecanismos de acción propuestos en las células paratiroides en una situación enj Alcalosis Respiratoria. Ca 2+ ( ) En Alcalosis Respiratoria el descenso de PCO 2 det ermina la elevación del pH extra e intracelular. Al igual que sucede en Alcalosis Metabólica, la elevación del pH extracelular potenciría la afinidad de los CaR por los iones Ca 2+ . Así, durante normocalcemia, la unión de los CaR con su agonista provoca una fuerte señal inhibitoria sobre la célula, que reduce drásticamente su secreción. Probablemente, el descenso agudo de PCO 2 o de pH en el interior de la célula produce al mismo tiempo un bloqueo en los mecanismos de secreción, por lo que la secreción de PTH se suprime completamente. De nuevo, la ausencia de CaR ocupados durante hipocalcemia severa, provocará un estímulo muy fuerte sobre la célula que consigue restaurar la secreción de PTH y se alcanza la secreción máxima de PTH. V Discusión 265 ALCALOSIS RESPIRATORIA NORMOCALCEMIA HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR CO 2 pH pHpH CO 2 pH pHpH ALCALOSIS RESPIRATORIA NORMOCALCEMIA HIPOCALCEMIA PTH PTH PTH PTH PTH PTH CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR CaR pH pHpH pH pHpH V Discusión 266 CONSIDERACIONES CLINICAS Los efectos negativos de la acidosis sobre el hueso se han descrito en numerosas ocasiones, y se conoce desde hace años la asociación entre la acidosis y los procesos de osteomalacia en adultos y de raquitismo en individuos jóvene s. 35,213,294 Al mismo tiempo, numerosos autores han descrito y revisado la contribución de la acidosis al desarrollo de osteodistrofia renal. 112,132,213,452 Sin embargo, siempre ha existido la duda de si la acidosis podría o no contribuir a estas alteracio nes modificando directamente los niveles de PTH. A partir de nuestros resultados, se puede afirmar que, en pacientes con insuficiencia renal, la acidosis metabólica contribuye directamente, como un factor etiopatogénico independiente, al hiperparatiroidism o secundario y, evidentemente, promueve la osteodistrofia renal. Hasta ahora, los datos que existen sobre el efecto de acidosis sobre el metabolismo del hueso muestran un efecto directo del bajo pH y bajo bicarbonato, favoreciendo la disolución fisicoquími ca de la fase mineral. 99,107,277,295 Al mismo tiempo, existen evidencias de un efecto resortivo de la acidosis metabólica mediado por células óseas (osteoclastos), así como también se ha comprobado que en acidosis existe un balance negativo de calcio que f avorece la descalcificación del hueso. 94,110,281,296,301 Con los datos obtenidos en el presente trabajo, se aporta una nueva dimensión en esa constelación de efectos, en donde la elevación de los niveles de PTH provocada por la acidosis puede actuar potenc iando o incluso mediando algunas de las alteraciones que el bajo pH produce en el hueso. Las alteraciones provocadas por la acidosis metabólica tendrán especial importancia cuando de forma concomitante existan alteraciones en los niveles de calcio y/o ma gnesio plasmáticos, circunstancia que con gran frecuencia existe en pacientes con IRC. Por otra parte, los datos recogidos en nuestros estudios de alcalosis ilustran la gran utilidad que tiene la administración de sustancias alcalinizantes, como el bicar bonato, a los enfermos renales con acidosis metabólica. Los efectos beneficiosos de la corrección V Discusión 267 de la acidosis metabólica mediante la suplementación de álcalis en pacientes con insuficiencia renal se han descrito en numerosos estudios clínicos, tanto en enfermos dializados, como en los enfermos en prediálisis. Con la corrección de los niveles de bicarbonato en plasma y la estabilización de éstos entre periodos interdiálisis, utilizando distintas técnicas de diálisis, se ha conseguido en la mayoría de los pacientes estudiados mejorar notablemente el estado del hueso, pudiendo incluso en algunos casos frenar la progresión del hiperparatiroidismo secundario. 215,291,310,315 Sin embargo, la inconsistencia de los resultados acerca del efecto de estas medidas ter apéuticas sobre los niveles de PTH en los pacientes ha dificultado notablemente encontrar una explicación lógica que conjugue los diferentes hallazgos reportados en este tipo de estudios clínicos. En base a nuestros resultados, donde se observa claramente que la elevación del pH (mediante la administración de bicarbonato) reduce de forma progresiva los niveles de PTH, podemos afirmar que algunos de los efectos beneficiosos que el suplemento de álcalis produce en pacientes con insuficiencia renal, están medi ados por la reducción en los niveles de PTH. Este hecho contribuiría a mejorar, entre otros, los problemas de osteitis fibrosa que se originan en el hiperparatiroidismo renal secundario. La corrección de la acidosis metabólica en pacientes con IRC report a otras ventajas adicionales, como son: una mejora del estado nutricional y de las alteraciones cardiovasculares, y la resolución de algunos de los problemas metabólicos originados por la resistencia a la acción de la insulina. 214,309,315,520 Estos efectos beneficiosos, en principio, pueden parecer independientes de los efectos que la acidosis ejerce sobre el metabolismo mineral, sin embargo, existen datos en la bibliografía que nos llevan a relacionar algunos de estos procesos con los elevados niveles de P TH que presentan los pacientes urémicos. Así, se ha descrito que el exceso de PTH en la IRC puede producir alteraciones en la secreción de insulina e intolerancia a la glucosa. 70,315 También existen datos sobre el efecto adverso del exceso de PTH sobre l os músculos esqueléticos y el miocardio, 70 por lo que parece evidente que si se actúa en los pacientes con insuficiencia renal frente a la acidosis metabólica, corrigiendo eficientemente los niveles de V Discusión 268 bicarbonato, se consigue paliar gran número de complic aciones que aparecen en estos enfermos debidos al hiperparatiroidismo renal secundario. A la hora de llevar a cabo las medidas oportunas para corregir la acidosis metabólica en pacientes con IRC en prediálisis y en diálisis hay que ser cautos, sobre todo en aquellos enfermos que tengan un calcio y un fósforo elevados, ya que la administración de bicarbonato puede favorecer la precipitación de sales de fosfato cálcico en los tejidos blandos. Así pues, este tipo de medidas debe realizarse de forma individua lizada, considerando los distintos parámetros que pueden verse afectados por los cambios de pH. Otro de los elementos fundamentales en el metabolismo mineral que puede modificarse por la corrección de la acidosis metabólica es el calcitriol. Aunque en nu estro estudio no se aportan datos sobre los niveles de la vitamina D, existe información en la bibliografía que revela un aumento en la actividad de esta vitamina y de los niveles plasmáticos de su forma activa (1,25 (OH) 2 D 3 ) en pacientes con IRC en los qu e se reduce el grado de acidosis metabólica administrando sustancias alcalinizantes. 133,311,315 Algunos de estos autores relacionan los cambios en la producción de CTR con los efectos inhibitorios que la acidosis ejerce sobre la enzima 1 α hidroxilasa renal , de manera que en un estado de IRC con hiperparatiroidismo secundario existe descenso en la producción de CTR provocado por esta acción inhibitoria de la acidosis, y aunque la concentración plasmática de PTH esté muy aumentada su acción renal está bloquea da por la acidosis metabólica. 311,315 Por lo tanto, al eliminar la acidosis metabólica en estos pacientes, aunque los niveles de PTH se redujeran, la PTH sería capaz de estimular la actividad de la enzima 1 α hidroxilasa renal y así aumentar la producción d e CTR. Los procesos de alcalosis metabólica son frecuentes en numerosas condiciones clínicas donde existen vómitos, uso de diuréticos, lavados gástricos, hipertensión inducida por renina o angiotensina, etc. Además, puede aparecer alcalosis respiratoria a guda asociada V Discusión 269 a hipocalcemia en pacientes en estado crítico que padecen sepsis, enfermedades hepáticas y neumonía. 124,348,526 Al mismo tiempo, pacientes que requieren cuidados intensivos a menudo presentan hipocalcemia de origen multifactorial asociada a n iveles inadecuados de PTH. 124,348,526,527 La alcalosis y la hipocalcemia iónica están además relacionadas, puesto que un incremento del pH reduce la ionización del calcio. En general, la información que existe sobre el efecto de la alcalosis metabólica y respiratoria aguda sobre la secreción de PTH es muy escasa. Además, no hay datos sobre la respuesta secretora de PTH a la hipocalcemia, en estados de alcalosis. Nuestros resultados en perros y los de Krapf et al . 273 en humanos sugieren que la alcalosis agu da reduce de forma directa los niveles de PTH y altera la respuesta de las glándulas paratiroides a los niveles de Ca 2+ . Por ello, en estos estados críticos donde coexiste una hipocalcemia con alcalosis aguda, es importante considerar que la alcalosis pued e ser un factor que afecte separadamente el desarrollo de hipocalcemia y la secreción de PTH, siendo así más fácil abordar el manejo terapéutico de estos pacientes. No se debe olvidar que estas consideraciones clínicas, además de tener especial relevanci a en pacientes humanos, tienen un gran interés en medicina veterinaria, sobre todo en la clínica de pequeños animales, donde el número de casos atendidos por enfermedad renal suele ser muy alto y el desarrollo de unidades de cuidados intensivos está muy av anzado. Como ya se ha descrito anteriormente, en estudios previos realizados en nuestro laboratorio, se observó que, al igual que en humanos, existe un incremento en la concentración de PTH en perros asociado a la edad. 5 En los individuos de edad avanzad a son muy frecuentes las alteraciones óseas degenerativas y los procesos de desmineralización ósea. 344 Además, en humanos se ha descrito una tendencia a padecer acidosis metabólica con la edad. Con estos datos y a la vista de nuestros resultados, puede ser de gran utilidad clínica comprobar si en los individuos seniles, donde aparecen V Discusión 270 frecuentemente problemas óseos, existen desequilibrios del estado ácido - base que estén agravando u originando estas alteraciones VI Conclusiones 271 VI. CONCLUSIONES VI Conclusiones 272 VI Conclusiones 273 1. En un modelo experimental canino in vivo , tanto la acidosis metabólica, como la acidosis respiratoria agudas producen una elevación en los niveles plasmáticos de PTH. 2. En perros, la acidosis meta bólica aguda potencia la respuesta secretora de las glándulas paratiroides a la hipocalcemia, incrementando la secreción máxima de PTH. 3. Aunque en perros sometidos a acidosis metabólica el metabolismo periférico de PTH está enlentecido, la elevación en los niveles plasmáticos de PTH en acidosis metabólica aguda se debe principalmente a un incremento de secreción hormonal. 4. Cuando se induce acidosis metabólica aguda a perros sin controlar la calce mia, los niveles plasmáticos de PTH sufren un ligero increment o, a pesar de la elevación de calcio iónico que se produce como consecuencia del descenso de pH. 5. Para mantener constante la calcemia en perros sometidos a acidosis, es necesario administrar mayor cantidad de EDTA en acidosis metabólica que en acidosis res piratoria. Este hecho sugiere que la acidosis metabólica provoca una mayor salida de calcio del hueso que la acidosis respiratoria. 6. La infusión intravenosa de EDTA a perros produce, además de un descenso en la calcemia, una disminución equiparable en los niveles plasmáticos de magnesio. La hipomagnesemia estimula la secreción de PTH y la acidosis metabólica potencia la respuesta secretora de las glándulas paratiroides a la hipomagnesemia en perros normocalcémicos. VI Conclusiones 274 7. En perros, la alcalosis aguda, tanto me tabólica como respiratoria, determina una disminución en los niveles plasmáticos de PTH. 8. La alcalosis respiratoria aguda da lugar a niveles plasmáticos de PTH inferiores a los registrados en la alcalosis metabólica aguda, llegando prácticamente a suprimir por completo la secreción hormonal. 9. Para un mismo incremento de pH, la inducción de alcalosis metabólica, mediante infusión de bicarbonato sódico, produce un mayor descenso en la calcemia iónica que la inducción de alcalosis respiratoria, mediante hiperv entilación. 10. Cuando existe un estímulo hipocalcémico, en los perros con alcalosis aguda (metabólica y respiratoria) se alcanzan niveles máximos de secreción de PTH. 11. Aunque no se conocen los mecanismos por los que los cambios del estado ácido - base influyen sobre la secreción de PTH, los resultados de este estudio apuntan hacia dos posibles hipótesis: a) cambios conformacionales en el receptor de calcio; y, b) modificaciones intracelulares provocadas por los cambios en la concentración de calcio intracelular u otros mediadores intracelulares dependientes del pH intracelular. VII Resumen 275 VII. RESUMEN VII Resumen 276 VII Resumen 277 Debido a los diversos efectos que las alteraciones del equilibrio ácido - base (acidosis y alcalosis) ejercen sobre el metabolismo mineral, no se ha establecido aún si los cambios en el pH del medio interno afectan directamente la secreción de PTH. Además, el efecto sobre la secreción de PTH puede ser diferente si las alteraciones del pH tienen un origen metabólico o respiratorio, y si son de carácter agudo o crónico. Este efecto del pH sobre la secreción de PTH también puede diferir dependiendo de los niveles de calcio iónico. Nuestros objetivos han sido determinar si la acidosis y alcalosis agudas: 1) afectan directamente a la secreción de PTH, 2) modifican la respuesta de PTH a la hipoca lcemia, 3) alteran el metabolismo de la PTH y 4) producen efectos sobre la PTH diferentes según sean de origen metabólico o respiratorio. En una primera fase se han estudiado 5 grupos de perros: 1) Control, 2) Acidosis Metabólica (Ac. Met.), 3) Acidosis Respiratoria (Ac. Res.), 4) Alcalosis Metabólica (Alc. Met.) y 5) Alcalosis Respiratoria (Alc. Res.). La Ac. y la Alc. metabólicas fueron inducidas mediante la infusión de HCl y bicarbonato, respectivamente; mientras que la Ac. y la Alc. respiratorias se est ablecieron mediante hipoventilación (Ac.) e hiperventilación (Alc), respectivamente. Durante los primeros 60 minutos del estudio, se infundió EDTA o CaCl 2 para prevenir el incremento o disminución del calcio iónico provocado por la Ac. y Alc. La cantidad de EDTA o CaCl 2 que se necesitó infundir en las alteraciones de origen metabólico fue mayor que en los procesos respiratorios. Entre el minuto 60 y 90 del estudio se evaluó la respuesta de PTH a una hipocalcemia inducida por EDTA. Fue necesaria la infusió n de una solución de magnesio para prevenir la hipomagnesemia provocada por la infusión de EDTA en los grupos de acidosis. Cuando la concentración de calcio iónico se mantuvo en valores normales durante los primeros 60 minutos del estudio, tanto la Ac. Met. como la Ac. Res. produjeron un incremento (p<0.05) en los niveles de PTH, alcanzando valores cercanos a 100 pg/ml; mientras que en ese mismo periodo se observó un descenso (p<0.05) en la concentración plasmática de PTH con la Alc. Met. y la Alc. Res. La respuesta máxima de PTH registrada durante hipocalcemia fue muy superior en el grupo de Ac. Met. que en los grupos de Ac. Res. y Control, mientras que esta respuesta fue similar en los grupos de Alc. y Control. En una segunda fase del estudio se sometió a Ac. VII Resumen 278 Met. a un nuevo grupo de perros sin controlar la elevación del Ca 2+ . En estos animales se observó también un incremento (p<0.05) en la concentración de PTH, a pesar de presentar una subida del Ca 2+ superior a 0.1 mmol/l. Finalmente, en la tercera fase del estudio se determinó la vida media de la PTH intacta durante la hipocalcemia, en cada uno de los grupos utilizados durante la primera fase, midiendo los niveles descendentes de PTH tras realizar una paratiroidectomía en el minuto 90 del estudio. La vida media de PTH en el grupo de Ac. Met. fue superior (p<0.05) que la del Control, no obstante, el ritmo de secreción en el grupo de Ac. Met. también fue más elevado que el de los demás grupos. En conclusión: 1) tanto la Ac. Met. aguda como la Ac. Res. aguda producen un rápido incremento en la secreción de PTH; 2) la Alc. Met. y la Alc. Res. determinan una reducción en los niveles plasmáticos de PTH; 3) la Ac. Met. aguda actúa como un secretagogo para la secreción de PTH, potenciando la máxima respuesta de las glándulas paratiroides a la hipocalcemia; 4) la elevación en los niveles de PTH durante una situación de acidosis aguda es debida fundamentalmente a un aumento del ritmo secretorio de las glándulas paratiroides; 5) l os mecanismos por los cuales la acidos is y alcalosis potencian o inhiben, respectivamente, la secreción de PTH permanecen sin ser aclarados , aunque se consideran algunas posibilidades como cambios conformacionales en el receptor de calcio y efectos intracelulares a través de las diferentes vías de señalización intracelular que regulan la secreción de PTH. VIII Summary 279 VIII. SUMMARY VIII Summary 280 VIII Summary 281 Because acid - base balance disorders have multiple effects on mineral metabolism, up to now it has been difficult to stablish whether pH changes directly affect PTH secretion. The work reported here was aimed to determine whether acute acidosis and acute alkalosis: 1) directly affect PTH secretion, 2) have different effects depending of their metabolic or respiratory origin, 3) affect the PTH response to hypocalcemia, and 4) alter the metabolism of P TH. Five groups of dogs were studied in the first stage: 1) Control, 2) Metabolic Acidosis (Met. Ac.), 3) Respiratory Acidosis (Res. Ac.), 4) Metabolic Alkalosis (Met. Alc.) and 5) Respiratory Alkalosis (Res. Alk.) . Acute Met. Ac. and Met. Alk. were induc ed in dogs by HCl and NaCO 3 H infusion respectively, whereas Res. Ac. and Res. Alk. were set up by hypoventilation and hyperventilation respectively. During the first 60 minutes of the study, EDTA or CaCl 2 were infused to prevent the acidosis - induced increa se or alkalosis - induced decrease in ionized calcium levels. More EDTA and CaCl 2 were needed in metabolic than in respiratory processes. Between 60 and 90 minutes of the study, the PTH response to hypocalcemia was evaluated during EDTA - induced hypocalcemia. Magnesium needed to be infused in the acidosis groups receiving EDTA to prevent hypomagnesemia. When the ionized calcium concentration was clamped at normal values during the first 60 minutes of the study, both Met. Ac. and Res. Ac. increased (p < 0.05) P TH values to near 100 pg/ml. A decrease (p<0.05) in PTH concentration was observed in Met. Alk. and Res. Alk.. The maximal PTH response to hypocalcemia was greater (p<0.05) in the Met. Ac. group than in the Control and Res. Ac. groups, whereas the response to hypocalcemia was similar in the Alkalosis and Control groups. In a second stage, metabolic acidosis was induced in a new group of dogs without clamping plasma calcium. Even though ionized calcium levels raised over 0.1 mmol/l, an increase (p<0.05) in P TH was observed in these animals. Finally, in the last stage of the study the half - life of intact PTH was studied. The decline in plasma PTH concentration was measured after a parathyroidectomy. The half - life of PTH was greater (p<0.05) in the Met. Ac. gro up than in the Control group. However, the secretion rate of PTH was also greater (p<0.05) in the Met. Ac. group. In conclusion: 1) both acute Met. Ac. and Res. Ac. increase PTH secretion when ionized calcium and magnesium VIII Summary 282 concentration are maintained at n ormal values; 2) acute Met. Alk. and Resp. Alk. decrease PTH secretion; 3) acute Met. Ac. enhances the maximal PTH response to hypocalcemia; and 4) the increase in PTH levels during Met. Ac. is caused mainly by an increase in secretion rate of PTH; and 5) although the mechanisms by which pH changes modify PTH secretion are unknown, changes in CaR and in intracellular signalling pathways are likely involved. IX Bibliografí a 283 IX. BIBLIOGRAFIA IX Bibliografía 284 IX Bibliografí a 285 1. 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