UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA E. T. S. DE INGENIEROS AGRÓNOMOS Y DE MONTES DEPARTAMENTO DE BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS “APORTACIONES DE LA TECNOLOGÍA NIRS A LA CALIDAD DE PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS” TESIS DOCTORAL Antonio Jesús Gaitán Jurado Directores: Dr. Victor Ortíz Somovilla Dra. Mª Isabel López Infante 2009 TITULO:Aportación de la tecnología NIRS a la calidad de productosagroalimentarios AUTOR:Antonio Jesús Gaitán Jurado © Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2010 Campus de Rabanales Ctra. Nacional IV, Km. 396 14071 Córdoba www.uco.es/publicaciones publicaciones@uco.es ISBN-13: 978-84-693-4178-0 “APORTACIONES DE LA TECNOLOGÍA NIRS A LA CALIDAD DE PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS” TESIS para aspirar al grado de Doctor por la Universidad de Córdoba presentada por el Ingeniero Agrónomo D. Antonio Jesús Gaitán Jurado El Doctorando Fdo.: Antonio Jesús Gaitán Jurado Vº Bº Los Directores Fdo.: Profª. Dra. Mª Isabel López Infante Fdo.: Dr. Víctor Ortiz Somovilla 2009 Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos VICTOR ORTIZ SOMOVILLA, profesor Asociado del Departamento de Bromatologia y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Córdoba y Mª ISABEL LÓPEZ INFANTE, Profesora Asociada del Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Córdoba. I N F O R M A N: Que la Tesis titulada “APORTACIONES DE LA TECNOLOGÍA NIRS A LA CALIDAD DE PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS”, de la que es autor D. Antonio Jesús Gaitán Jurado, ha sido realizada bajo nuestra dirección durante los años 2005, 2006, 2007, 2008, 2009; y cumple las condiciones académicas exigidas por la Legislación vigente para optar al título de Doctor por la Universidad de Córdoba. Y para que conste a los efectos oportunos firman el presente informe en Córdoba a 10 de Julio de 2009 Fdo.: Profª. Dra. Mª Isabel López Infante Fdo.: Dr. Victor Ortiz Somovilla Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos A Mónica A mis Padres y Hermanos Agradecimientos Se extendería demasiado este apartado si tuviera que nombrar a todas las personas que, directa o indirectamente, han colaborado en la realización de este trabajo. Haciendo un esfuerzo de síntesis, tengo que dar mi más sincero agradecimiento: A Victor Ortiz Somovilla, aparte de director de esta Tesis, es el responsable en gran medida de la formación recibida y actitudes que he ido desarrollando a lo largo de mi trayectoria profesional, Gracias Victor. A Mª Isabel López Infante, del mismo modo, directora de Tesis, gracias por ese empujón final necesario. A muchísimos compañeros del IFAPA, especialmente al Área de Tecnología Postcosecha del IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’: Paco Peña y Toñi Herruzo, gracias por vuestra colaboración continua en todo momento; a los becarios actuales, Inma, Lourdes y Rafa, y a otros más antiguos, como mi gran amigo Carlitos. Mención especial a Fide, con quién empecé a desarrollar mi andadura en el “CIFA de Córdoba”. A mis actuales compañeros, teleformers, Gema, Patricia y Jose, y al resto que conforman el departamento de Formación del IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’. A la Universidad de Córdoba, especialmente los departamentos de Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Producción Animal de ETSIAM y al SCAI, unidad de espectroscopia NIR/MIR. Y por su puesto, si no tuviese en cuenta el plano personal, difícilmente llegaría a buen puerto este trabajo. Por lo tanto, no tengo suficientes palabras de agradecimiento, hacia cinco personas con las que me gustaría compartir más tiempo, que simplemente con su forma de ser, me ayudan a conseguir los objetivos que me planteo y a ser como soy. Mis padres, Antonio y Carmen, ejemplo de entrega, cariño y comprensión; mis hermanos, Rafael y Rocío, que además son mis amigos; y mi mujer, Mónica, muchísimas gracias por todo tu amor. Índice 13 CAPÍTULO I. GENERALIDADES .............................................................................. 31 1.1 Introducción....................................................................................................33 1.1.1 Control y Aseguramiento de la Calidad en la Industria Agroalimentaria .. ....................................................................................................................... 33 1.1.2 Tendencias Actuales en el Consumo de Alimentos............................. 34 1.1.3 Demanda Tecnológica en la Industria Agroalimentaria en un Contexto Analítico .............................................................................................. 36 1.2 Tecnología NIRS ............................................................................................ 38 1.2.1 Definición y Evolución Histórica .......................................................... 38 1.2.2 Instrumentación................................................................................... 41 1.2.2.1 Interacción radiación-muestra ............................................................. 41 1.2.2.2 Componentes básicos de un instrumento NIRS ................................. 41 1.2.2.3 Criterios para la selección de un instrumento NIRS ........................... 47 1.2.3 Quimiometría ...................................................................................... 47 1.2.3.1 Análisis de Componentes Principales................................................. 48 1.2.3.2 Análisis cuantitativo. Calibración multivariante.................................. 49 1.2.3.3 Análisis cualitativo ............................................................................... 51 1.2.3.4 Pretratamientos sobre la señal espectroscópica NIR......................... 55 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 59 CAPÍTULO II. CONTROL DE CALIDAD SOBRE EMBUTIDOS DE CERDO ............ 63 2.1 Introducción....................................................................................................65 2.1.1 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en cárnicos ...................................65 2.1.1.1 Trabajos iniciales................................................................................... 65 2.1.1.2 Trabajos recientes ................................................................................. 67 2.1.2 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en el Sector del Cerdo Ibérico ......80 2.2 Objetivos ........................................................................................................ 82 2.3 Clasificación de embutidos según calidades................................................... 84 2.3.1 Antecedentes......................................................................................... 84 2.3.2 Material y Métodos................................................................................. 85 2.3.2.1 Materia prima......................................................................................... 85 2.3.2.1.1 Elaboración de chorizo................................................................ 85 2.3.2.1.2 Elaboración de salchichón........................................................... 86 2.3.2.2 Diseño del colectivo experimental........................................................ 87 2.3.2.2.1 Chorizo ....................................................................................... 87 14 2.3.2.2.2 Salchichón .................................................................................. 87 2.3.2.3 Análisis NIRS ......................................................................................... 88 2.3.2.3.1 Espectrofotómetro....................................................................... 88 2.3.2.3.2 Formas de presentación de muestras.......................................... 89 2.3.2.4 Análisis de datos ................................................................................... 92 2.3.2.4.1 Filtrado de espectros................................................................... 93 2.3.2.4.2 Análisis de Componentes Principales.......................................... 94 2.3.2.4.3 Análisis discriminante.................................................................. 95 2.3.2.4.4 Modelos de predicción de mezclas.............................................. 96 2.3.2.4.5 Pretratamientos matemáticos aplicados a la señal espectroscópica ......................................................................... 99 2.3.3 Resultados y Discusión........................................................................101 2.3.3.1 Estudio de repetibilidad espectral ...................................................... 101 2.3.3.1.1 Chorizo ..................................................................................... 102 2.3.3.1.2 Salchichón ................................................................................ 103 2.3.3.2 Caracterización espectral.................................................................... 104 2.3.3.2.1 Chorizo ..................................................................................... 104 2.3.3.2.2 Salchichón ................................................................................ 108 2.3.3.3 Análisis discriminante......................................................................... 110 2.3.3.3.1 Chorizo ..................................................................................... 110 2.3.3.3.2 Chorizo y salchichón ................................................................. 113 2.3.3.4 Modelos de predicción de mezclas..................................................... 116 2.3.3.4.1 Análisis de Componentes Principales........................................ 116 2.3.3.4.2 Ecuaciones de predicción.......................................................... 119 2.4 Caracterización de embutidos mediante predicciones de constituyentes mayoritarios ...............................................................................................123 2.4.1 Antecedentes.......................................................................................123 2.4.2 Material y Métodos...............................................................................124 2.4.2.1 Materia prima y diseño experimental.................................................. 124 2.4.2.2 Análisis NIRS ....................................................................................... 124 2.4.2.3 Análisis químico.................................................................................. 124 2.4.2.4 Análisis de datos ................................................................................. 124 2.4.2.4.1 Filtrado espectral....................................................................... 124 2.4.2.4.2 Análisis de Componentes Principales........................................ 124 2.4.2.4.3 Modelos predictivos: calibración y validación............................. 125 2.4.2.4.4 Pretratamientos matemáticos aplicados a la señal espectroscópica ...................................................................... 125 2.4.3 Resultados y Discusión........................................................................126 2.4.3.1 Valores de referencia........................................................................... 126 15 2.4.3.2 Estudio de repetibilidad espectral ...................................................... 127 2.4.3.3 Caracterización espectral.................................................................... 128 2.4.3.4 Análisis de Componentes Principales................................................ 128 2.4.3.5 Modelos de predicción de Grasa, Humedad y Proteína..................... 128 2.4.3.5.1 Caracterización de los modelos................................................. 128 2.4.3.5.2 Evaluación de los modelos ........................................................ 131 2.5 Optimización de un proceso de adquisición espectral NIR con embutidos de cerdo comerciales loncheados, dispuestos en bandejas y cubiertos con plástico film de uso alimentario.................................................................. 137 2.5.1Antecedentes........................................................................................ 137 2.5.2 Material y Métodos............................................................................... 139 2.5.2.1 Materia prima....................................................................................... 139 2.5.2.2 Diseño experimental............................................................................ 140 2.5.2.3 ACFs en la preparación de muestra ................................................... 142 2.5.2.4 Análisis NIRS ....................................................................................... 144 2.5.2.5 Respuestas .......................................................................................... 144 2.5.3 Resultados y Discusión........................................................................ 146 2.5.3.1 Grupo ‘Difícil Control’ (DC) ................................................................. 148 2.5.3.2 Grupo ‘Fácil Control’ (FC) ................................................................... 149 2.5.3.3 Grupo ‘Control Robusto’ (CR)............................................................. 150 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 153 CAPÍTULO III. CONTROL DE CALIDAD SOBRE ALGODÓN BRUTO................... 159 3.1 Introducción.................................................................................................. 161 3.1.1 Antecedentes....................................................................................... 161 3.1.2 Material y Métodos............................................................................... 163 3.1.2.1 Colectivo experimental........................................................................ 163 3.1.2.2 Análisis de referencia.......................................................................... 163 3.1.2.2.1 Humedad .................................................................................. 163 3.1.2.2.2 Impurezas ................................................................................. 165 3.1.2.3 Análisis NIRS ....................................................................................... 165 3.1.2.4 Sistemática en la metodología de análisis ......................................... 166 3.1.2.5 Análisis estadístico ............................................................................. 167 3.1.2.5.1 Root Mean Squared (RMS) ....................................................... 167 3.1.2.5.2 Análisis de Componentes Principales (ACP).............................. 168 3.1.2.5.3 Modelos de predicción............................................................... 168 3.1.2.5.4 Modelos de diferenciación entre niveles de impurezas............... 169 3.1.3 Resultados y Discusión........................................................................ 170 16 3.1.3.1 Características de espectros VIS-NIR de algodón bruto ................... 170 3.1.3.2 Estudio de repetibilidad espectral ...................................................... 171 3.1.3.3 Análisis de Componentes Principales................................................ 172 3.1.3.4 Predicciones de humedad................................................................... 173 3.1.3.5 Diferenciación entre niveles de impurezas ........................................ 176 3.2 Síntesis.........................................................................................................178 BILIOGRAFÍA......................................................................................................... 179 CAPÍTULO IV. CONTROL DE CALIDAD SOBRE ZUMO DE NARANJA Y NARANJA INTACTA .......................................................................................181 4.1 Introducción..................................................................................................183 4.1.1 Descripción del Fruto ...........................................................................183 4.1.2 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en Control de Calidad de Zumos.184 4.1.2.1 Predicciones de constituyentes.......................................................... 185 4.1.2.2 Autentificación y diferenciación ......................................................... 191 4.1.3 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en Control de Calidad de Fruta Intacta ..................................................................................................194 4.1.3.1 Aplicaciones en varios tipos de frutos............................................... 196 4.1.3.2 Aplicaciones en cítricos...................................................................... 197 4.1.3.3 Aplicaciones en melón y sandía......................................................... 198 4.1.3.4 Aplicaciones en peras......................................................................... 199 4.1.3.5 Aplicaciones en manzanas ................................................................. 200 4.1.3.6 Tendencias de la Tecnología NIRS en fruta intacta ........................... 201 4.2 Objetivos.......................................................................................................202 4.3 Control de Calidad en zumo de naranja mediante predicciones de ºBrix, Acidez, pH y Limonina............................................................................................202 4.3.1 Antecedentes.......................................................................................202 4.3.2 Material y Métodos...............................................................................203 4.3.2.1 Colectivo experimental........................................................................ 203 4.3.2.1.1 Grupo de zumos recién exprimidos sin envasar......................... 204 4.3.2.1.2 Grupo de zumos comerciales a base de concentrado................ 204 4.3.2.1.3 Grupo de zumos comerciales de naranja exprimida................... 206 4.3.2.2 Preparación de muestra: proceso de filtración.................................. 207 4.3.2.3 Valores de referencia........................................................................... 208 4.3.2.3.1 Determinación del contenido en sólidos solubles ....................... 208 4.3.2.3.2 Determinación del pH................................................................ 208 4.3.2.3.3 Determinación de acidez ........................................................... 209 4.3.2.3.4 Determinación del contenido en limonina................................... 209 17 4.3.2.4 Análisis NIRS ....................................................................................... 210 4.3.2.5 Análisis de datos ................................................................................. 212 4.3.2.5.1 Estudio de repetibilidad espectral .............................................. 212 4.3.2.5.2 Análisis de Componentes Principales ........................................ 212 4.3.2.5.3 Modelos de predicción............................................................... 213 4.3.3 Resultados y Discusión........................................................................ 215 4.3.3.1 Estudio de repetibilidad espectral ...................................................... 215 4.3.3.1.1 Zumo intacto ............................................................................. 215 4.3.3.1.2 Zumo filtrado ............................................................................. 218 4.3.3.2 Caracterización espectral VIS-NIR de zumo de naranja..................... 219 4.3.3.3 Análisis de Componentes Principales................................................ 222 4.3.3.4 Modelos de predicción de pH, Acidez, contenido en Sólidos Solubles (CSS) y Limonina................................................................................ 226 4.3.3.4.1 Valores de referencia ................................................................ 226 4.3.3.4.2 Caracterización de los modelos................................................. 232 4.3.3.4.3 Evaluación de los modelos ........................................................ 234 4.4 Estudio de detección y cuantificación de Tiabendazol mediante Tecnología NIRS sobre naranja intacta........................................................................ 241 4.4.1 Antecedentes....................................................................................... 241 4.4.2 Material y Métodos............................................................................... 243 4.4.2.1 Colectivo experimental........................................................................ 243 4.4.2.1.1 Recepción................................................................................. 243 4.4.2.1.2 Aplicación del tratamiento.......................................................... 243 4.4.2.1.3 Conservación y preparación de muestras .................................. 248 4.4.2.2 Análisis NIRS ....................................................................................... 249 4.4.2.3 Análisis de referencia.......................................................................... 250 4.4.2.4 Análisis de datos ................................................................................. 251 4.4.2.4.1 Estudio de repetibilidad espectral .............................................. 251 4.4.2.4.2 Análisis de Componentes Principales ........................................ 251 4.4.2.4.3 Análisis discriminante. Detección de Tiabendazol...................... 251 4.4.2.4.4 Modelos de predicción............................................................... 252 4.4.3 Resultados y Discusión........................................................................ 253 4.4.3.1 Estudio de repetibilidad espectral ...................................................... 253 4.4.3.2 Análisis de Componentes Principales................................................ 256 4.4.3.3 Análisis discriminante. Detección de Tiabendazol ............................ 257 4.4.3.4 Modelos de predicción de Tiabendazol.............................................. 260 BILIOGRAFÍA......................................................................................................... 265 18 CAPÍTULO V. CONCLUSIONES .............................................................................271 CAPÍTULO VI. ANEXOS..........................................................................................275 Anexo I...............................................................................................................277 Anexo II ..............................................................................................................287 Anexo III .............................................................................................................305 Anexo IV.............................................................................................................327 Anexo V..............................................................................................................339 Anexo VI.............................................................................................................351 19 ÍNDICE DE TABLAS Tabla I-1. Resumen de técnicas analíticas empleadas para certificación de origen y control de calidad en alimentos .........................................................................................................37 Tabla I-2. Detectores comúnmente empleados en equipos NIR (adaptado de Workman, 2004 [26]) ...................................................................................46 Tabla I-3. Estrategias de calibración empleadas en Tecnología NIRS ..............................................51 Tabla II-1. Resumen de trabajos publicados en la última década sobre aplicaciones de la Tecnología NIRS para la predicción de constituyentes químicos en cárnicos................69 Tabla II-2. Resumen de trabajos publicados en la última década sobre aplicaciones de la Tecnología NIRS para la predicción de características tecnológicas y sensoriales en cárnicos.............................................................................................................................73 Tabla II-3. Valores límite obtenidos para el estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados en cada forma de presentación de muestras con el producto chorizo..........................103 Tabla II-4. Valores límite obtenidos para el estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados en cada forma de presentación de muestras con el producto salchichón ....................103 Tabla II-5. Modelos seleccionados mediante Análisis Discriminante y producto chorizo..............111 Tabla II-6. Modelos seleccionados mediante Análisis Discriminante para clasificar embutidos (chorizo y salchichón) en producto curado, homogeneizado y analizado en el modo de visión inferior ..................................................................................................................114 Tabla II-7. Modelos seleccionados mediante Análisis Discriminante para clasificar embutidos (chorizo y salchichón) blancos e ibéricos en producto curado, loncheado y analizado en modo de visión inferior, con colectivo de validación externa........................................115 Tabla II-8. Valores medios de Grasa, Humedad y Proteína del tratamiento E comparados con muestras características del mismo tratamiento............................................................118 Tabla II-9. Anómalos espectrales (H>3), Componentes Principales (CPs) seleccionadas y Varianza Explicada (VE) de cada forma de presentación de muestras.........................................118 Tabla II-10. Modelos seleccionados para predicción de mezclas en salchichón para cada forma de presentación de muestras...............................................................................................120 Tabla II-11. Validación Externa de los modelos seleccionados para predicción de mezclas en salchichón para cada forma de presentación de muestras............................................120 Tabla II-12. Valores de referencia de los colectivos de calibración y validación en producto fresco .........................................................................................................................................126 Tabla II-13. Valores de referencia de los colectivos de calibración y validación en producto curado .........................................................................................................................................126 Tabla II-14. Caracterización de ecuaciones seleccionadas para predecir grasa, humedad y proteína en salchichón en cada forma de presentación de muestras..........................................129 Tabla II-15. Ecuaciones seleccionadas en fase de calibración (ETC, R2), validación cruzada (ETVC, r2, RPD) y validación externa (ETP, R2VE) para predecir grasa, humedad y proteína en salchichón en cada forma de presentación de muestras...............................................132 Tabla II-16. Factores influyentes (Apparent Critical Factors, ACF) y rango experimental, para los dos niveles del diseño planteado a resolución IV..........................................................141 Tabla II-17. Diseño Experimental Completo 27-3 empleado para determinar factores críticos en el proceso de adquisición espectral ..................................................................................142 Tabla II-18. Respuestas obtenidas con las combinaciones de pretratamientos aplicados ............146 20 Tabla II-19. Efectos estandarizados en cada factor (codificado), en respuestas con valores estadísticamente significativos. Un efecto se consideró como fuerte cuando p≤0,05..............................................................................................................................147 Tabla III-1. Valores de referencia (media, rango y desviación típica, DT) del contenido de humedad (%) en algodón bruto, para los colectivos de calibración y validación..........................174 Tabla III-2. Modelo de predicción seleccionado para la determinación del contenido de humedad de algodón bruto mediante el equipo NIRSystems 6500.....................................................175 Tabla III-3. Modelo de predicción seleccionado para la determinación del contenido de humedad de algodón bruto mediante el equipo InfraXact Lab ...........................................................175 Tabla III-4. Pretratamientos aplicados a los modelos discriminantes seleccionados para detectar niveles de impurezas en algodón bruto superiores al 3%..............................................176 Tabla III-5. Modelos discriminantes seleccionados para detectar niveles de impurezas superiores al 3% en algodón bruto.......................................................................................................177 Tabla IV-1. Resumen de trabajos publicados sobre aplicaciones de la Tecnología NIRS para la predicción de parámetros de control de calidad en zumo de frutas..............................186 Tabla IV-2. Nombre comercial, localización del envasado/sede social y observaciones de las muestras que conforman el “Grupo de zumos a base de concentrado”.......................205 Tabla IV-3. Nombre comercial, localización del envasado/sede social y observaciones de las muestras que conforman el “Grupo de zumos de naranja exprimida”..........................206 Tabla IV-4. Modelos predictivos desarrollados en zumo de naranja, según combinaciones de rango espectral, derivada y corrección de radiación dispersa.................................................214 Tabla IV-5. Valores límite del estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados para cada grupo de zumos intactos ................................................................................................216 Tabla IV-6. Valores límite del estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados para cada grupo de zumos filtrados................................................................................................218 Tabla IV-7. Anómalos espectrales (H>3), Componentes Principales (CPs) seleccionados y Varianza Explicada (VE) en zumo intacto y filtrado, para todos los grupos y para el grupo zumo recién exprimido sin envasar..........................................................................................223 Tabla IV-8. Valores de referencia de los colectivos de calibración y validación externa de zumo intacto .............................................................................................................................228 Tabla IV-9. Valores de referencia de los colectivos de calibración y validación externa de zumo filtrado.............................................................................................................................229 Tabla IV-10. Caracterización de los modelos predictivos seleccionados en zumo de naranja ......233 Tabla IV-11. Ecuaciones seleccionadas para predecir pH, acidez, sólidos solubles y limonina en zumo de naranja intacto. Grupos comerciales y recién exprimidos sin envasar ..........236 Tabla IV-12. Ecuaciones seleccionadas para predecir pH, acidez, sólidos solubles y limonina en zumo de naranja intacto. Grupo recién exprimidos sin envasar....................................236 Tabla IV-13. Ecuaciones seleccionadas para predecir pH, acidez, sólidos solubles y limonina en zumo de naranja filtrado. Grupos comerciales y recién exprimidos sin envasar..........237 Tabla IV-14. Ecuaciones seleccionadas para predecir pH, acidez, sólidos solubles y limonina en zumo de naranja filtrado. Grupo recién exprimidos sin envasar ...................................237 Tabla IV-15. Predicciones de muestras con sospecha de valores de referencia erróneos en zumos. Efecto de su eliminación sobre los valores de ETP y R2VE.............................................239 Tabla IV-16. Valores límite del estadístico RMS, teórico y aplicado, en las regiones espectrales de la base, ecuador y suma de ambas.................................................................................254 21 Tabla IV-17. Muestras seleccionadas para el desarrollo de modelos discriminantes que permitan la detección sobre naranja intacta de tiabendazol.............................................................257 Tabla IV-18. Caracterización de los modelos discriminantes seleccionados para detectar tiabendazol sobre naranja intacta...................................................................................258 Tabla IV-19. Evaluación de los modelos discriminantes seleccionados para detectar tiabendazol sobre naranja intacta.......................................................................................................258 Tabla IV-20. Matriz de Clasificación del modelo discriminante seleccionado para detectar tiabendazol sobre naranja intacta...................................................................................259 Tabla IV-21. Modelos seleccionados para la predicción de tiabendazol sobre naranja intacta......261 Tabla IV-22. Predicciones individuales de tiabendazol en naranja intacta del colectivo de validación externa a partir del modelo seleccionado (espectros obtenidos en la región del ecuador) .........................................................................................................................................262 22 ÍNDICE DE FIGURAS Figura I-1. William Herschel, descubridor de la radiación infrarroja en 1800 (http://www.ipac.caltech.edu/Outreach/Edu/herschel.gif)................................................39 Figura I-2. Bandas de absorción en el infrarrojo cercano (fuente: http://www.molecularbiometrics.com/instrumentation.html)...........................................40 Figura I-3. Tipos de interacción de la radiación NIRS con una muestra ...........................................41 Figura I-4. Esquema de modo de análisis por transmisión o transmitancia.....................................44 Figura I-5. Esquema de modo de análisis por reflexión o reflectancia .............................................45 Figura I-6. Esquema de modo de análisis por doble transmisión o transflectancia.........................45 Figura I-7. Esquema de modo de análisis por interacción ................................................................46 Figura I-8. Asignación errónea mediante aplicación de mínima distancia Euclídea sin considerar el tamaño de los grupos (línea discontínua) ........................................................................53 Figura I-9. ACPs en el Análisis SIMCA. Modelado individual para cada clase..................................54 Figura I-10. Ejemplos puntuales del efecto del suavizado ................................................................56 Figura II-1. Etapas de obtención de información espectral NIRS en el proceso de elaboración de embutidos .........................................................................................................................83 Figura II-2. Modos de análisis empleados en la adquisición espectral con el equipo Perten DA 7000 (A: modo de visión inferior, I; B: modo de visión superior, S).........................................98 Figura II-3. Obtención espectral en la forma de presentación de muestras Curado Loncheado, modo de visión Superior, con el equipo Perten DA 7000.................................................90 Figura II-4. Esquema para la obtención de las ocho formas de presentación de muestras analizadas con el equipo Perten DA 7000...........................................................................................91 Figura II-5. Recorte espectral (color rojo) sometido a los espectros obtenidos con el equipo Perten DA 7000 por presentar baja repetibilidad .........................................................................93 Figura II-6. Tratamientos empleados para la obtención de modelos de predicción de mezclas de embutidos blancos/ibéricos y límites seleccionados para su diferenciación .................97 Figura II-7. Esquema representativo de los pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa aplicados en los modelos discriminantes .......................................................101 Figura II-8. Esquema representativo de los pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa aplicados en los modelos de predicción de mezclas......................................101 Figura II-9. Evolución de espectros eliminados a medida que se incrementa el valor del estadístico RMS.................................................................................................................................102 Figura II-10. Espectros medios por tratamiento y forma de presentación de muestras en chorizo ...............................................................................................................................105 Figura II-11. Espectro medio de cada forma de presentación de muestras en chorizo..................106 Figura II-12. Espectro medio de cada forma de presentación de muestras con tratamiento espectral de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT en chorizo..............108 Figura II-13. Espectro medio de cada forma de presentación de muestras en salchichón ............108 Figura II-14. Distribución de calidades en validación de embutidos (chorizo, salchichón) con modelos desarrollados para diferenciar blanco e ibérico en producto curado, loncheado y analizado en modo de visión inferior...........................................................................115 23 Figura II-15. Representación del Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2) en cada forma de presentación de muestras...............................................................................................117 Figura II-16. Clasificaciones obtenidas con los colectivos de validación externa aplicando los modelos seleccionados para predicción de mezclas en salchichón en cada forma de presentación de muestras...............................................................................................122 Figura II-17. Esquema representativo de los pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa aplicados en los modelos de predicción de Grasa, Humedad y Proteína en salchichón.......................................................................................................................125 Figura II-18. Distribución de los parámetros grasa, humedad y proteína en producto fresco y curado (salchichón) ........................................................................................................127 Figura II-19. Disposición del producto loncheado sobre las bandejas de análisis.........................140 Figura II-20. Valor RMS medio de cada respuesta...........................................................................150 Figura III-1. Recepción de muestras (A); determinación de humedad en algodón bruto mediante medidor portátil (B) .........................................................................................................164 Figura III-2. Descripción del procedimiento de análisis: muestra – análisis NIR – análisis referencia .........................................................................................................................................167 Figura III-3. Pretratamientos aplicados sobre los espectros para la obtención de modelos predictivos de humedad sobre algodón bruto................................................................169 Figura III-4. Espectros medios característicos de los niveles de impurezas en algodón bruto (<3%, >3%) obtenidos a partir del equipo NIRSytems 6500 (A) e InfraXact Lab (B).................170 Figura III-5. Valores individuales del estadístico RMS en algodón bruto........................................172 Figura III-6. Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2 y CP3) con pretratamiento de primera derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT sobre la información espectral de NIRSystems 6500 (A) e InfraXact Lab (B) para muestras de algodón bruto procedentes de ocho industrias desmotadoras (I1-I8) ........................................................................173 Figura III-7. Distribución del contenido en impurezas del colectivo de calibración (<3%, n = 46; >3%, n = 34)..............................................................................................................................178 Figura IV-1. Naranja dulce................................................................................................................183 Figura IV-2. Estructura de una célula de zumo de naranja de una vesícula del endocarpio (adaptación de D.A. Kimball) [213]..................................................................................184 Figura IV-3. Almacenamiento de muestras de zumo de naranja en -80ºC.......................................204 Figura IV-4. Unidad de filtración empleada para los zumos de naranja ..........................................207 Figura IV-5. Refractómetro de Abbe empleado para la determinación de sólidos solubles en zumo de naranja........................................................................................................................208 Figura IV-6. pH-metro de laboratorio empleado para la determinación de pH en zumo de naranja209 Figura IV-7. Módulo DCA abierto para disposición de muestra ......................................................211 Figura IV-8. Etapa de lavado de placa soporte en el análisis de zumos con el módulo DCA (observar cápsulas empleadas y módulo DCA acoplado a espectrofotómetro)............212 Figura IV-9. Valores individuales del estadístico RMS en zumo de naranja intacto .......................217 Figura IV-10. Valores individuales del estadístico RMS en zumo de naranja filtrado.....................219 24 Figura IV-11. Espectros medios de zumos comerciales (procedentes de concentrado y de naranja exprimida), y de los recién exprimidos sin envasar (espectros brutos y con pretratamiento de 2ª derivada + SNV-DT) .......................................................................220 Figura IV-12. Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2 y CP3) con pretratamiento de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT sobre la información espectral obtenida a partir de zumo de naranja intacto y filtrado..................................225 Figura IV-13. Distribución presentada del colectivo experimental en zumo filtrado para los constituyentes pH, acidez, sólidos solubles y limonina ................................................231 Figura IV-14. Evolución de la producción de naranja de Andalucía frente al resto de España......242 Figura IV-15. Recepción de naranjas en el IFAPA Centro de Palma del Río (Córdoba) para realización de tratamiento con tiabendazol....................................................................243 Figura IV-16. Grupo de naranjas lavadas (L) en el inicio de la etapa de lavado..............................244 Figura IV-17. Abrillantador para cítricos empleado.........................................................................245 Figura IV-18. Inmersión de naranjas en emulsión de aceite-agua a base de cera de polietileno y goma laca........................................................................................................................245 Figura IV-19. Detalle de etiqueta de tiabendazol empleado para el tratamiento de naranjas .........246 Figura IV-20. Aplicación de lavado y tratamiento de tiabendazol ...................................................246 Figura IV-21. Etapa de secado .........................................................................................................247 Figura IV-22. Descripción esquemática del proceso para la elaboración de los grupos de naranja L, LTBZ, LC, LCTBZ ............................................................................................................247 Figura IV-23. Naranjas eliminadas del colectivo experimental por presentar defectos..................248 Figura IV-24. Ventana de análisis (2,5 cm) para la adquisición de información espectral sobre naranja intacta.................................................................................................................249 Figura IV-25. Puntos de lectura de información espectral efectuados sobre cada naranja ...........250 Figura IV-26. Obtención de información espectral sobre zona del ecuador (A) y base (B) en naranja intacta..............................................................................................................................250 Figura IV-27. Pretratamientos aplicados sobre los espectros para la obtención de modelos discriminantes para la detección de tiabendazol en naranja intacta.............................252 Figura IV-28. Pretratamientos aplicados sobre los espectros para la obtención de modelos predictivos de tiabendazol en naranja intacta...............................................................253 Figura IV-29. Representación en el Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2, CP3) del colectivo experimental empleado para la obtención de modelos predictivos de tiabendazol sobre naranja intacta...................................................................................256 Figura IV-30. Representación gráfica del modelo discriminante seleccionado para detección de tiabendazol en naranja intacta........................................................................................259 Figura IV-31. Distribución de tiabendazol del colectivo experimental empleado el desarrollo de modelos predictivos a partir de espectros obtenidos de la región de la base, ecuador o suma de ambos en naranja intacta.................................................................................261 Abreviaturas 27 ACF: Apparent Critical Factors ACP: Análisis de Componentes Principales ADF: Análisis Discriminante Factorial ADL: Análisis Discriminante Lineal AD-MCP: Análisis Discriminante por Mínimos Cuadrados Parciales ANN: Artificial Neural Network ANOVA: Análisis de Varianza AOFT: Acousto-Optic Tunable Filter CHI: Forma de presentación de muestras Curado, Homogeneizado y analizado en el modo de visión Inferior CHS: Forma de presentación de muestras Curado, Homogeneizado y analizado en el modo de visión Superior CIE: Commision Internationale de l´Eclairage CITAGRO: Centro de Innovación y Tecnología Agroalimentaria, S.A. CL-EM: Cromatografía líquido-masas CLI: Forma de presentación de muestras Curado, Loncheado y analizado en el modo de visión Inferior CLS: Forma de presentación de muestras Curado, Loncheado y analizado en el modo de visión Superior cm: Centímetro CP: Componente Principal CR: Grupo ‘Control Robusto’ DC: Grupo ‘Difícil Control’ DCA: Direct Contanct of Food Analyzer DESIR: Dry Extract Spectroscopy by Infrared Reflectance DF: Diseño Factorial DT: Desviación Estándar E: Error de Clasificación EFSA: European Food Safety Authority ETC: Error Típico de Calibración ETL: Error Típico de Laboratorio ETP: Error Típico de Predicción ETVC: Error Típico de Validación Cruzada F: Test de la significación de la diferencia FC: Grupo ‘Fácil Control’ FCWB: Fuerza de Corte Warner Bratzler FDA: Food and Drug Administration FHI: Forma de presentación de muestras Fresco, Homogeneizado y analizado en el modo de visión Inferior FHS: Forma de presentación de muestras Fresco, Homogeneizado y analizado en el modo de visión Superior 28 FPI: Forma de presentación de muestras Fresco, Picado y analizado en el modo de visión Inferior FPS: Forma de presentación de muestras Fresco, Picado y analizado en el modo de visión Superior FT: Transformada de Fourier g: Gramo GL: Grosor del Loncheado GNP: Good Nutrition Practice H: Distancia de Mahalanobis h: Hora HPLC: High-performance liquid chromatography HPLC: High-Performance Liquid Chromatography HR: Humedad Relativa IFAPA: Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica InAs: Arseniuro de Indio InGaAs: Arseniuro de Galio e Indio INIA: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria InSb: Antimoniuro de Indio kg: Kilogramo KNN: K-Nearest Neighbour l: Litro LC: Grupo naranjas Lavadas con aplicación de Cera LCFT: Light Cristal Aunable Filter LCTBZ: Grupo naranjas Lavadas con aplicación de Cera y fungicida Tiabendazol LED: Light Emitting Diodes LMR: Límite Máximo de Residuos LTBZ: Grupo naranjas Lavadas con aplicación de fungicida Tiabandazol m: Metro MCT: Telururo de Cadmio y Mercurio mg: Miligramo min: Minuto MIR: Región del infrarrojo medio del espectro electromagnético ml: Mililitro mm: Milímetro MSC: Multiplicative Scatter Correction N: Newton NCL: Número de Capas de Lonchas NIR: Near Infrared Reflectance. Reflectancia en el Infrarrojo Cercano NIRS: Near Infrared Reflectance Spectroscopy. Espectroscopía de Reflectacia en el Infrarrojo Cercano 29 nm: Nanometros NSE: Número de Subescaneos en la adquisición de un Espectro OSC: Orthogonal Signal Correction OVAT: One Variable At Time PbS: Sulfuro de Plomo PbSe: Seleniuro de Plomo PbTe: Telururo de Plomo PLS: Térmimos o Factores Partial Least Square ppm: Partes Por Millón PROFIT: Programa de Fomento de la Investigación Técnica R.D.: Real Decreto R: Coeficiente de Correlación R: Reflectancia R2: Coeficiente de Determinación en Calibración r2: Coeficiente de Determinación en Validación Cruzada R2VE: Coeficiente de Determinación en Validación Externa RC: Regresión Contraída; Regresión Continua RCP: Regresión de Componentes Principales RFID: Identificación por Radio Frecuencias RLP: Regresión Local Ponderada RMCP : Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales RMCPM : Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales Modificada RMS: Root Mean Squared (Raíz cuadrada del cuadrado medio del error) RNA: Redes Neuronales Artificiales RPD: Residual Predictive Deviation RRL: Regresión de Raíces Latentes RSM: Response Surface Methodology s: Segundo SIMCA: Soft Independent Modelling of Class Analogies SNV: Standard Normal Variate SNV-DT: Standard Normal Variate – Detrending STD: Standard Deviation SVM: Support Vector Machines TBZ: Fungicida Tiabendazol TP: Tipo de Producto TPD: Tiempo Previo de Descongelación TPF: Tipo de Plástico Film UE: Unión Europea VE: Varianza Explicada VIS: Región visible del espectro electromagnético 30 VIS+NIR: Región visible e infrarroja cercano del espectro electromagnético VPM: Vueltas de Plástico alrededor de la Muestra W: Watio g: Microgramo CAPÍTULO I GENERALIDADES Generalidades 33 1.1 Introducción 1.1.1 Control y Aseguramiento de la Calidad en la Industria Agroalimentaria El sector agroalimentario es uno de los principales motores económicos en Europa [1], estando compuesto por la industria suministradora (destacando la industria química, que aporta recursos para la producción agrícola), la agricultura, industria transformadora, distribución, y minoristas, eslabón final con los consumidores, últimos agentes de la cadena agroalimentaria. Teniendo en cuenta tan solo la industria de procesado de alimentos, en la Unión Europea representa el mayor sector industrial desde un punto de vista económico [2]. Para su correcto desarrollo, actualmente se debe prestar atención a conceptos como calidad, seguridad alimentaria, sostenibilidad o transparencia. El concepto de Control de Calidad en la Industria Agroalimentaria lleva asociado múltiples definiciones que van evolucionando y modificándose a lo largo del tiempo, dependiendo de factores culturales, sociales y geográficos, entre otros. Por lo tanto, la calidad es un concepto dinámico, difícil de definir de forma precisa, aunque genéricamente se puede afirmar que es el grado de excelencia de un alimento, incluyendo todas sus características significativas que lo hacen aceptable. La calidad en los alimentos se debe controlar de forma regular para asegurar la homogeneidad en la producción y el cumplimiento de los estándares de control requeridos. Dentro de los aspectos más comunes que la definen, se encuentra la apariencia (tamaño, forma, color, estructura…), textura (elasticidad, viscosidad, plasticidad), sabor, aroma, etc., empleando para su evaluación tanto pruebas de medida objetivas (técnicas físicas y químicas) como subjetivas (órganos sensoriales humanos), mediante las cuales deberían correlacionarse o complementarse entre sí [3]. El concepto de seguridad alimentaria es bastante amplio, el cual está relacionado con la certeza de que un alimento no causará daño al consumidor cuando es preparado y/o consumido, según el uso al que vaya a ser destinado [4]. En Estados Unidos, la Food and Drug Administration (FDA), sitúa las enfermedades de origen alimentario como la principal preocupación de acuerdo con el riesgo que suponen para la seguridad alimentaria, siendo el alimento contaminado más que el alimento deteriorado, el causante de la enfermedad [3]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 34 En numerosas ocasiones, la calidad y seguridad alimentaria de los alimentos no se puede garantizar completamente con un análisis sobre el producto final, ya que necesitan un estricto control a lo largo de todo el proceso productivo, surgiendo el concepto de sistema de trazabilidad, mediante el cual permite detectar un producto o proceso desde su origen a lo largo de todo su desarrollo [5]. Así, la gestión de la calidad alimentaria está incrementándose a lo largo de toda la cadena productiva, desde piensos, semillas y materias primas, hasta el consumidor final. En este sentido, la calidad alimentaria es un reto que ha ido aumentando con el paso del tiempo en la industria, debido principalmente a cambios en hábitos de consumo, desarrollo tecnológico y condiciones ambientales cambiantes. Sin embargo, su gestión es complicada debido por un lado al carácter perecedero de los productos agroindustriales y por otro, al comportamiento dinámico e impredecible de personas implicadas en las cadenas productivas [6]. 1.1.2 Tendencias Actuales en el Consumo de Alimentos Uno de los principales agentes que ha participado en los cambios y progreso de la Industria Alimentaria, ha sido la propia evolución con respecto al consumo de alimentos que ha experimentado el consumidor. Éste, hoy en día tiene en cuenta aspectos relacionados con la seguridad y calidad alimentaria, así como preocupaciones éticas relacionadas con el bienestar animal [7]. En las últimas décadas, la demanda en cuanto a producción de alimentos ha cambiado considerablemente. Cada vez más el consumidor cree que los alimentos influyen directamente sobre su salud. Actualmente, en los países desarrollados la producción de alimentos no se diseña únicamente para satisfacer el hambre y las necesidades nutritivas, sino también para prevenir enfermedades y mejorar el estado de bienestar físico y psíquico del consumidor [8]. Así, en la década de 1990’s se fue implantando una actitud por parte de los consumidores en torno a una alimentación sana, surgiendo el concepto de alimentos con características “especiales” como por ejemplo los alimentos funcionales y/o nutraceúticos (término originariamente introducido en Japón para definir alimentos con una función o actividad fisiológica, empleado para productos que contienen componentes biológicamente activos) [5]. Por otro lado, la necesidad de tiempo imperante en la sociedad desarrollada actual ha estado implicada también en cambios en cuanto a pautas de comportamiento respecto al consumo de alimentos, que, en consecuencia, se traduce en una disminución de comida preparada en hogares, un incremento en el consumo de comida rápida y en alimentos preparados Generalidades 35 para comer (alimentos de cuarta, quinta y sexta gama). Esto provoca la aparición e identificación continua de nuevos riesgos que afectan a la salud humana [4]. La confianza de los consumidores en la seguridad y calidad alimentaria puede haber descendido en las décadas recientes como reacción a diversas crisis alimentarias e inapropiadas prácticas de gestión de riesgos [7]. Los productores e instituciones (p. ej. la Comisión Europea y la European Food Safety Authority, EFSA) han intentado recuperar la confianza del consumidor introduciendo sistemas de trazabilidad en ingredientes y alimentos. En la última década, un número de riesgos químicos han conducido a acontecimientos negativos relacionados con la seguridad alimentaria en la Unión Europea y en otras regiones del planeta. Algunos ejemplos de estos incidentes fueron: dioxinas en aceite vegetal mezclados con aceite industrial y empleados en piensos para ganadería avícola, antibióticos no autorizados tales como cloranfenicol y nitrofuranos empleados en acuicultura, acrilamida, compuesto considerado cancerígeno, detectado en productos que fueron sometidos a tratamiento térmico como patatas fritas o cereales, tintes industriales en especias y aceites, etc. [9]. En un trabajo realizado en 2003 [10], estimaron que 130x106 de europeos, 76 x106 americanos y 4,7x106 australianos habían sido afectados por enfermedades de origen alimentario. En respuesta a solucionar las barreras existentes en cuanto a la implementación y mantenimiento de sistemas de control de calidad y seguridad alimentaria, de forma que se integren todos los elementos que participan en la cadena, surge el concepto de Buenas Prácticas de Nutrición (Good Nutrition Practice, GNP), el cual implica a la agricultura, el sistema de producción en industria, almacenamiento y distribución, elaboración de alimentos y catering, y por último se tiene en cuenta el consumidor final [4]. En otro estudio el cual se llevó a cabo sobre ciudadanos europeos, se ha demostró que los atributos que más preocupan a la población con respecto a la calidad y seguridad de los alimentos, son el consumo antes de la fecha de caducidad, el origen geográfico, la autenticidad del producto, la etiqueta de seguridad, el método de elaboración, la etiqueta de certificación, la etiqueta que certifica el origen de la Unión Europea y el conocimiento previo del producto [7]. Por lo tanto, el origen del producto es un factor que tiene en cuenta el consumidor cuando se le pregunta a cerca de la definición de trazabilidad, asociando además este concepto con Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 36 incremento del precio [11]. 1.1.3 Demanda Tecnológica en la Industria Agroalimentaria en un Contexto Analítico Considerando la situación actual en la cadena alimentaria, se están produciendo cambios en un contexto tecnológico y organizativo, situando altas cotas de demanda y exigencias en cuanto al control y aseguramiento de la calidad. Algunos ejemplos de cambios tecnológicos son la tendencia hacia una menor intensificación en el procesado de alimentos, mayores niveles de preparación (comidas preparadas), incorporación de compuestos activos que producen mejoras en la salud y la sustitución continua de productos e ingredientes [6]. Por ejemplo, la aplicación de técnicas de conservación cada vez menos agresivas conduce a productos más vulnerables, a la posible aparición de patógenos microbianos, los cuales incrementan la necesidad de control y aseguramiento en las etapas de procesado, empaquetado, y condiciones de conservación y almacenamiento. La adición de ingredientes activos requiere la comprobación y chequeo de la funcionalidad de los mismos a lo largo de toda la cadena alimentaria hasta su consumo [12]. Asimismo, se observan cambios logísticos en la cadena de suministro que influyen en la gestión de la calidad, experimentando mayor flexibilidad en cuanto a la recepción de productos, mayor frecuencia de entregas, nuevos requerimientos específicos en aspectos de rastreo y trazado del alimento a lo largo de toda la cadena, o aumento del número de salidas de producto terminado. Por otro lado, se da un incremento de la preocupación pública y gobiernos acerca de la seguridad alimentaria y la producción de alimentos sanos y seguros, que provocan de nuevo un aumento de demanda en el control de calidad [6]. Como se ha ido describiendo, ante la situación actual y futura en la que se encuentra y se prevé que se encontrará la agroindustria, desde una perspectiva de producción y aseguramiento de calidad en todos los aspectos relacionados con alimentos y salud, es importante cuestionar si existe potencial analítico que permita satisfacer la demanda creada de forma sistemática en los diferentes sectores productivos, desde que la materia prima se encuentra en el campo cosechada hasta que llega al consumidor, tanto desde un punto de vista normativo (métodos de análisis y controles oficiales), como específico (política de calidad empresarial para incorporar valor añadido al producto). Generalidades 37 Actualmente, existen técnicas analíticas basadas en determinación de constituyentes orgánicos, contenido o composición mineral, isótopos de elementos, o combinaciones de las mismas, que, junto con el análisis quimiométrico de los datos aportados, disponen de la capacidad para determinar más de un componente en el mismo tiempo. Si estos componentes tienen el suficiente poder discriminatorio, el conjunto de las concentraciones pueden constituir una pauta característica o huella digital que incluso puede relacionarse con la certificación geográfica del producto [13]. A continuación, a modo de resumen, la tabla I-1 expone las técnicas analíticas más comúnmente empleadas hoy en día para certificación de origen del producto y control de calidad [13], agrupadas en espectrometría de masas, espectroscopia, técnicas de separación y otras. Tabla I-1. Resumen de técnicas analíticas empleadas para certificación de origen y control de calidad en alimentos Fundamento Técnica Analítica Espectrometría de Masas de Relaciones Isotópicas (IRMS) Espectrometría de Masas con Fuente de Plasma Acoplado (ICP-MS) Espectrometría de Masas de Reacción por Transferencia de Protones (PTR-MS) Espectrometría de Masas Espectrometría de Masas Acoplada a Cromatografía de Gases (GC-MS) Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (NMR) Espectroscopia de Infrarrojo (IR) Espectroscopia de Fluorescencia Espectroscopia Espectroscopia Atómica Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) Cromatografía de Gases (GC) Separación Electroforesis Capilar (CE) Tecnología de Sensores Tecnología Genética (DNA) Otras Análisis Sensorial Por otro lado, se pueden definir unos principios tecnológicos que se deben integrar parar cubrir las necesidades actuales de rastreo y trazado de alimentos en la industria agroalimentaria [2]: Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 38  Métodos analíticos que permitan, mediante el análisis de producto, identificar el origen y sus componentes.  Etiquetas electrónicas del producto, como por ejemplo (RFID, Identificación por Radio Frecuencia), que permite identificar el origen, y, combinado con tecnologías de sensores, permite la supervisión del proceso, condiciones ambientales y situación en la cadena de agroalimentaria.  Redes de sistema de información que implican bases de datos y esquemas de intercambio de información. De las técnicas descritas en la tabla I-1, una forma específica de la espectroscopia de infrarrojo es la denominada tecnología NIRS (Near InfraRed Spectroscopy), Espectroscopia de Infrarrojo Cercano, la cual destaca como herramienta que satisface gran parte de la problemática planteada en la Industria Agroalimentaria, desde autentificación y certificación de producto, hasta determinación de numerosos constituyentes químicos, físicos o sensoriales. Actualmente está en constante evolución, encontrando cada día nuevas aplicaciones para su implantación en la industria. La piedra angular de la presente Tesis Doctoral versa sobre el estudio de la Tecnología NIRS en diferentes productos agroalimentarios, planteando la resolución de diversos problemas relacionados con su control de calidad. Para ello, previamente se realiza a modo de resumen, una introducción con los fundamentos teóricos básicos que rigen dicha tecnología, para posteriormente describir los trabajos desarrollados. 1.2 Tecnología NIRS 1.2.1 Definición y Evolución Histórica La tecnología NIRS es una técnica espectroscópica (Spectrum, apariencia, imagen; Skopia, ver) que trabaja en la zona del espectro electromagnético del infrarrojo cercano (780 – 2.500 nm, 25000 – 4000 cm-1), obteniendo información de absorciones moleculares relacionadas fundamentalmente con los enlaces C-H, N-H y O-H. En 1800, el astrónomo y músico británico William Herschel descubrió la radiación NIR (Near Infrared) haciendo pasar luz solar a través de un prisma. Colocó termómetros para medir la Generalidades 39 temperatura de los diferentes colores que componen la luz polarizada, y en una zona ligeramente posterior al rojo, observando un incremento de temperatura en esta zona. Quería saber si algún color estaba asociado con el calor de la luz del sol, encontrando que la temperatura máxima estaba más allá del rojo, al final del espectro [14]. Figura I-1. William Herschel, descubridor de la radiación infrarroja en 1800 (http://www.ipac.caltech.edu/Outreach/Edu/herschel.gif) Posiblemente, la primera determinación cuantitativa NIR fue sobre humedad atmosférica en 1912 por E. Fowle [15]. Pero no fue hasta mediados del siglo XX, cuando Wilbur Kaye publicó dos trabajos en los que la espectroscopia NIRS adquiría relevancia, aunque todavía la región del infrarrojo cercano no se apreciaba como una fuente importante de información estructural. La aceptación de la tecnología como método analítico por parte de la comunidad científica comenzó en la década de 1960’s con el trabajo de Karl Norris en el Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de Estados Unidos [16]. Desde 1970 ha evolucionado rápidamente, teniendo en la actualidad amplia aceptación en sectores como la agroindustria, petroquímica, medio ambiente, farmacia, medicina, etc. La espectroscopia NIR se basa en información obtenida a partir de absorciones moleculares, como consecuencia de modificaciones de estados vibracionales energéticos cuando las moléculas interaccionan con la radiación. Las modificaciones energéticas se generan fundamentalmente por dos procesos: sobretonos y bandas de combinación. Aunque también se pueden observar absorciones electrónicas debidas al movimiento de electrones entre diferentes Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 40 niveles energéticos. Los sobretonos, interpretados como harmónicos, son múltiplos aproximados de vibraciones fundamentales. Las bandas localizadas entre 700 – 1900 nm se corresponden con primeros, segundos y terceros sobretonos de absorciones fundamentales [17]. La mayoría de picos de sobretonos observados en un espectro NIR provienen de movimientos de alargamiento (stretching) de enlaces X-H (O-H, C-H, S-H y N-H). Se encuentran entre 10 y 1000 veces más débiles que las bandas fundamentales [18]. Otra característica del espectro NIR es la tendencia para combinar dos o más frecuencias fundamentales, a través de adición o substracción de energía, para dar una banda simple [18]. Las bandas situadas entre 1900 – 2500 nm son combinaciones de uno o más sobre tonos [17]. Por lo tanto, en un espectro NIR es posible reconocer características que estén relacionadas con la composición de la muestra analizada; aunque en productos agroalimentarios, compuestos por matrices biológicas complejas, se convierte en una difícil tarea. En bibliografía se encuentran numerosas tablas y gráficas en las que se exponen bandas de absorción a determinadas longitudes de onda, relacionadas con compuestos químicos, como la que se muestra en la figura I-2. Figura I-2. Bandas de absorción en el infrarrojo cercano (fuente: http://www.molecularbiometrics.com/instrumentation.html) Generalidades 41 1.2.2 Instrumentación En el desarrollo de una aplicación NIRS, uno de los aspectos claves es la elección adecuada del equipo. En el mercado se encuentra gran variedad de instrumentos NIRS, en función de características específicas. 1.2.2.1 Interacción radiación-muestra En primer lugar, como paso previo a la diferenciación de equipos, es necesario entender los diferentes tipos de interacción entre la radiación NIRS y la muestra. La figura I-3 ilustra a modo de ejemplo tales interacciones. Radiación A F E D C B Figura I-3. Tipos de interacción de la radiación NIRS con una muestra Los distintos comportamientos que se pueden encontrar son:  A (Reflectancia especular): Se produce un cambio brusco en la dirección de la radiación. Escasa interacción radiación-muestra. Se obtiene poca información.  B (Efecto “Scatter”): Dispersión de la radiación a causa de la interacción radiación-muestra  C (Absorción): La radiación es absorbida por la muestra.  D (Transmitancia): La radiación atraviesa la muestra, absorbiendo energía en función de los tipos de enlaces presentes en la misma.  E (Refracción): Radiación refractada provocada por la variación de los índices de refracción de partículas de diferente composición.  F (Reflectancia difusa): Suma de propiedades de Absorción y de Radiación dispersa. Determina el espectro de Reflectancia difusa de una muestra, proporcionando información de propiedades físicas, químicas, sensoriales, etc, de la misma. 1.2.2.2 Componentes básicos de un instrumento NIRS Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 42 Básicamente, un instrumento NIRS mide la energía que interacciona con la muestra antes de llegar a los detectores [19]. Las partes básicas que lo conforman son [20]:  Fuente de radiación: Se pueden clasificar en térmicas y no térmicas. Las primeras emiten radiación térmica a partir de un filamento incandescente. En este grupo destacan las lámparas de filamento de tungsteno y lámparas halógenas de cuarzo, con mucho, la fuente de radiación NIR más popular [21]. Las fuentes de radiación no térmicas se caracterizan por emitir en un rango estrecho, dependiendo del material semiconductor empleado. En este grupo se encuentran los diodos emisores de luz (LEDs, Light Emitting Diodes), siendo el segundo grupo más popular de fuente de energía NIR [21]. La potencia de la fuente de radiación es un factor a tener en cuenta en la elección de un equipo NIRS, ya que influye en la profundidad de penetración en la muestra.  Dispositivo para la selección de longitudes de onda. El desarrollo de la tecnología en torno a estos dispositivos ha sido el principal responsable de la diversificación actual de instrumentación NIRS. La clasificación de estos dispositivos se establece en función de si se obtienen espectros completos o con longitudes de ondas discretas. Resumidamente, los dispositivos que obtienen espectros de longitudes de onda discretas se dividen en [21-23]: Diodos emisores de luz (LEDs). La longitud de onda es directa de la fuente. Permiten obtener espectrómetros muy compactos, sin partes móviles, portátiles y de bajo coste para aplicaciones específicas que requieren pocas longitudes de onda. Estos equipos comenzaron a comercializarse a finales de la década de 1970’s. Diodos láser. Producción de longitudes de onda a partir de diodos láser. Se obtienen limitadas longitudes de onda. En relación con la tecnología NIRS, se encuentran todavía en fase de investigación. Filtros. Los primeros dispositivos empleados para la selección de longitudes de onda, comercializándose a principios de la década de 1970’s. Básicamente consisten en una rueda o volante giratorio, en donde se encuentran los filtros selectivos de determinadas longitudes de onda. Los dispositivos que se citan a continuación son los que permiten producir espectros completos [21-23]: Generalidades 43 Redes de difracción (grating monochromators). Producen una dispersión linear de las longitudes de onda en el espacio. Una parte de no linearidad restante se elimina con una aplicación informática. Aportan suficiente resolución para la mayoría de aplicaciones. Se comienzan a implantar desde finales de 1970’s. Matrices de diodos (Diode-array). Junto con una red de difracción fija, se obtiene un espectrofotómetro compacto con resolución limitada por el número de receptores de la matriz. Aparecen a finales de 1980’s. Transformada de Fourier (FT-NIR). No hay dispersión de la radiación. Los más usados se basan en el interferómetro de Michelson. Modula la energía a una frecuencia proporcional a la de la luz produciendo un interferograma que es convertido a un espectro por el algoritmo ‘Transformada de Fourier’ (FT). Comienzan a aparecer a principios de 1990’s. Filtros ajustables acusto-ópticamente (AOFT, Acousto-Optic Tunable Filter). Interacción de la energía radiante con una onda acústica en un cristal de TeO2. La longitud de onda transmitida se ajusta electrónicamente. Su aparición fue ligeramente posterior a los equipos FT-NIR. Filtros ajustables de cristal líquido (LCFT, Light Cristal Aunable Filter). En su configuración óptica se suelen emplear placas de cristal de cuarzo líquido entre hojas polarizadoras. Ofrecen mayor calidad que un AOFT pero la longitud de onda máxima en equipos comerciales se encuentra en torno a 1800nm. Además el tiempo de conmutación es inferior a los AOFT. Aparecen a mediados de 1990’s.  Sistema de presentación de muestras. En un instrumento NIR se suele medir la absorbancia relativa mejor que la absorbancia absoluta mediante el uso de un material de referencia. Así, se mide en primer lugar la intensidad de radiación reflejada por la cerámica de referencia, para posteriormente incidir la misma radiación sobre la muestra en cuestión [24]. Una de las principales fuentes de error de la señal espectroscópica NIR está relacionada con la muestra (homogeneidad, comportamiento frente a humedad y temperatura, tamaño de partículas, etc.). Por lo tanto se debe optimizar la forma de presentación de muestras. Las características propias de la muestra deciden el sistema de presentación al equipo, por lo tanto es de vital importancia el estado físico en el que se presenta (líquido, sólido, pastoso, etc.), grado de homogeneidad, definición de la unidad de muestreo, entre otros. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 44 Por otro lado, las características de la muestra también van a ser función de la profundidad de penetración de la radiación, por lo que se debe tener en cuenta para la selección de la fuente de energía radiante NIR. También es necesario recordar que la espectroscopia NIR es muy sensible a cambios en la matriz del producto agroalimentario sobre el que se va a desarrollar una determinada aplicación [25]. En productos agroalimentarios, los sistemas de presentación de muestras más empleados son los que a continuación se describen [20, 24]: Transmisión o transmitancia (figura I-4): La radiación atraviesa por completo la muestra, detectando la luz transmitida por la cara opuesta de donde incidió. Este tipo de análisis permite analizar productos líquidos y sólidos (molido e intacto). En el análisis por transmitancia de productos líquidos se dice que se efectúa una transmisión verdadera, mientras que para productos sólidos, transmisión difusa. La determinación del paso óptico adecuado para este tipo de análisis es un factor clave, dependiendo de la longitud de onda con la que se trabaje (a menores longitudes de onda, mayor paso óptico) y el tipo de producto (por ejemplo, para trigo 2 cm y para colza 0,5 cm). Muestra Radiación Incidente Radiación Transmitida Figura I-4. Esquema de modo de análisis por transmisión o transmitancia Reflexión o reflectancia (figura I-5): La radiación incidente incide sobre la superficie de la muestra, detectando la radiación difusa reflejada de la superficie o de una porción cercana de la misma. Este análisis se emplea para productos sólidos y pastosos. La muestra debe ser opaca, aconsejando una profundidad superior a 1 cm. Generalidades 45 Muestra Radiación Incidente Radiación Reflejada Radiación Reflejada Figura I-5. Esquema de modo de análisis por reflexión o reflectancia Doble transmisión o transflectancia (figura I-6). Desarrollado por Technicon para el instrumento InfraAlyzer, combina los modos de transmisión y reflexión. La radiación incidente atraviesa por completo la muestra, donde interacciona con una superficie reflectante, que permite atravesar de nuevo la muestra antes de ser detectada. Modo de análisis especialmente indicado para productos líquidos y pastosos. Este sistema permite analizar muestra líquidas en equipos diseñados para trabajar en reflectancia. Muestra Radiación Incidente Radiación Reflejada Radiación Reflejada Superficie Reflectante Figura I-6. Esquema de modo de análisis por doble transmisión o transflectancia Interacción (figura I-7). Una sonda posee un anillo externo concéntrico por donde generalmente se conduce la radiación previa interacción con la muestra, y un sector circular interno empleado para conducir la radiación recibida. El final de la sonda debe estar en contacto con la superficie de la muestra. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 46 Muestra Fibra Óptica Radiación Incidente Radiación Reflejada Figura I-7. Esquema de modo de análisis por interacción En la actualidad, mediante el empleo de sondas de fibra óptica, permite obtener información espectral NIRS en transmisión, transflexión, reflección e interacción, controlando la calidad del producto directamente en el proceso productivo. Dependiendo de la posición del instrumento con respecto a la línea de procesado, se pueden distinguir las siguientes situaciones: Off line (el equipo se sitúa fuera de la línea), At line (el equipo se sitúa junto a la línea), On line (el equipo se sitúa sobre la línea) y In line (el equipo se sitúa fuera dentro de la línea).  Detectores. Se encargan de transformar la energía radiante en energía eléctrica. Básicamente se encuentran de dos tipos: detectores de emisión (tubos fotomultiplicadores) y detectores de estado sólido (fotodiodos, piroeléctricos y detectores infrarrojos). La tabla I- 2 muestra los detectores más comunes que se encuentran incorporados en equipos NIRS [26]. Tabla I-2. Detectores comúnmente empleados en equipos NIR (adaptado de Workman, 2004 [26]) Detector Rango espectral de detección (nm) Silicio 300 – 1100 PbS (Sulfuro de Plomo) 1100 – 3000 InAs (Arseniuro de Indio) 1700 – 5700 InGaAs (Arseniuro de Galio e Indio) 900 – 1700 PbSe (Seleniuro de Plomo) 1700 – 5500 InSb (Antimoniuro de Indio) 1800 – 6800 PbTe (Telururo de Plomo) 1500 – 4500 MCT (Telururo de Cadmio y Mercurio) 1000 – 17000 Generalidades 47 Además de los elementos descritos, habría que añadir los procesadores de la señal eléctrica que aportan los valores de absorbancia. 1.2.2.3 Criterios para la selección de un instrumento NIRS Dependiendo de las aplicaciones que se deseen desarrollar, se deben adoptar unos criterios para la elección del equipo NIRS adecuado. Sobredimensionar el mismo supone asumir un coste innecesario, por lo que un estudio importante inicial previo a la implantación de la nueva aplicación se hace prácticamente imprescindible. En primer lugar, se deberían tener en cuenta dos aspectos, uno fundamentado en las especificaciones fotométricas, y otro en el rango espectral (selección de la longitud de onda de trabajo) [27]. Las especificaciones fotométricas están relacionadas con la obtención de una señal que satisfaga las necesidades de magnitud y reproducibilidad en cada longitud de onda. Esta característica permite optimizar la calidad, tanto en el modo de análisis, como en la exactitud y precisión de los resultados analíticos. Con el rango espectral está directamente asociado el tipo de detector (tabla I-2), que permite trabajar en el rango deseado, condicionando al mismo tiempo la sensibilidad a la radicación (capacidad para detectar pequeños cambios en una señal analítica que está limitada por algún tipo de ruido) y un porcentaje del coste del equipo. Las exigencias actuales en la adquisición de equipos NIRS van encaminadas hacia [28]:  Sensibilidad y rango dinámico (ratio entre la máxima señal admisible y la mínima detectable) acordes con la aplicación a desarrollar.  Reproducibilidad espectral entre instrumentos.  Resolución espectral optimizada para la exactitud y precisión requerida en la aplicación a desarrollar.  Velocidad de medida adecuada.  Estabilidad y robustez ante condiciones ambientales adversas requeridas por la aplicación.  Portabilidad y coste reducido. 1.2.3 Quimiometría Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 48 Se define quimiometría como la disciplina química que emplea métodos estadísticos y matemáticos para diseñar o seleccionar de forma óptima procedimientos de medida y experimentos, y para aportar la máxima información química a partir de los datos analizados [29]; si bien esta y otras definiciones pueden verse modificadas con el tiempo según la evolución del desarrollo tecnológico. El concepto de quimiometría (Chemometric) fue introducido por diversos grupos de investigación en química analítica y química física orgánica, a finales de 1960’s y durante la década de 1970’s. Se considera que el término se empleó por primera vez por Svante Wold y Bruce R. Kowalski en 1972 [30, 31] para intentar superar las limitaciones impuestas por la estadística univariante en diseño experimental, clasificación y calibración multivariante. Una idea genérica en el uso de la quimiometría es que las matrices de datos incluyen información redundante que puede ser reducida sustancialmente. Por otro lado, no se entiende esta disciplina sin una etapa de visualización de datos mediante el empleo de gráficos y figuras [32]. Por lo tanto, el análisis de datos multivariante (multidimensional o multicanal), como parte principal de la quimiometría, se hace indispensable para el desarrollo de aplicaciones cuantitativas o cualitativas en espectroscopia NIR, la cual en algunas ocasiones maneja matrices de datos en las que cada objeto (muestra) presenta más de 1000 variables (valores de absorbancia). 1.2.3.1 Análisis de Componentes Principales El Análisis de Componentes Principales es definido por Martens [33] como ‘la madre de todos los análisis multivariantes’. Se trata de desarrollar un modelo bilineal en el que las variables originales (valores de absorbancia NIR) se combinan para formar otras, denominadas Componentes Principales (CPs). Las relaciones de las CPs con las muestras (filas de datos) se denominan scores (puntuaciones), y con las variables (columnas de datos), loadings (coeficientes de las variables). Mediante el ACP es posible realizar una exploración de los datos para la detección de anómalos (outliers), agrupamiento de objetos y observación de gradientes entre grupos [32]. Por lo tanto, la idea es aproximar la matriz original de datos a un producto de dos matrices de menor dimensión, definidas por los scores y los loadings, como se muestra en la siguiente expresión: Generalidades 49       ELxTX dxpnxdnxp  donde:  nxpX Matriz de datos originales con n objetos (muestras) y p variables (valores de absorbancia  nxdT Matriz relación n objetos (muestras) y d variables (CPs) (define los scores)  dxpL Matriz relación d CPs con p valores de absorbancia (define los loadings) E Matriz Residual, con la misma dimensión que la matriz de datos originales (nxp) Las nuevas variables obtenidas (CPs) son ortogonales y linealmente independientes. El objetivo es explicar la mayor variabilidad posible de la matriz original (X), con el menor número de CPs. [32]. En el ACP una etapa crucial es seleccionar el número óptimo de CPs. Este número realiza una separación entre las componentes que generan ruido y la información espectroscópica. Para decidir el número de CPs existen diversos criterios estadísticos y heurísticos [29], como porcentaje de varianza explicada (si se posee la suficiente experiencia con los datos que se manejan, se fija un porcentaje de varianza explicada, que es determinado por el número de CPs a seleccionar), criterio de valor propio uno (se seleccionan las componentes principales que en las que su valor propio sea superior a uno; el valor propio medio de datos estandarizados es uno), prueba de sedimentación (scree-set ; la varianza residual se nivela cuando se obtiene el número adecuado de CPs), validación cruzada (se eliminan uno/s objetos, se desarrolla el modelo definido por el ACP, los datos eliminados se predicen, calculando la suma de cuadrados de los residuales, seleccionando el número de CPs que minimiza el error residual). 1.2.3.2 Análisis cuantitativo. Calibración multivariante El desarrollo de modelos de calibración multivariantes es la aplicación más exitosa de la combinación de quimiometría con datos espectrales [32]. El análisis cuantitativo de la espectroscopia NIR se basa en la Ley de Lambert-Beer, la cual afirma que existe una relación lineal entre la concentración de una sustancia y los niveles de absorbancia de dicha sustancia a una longitud de onda dada [34], según la siguiente expresión:   dx donde: Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 50 x absorbancia, como log(1/T) (transmitancia) o log(1/R) (reflectancia)  constante de absortividad molar d paso óptico  concentración de la sustancia Pero el análisis espectroscópico NIR actual está distanciado del procedimiento descrito. Los espectros NIR que se obtienen a primera vista, en ocasiones, no poseen una característica que los distinga, haciendo prácticamente imposible la identificación de bandas para su uso directo en determinaciones cuantitativas. Por lo tanto, el empleo de modelos cuantitativos multivariantes de nuevo se hace indispensable. Se iniciaría a parir de la siguiente relación: )(xfy  donde y es la propiedad que se pretende determinar (química, física o biológica), siendo x el espectro NIR. Por lo tanto, la calibración consiste en desarrollar una relación entre la propiedad que se desea determinar de una muestra y su espectro NIR correspondiente. La expresión típica de una ecuación de calibración multivariante es [35]: EABBY i n i io    )( 1 donde: Y Propiedad a determinar oB Ordenada en el origen iB Coeficientes de la regresión para las longitudes de onda i=1…n iA Valores de absorbancia para las longitudes de onda i=1…n E Error del modelo El paso más importante en el desarrollo de una calibración es la correcta selección de muestras empleadas para su elaboración, que sean representativas de toda la población para el posterior análisis de rutina. Del gran número de estrategias que se emplean para el desarrollo de modelos cuantitativos, la tabla I-3 resume los algoritmos comúnmente empleados. Generalidades 51 Tabla I-3. Estrategias de calibración empleadas en Tecnología NIRS Modelo Observaciones Regresión por Mínimos Cuadrados Ordinaria (RMCO) [29] Sinónimo de Regresión por Mínimos Cuadrados o Mínimos Cuadrados Multivariante Regresión Contraída (RC) (Ridge Regression) [36] Para la determinación de los coeficientes de la regresión se calcula un escalar denominado parámetro Ridge Regresión de Componentes Principales (RCP) [35] Regresión múltiple que emplea CPs en lugar de datos espectrales Regresión de Raíces Latentes (RRL) [37] Las variables latentes son combinaciones lineales de las variables predictivas Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales (RMCP) [29] Las variables latentes MCP consideran los valores de referencia y la variabilidad espectral Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales Modificada (RMCPM) [20] En cada término de la regresión se estandarizan los residuos para cada longitud de onda Regresión Continua (RC) (Continuum Regression) [38] Aúna los métodos de regresión RCP, RMCP y RC Regresión Local Ponderada (RLP) [32] Método a base de memoria. Desarrolla una regresión en torno a un valor determinado en cada caso Regresión mediante Redes Neuronales (RRN) [35] Método no lineal desarrollado en base a las conexiones del cerebro humano Una vez seleccionado el modelo, es preciso someterlo a un proceso de validación con muestras externas, representativas del producto a analizar, como paso previo a la implantación del mismo en el análisis de rutina. 1.2.3.3 Análisis cualitativo Estos modelos también se denominan de clasificación o de reconocimiento de pautas. En bibliografía se pueden apreciar diversos criterios para su caracterización. Por ejemplo, la división en métodos supervisados y no supervisados [29], desarrollándose los primeros a partir de un conocimiento previo en cuanto a asociación entre miembros que constituyen grupos o clases, no existiendo estas características en los no supervisados, por lo que los modelos se diseñan sin una comprensión previa de la distribución o comportamiento en grupos que pueda presentar el colectivo experimental. Otra tipificación del análisis cualitativo se basa en la división en análisis discriminante (desarrollo de algoritmos para determinar si una muestra pertenece a un grupo de muestras Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 52 conocidas), búsqueda espectral (modelos que determinan el grado de similitud entre el espectro de una muestra y los espectros pertenecientes a librerías) e interpretación espectral (se clasifican muestras en base a asignación de bandas características) [39]. Generalmente, el inicio del análisis cualitativo se basa en una inspección visual de los espectros que constituyen el colectivo a estudiar, observando pautas espectrales características junto con picos y bandas de absorción asociados a constituyentes. Pero es importante destacar que este análisis tiene limitaciones, ya que al contrario de otras técnicas espectroscópicas como el infrarrojo medio, donde los espectros están formados por absorciones fundamentales y algunos sobretonos, en los espectros NIR no se encuentra tal nivel de detalle, debido a que están dominados por amplias bandas de absorción donde además, se encuentra un nivel importante de solapamiento [34]. Un grupo de métodos se incluirían en los denominados factoriales, cuyo objetivo radica en realizar una proyección del conjunto de datos originales sobre un espacio de dimensión más reducida. Aquí destaca el Análisis Factorial y el Análisis de Componentes Principales, ya descrito en el apartado 1.2.3.1. Numerosos métodos de agrupamiento se basan en las propiedades geométricas del espacio multivariante, mediante la determinación de distancias, como la Euclídea, de Minkowski o de Mahalanobis [32]. Para trabajar con distancias, en primer lugar es necesario determinar el centroide de cada grupo, definido como la media de los puntos que lo constituyen [39]. La distancia Euclídea apenas se aplica en información obtenida con espectroscopia NIR, ya que presenta el inconveniente de no tener en cuenta los diversos tamaños de los grupos, empleando únicamente el criterio de distancia más pequeña, dando lugar a información errónea. La figura I-8 ejemplifica gráficamente este comentario. Generalidades 53 E1 E2 ¿? D1 D2 D1 > D2 E3 Figura I-8. Asignación errónea mediante aplicación de mínima distancia Euclídea sin considerar el tamaño de los grupos (línea discontínua) Esta situación se evita estableciendo distancias límite en cada grupo (figura I-8, línea discontinua). Así, la distancia de Mahalanobis (H) establece dichos límites en función de las desviaciones estándar de los grupos, calculando además la matriz de varianza-covarianza para escalar los datos, y, de este modo, emplear la misma distancia límite para todos los grupos, independientemente del tamaño de cada uno [34]. A continuación se expone la expresión que permite el cálculo de esta distancia: )()'( 12 ici XXAXXH   donde: X Vector multidimensional que describe la localización del punto x iX Vector multidimensional que describe el centroide del grupo i )'( iXX  Traspuesta del vector )( iXX  1cA Inversa de la matriz de covarianza Existe otra estrategia que emplea distancias para el desarrollo de un análisis discriminante, determinando la proximidad de una muestra no conocida con respecto a las del colectivo de aprendizaje. Esta técnica se conoce como la del ‘Vecino/os más cercano/os’ (K Nearest Neighbor, KNN); la letra K denota el número de vecinos considerados en el cálculo de las distancias [40]. En lugar de obtener clasificaciones en función de distancias, se puede dividir el espacio que representa el colectivo experimental en regiones discretas, representadas por cada una de las Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 54 clases a discriminar [39]. Los límites entre clases se calculan maximizando la variación entre grupos y minimizando la que se encuentra dentro de los grupos [29]. Una vez definidas las fronteras entre clases, una muestra no conocida se clasifica fácilmente observando en qué lugar del espacio multidimensional se sitúa. El método descrito es el Análisis Discriminante Lineal (ADL). Un tipo de Análisis Discriminante, ampliamente difundido en aplicaciones NIRS, empleado para el cálculo de modelos en la presente Tesis Doctoral, es el que desarrolla modelos de regresión mediante Mínimos Cuadrados Parciales (MCP). Este método se diseñó originariamente para aplicaciones cuantitativas, sin embargo, en ocasiones se obtienen resultados satisfactorios cuando se emplea con un enfoque cualitativo. La idea fundamental es asignar números a cada grupo y emplearlos como variables semicontinuas. Estos números constituirán la matriz Y (en lugar de los valores de los parámetros a predecir en un modelo cuantitativo). La matriz Y es centrada y normalizada previo desarrollo de la calibración, definiendo límites para aceptación y rechazo de una determinada muestra a un grupo [34]. Una visión algo distinta aporta el análisis SIMCA (Soft Independent Modelling of Class Analogies), donde cada clase se modela independientemente, previo ACP en cada una de ellas (figura I-9) [34]. E1 E2 E3 Clase 1 CP 12 CP31 CP 21 Clase 2 CP 11 CP 22 Figura I-9. ACPs en el Análisis SIMCA. Modelado individual para cada clase En el resultado de este análisis, los datos obtenidos se corresponden fuertemente con cada grupo definido por sus componentes principales. Por lo tanto, se pueden distinguir muestras entre Generalidades 55 clases que poseen entre ellas niveles de proximidad elevados [41]. Un aspecto interesante de este análisis es que los modelos obtenidos se pueden emplear para detección y eliminación de anómalos, estimar lo que aporta al modelo cada variable y clasificación de nuevas muestras. Una técnica discriminante que es útil para separar grupos que se encuentran irregularmente definidos, es la aplicación de redes neuronales. Como ya se ha comentado, se trata de una estrategia de cálculo no lineal, el cual imita la inteligencia humana [42]. Generalmente para su cálculo es común emplear como paso previo alguna aproximación para reducción de información, ya que reduce el tiempo de entrenamiento y mejora la velocidad y estabilidad del modelo [43]. Finalmente, se cita brevemente una metodología que comenzó a desarrollarse en la década de 1990’s con el objetivo de resolver los problemas que plantean las clasificaciones binarias y el sobreajuste de los modelos, denominada Máquinas de Soporte Vectorial o Máquinas de Vectores de Soporte (Support Vector Machines, SVM) [43, 44]. Consiste en una aplicación matemática que construye un hiperplano en un espacio multidimensional para separar casos que pertenecen a diferentes clases. Se emplean diversas estrategias de decisión para separar dos clases. Se busca un plano (lineal o curvo) que haga máxima la separación entre los planos definidos por las dos clases que se desea separar [44]. 1.2.3.4 Pretratamientos sobre la señal espectroscópica NIR En la espectroscopia NIR actual se analizan matrices muy complejas, que producen frecuentes fuentes de variación espectral [34, 45]:  Interacciones entre compuestos químicos.  Luz dispersa (Scattering) de partículas sólidas o líquidos con materiales en suspensión.  Escasa reproducibilidad en el proceso de medida (variaciones en el paso óptico).  Distorsiones espectrales debidas a instrumentación: variaciones de la línea base, modificaciones en las lecturas a determinadas longitudes de onda, no linealidad de los detectores, ruido instrumental.  Bandas espectrales que provienen de sobretonos y combinaciones que producen solapamientos en el espectro. Por lo tanto, extraer información relevante a partir de espectros NIR de productos Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 56 agroalimentarios es complicado debido a la existencia de numerosas fuentes de error. Todas las fuentes de error se pueden concentrar en tres grupos: las relacionadas con factores instrumentales, ambientales y con la muestra. Por lo tanto, para minimizar los efectos mencionados, se efectúan pretratamientos sobre la señal como paso previo al desarrollo de modelos cuantitativos o cualitativos. Los pretratamientos más comunes que se emplean para el desarrollo de aplicaciones NIRS, se suelen dividir en cuatro categorías: reducción de ruido, corrección de la línea base, mejora de resolución espectral y métodos de centrado y normalización espectral. Todos los tratamientos empleados para reducir ruido se aplican con el objetivo de disminuir el ratio señal/ruido obtenido. Los métodos más comunes para la reducción del ruido son el suavizado y la transformación wavelet (picos pequeños). El suavizado es muy efectivo para el ruido que se muestra con cambios rápidos de amplitud en la señal, siendo efectivo por lo tanto en la eliminación de altas frecuencias. Se modifican los valores puntuales de una señal, de tal forma que los más altos que los inmediatamente adyacentes, supuestamente a causa del ruido, son reducidos, mientras que los valores más bajos que los adyacentes son incrementados [46]. Por lo tanto, se produce una reducción de la amplitud y un incremento de la anchura del pico. La figura I-10 expresa gráficamente tal situación. Figura I-10. Ejemplos puntuales del efecto del suavizado Los métodos más difundidos y empleados de suavizado son la media móvil no ponderada y Savitzky-Golay. La transformación wavelet elimina tanto altas como bajas frecuencias, poco comunes en los espectrómetros NIR actuales. El método es similar a la transformada de Fourier. Generalidades 57 Un espectro NIR viene representado por la siguiente función [45]: )()( 0  eAA  Los tres factores están relacionados respectivamente con los efectos multiplicativo ( 0A ) y aditivo ( ) debido a la radiación dispersa y con el ruido )(e . Los métodos desarrollados para la corrección de la línea base intentan minimizar o eliminar los factores  y  . Los métodos más empleados son: Derivadas. Realmente son diferencias finitas, ya que la aplicación de derivadas verdaderas no es posible dado que los espectros son digitalmente almacenados como una secuencia de puntos de datos y no como una función continua (condición de derivabilidad) [34]. Usualmente en Tecnología NIRS se emplea la segunda derivada, que permite diferenciar picos solapados y reducir diferencias de tipo lineal. La primera derivada también tiene estos efectos, pero en menor grado [47]. Multiplicative Scatter Correction (MSC). Corrige tanto el efecto aditivo como el multiplicativo. La base de esta metodología radica en que la luz procedente de la radiación dispersa posee una dependencia de la longitud de onda diferente de la luz que se absorbe debido a compuestos químicos [48]. De este modo se pueden emplear datos de longitudes de onda para distinguir entre absorción de luz y radiación dispersa. Se calcula empleando todo el colectivo experimental. Standard Normal Variate (SNV). Se calcula de manera individual para cada espectro, por lo que no es dependiente del colectivo inicial usado en el cálculo. El resultado obtenido es un espectro transformado con media cero y desviación típica uno, corrigiendo desplazamientos espectrales a lo largo del eje vertical [46]. Detrending (DT). Se emplea como complemento del tratamiento SNV, puesto que éste no corrige curvaturas en la línea base. Al igual que la corrección SNV, se calcula de manera individual para cada espectro. Elimina la curvatura de la línea base causada por interacciones variables entre la humedad y efectos de partícula [46]. Orthogonal Signal Correction (OSC) [49]. Trata de eliminar un pequeño número de factores que representan toda la variación posible de la matriz X (espectros), y son ortogonales a la variable Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 58 dependiente que va a ser modelada. Los métodos que se emplean para el incremento de la resolución espectral juegan un papel muy importante en eliminar el solape entre bandas espectrales. Los métodos más empleados son: Derivadas. Explicadas resumidamente en el párrafo anterior. Sustracciones espectrales. Se trata de restar espectros. Muy efectivo para detectar ligeras diferencias. Del mismo modo este método es útil para espectros NIR dependientes de ciertas perturbaciones como temperatura, pH, etc [45]. Los métodos de centrado tratan simplemente de realizar un ajuste al conjunto de datos para reposicionar el centroide de los mismos en el origen de coordenadas. La normalización es otro ajuste, que en este caso trata de igualar la magnitud de cada muestra. Generalidades 59 BIBLIOGRAFÍA [1] CIAA, European Technology Platform on Food for Life: Strategic Research Agenda 2007- 2020, 2007, CIAA, Brussels. [2] M. Fritz, G. Schiefer, Int. J. Prod. Econ., 2009, 117(2), 317. [3] V.A. Vaclavik, Fundamentos de ciencia de los alimentos, Abribia S.A. (Ed.), Zaragoza, España, 1998, p.3. [4] P. Raspor, Trends Food Sci. Technol., 2008, 19(8), 405. [5] Dictionary of Food Science and Technology, Blackwell Publishing (Ed.), Blackwell Publishing Ltd, Gariston Road, Oxford, UK, 2005, p. 157. [6] P. A. Luning, W. J. Marcelis, Trends Food Sci. Technol., 2009, 20(1), 35. [7] W. Rijswijk, L. J. Frewer, D. Menozzi, G. Faioli, Food Qual. Prefer., 2008, 19(5), 452. [8] I. Siró, E. Kápolna, B. Kápolna, A. 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Así, los primeros ensayos con este tipo de productos fueron llevados a cabo hace cuatro décadas, en 1968, por Ben Gera y Norris [50], desarrollando una aplicación NIRS para predecir humedad y grasa en productos cárnicos mediante análisis por transmitancia. No obstante, la confirmación de la tecnología mediante numerosos trabajos de investigación en cárnicos no se llevó a cabo hasta la pasada década [51]. En la actualidad, es una realidad la viabilidad de aplicación de la tecnología en el análisis on-line en tiempo real, tanto desde un punto de vista predictivo, como para la autentificación y diferenciación de calidades. El grueso de los trabajos efectuados han tratado sobre la capacidad de la tecnología NIRS para predecir la composición química en diferentes sistemas productivos (porcino, ovino, vacuno, avícola, etc), principalmente en análisis de parámetros mayoritarios (grasa, humedad y proteína, existiendo menos literatura relacionada con la capacidad NIRS para evaluar la calidad de la carne mediante la cuantificación o detección de características tecnológicas, sensoriales o categorizaciones en grados de calidad [52]. 2.1.1.1 Trabajos iniciales Si se efectúa una revisión sobre los trabajos llevados a cabo con anterioridad a la última década, se partiría de 1981 [53], donde se empleó carne fresca de ternera y cordero para la determinación de componentes mayoritarios (grasa, humedad y proteína) mediante un equipo NIR de filtros. Las mismas determinaciones, sobre carne emulsionada de ternera y cerdo, se llevaron a cabo en 1983 [54] con un equipo monocromador. Ambos estudios obtuvieron coeficientes de determinación (R2) superiores a 0,7 en los tres parámetros. En 1986, destacaron dos trabajos [55, 56]. Los primeros autores obtuvieron predicciones de grasa y proteína sobre canales y pechuga de pollo con un espectrofotómetro NIR de filtros. En este caso, los coeficientes de determinación inferiores fueron de 0,78, aunque cuando los modelos se validaron externamente, este valor disminuyó a 0,6 (grasa en pechuga de pollo). Con el segundo trabajo se obtuvo la composición de grasa y humedad en canales de gallinas, alcanzando en todos los casos valores de R2≥0,92, tanto en fase de calibración, como de validación. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 66 De nuevo para predecir constituyentes mayoritarios, en 1991 [57] se empleó un monocromador para analizar jamón de cerdo fresco. Nuevamente se obtuvieron coeficientes de determinación satisfactorios, así como errores típicos en validación (ETPs) de 0,54%, 0,59% y 0,68% según se tratase respectivamente de grasa, humedad y proteína, con unos rangos predictivos de 1-7%, 58-65%, y 24-30% en el mismo orden. En 1992 [58], se obtuvieron predicciones de grasa sobre el músculo longissimus dorsi en carne de vacuno, comparando producto intacto con homogeneizado. Cuando se validaron estas calibraciones, los coeficientes de determinación fueron de 0,98 y 0,81 según se tratase de producto homogeneizado o intacto, obteniendo asimismo unos errores de predicción (ETPs) de 0,28 y 0,9. Finalmente, cabe citar otro trabajo desarrollado en 1996 sobre la elaboración de modelos predictivos para grasa, humedad y proteína en muslos y pechugas de pollo [59], aunque en este caso no se validaron externamente. Si se extiende el estudio sobre predicciones de características tecnológicas de la carne, o parámetros minoritarios en trabajos previos a la última década, escasas aportaciones se encuentran en literatura, destacando estudios efectuados sobre predicciones en vacuno. Así, en 1994 [60] se examina la capacidad de la tecnología NIRS, para evaluar la calidad sensorial mediante la determinación de la terneza, el cual es el parámetro más importante relacionado con la calidad en este tipo de carne. Sobre el músculo longissimus dorsi, la validación de los modelos arrojaron valores de R2=0,64-0,81 y ETP=0,5-0,7. En 1995 [61], se efectuó un estudio en el que se empleaba la tecnología NIR para obtener información sobre la palidez de la carne de cerdo, sin que las características ópticas y de dispersión de la radiación afectaran al pH y la longitud del sarcómero del músculo. Un estudio para medir las propiedades del colágeno en ovino mediante NIRS se efectuó en 1996 [62], obteniendo coeficientes de correlación R≤0,55 para medir la concentración de colágeno, y R≥0,8 en el estudio de su solubilidad. Los modelos obtenidos se validaron mediante validación cruzada. En cuanto a los trabajos relacionados con clasificaciones o categorizaciones en grados de Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 67 calidad, destacarían cuatro, elaborados en 1997 [63-66]. De este modo, se empleó la tecnología NIRS para diferenciar mezclas de carne de vacuno, cordero, cerdo y pollo, previa homogeneización, centrifugación y obtención del extracto seco (DESIR, Dry Extract Spectroscopy by Infrared Reflectance) mediante modelos de regresión PLS [63]. Empleando validación cruzada, obtuvieron unos errores de predicción del 12% en carne de vacuno, 8% en carne de cerdo, y un 7% en carne de cordero y pollo. Analizando del mismo modo sobre extracto seco (DESIR), para diferenciar si la carne de vacuno fue sometida a procesos de congelación/descongelación [64], se desarrollaron modelos de los k vecinos más cercanos (K Nearest Neighbours) con validación cruzada, clasificando correctamente todo el colectivo empleado (80 muestras). Se encuentran otros estudios en los que trabajaron directamente sobre carne fresca. Destaca el que se llevó a cabo para clasificar tres grados de dureza de carne de vacuno comparando el análisis discriminante clásico, con calibraciones multivariantes en componentes principales [65]. El análisis discriminante clásico aportó menores errores de clasificación que la calibración multivariante. Así, el método de regresión obtuvo errores de hasta el 77%, descendiendo al 40% con el análisis discriminante. En cambio, este error disminuyó al 3% cuando se comparaba entre grupos extremos. Del mismo modo se clasificaron espectros NIR procedentes de carne fresca de cerdo, pavo y pollo mediante análisis discriminante [66]. En este caso, el porcentaje de muestras correctamente clasificadas fue del 91,9% (34/37 muestras). 2.1.1.2 Trabajos recientes Siguiendo la misma línea argumental del apartado anterior, a continuación, mediante la tabla II-1, se expone una síntesis de trabajos relevantes que se han llevado a cabo en la última década, sobre predicciones de parámetros químicos en diferentes tipos de carne. Mediante la observación de esta tabla, se aprecia gran diversidad de aplicaciones en cuanto a tipo de producto y constituyentes a predecir en productos cárnicos. Del mismo modo, se advierte que tan solo aproximadamente el 30% de los trabajos se han llevado a cabo sobre producto intacto, presentación a través de la cual permitiría la aplicación de los modelos desarrollados en la línea de producción del producto. Este mismo porcentaje se ha mantenido en cuanto a aplicaciones que han presentado validación externa de sus modelos, por lo tanto, se percibe una carencia generalizada en el estudio del comportamiento de los modelos mediante un colectivo de validación externa, independiente del empleado para el desarrollo de los mismos. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 68 Con relación a los modelos predictivos de características tecnológicas y sensoriales para productos cárnicos que se han desarrollado en la escala temporal que se analiza, la tabla II-2 expone una síntesis de los trabajos más relevantes. En estos trabajos se observa menor variación en cuanto a tipo de producto, ya que la mayoría se centran en porcino y vacuno. Asimismo, se aprecia que los resultados varían considerablemente, obteniendo predicciones para este tipo de parámetros de calidad, menos satisfactorias que las obtenidas para predecir la composición química (tabla II-1). Este hecho se debe por un lado, a la mayor complejidad de los parámetros a predecir, que, en numerosas ocasiones, su respuesta NIR se corresponde con correlaciones secundarias. De otro lado, la mayoría de estos trabajos (aproximadamente el 83%) se han llevado a cabo sobre producto no homogeneizado (intacto o cocinado), incidiendo negativamente en la bondad de los modelos desarrollados. De las cuantificaciones expuestas en la tabla II-2, destaca la predicción de la terneza de la carne, ya que es uno de los parámetros tecnológicos sobre el que se efectúan más estudios, debido a que junto al color, son los más valorados por los consumidores [102]. Así, además de los trabajos expuestos en la tabla II-2, se pueden encontrar otros sobre este parámetro [103, 104]. En consecuencia, es evidente que la tecnología NIRS puede predecir la terneza de la carne, si bien quedan retos por superar, especialmente en el proceso de muestreo y forma de presentación de muestras, debido a la heterogeneidad natural del producto. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 69 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 70 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 71 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 72 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 73 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 74 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 75 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 76 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 77 Además de las aplicaciones de la tecnología NIRS expuestas hasta el momento sobre productos cárnicos, cabrían destacar otras, que consisten en la obtención de modelos cualitativos o de reconocimiento de pautas, desarrollando clasificaciones o categorizaciones en diferentes grados de calidad. En la última década, se ha apreciado un incremento en este tipo de aplicaciones. En el sistema de producción avícola es donde se encuentra mayor número de trabajos, junto con el vacuno. Así, en 1999 [105] se autentificaron pollos chinos (n=37), frente a otros de crecimiento rápido (n=33) que alcanzaban un precio inferior en el mercado. Los resultados fueron excelentes, clasificando correctamente el 100% de las muestras, si se trataba de carne de muslo homogeneizada. Este porcentaje descendió al 96% cuando emplearon cortes de pechuga (intacto), y al 92% cuando estos cortes presentaban piel. Posteriormente, en el año 2000 [106], se diseñó un analizador NIRS para detectar canales de pollo enfermas o defectuosas (n=576) frente a canales sanas (n=1174), alcanzando un 95% en la precisión de la clasificación mediante modelos no lineales (redes neuronales). Este trabajo empleó 1/3 del total de las muestras como colectivo de validación externa. En el mismo año, se diseñó un modelo [92] que permitió clasificar correctamente el 74% de muestras de carne de pollo, para diferenciar entre tierno y duro. Este trabajo también empleó tanto colectivo de calibración (n=96), como de validación externa (n=48). En 2005 [69], se diferenciaron correctamente canales de pollo picadas y secadas, empleando como criterio discriminatorio tres grupos de genotipos distintos. En el mismo estudio, se clasificaron correctamente el 98% de las gallinas que fueron alimentadas con dos regímenes distintos. En cuanto al tipo de carne procedente de ganado vacuno, en 1998 [107] se empleó un modelo para identificar mezclas con otros tipos de carne (cordero, pollo y cerdo), mediante la técnica DESIR (Dry Extract Spectroscopy by Infrared Reflection). Más adelante, siguiendo la misma línea para autentificar carne de vacuno, se desarrollaron modelos para detectar hamburguesas adulteradas con carne de cerdo, cordero, leche en polvo o harina de trigo [108]. Alcanzaron una precisión próxima al 93% mediante una función discriminante KNN (K-Nearest Neighbour). En 2003, se obtuvieron modelos PLS discriminantes con validación cruzada, para diferenciar entre 2 troncos raciales, 3 tipos de músculo, y entre 6 estándares de calidad (según normativa chilena) en función del sexo, edad y nivel de engrasamiento de los animales [77]. La diferenciación racial y muscular se efectuó con grandes porcentajes de éxito (78% y 95% respectivamente), no obteniendo, por el contrario, valores tan positivos en la discriminación entre los estándares de Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 78 calidad (53%, porcentaje medio de muestras correctamente clasificadas). En el mismo año se publicó un trabajo [101] en el que, mediante una análisis SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogy), previa síntesis de información espectral por ACP (Análisis de Componentes Principales) con validación cruzada completa, se obtuvo un porcentaje de muestras del 96% correctamente clasificadas para la diferenciación entre filetes tiernos y duros. El mismo tipo de herramienta quimiométrica (SIMCA) se empleó en un estudio efectuado en 2004 [109] para optimizar los modelos predictivos que se obtenían a partir de una cinta transportadora de carne picada de vacuno. En este caso, se trataba de segregar entre espectros de carne puros y espectros que contenían otro tipo de información que generaban ruido sobre los modelos predictivos. En cuanto al desarrollo de modelos de clasificación en carne de porcino, es importante destacar dos trabajos llevados a cabo en los años 2000 [97] y 2006 [110]. En el primero, se estudió la separación de cerdos portadores (n=63), de otros no portadores (n=33) de un gen que aporta unas características determinadas a la carne, adecuadas para ciertos procesos tecnológicos, como la producción de jamón. La clasificación se llevó a cabo mediante el empleo de redes neuronales, clasificando tan solo 4 animales no portadores como portadores del gen. El segundo trabajo versó sobre la evaluación de muestras de jamón curado (n=117) según 5 características sensoriales (pastosidad, color, frío superficial, veteado y manchas de color). Se realizó validación cruzada en los modelos obtenidos, los cuales, manteniendo el mismo grado de conformidad tanto para falsos positivos como negativos, el grado de confusión estuvo entre 0,4% - 8% según se tratase de pastosidad o veteado respectivamente. En otros subsectores de la industria cárnica, es importante destacar un trabajo realizado en 2007 sobre carne de conejo [74], mediante el cual se discriminó según sistemas productivos, es decir, convencional y ecológico. El colectivo experimental estuvo constituido por 52 muestras, empleando ecuaciones PLS discriminantes como algoritmos de clasificación, distinguiendo correctamente el 98% de las muestras. En este mismo año, destacó otro trabajo, pero en este caso con corderos [111], para diferenciar aquellos criados con leche materna de los que se alimentan con sustitutos lácteos. Con un total de 100 muestras y empleando el mismo tipo de funciones discriminantes del trabajo anterior, el 100% de las muestras fueron clasificadas correctamente. Para finalizar este apartado, es necesario tener en cuenta la tendencia de la tecnología en cuanto a su evolución instrumental y de diseño. En este sentido, numerosos departamentos de Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 79 I+D+i, tanto públicos como privados, en diferentes puntos de la geografía mundial, están transfiriendo e implantando tecnología NIRS en el sector cárnico directamente en la línea de producción (procesado, mataderos, etc.). Así, ya es una realidad la existencia de empresas específicas que se encargan exclusivamente de ejecutar este tipo de proyectos, permitiendo, mediante NIRS, la estandarización de productos, supervisión de proveedores, rastreo de lotes y/o productos, entre otros. A modo de ejemplo, se puede citar la financiación que está realizando el gobierno australiano (Australian Meat Industry Council), para certificar la calidad de la carne de cordero según su edad, mediante la aplicación on-line de la tecnología NIRS en diversas etapas del sistema productivo [112]. Del mismo modo, el gobierno estadounidense (U.S. Meat Animal Research Center) ha desarrollado un espectrofotómetro NIRS para intentar predecir la terneza en carne de vacuno, analizando directamente en planta de procesado, sobre la canal de los animales [113, 114]. Desde 1999 se encuentran trabajos relacionados con este tipo de aplicaciones en el sector cárnico. Así, de nuevo el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA-Agricultural Research Service), desarrolló un prototipo de un espectrofotómetro VIS/NIR a escala industrial para inspeccionar canales de pollo defectuosas o procedentes de animales enfermos [106]. Posteriomente (2003), avanzaron en esta línea de investigación obteniendo modelos discrimantes que permitían diferenciar on-line canales procedentes de animales muertos, sanos ó septicémicos [115]. Otros autores [116], analizaron constituyentes mayoritarios (grasa, humedad y proteína) para controlar lotes de carne picada mediante la instalación de un instrumento NIR a la salida de la picadora. Las calibraciones se efectuaron sobre carne de cerdo, ternera, y mezcla de ambas, cubriendo un rango predictivo comprendido entre 7%-26% (grasa), 58%-75% (humedad) y 15%- 21% (proteína). La evaluación mediante validación cruzada de los modelos generados arrojó unos coeficientes de determinación (r2) de 0,86 para grasa y humedad, y de 0,61 para proteína. Los Errores Típicos de Validación Cruzada (ETVCs) fueron de 1,4%, 1,09% y 0,56% según se tratase de grasa, humedad y proteína respectivamente. Posteriormente, el mismo grupo de investigación, empleó la misma estrategia descrita, pero en este caso para predecir los constituyentes mayoritarios en carne de ternera congelada [88]. Utilizaron 55 lotes de carne entre 400-800 kg con rangos comprendidos entre 7,66%-22,91%, 59,36%-71,48% y 17,04%-20,76%, obteniendo unos Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 80 Errores Típicos en Validación Cruzada de 0,48%, 0,43% y 0,41%, según se tratase del parámetro grasa, humedad y proteína respectivamente. Un trabajo más reciente intentó predecir parámetros tecnológicos (pérdida por goteo, color, terneza) y grasa intramuscular en 112 canales de cerdo al final de la línea de sacrificio [117]. Tan sólo obtuvieron resultados concluyentes en las predicciones de la grasa intramuscular, subrayando la mejora de diferentes factores para la adquisición de una señal espectroscópica de calidad en este tipo de análisis. 2.1.2 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en el Sector del Cerdo Ibérico En el sector porcino español, además del sistema productivo convencional, destaca la producción de cerdo Ibérico, que difiere en múltiples factores con respecto al primero, tales como raza, alimentación, edad y peso al sacrificio, reproducción y manejo, etc. El cerdo Ibérico se caracteriza por ser un animal precoz, con elevado nivel de engrasamiento, alta rusticidad y autóctono de la península Ibérica [118]. Otra particularidad de estos animales es su explotación en régimen extensivo, donde completan su cebo en dehesas de encinas y alcornoques principalmente, alimentándose básicamente de bellotas y pasto (leguminosas y gramíneas), obteniendo un aprovechamiento óptimo de los recursos del ecosistema natural que constituye la dehesa, con una perfecta adaptación a este medio. Este sistema productivo aporta unos productos cárnicos de selecta calidad, siendo de los que alcanzan los precios más elevados a nivel mundial [119]. En la actualidad existe una demanda creciente de este tipo de productos, superior a su oferta potencial. Esta situación se ha traducido, en ciertas ocasiones, en falta de transparencia y fraudes en el sector. Por lo tanto, la industria del cerdo Ibérico, requiere de la implantación de tecnologías rápidas, precisas y de bajo coste, que permitan un control de calidad sobre todos los animales sacrificados, así como de sus productos derivados. En este sentido, destacan diferentes grupos de investigación en España que están desarrollando aplicaciones de la tecnología NIRS como herramienta de control y autentificación del cerdo Ibérico y sus derivados. Desde 1992, ya se encuentran trabajos publicados sobre la aplicación NIRS para el control de calidad en la industria del cerdo ibérico [120], y en 1994 comienzan a desarrollarse aplicaciones cualitativas para la clasificación de muestras de grasa (n=118) procedentes de zonas Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 81 específicas de la canal, en tres grupos de calidad, mediante redes neuronales (ANN, Artifical Neural Networks) [121]. Tres años más tarde, la profundización sobre este tipo de estudios aumenta, y se realizan trabajos conjuntos de aplicaciones cuantitativas y cualitativas sobre productos derivados del cerdo ibérico [122]. En 1998, se publicó un trabajo en el que se estudiaba una metodología de análisis para la optimización en la obtención espectral sobre tejido adiposo en interactancia- reflectancia, observando como comienza a abrirse el camino hacia el análisis NIRS de estos productos de forma intacta, mediante sondas de fibra óptica [123]. En el mismo año, siguiendo esta tendencia, se analizaron muestras homogeneizadas y emulsionadas de jamones ibéricos, estudiando el efecto de la heterogeneidad de la muestra sobre la calidad del dato espectral [124]. En el año 2000, se publicó un trabajo en el que, mediante Análisis Dicriminante Lineal (ADL), se diferenciaban muestras de lomo en tres calidades según la alimentación recibida por los animales en fase de cebo [125]. El error de clasificación del modelo fue inferior al 2%, incrementándose al 3,5% cuando se validó externamente. Además, se evaluó la detección de espectros procedentes de animales que habían sido alimentados con un pienso especial, compuesto por un núcleo de oleínas, el cual podía simular la alimentación recibida en campo por los animales mediante pasto y bellotas. El error cometido en la validación de estos espectros fue aproximadamente del 7%. En el año 2001, dos trabajos se llevaron a cabo sobre la evaluación de la alimentación del cerdo Ibérico mediante NIRS [126, 127], junto con otro [128], que evaluó la transferencia de calibraciones entre dos equipos, para la predicción del perfil lipídico (ác. oleico, ác. palmítico, ác. esteárico y ác. linoleico) de muestras de grasa de cerdo Ibérico, obteniendo un Error Típico de las Diferencias (ETD) entre ambos equipos similar, o incluso menor, que los valores del error típico de predicción de los modelos desarrollados. En el año 2002 un mismo grupo de trabajo publicó tres estudios sobre la viabilidad de la tecnología NIRS para el control de calidad del cerdo Ibérico. De este modo, obtuvieron predicciones a partir de 115 muestras de grasa subcutánea de 12 ácidos grasos, ácidos grasos poliinsaturados totales, moinsaturados y saturados [129]. Los coeficientes de determinación (R2) se encontraron entre 0,62 (ácido margárico) y 0,95 (ácidos grasos saturados totales), obteniendo unos Errores Típicos de Calibración (ETCs) entre 0,007% (ácido laúrico) y 0,77% (ácido oléico). De la misma forma, obtuvieron predicciones de concentraciones de minerales (Fe, Ca, Zn, Na y K) para muestras de lomo homogeneizado e intacto mediante fibra óptica [82] (tabla II-1). Profundizando sobre el análisis de producto intacto, desarrollaron otro trabajo en el que obtuvieron predicciones de proteína y grasa infiltrada en lomo, con otro tipo de sonda que poseía una ventana de análisis Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 82 de mayor dimensión (25 cm2) [83] (tabla II-1). El mismo grupo, en el año 2003 [81] (tabla II-1), obtuvo de nuevo predicciones del perfil lipídico de grasa subcutánea, pero empleando en este caso la última sonda mencionada. En trabajos más recientes (año 2005 [130]), autentificaron carne de cerdo Ibérico mediante ecuaciones que predecían diferentes porcentajes de carne de cerdo estándar en Ibérico (tanto en producto fresco como curado). En 2007, un trabajo describe cómo se minimizan las variaciones que se producen en las predicciones de ácidos grasos y grasas a medida que transcurre el tiempo entre el desarrollo del modelo y el análisis de nuevas muestras [131], y otro desarrolla un procedimiento para la optimización de las calibraciones obtenidas para predecir ácidos grasos, según el pretratamiento matemático que se aplique sobre la señal espectroscópica [132]. En el mismo año, se publicó un trabajo que predecía con elevada exactitud y precisión los compuestos mayoritarios (grasa, humedad y proteína) de masa fresca picada que se emplea para la elaboración de embutidos típicos españoles (chorizo) [133]. Este mismo grupo, desarrolló otro estudio [134] para completar el control de calidad a lo largo del proceso en la elaboración de embutidos curados. Para ello, obtuvieron predicciones de los mismos compuestos, pero sobre producto curado. Los mayores errores en validación externa (ETP) se produjeron sobre los embutidos curados en grasa (1,64%), con una forma de presentación de muestras similar a como se encuentran en el comercio envasados al vacío. Estos últimos trabajos se describirán detenidamente en posteriores apartados, ya que han formado parte del contenido de la presente Tesis Doctoral. 2.2 Objetivos En el presente capítulo, se exponen trabajos que se han llevado a cabo para el establecimiento de un Sistema de Control de Calidad mediante tecnología NIRS a lo largo del proceso productivo de embutidos curados de cerdo. Para tal fin se elaboraron dos tipos de embutidos (salchichón y chorizo), muy consumidos y característicos en el mercado español. El proceso de elaboración se llevó a cabo en el año 2002, en una planta piloto perteneciente al IFAPA-Centro Palma del Río (Córdoba). Este tipo de productos son los que han participado en mayor medida para la elaboración de la presente Tesis Doctoral, tanto desde un punto de vista de planificación y ejecución de diseños experimentales, como publicaciones y participaciones en congresos. Un resumen de los trabajos que comenzaron a desarrollarse, fue publicado mediante una comunicación a la revista Solo Cerdo Ibérico [135]. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 83 Los objetivos que en este capítulo se plantean con respecto al desarrollo de aplicaciones NIRS para Control de Calidad son los siguientes:  Autentificación de embutidos ibéricos mediante modelos discriminantes y modelos de detección de mezclas para diferenciación de calidades.  Caracterización de embutidos de cerdo mediante predicciones de constituyentes mayoritarios (grasa, humedad y proteína), tanto para producto fresco (picado) como curado (loncheado).  Estudio y optimización de diferentes formas de presentación de muestras, así como factores determinantes en la obtención de la señal espectroscópica. La figura II-1 sintetiza las etapas que se llevan a cabo en la elaboración de embutidos, señalando a partir de cuales se obtuvo información espectral NIRS para el desarrollo del Sistema de Control de Calidad. Figura II-1. Etapas de obtención de información espectral NIRS en el proceso de elaboración de embutidos Para la consecución de los objetivos planteados, los trabajos fueron financiados a través de dos Proyectos de Investigación: ­ Utilización de la Tecnología NIRS como método rápido para la certificación de embutidos tradicionales elaborados con cerdo ibérico (CAL00-001) ­ Utilización de la Tecnología NIRS como método rápido para la certificación de embutidos tradicionales elaborados con cerdo ibérico. Validación de los modelos obtenidos (PIA-03- 051) Recepción y almacenamiento de materia prima Picado Aditivos Amasado Pre-maduraciónEmbutidoFermentación / Maduración / Secado Producto terminado. Almacenamiento Distribución Comercio Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 84 2.3 Clasificación de embutidos según calidades Parte del trabajo que se expone en el presente apartado, ha sido objeto de una publicación en la revista Meat Science, con el título ‘Meat mixture detection in Iberian pork sausages’, mostrando su contenido en el Anexo 1. 2.3.1 Antecedentes En España, los embutidos elaborados a partir de cerdo Ibérico son considerados como productos de elevada calidad. La norma de calidad española específica para el cerdo Ibérico [136], ha protegido en su evolución exclusivamente a los denominados ‘productos nobles’, es decir, jamón, paleta y caña de lomo, quedando otros productos sin un adecuado respaldo normativo para su regulación y control. Dentro de estos productos, destacan los embutidos curados de cerdo ibérico, especialmente el chorizo y salchichón, que alcanzan elevadas cotas de aceptación entre los consumidores. Un ingrediente fundamental de estos embutidos, es la carne magra de cerdo ibérico, que justifica en gran medida la diferencia de precio con respecto a los embutidos de cerdo blanco o estándar. De este modo, la falta de criterios objetivos para la autentificación de embutidos ibéricos es notoria, creándose un nicho para posibles fraudes mediante adulteraciones, especialmente con carne de cerdo blanco, afectando a la calidad final del producto, desde un punto de vista organoléptico, nutritivo y funcional. Antes del sacrificio, los animales son identificados mediante un sistema de trazabilidad. Después del sacrificio, la trazabilidad de los productos elaborados es de gran importancia, basándose un una caracterización química, física y microbiológica. Cada vez es más patente la necesidad de desarrollar una técnica capaz de llevar a cabo determinaciones rápidas para poder ‘trazar’ el producto final, permitiendo identificar la presencia y cantidad de carne de inferior calidad a la que se debe emplear en la elaboración de este tipo de embutidos. Actualmente, se han desarrollado metodologías de análisis para la determinación de mezclas en productos cárnicos, como la electroforesis, sistemas inmunoquímicos, resonancia magnética nuclear, cromatografía líquida y gaseosa, marcadores de ADN, así como la tecnología NIRS, que podría llegar a ser una técnica de autentificación en la industria del porcino Ibérico. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 85 Los trabajos que se desarrollan en el presente apartado, van orientados hacia la posibilidad de incluir la tecnología NIRS como herramienta para dar respuesta en tiempo real sobre la autenticidad de los embutidos ibéricos, controlando dos puntos básicos en el proceso de elaboración, la masa fresca picada, y el posterior producto curado terminado. Por último, es importante destacar que son muy pocos los trabajos que se han llevado a cabo para controlar mediante NIRS este tipo de productos. 2.3.2 Material y Métodos 2.3.2.1 Materia prima El material de partida empleado para el desarrollo del presente estudio, consistió en carnes magras de cerdo ibérico y blanco, para la posterior obtención de embutidos con mezclas en diferentes porcentajes de ambas. El magro procedente de los cerdos ibéricos procedía de animales pertenecientes a una misma partida y explotación, todos ellos inscritos en el libro genealógico para la raza porcina Ibérica. Fueron sacrificados aproximadamente con 13 meses y 145 kg de peso. Además, se efectuó un proceso de inspección y selección de los mismos por técnicos pertenecientes al IFAPA en las etapas ante y post mortem, todo ello para obtener la mayor garantía a cerca de la autenticidad de la materia prima a emplear, factor clave para la obtención de modelos adecuados para la diferenciación de calidades. La carne de cerdo blanco consistió en recortes de magro de primera, siendo obtenidos de distintas ganaderías con el estándar racial tipo. Estos animales se sacrificaron aproximadamente con 6 meses y 95 kg de peso. Del total de esta carne, un 10% era grasa añadida procedente de cerdos blancos, necesaria para una correcta elaboración de los embutidos que estuvieran constituidos exclusivamente por este tipo de carne, o aquellos en los que fuera predominante, según los diferentes tratamientos de mezclas que se obtuvieron, como se comentará a continuación. Ambos tipos de carne se recibieron congeladas en el IFAPA-Centro Alameda del Obispo (Córdoba), y fueron almacenadas en estas condiciones hasta el momento de su utilización. 2.3.2.1.1 Elaboración de chorizo Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 86 Se elaboraron 75 piezas de chorizo de forma tradicional, junto con 75 muestras de masa picada sin embutir, para obtener modelos que permitan el control de calidad tanto sobre masa fresca, como en producto curado. El peso por muestra en ambas formas de presentación estuvo comprendido entre 300-350 g, y su composición difería según porcentajes de mezclas de carne de cerdo ibérico y/o blanco, como se expondrá en el apartado 2.3.2.2.1. La carne se descongeló a temperatura ambiente, para posteriormente ser troceada y mezclada. El troceado se llevó a cabo con una picadora de placas Sammic®, Mod. G85 R-Olotinox 22, empleando para el cribado un diámetro de agujeros de 5 mm. A continuación se procedió a un amasado manual durante 15 min., seguido de un amasado mecánico durante 20 min., mediante una amasadora-mezcladora Mainca Equipamientos cárnicos S.L., Mod. BM 35. En la etapa de amasado mecánico, a la misma vez se llevó a cabo la adición de los aditivos, empleando los mismos que se utilizan en la industria española para la elaboración de embutidos curados. Estos aditivos, junto con los porcentajes con respecto al peso total fueron los siguientes: sal fina (2%), ajo deshidratado en polvo (1%), pimienta negra molida (0,25%), polifosfato (0,1%), pimentón (1,5%), nitrificante (0,2%), dextrosa (0,1%), ácido ascórbico (0,05%) y vino blanco (2%). El ácido ascórbico se añadió al final por separado para evitar que reaccionara con algunos condimentos. Las proporciones comentadas fueron añadidas según la fórmula de Martín-Bejarano [137]. Los ingredientes descritos, producen una mejora en el proceso de maduración de los embutidos, así como un aporte característico de aspectos organolépticos que identifican el flavor del producto. Finalizado el proceso de adición de aditivos y amasado mecánico, se mantuvo la masa en reposo durante 24 h a 4ºC. A continuación se pasó a la etapa de embutido, en donde se introducía entre 300-350 g de masa en tripas artificiales de 40 mm de diámetro. Por último, se procedió al proceso de maduración del producto durante un periodo de 21 días, con unas condiciones ambientales modificadas a lo largo del mismo, desde 4-5ºC, 70% HR al comienzo, hasta 10-12ºC, 50-55% HR en su finalización. Una vez obtenido el producto curado, se procedía a su loncheado y conservación a -20ºC hasta su análisis. 2.3.2.1.2 Elaboración de salchichón El proceso de elaboración de este producto se realizó de la misma forma que el anterior, con las siguientes salvedades: Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 87 ­ En este caso se elaboraron 100 piezas y 100 muestras de masa fresca picada, de aproximadamente 300 g cada una. ­ El condimento pimentón de los aditivos no se encuentra en este producto, incluyéndose tomillo, en 0,2%. ­ El condimento ajo de los aditivos se encuentra en un porcentaje inferior que en el chorizo, concretamente al 0,5%. 2.3.2.2 Diseño del colectivo experimental 2.3.2.2.1 Chorizo La masa descrita para la obtención de chorizo, se elaboró de cinco formas distintas en cuanto a diferentes proporciones de carne de cerdo Ibérico y/o blanco, es decir, se obtuvieron cinco tratamientos diferenciados en porcentajes de mezclas de ambos tipos de carne. Así, se conformaron los tratamientos A, B, C, D y E, con los siguientes porcentajes de Ibérico/Blanco respectivamente: 100%/0%, 75%/25%, 50%/50%, 25%/75%, 0%/100%. Además, para intentar introducir en los modelos de clasificación la mayor cantidad de factores de variación, se efectuaron cinco repeticiones o periodos de elaboración, diferenciados en el tiempo entre 8-12 días. En consecuencia, las 75 piezas de chorizo (producto curado) y las 75 muestras de masa picada (producto fresco) se elaboraron en cinco periodos, constituido cada uno de ellos por 15 muestras, estando formado cada periodo por lo tanto, por tres piezas o muestras de cada uno de los tratamientos comentados (A, B, C, D y E). Asimismo, dada la gran heterogeneidad que presenta este producto, producida en parte por el gran tamaño del picado, se procedió a la homogeneización del mismo una vez obtenida su información espectral NIRS, obteniendo dos nuevas formas de presentación de muestras, producto fresco homogeneizado y producto curado homogeneizado. Esta homogeneización se efectuó con una picadora comercial de cuchillas horizontales (Moulinex®). Finalmente, cuando se analizaron las formas de presentación de muestras homogeneizadas vía NIRS, se procedió al envío de 50 g aproximadamente de cada una de ellas al Laboratorio Agroalimentario de Córdoba, para su caracterización mediante los análisis de los parámetros grasa, humedad y proteína. 2.3.2.2.2 Salchichón El diseño para este producto se realizó de la misma forma que el anterior, con la siguiente salvedad: Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 88 ­ En este caso, el número de repeticiones o periodos de elaboración fue dos, y como con este producto se obtuvieron 100 muestras de ambas formas de presentación, 50 muestras se encontraban repartidas entre los cinco tratamientos en cada periodo. Por lo tanto, 10 muestras de cada tratamiento (A, B, C, D, y E) había en cada uno de los dos periodos. 2.3.2.3 Análisis NIRS 2.3.2.3.1 Espectrofotómetro El equipo NIR empleado para la adquisición de espectros fue un espectrofotómetro Perten DA 7000 (Perten Instrument, Huddinge, Suecia). Este instrumento emplea tecnología de matrices de diodos de canal paralelo, y como consecuencia, una de sus principales características, es la inexistencia de partes móviles en su configuración óptica. El doble canal de matrices permite procesar simultáneamente señales de longitudes de onda entre 400-950 nm, y 950-1700 nm, proporcionando por lo tanto medidas simultáneas en la región visible (VIS) e infrarrojo cercano (NIR) respectivamente. Emplea fotodiodos de silicio (Si) como detectores para la región visible (400-950 nm), e InGaAs (Indio-Galio-Arsénico) para la región NIR (950-1700 nm). El espectrofotómetro interpola la información recibida para producir un punto de datos cada 5 nm, y teniendo en cuenta que su rango espectral está comprendido entre 400-1700 nm, los espectros obtenidos poseen 261 puntos de datos. El tiempo requerido para la obtención de un espectro es de 1/30 segundos, efectuando 30 lecturas espectrales que posteriormente son mediadas. Cuando se añade el tiempo necesario por el equipo informático para procesar la información, se obtiene un tiempo de muestreo total aproximadamente de dos segundos. Las muestras son iluminadas con haces de luz blanca intermitentes de alta intensidad, a partir de una lámpara halógena de tungsteno (42 W). La luz reflejada se dirige hacia una red de difracción estacionaria, la cual la separa en las diferentes longitudes de onda. El diseño del instrumento permite la obtención de espectros a partir de muestras localizadas en dos posiciones diferentes, modo de visión inferior (I) y superior (S). El modo de visión inferior trabaja posicionando las muestras en una cápsula circular de 127 mm de diámetro, obteniendo medidas sobre múltiples puntos de la muestra, mientras la cápsula gira. Este modo de análisis es más recomendado para producto con mayor grado de heterogeneidad, ya que el giro de la cápsula permite obtener información de toda la superficie de la muestra, permitiendo obtener 1800 observaciones, reduciendo el efecto que provocan diferencias en la superficie expuesta. Para el uso del modo de análisis de visión superior, el instrumento tiene que ser invertido con respecto a Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 89 la posición anterior y se coloca la muestra directamente sobre una ventana de cuarzo, con la misma superficie de análisis que en el modo de visión inferior, y manteniendo cierto grado de homogeneidad en cuanto al grosor de muestra expuesto (2-3 cm). En este caso, no existen elementos móviles durante el proceso de adquisición espectral, por lo que la media de las lecturas es obtenida a partir de escaneos de posiciones fijas de la muestra, la cual, el analista va modificando su posición después de la obtención de cada espectro. La figura II-2 expone una representación gráfica de ambos modos de análisis. A B Figura II-2. Modos de análisis empleados en la adquisición espectral con el equipo Perten DA 7000 (A: modo de visión inferior, I; B: modo de visión superior, S) Se obtuvieron 5 espectros por muestra en cada una de las posiciones y formas de presentación estudiadas. 2.3.2.3.2 Formas de presentación de muestras Hasta el momento, según lo expuesto en los apartados anteriores, se emplearon cuatro formas de presentación de muestras, es decir, dos con producto fresco (masa fresca picada y masa fresca homogeneizada), y dos con producto curado (producto curado loncheado y producto curado homogeneizado). Teniendo en cuenta que todas estas formas de presentación se analizaron en los dos modos de análisis descritos en el apartado anterior, finalmente se emplearon ocho formas de presentación de muestras con cada producto, es decir, con salchichón y chorizo. Otro aspecto importante a destacar es la diferencia entre la forma de presentación de producto curado loncheado, cuando se analizó en un modo de visión u otro del equipo. En el modo Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 90 de visión inferior, el embutido loncheado se disponía sobre el plato giratorio de 127 mm de diámetro. En cambio, cuando se analizaba en el modo de visión superior, previamente se procedía al envasado al vacío de la muestra, y de este modo se efectuaba el análisis NIRS. Esta forma de presentación estudia el posible control de calidad del producto como se encuentra en el proceso de distribución y comercio del mismo, analizando la muestra sin modificación alguna, junto con el plástico que lo envuelve. La Figura II-3 muestra este tipo de análisis. Figura II-3. Obtención espectral en la forma de presentación de muestras Curado Loncheado, modo de visión Superior, con el equipo Perten DA 7000 El análisis con todas las formas de presentación descritas se justifica con el objetivo de optimización y mejora en el control de calidad del producto. En primer lugar, para evaluar la posible pérdida de exactitud y precisión que produciría en los modelos el hecho de trabajar con producto homogeneizado frente a intacto. En segundo lugar, para efectuar la misma evaluación, pero comparando en este caso el mismo tipo de producto, en diferentes modos de análisis en el equipo. Es decir, valorar la posible pérdida de calidad en los modelos a cambio de menor preparación de muestras, y por lo tanto mayor acercamiento al producto intacto empleado en el proceso de elaboración. Finalmente, la figura II-4 representa la obtención de todas las formas de presentación de muestras. Estas etapas se llevaron a cabo tanto con chorizo, como con salchichón, conformando en cada forma de presentación un colectivo de 75 y 100 muestras respectivamente. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 91 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 92 2.3.2.4 Análisis de datos El programa informático empleado para la creación de proyectos que permitieran una correcta adquisición y gestión de los espectros fue Simplicity (Perten Instruments, Huddinge, Sweden), suministrado por el fabricante, luego viene incorporado con el ordenador del equipo. Una vez conectado el espectrofómetro, es aconsejable no analizar durante aproximadamente una hora, para la estabilización de la lámpara. Como paso previo a la captura de espectros, se obtenía la línea base mediante el análisis de una muestra de referencia suministrada por el fabricante. Esta operación se repetía al comienzo del análisis y cada 10-15 muestras analizadas. Todos los espectros se fueron almacenando en formato jcamp.dx, para posteriormente ser transformados a formato ISI, el cual permite trabajar con el programa WinISI III (v1.50e) (Infrasoft Intrenational,Port Matilda, PA, USA) que fue con el que se obtuvieron todas las aplicaciones quimiométricas NIR presentadas en la presente Tesis. A continuación se procedió a aplicar un recorte espectral a todos los espectros obtenidos, es decir, una reducción del rango de longitud de onda de 400-1700 nm a 515-1650 nm, pasando por lo tanto de 261 a 228 valores de absorbancia. Esta pérdida de información se debe a la baja repetibilidad encontrada en los extremos de los espectros, que hacen que no posean una calidad adecuada, por lo que es importante la eliminación de estas regiones para el posterior tratamiento de los datos. El procedimiento se llevó a cabo mediante un patrón que poseía el rango espectral deseado. La figura II-5 muestra un colectivo de espectros procedentes de embutidos curados, en la que se indica gráficamente la zona eliminada por el recorte espectral debido a la baja repetibilidad. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 93 Figura II-5. Recorte espectral (color rojo) sometido a los espectros obtenidos con el equipo Perten DA 7000 por presentar baja repetibilidad 2.3.2.4.1 Filtrado de espectros Esta etapa constituye un aspecto crítico antes del desarrollo de modelos cuantitativos o cualitativos, ya que nos informa sobre la calidad del dato espectral. Para obtener de cada muestra un espectro representativo y de calidad, se empleó el estadístico RMS (Root Mean Squared) o raíz cuadrada del cuadrado medio del error [19], que nos informa sobre la repetibilidad de diferentes señales espectroscópicas. Dicho estadístico calcula la similitud entre diferentes espectros de submuestras o espectros de una misma muestra, con el objeto de minimizar fuentes de error (presencia de burbujas de aire, diferencias en humedad y temperatura, mayor o menor contenido de tejido no deseado, etc.). Su cálculo se efectúa obteniendo la raíz cuadrada de la media del cuadrado de las diferencias entre cada espectro y el espectro medio de las submuestras, para cada punto de lectura de absorbancia, esto es, los n valores obtenidos con el equipo, según la siguiente expresión: n D RMS n i ij j   1 2 ; iYYD ijij  donde: Yij: Valor de absorbancia log(1/R) para la submuestra “j” a la longitud de onda i (i). iY : Valor de absorbancia log(1/R) para el espectro medio a la longitud de onda i (i). n: Número de datos. (Lecturas de absorbancia: VIS + NIR =1050). Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 94 Los valores obtenidos que muestra el programa WinISI son multiplicados por 106 para facilitar el procesamiento y manejo de los datos. Para llevar a cabo el proceso de depuración o filtrado espectral es necesario determinar un valor límite o cut off del RMS, específico para cada producto y forma de presentación de muestras. Para su cálculo, en primer lugar se obtiene el valor medio y desviación estándar de los diferentes espectros obtenidos por muestra (MEAN y STD en WinISI), según las siguientes expresiones: NRMSMEAN N j j   1 2)( = nNYY N i n j iij    1 1 2)( 1)( 1 2    NRMSSTD N j j = )1()( 1 1 2    NnYY N i n j iij donde: i = 1......n datos. J = 1......N submuestras. Como la expresión STD es una varianza del error, sigue una distribución χ2, empleando el siguiente valor límite: 2 1 2 036,1036,1 STDmSTDSTD mK K Klímite     donde m es el número de muestras utilizado para el cálculo. Con el valor de STDlímite se obtiene el valor RMSlímite. A continuación, con el valor RMSlímite obtenido, se van eliminando espectros cuyos valores individuales de RMS son superiores al límite, recalculando hasta que ningún espectro supere dicho valor. Finalmente, se procede al mediado de los espectros que queden por muestra, para de este modo obtener un espectro representativo de cada una. 2.3.2.4.2 Análisis de Componentes Principales Como paso previo a la obtención de los diferentes modelos, se llevó a cabo un Análisis de Componentes Principales, para sintetizar la información espectral, eliminando colinealidad e información redundante. El principal objetivo de este análisis fue la detección de anómalos Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 95 espectrales. Para ello, una vez efectuado el análisis, se calculó el centro de la población y se determinó la distancia de cada muestra al centro del modelo. La distancia empleada fue la de Mahalanobis (H), considerando una muestra anómala la que presentara un valor H>3 [138]. Las muestras detectadas como anómalas no se incluyeron en los colectivos de desarrollo de los modelos. 2.3.2.4.3 Análisis discriminante Para el cálculo de los modelos discriminantes se emplearon algoritmos basados en regresiones por mínimos cuadrados parciales (RMCP). El programa desarrolla una calibración, creando un fichero en el que a cada muestra le asigna el valor 1 ó 2 para una variable ficticia, según pertenezca o no, respectivamente, a su grupo o clase. Se ha considerado como valor frontera entre grupos 1,5 [139]. De este modo, una muestra puede pertenecer a varios grupos, si en cada uno supera el valor límite establecido de la variable discriminatoria. Por contra, puede que no pertenezca a ningún grupo o únicamente a uno. Esto es debido a que para cada clase se genera una variable discriminatoria independiente, por lo que la estrategia de este análisis se asemeja más a un análisis de modelado que a un discriminante. Para la determinación del número óptimo de términos de la regresión, el programa WinISI emplea validación cruzada. En este procedimiento, se realizan diferentes repeticiones o pases, escogiendo en cada uno un colectivo de calibración y otro de validación a partir del colectivo global considerado para la obtención del modelo discriminante. En cada iteración se realiza una ecuación con n términos, desde 1 hasta el máximo seleccionado. Finalmente el programa encuentra una ecuación tal que el Error Típico de Validación Cruzada (ETVC) sea mínimo. En los modelos obtenidos se ha seleccionado un número de pases de validación cruzada en función del número de individuos que constituye cada clase (según recomendación del programa). Asimismo, todos los modelos seleccionados fueron evaluados con un colectivo de validación externa independiente del colectivo inicial empleado para el desarrollo de los mismos. Los estadísticos empleados para el estudio de la bondad de los modelos fueron: E (Error de Clasificación). Porcentaje de muestras de un grupo determinado que son clasificadas en otro u otros grupos. Ē (Media del Error de Clasificación). Valor medio de los errores de clasificación de todos los grupos que constituyen el modelo. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 96  (Estadístico tau). Es una medida del error de clasificación, teniendo en cuenta el número de grupos. Se determina mediante la expresión:        g i ii g i iic npn npn 1 1 donde: cn = número de casos correctamente clasificados. ip = probabilidad a priori de pertenencia a un grupo. Total de casos correctamente clasificados si la distribución entre los grupos se hubiera hecho al azar. El valor máximo de tau es 1, que se alcanzaría cuando no hay errores de predicción. El resultado indica la proporción en que se reduce el error de clasificación cometido, frente al error que se cometería en una clasificación al azar. 2.3.2.4.4 Modelos de predicción de mezclas Para la consecución de este objetivo se desarrollaron modelos que permitieran diferenciar 5 grupos o clases: tres niveles de mezclas de cerdo Ibérico con cerdo blanco o estándar, embutidos elaborados exclusivamente con material procedente de cerdos ibéricos, y el mismo caso anterior, pero con cerdos blancos o estándar. De este modo, el material experimental empleado para este estudio se describió en el apartado 2.3.2.1.2. El tipo de algoritmo empleado, así como los criterios de evaluación de los modelos que se exponen en este apartado, han sido los mismos que para el desarrollo de todos los modelos predictivos expuestos en la presente Tesis Doctoral. Por lo tanto, en capítulos posteriores se hará alusión a este apartado, incluyendo en cada caso particularidades propias. Dicho algoritmo ha sido ecuaciones de regresión lineal múltiple por mínimos cuadrados parciales modificada (RMCPM), en donde los residuos obtenidos después del cálculo de cada término de la regresión son estandarizados dividiendo por el valor residual medio, antes de calcular el siguiente término de la regresión. En todas las ecuaciones se ha empleado Validación Cruzada [19], utilizando para el diseño de estos modelos predictivos 6 pases o grupos de validación cruzada.   g i iinp 1 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 97 Asimismo se empleó un Colectivo de Calibración constituido por N=80 muestras, y otro de Validación Externa de N=20 muestras. La elección de este grupo se hizo obteniendo 10 muestras al azar de cada periodo de elaboración (apartado 2.3.2.2.2). Los valores de referencia introducidos para la obtención de las calibraciones fueron los porcentajes de cerdo Ibérico perteneciente a cada tratamiento (A 100%, B 75%, C 50%, D 25%, E 0%). En este sentido, la magnitud en cuanto al error predictivo de estos modelos se espera elevada, ya que sus valores de referencia no han sido obtenidos mediante precisos métodos analíticos en laboratorio. Aún así, estas ecuaciones pueden desarrollar un potencial excelente para la diferenciación entre los 5 niveles expuestos (A, B, C, D, E). Esto se debe a que la estrategia empleada para el establecimiento de un límite o frontera que diferencie dichos niveles, fue el valor medio entre cada uno. Por lo tanto, una muestra pertenecería al tratamiento A, si su valor predicho se encuentra por encima de 87,5%; al B si este valor oscila entre 87,5%-62,5%, y así sucesivamente hasta llegar al tratamiento E, en el que el valor predicho debe ser inferior a 12,5%. De este modo es posible detectar ambos productos puros (100% Ibérico, 100% Blanco) y tres niveles de adulteración (denominados como bajo, medio y alto). La figura II-6 define gráficamente cada tratamiento, junto con los límites que diferencian a cada uno. -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 % Ibérico E 0% Ib 100% B A 100% Ib 0% B BL AN CO O ES TÁ ND AR AD UL TE RA CI ÓN NI VE L E LE VA DO AD UL TE RA CI ÓN NI VE L M ED IO AD UL TE RA CI ÓN NI VE L B AJ O IB ÉR IC O D 25% Ib 75% B C 50% Ib 50% B B 75% Ib 25% B Figura II-6. Tratamientos empleados para la obtención de modelos de predicción de mezclas de embutidos blancos/ibéricos y límites seleccionados para su diferenciación La evaluación de los modelos obtenidos se efectuó con los siguientes estadísticos: En Calibración y Validación Cruzada [142]: ETC (Error Típico de los residuales para el colectivo de Calibración) Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 98 ETVC (Error Típico de los residuales para el colectivo de Validación Cruzada)   1 ˆ 1 2      pN yy ETVCETC N i ii donde: N = número de muestras del colectivo de calibración. p = nº de factores de la regresión. iy = valor del constituyente a calibrar para la muestra i. iyˆ = valor predicho por la ecuación de calibración para la muestra i. Coeficientes de determinación de la Regresión. Porcentaje de la varianza de los datos de referencia que puede ser explicada por el modelo de la regresión (a partir de los datos espectrales). Se ha calculado tanto para el colectivo de calibración (R2), como el de validación cruzada (r2).           N i N i ii yyi yy SCtot SCres SCtot SCresSCtot SCtot SCregR 1 2 1 2 2 ˆ 11 donde: SCreg = Suma de cuadrados de la regresión SCtot = Suma de cuadrados total Validación Externa [143]: ETP (Error Típico de las diferencias entre los valores de referencia y los predichos NIRS) 1N )(D ETP N 1i 2 i    donde: iD = Diferencia entre el valor de laboratorio y el valor predicho NIRS, para la muestra i. N = Número de muestras del colectivo de Validación Externa. Coeficiente de determinación en Validación Externa (R2VE) Es importante destacar que en el proceso de desarrollo del modelo, el programa identifica anómalos químicos. Este tipo de anómalos son muestras cuyos valores de referencia son Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 99 significativamente distintos a los valores predichos NIRS. Esta detección se lleva a cabo mediante un test T de Student para los residuales, sabiendo que el resultado de dividir cualquier estadístico por su error estándar tiene una distribución T [142]. Así: T = ETCsidualRe = ETCyy ii ˆ Se consideran anómalos químicos las muestras que obtengan un valor T>2,5. 2.3.2.4.5 Pretratamientos matemáticos aplicados a la señal espectroscópica Es característico en los datos analíticos NIR encontrar pequeñas fluctuaciones debidas al afecto de radiación dispersa (Scatter), ruído de fondo y desviación de la línea base. Estas variaciones no deseadas pueden influir negativamente sobre el diseño de los posteriores modelos, aportando una fuente de error adicional. Por lo tanto, en todos los estudios incluidos en la presente Tesis Doctoral, se ha trabajado, además de con los espectros sin transformar, con diferentes pretratamientos matemáticos que permiten una optimización de los modelos, así como también con la exclusión de la región visible del espectro. Estos tratamientos consisten en la aplicación de derivadas y correcciones de radiación dispersa. Las derivadas se usan fundamentalmente con tres objetivos: acentuar pequeñas diferencias entre espectros, incrementar la resolución espectral aparente de bandas espectrales solapadas, y como técnica de corrección de absorciones irrelevantes relacionadas con ruido de fondo. Los tratamientos de derivación espectral aplicados serán indicados con una nomenclatura de 3 dígitos (a, b, c). Así, el primero (a) hace alusión al orden de la derivada (0 para el espectro sin derivar, 1 primera derivada, 2 segunda derivada, etc.). El segundo dígito (b) indica el segmento de derivación expresado en puntos de datos, y el tercero (c), representa la longitud del segmento usado en el suavizado de la señal. Para la corrección de la radiación dispersa se han empleado dos tratamientos, el SNV-DT (Standard Normal Variate y Detrending), y el MSC (Multiplicative Scatter Correction). Con el tratamiento SNV-DT en primer lugar se efectúa un centrado de cada espectro según la expresión siguiente (SNV): Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 100 i iij ijSNV XXX log loglog, ,   i=1,2, ... n donde: ijSNVX , = valor del espectro i corregido para la longitud de onda j iX log = media de los valores de absorbancia dentro del espectro i ilog = desviación típica de los mismos. A continuación, el tratamiento DT elimina la curvatura de la línea base, causada por interacciones variables, entre la humedad y efectos de partícula a lo largo de la región NIR. El proceso se lleva a cabo de forma individual para cada espectro, y consiste en una regresión polinómica de segundo orden en la que los valores espectrales forman la respuesta, y la variable independiente (W) viene determinada por los valores de las longitudes de onda según la expresión siguiente [140]: 2 log,ˆ jjij CWBWAX  Seguidamente, la línea base cuadrática (BASElog,i) en la expresión anterior, es calculada a partir de los valores estimados iX log,ˆ , por lo que el espectro corregido para la transformación DT se expresa mediante: ijijijDT XXX log,log,, ˆ El espectro transformado con DT tiene media cero y varianza distinta de cero. Con el tratamiento MSC, se realiza en primer lugar una regresión por mínimos cuadrados parciales entre cada espectro individual y el espectro medio del conjunto, y posteriormente se emplean los coeficientes de regresión para calcular el espectro corregido por MSC [141]. iiiii eXbaX  log,log, i ii iMSC b aXX )( log, ,  donde: ia = intersección con el eje de ordenadas para el espectro i ib = pendiente para el espectro i ie (error o residual) = atribuible a la información química del espectro de la muestra. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 101 Para la obtención de los modelos discriminantes se emplearon 30 combinaciones de pretratamientos, expuestos en la figura II-7. 1 #,#,# : orden de derivada, segmento de derivación, segmento de suavizado 2 SNVDT: Standard Normal Variate y De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction Derivada1 0,0,1 1,4,4 1,10,5 2,5,5 2,10,5 Corrección Rad. Dispersa2 Sin corrección SNV-DT MSC Id. Ecuación 1,2.....................30 Región espectral VIS-NIR NIR Figura II-7. Esquema representativo de los pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa aplicados en los modelos discriminantes Asimismo, la combinación de pretratamientos matemáticos aplicada a los modelos de predicción de mezclas se expone en la figura II-8. 1 #,#,# : orden de derivada, segmento de derivación, segmento de suavizado 2 SNVDT: Standard Normal Variate y De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction Derivada1 0,0,1 2,5,5 1,4,4 2,10,5 1,5,5 3,5,5 1,10,5 3,10,5 2,4,4 3,10,10 Corrección Rad. Dispersa2 Sin corrección SNV-DT MSC Id. Ecuación 1,2.....................30 Figura II-8. Esquema representativo de los pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa aplicados en los modelos de predicción de mezclas 2.3.3 Resultados y Discusión 2.3.3.1 Estudio de repetibilidad espectral En este apartado se muestran los cálculos obtenidos de los valores límite del estadístico RMS, en las ocho formas de presentación de muestras empleadas (apartado 2.3.2.3.2) y ambos productos (chorizo y salchichón). Con estos valores se pueden identificar, en la obtención de espectros de una muestra, cuáles son validos para ser incluidos en posteriores cálculos, o si por el contrario, deben ser repetidos por no presentar la calidad requerida evaluada mediante el RMSlimite. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 102 2.3.3.1.1 Chorizo Cada forma de presentación estaba compuesta por N=75 muestras, y de cada muestra se obtuvieron 5 espectros, por lo que inicialmente se partía de 375 espectros/forma de presentación. Como paso previo a la determinación de los valores RMSlimite, la figura II-9 representa el porcentaje de espectros que se tendrían que eliminar a medida que se incrementa el valor del estadístico RMS en las ocho formas de presentación de muestras. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 >10 >15 >20 >25 >30 >35 >40 >45 >50 >55 >60 >65 >70 RMS x 103 % es pe ctr os el im in ad os FPS FHS CLS CHS FPI FHI CLI CHI Figura II-9. Evolución de espectros eliminados a medida que se incrementa el valor del estadístico RMS Se observa como se diferencia la repetibilidad espectral, cuando se obtienen espectros según los dos modos de análisis empleados con el espectrofotómetro (modo de visión inferior, I, y superior, S) para un mismo tipo de muestras. Esta diferencia se acentúa con las muestras curadas y loncheadas, siendo las analizadas en el modo de visión superior (CLS) las que destacan por obtener el menor nivel de repetibilidad espectral. Esto se debe a la particularidad de esta forma de presentación de muestras, es decir, con esta forma de presentación no se obtienen los espectros directamente sobre el producto, ya que las muestras se encontraban envasadas al vacío, incluyendo por lo tanto fuentes de variación adicionales. Posteriormente, se obtuvieron los valores límite para cada forma de presentación de muestras (tabla II-3), llevando a cabo el proceso de eliminación espectral para todos los valores superiores a los límites considerados. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 103 Estos valores no se aplicaron de forma estricta, dado que la determinación del estadístico RMSlimite se efectúa para obtener una aproximación del dato espectral, no para la obtención de un valor matemático exacto. Así, con el objetivo de homogeneizar en la medida de lo posible los datos, se aplicaron los valores expuestos en la tabla II-3 (RMSlimite Aplicado). Tabla II-3. Valores límite obtenidos para el estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados en cada forma de presentación de muestras con el producto chorizo RMSlímite CHI CHS CLI CLS FHI FHS FPI FPS Teórico 10860 23880 24107 77992 13421 18217 23599 26995 Aplicado 12500 25000 25000 75000 12500 20000 25000 25000 % espectros eliminados 17,6 17,3 19,2 23,2 22,4 20 19,5 32 Finalmente, se median todos los espectros que queden en cada muestra, para tener un espectro representativo de cada una. 2.3.3.1.2 Salchichón En este caso, cada forma de presentación estaba compuesta por N=100 muestras, y de cada muestra se obtuvieron 5 espectros, por lo que inicialmente se partía de 500 espectros/forma de presentación. Los valores RMSlimite que con este producto se obtuvieron, junto con el porcentaje de espectros que fueron eliminados, se exponen en la tabla II-4. Tabla II-4. Valores límite obtenidos para el estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados en cada forma de presentación de muestras con el producto salchichón RMSlímite CHI CHS CLI CLS FHI FHS FPI FPS Teórico 15411 28414 38859 95833 10573 26442 19780 25545 Aplicado 15000 30000 30000 80000 10500 26500 20000 25500 % espectros eliminados 19 20,4 23,2 25 22,2 23,5 21,4 21,6 A pesar de que se aprecian notables diferencias entre los valores límite obtenidos entre ambos productos para un mismo tipo de formas de presentación, el porcentaje de espectros eliminados sí alcanza cierto grado de similitud, indicando por lo tanto que la metodología desarrollada para el cálculo de estos valores ha sido adecuada, y que los límites calculados para Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 104 un producto no deben ser aplicados para el otro. Al igual que con el producto chorizo, se realizó una aproximación de los valores, como muestra la tabla II-4. De todos, el que más se distancia de su homónimo es la forma de presentación CLS (95833 vs. 80000), debido a que en el proceso para la determinación del límite teórico se incluían espectros con unos valores RMS muy superiores a la media para esta forma de presentación, que se consideraron excepcionalmente elevados. Posiblemente la causa de dichos valores radique en errores procedentes del proceso de lectura espectral, como por ejemplo incorrecta disposición de la muestra o retirada de la misma antes de la finalización del proceso de lectura. 2.3.3.2 Caracterización espectral 2.3.3.2.1 Chorizo En primer lugar, se mediaron todos los espectros correspondientes a cada tratamiento para cada forma de presentación de muestras (figura II-10). Como se puede apreciar, mediante la observación visual no es posible diferenciar con claridad entre los 5 tratamientos. En cualquier caso, las máximas diferencias en cuanto a valores de absorbancias no se han encontrado entre los tratamientos extremos (a y e) a lo largo del recorrido espectral. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 105 Figura II-10. Espectros medios por tratamiento y forma de presentación de muestras en chorizo Trat A Trat B Trat C Trat D Trat E CHS 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) CHI 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g( 1/R ) CLI 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) CLS 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) FHI 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) FHS 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) FPI 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) FPS 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) lo g (1 /R ) Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 106 La figura II-11 contrasta el espectro medio de cada forma de presentación de muestras. En esta figura, destacan las diferencias que se observan entre los espectros obtenidos por las dos configuraciones empleadas del equipo: modos de visión superior (S) e inferior (I). Esta apreciación es notoria para las formas presentación curadas, tanto, que si se comparan los espectros curados dos a dos, por un lado estarían CLI y CHI, y por otro CLS y CHS, por lo que la diferencia entre estos espectros está más marcada por el modo de análisis en el equipo (Superior e Inferior), que por la presentación del producto (curado o loncheado). En cambio, en los espectros frescos se observa el mismo patrón espectral para FHI y FHS, y para FPI y FPS. Por lo tanto, en las muestras frescas, las diferencias espectrales se han acentuado más por la presentación del producto (picado, homogeneizado), que por los modos de análisis. Esta particularidad tiene sentido si se tiene en cuenta que el modo de visión superior es recomendado para analizar producto homogéneo, y las muestras frescas (picadas y homogeneizadas) presentan mayor grado de homogeneidad que las curadas. 0,15 0,35 0,55 0,75 0,95 1,15 1,35 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) log (1 /R ) CHI CHS CLI CLS FHI FHS FPI FPS 550 930 975 1210 1455 Figura II-11. Espectro medio de cada forma de presentación de muestras en chorizo Aunque todos los espectros siguen patrones similares, se observan algunas diferencias, principalmente alrededor de las bandas de absorción marcadas en la figura II-11. La mayoría de estas diferencias se deben, junto con las razones expuestas en el comentario anterior, a las modificaciones físicas y químicas que ocurren durante el proceso de curación en los embutidos. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 107 Las tres últimas bandas indicadas (975 nm, 1210 nm ,1455 nm) son prácticamente comunes a todas las formas de presentación. La banda que se encuentra en torno a los 975 nm, está relacionada con el segundo sobretono del enlace O-H, por lo tanto, con la humedad de las muestras. Cerca de los 1210 nm, se relaciona con absorciones de compuestos lipídicos, ya que se encuentra el segundo sobretono del enlace C-H. El primer sobretono del enlace O-H, con lo cual también relacionado con el contenido en humedad, se localiza en torno a los 1455 nm. Otros autores [144], analizando carne de pollo con el mismo espectrofotómetro han observado las mismas bandan de absorción. Además de las bandas comentadas, se han encontrado variaciones entre 515-700 nm. Estas absorciones están principalmente relacionadas con la mioglobina, proteína responsable del color del músculo, la cual, dependiendo de su estado de oxidación, deriva a diferentes pigmentos (oximioglobina, metmioglobina, y dexoximioglobina) [145]. Durante el proceso de maduración de los embutidos, se produce un enrojecimiento de la masa causado principalmente por reacciones redox de la mioglobina [146]. Del mismo modo, una pequeña banda de absorción se encuentra en torno a 930 nm, exclusivamente en las formas de presentación procedentes de producto curado. Esta longitud de onda está relacionada con compuestos lipídicos, por lo que estas diferencias podrían deberse a reacciones de oxidación de compuestos lipídicos producidas durante el proceso de maduración. La figura II-12 muestra los espectros medios de cada forma de presentación de muestras bajo un tratamiento de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT. Con la aplicación del tratamiento, se aprecia la corrección que se ha producido en cuanto a la desviación vertical de la línea base, suavizando además el efecto de radiación dispersa producido por diversos factores tales como diferencias en el tamaño de partícula, contenido de humedad, diferencias en la intensidad de empaquetado de la muestra, etc., y reduciendo asimismo el solape de picos de absorción. Por lo tanto, se observa una mayor resolución espectral, así como también la práctica eliminación del efecto producido en las diferentes formas de presentación debido a variaciones en cuanto a la homogeneidad, como se comentó anteriormente. Este tipo de tratamientos han sido muy comunes en estudios sobre productos cárnicos [77, 134, 145, 147]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 108 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) 2ª D er iva da + SN V- DT CHI CHS CLI CLS FHI FHS FPI FPS Figura II-12. Espectro medio de cada forma de presentación de muestras con tratamiento espectral de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT en chorizo 2.3.3.2.2 Salchichón La figura II-13 muestra el espectro medio de cada forma de presentación de muestras para este tipo de producto. 0,15 0,35 0,55 0,75 0,95 1,15 1,35 515 665 815 965 1115 1265 1415 1565 Longitud de onda (nm) log (1 /R ) CHI CHS CLI CLS FHI FHS FPI FPS 550-585 965-1020 1195-1230 1450 Figura II-13. Espectro medio de cada forma de presentación de muestras en salchichón Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 109 Como se puede observar, los espectros siguen comportamientos muy similares al producto chorizo, destacando en este caso, en mayor medida, la forma de presentación de muestras (CLS), la cual su espectro se encuentra diferenciado del resto desde 700 nm hasta 1400 nm aproximadamente. Esto es debido a la particularidad de esta forma de presentación, ya que era la única que analizaba el producto en bolsas, envasado al vacío, como se ha comentado. Mediante un estudio visual, se detectaron fundamentalmente 4 bandas de absorción importantes, similares de nuevo al producto chorizo [133, 134]. En la región visible del espectro destaca una banda entre 550-585 nm. Como se ha explicado, dentro de este rango, absorben radiación pigmentos del músculo [95, 148]. Por lo tanto, esta banda puede ser explicada por la región azul del espectro debido a proteínas hemo, oximioglobina y mioglobina [145, 149]. A continuación se localiza una banda de absorción en el área de transición del visible al infrarrojo cercano (965-1020 nm). Esta banda se debe probablemente al contenido en humedad [150], ya que está relacionada con el tercer sobretodo del enlace O-H [148]. Como se puede apreciar en la figura, estas bandas son más pronunciadas en las formas de presentación del producto fresco, con mayor contenido en humedad. De nuevo es necesario destacar la banda de absorción de baja intensidad característica de las formas de presentación de productos curados, entre 920-945 nm [133]. Esta banda se relaciona con el enlace CH2, característico de la grasa. Esta característica no se presentó en la masa antes de embutir (producto fresco) debido, por un lado a reacciones exclusivas del proceso de maduración, y por otro a que el contenido relativo en grasa es considerablemente inferior que en producto curado (20% en masa fresca frente a 32% en producto curado). En la región NIR, se observa una banda de absorción (1195-1230 nm) con un pico a 1215 nm. En longitudes de onda próximas a 1200 nm, los enlaces C-H, los cuales son constituyentes fundamentales de las moléculas de ácidos grasos, absorben fuertemente radiación [151]. Concretamente, el pico localizado en 1215 nm se ha relacionado por otros autores [152] con el enlace CH2. Asimismo, los mismos autores relacionaron las absorbancias a 1195 nm y 1225 nm con los enlaces CH3 y CH2 respectivamente. Por lo tanto, en torno a 1200 nm se encuentra información importante relativa al contenido graso. Por último, otra banda de absorción a destacar Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 110 se encontró en torno a 1450 nm. Esta banda se ha relacionado con diversas bandas de combinación del enlace CH (CH2 a 1440 nm y estructuras aromáticas a 1446 nm), con el primer sobretodo del enlace OH, con el tercer sobretodo del enlace C=O (1450 nm), y con el primer sobretodo del enlace NH (urea a 1460 nm y CONH2 a 1463) [152]. En productos cárnicos, esta banda se ha relacionado principalmente con el contenido en humedad (enlace OH) [87, 100, 117, 146, 148]. 2.3.3.3 Análisis discriminante 2.3.3.3.1 Chorizo Para la realización de los siguientes modelos se emplearon 5 pases o grupos de validación cruzada, y, en todos los modelos seleccionados, se empleó la región VIS+NIR del espectro, ya que ofreció mejor comportamiento que cuando se excluía la región VIS. La tabla II-5 expone los resultados de los modelos seleccionados en cada forma de presentación de muestras. Mediante la observación de esta tabla, es patente como los mejores resultados se han obtenido con producto homogeneizado. Así, el mejor modelo de clasificación (τ = 83,3%; Ē = 13,3%) se logró con producto curado, homogeneizado y analizado en el modo de visión inferior del equipo (CHI). Este menor error frente a la forma de presentación FHI se debe probablemente al mayor porcentaje de humedad que presenta esta forma de presentación, pudiendo enmascarar el agua características diferenciadoras entre tratamientos. Por otro lado, los peores resultados (τ = 52,78%; Ē = 38,9%) se alcanzaron con la forma de presentación de muestras que, como ya se ha comentado, posee más factores de variación, es decir, producto curado, loncheado, envasado al vacío, y analizado en el modo de visión superior (CLS). Es importante destacar la aplicación de pretratamientos matemáticos sobre la señal para la optimización de los resultados, ya que, como se puede apreciar en todos los modelos seleccionados se la ha aplicado algún tratamiento de derivada junto con corrección de radiación dispersa, dominando la segunda derivada con el tratamiento SNV-DT. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 111 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 112 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 113 En el Anexo 2 se exponen los resultados individuales para cada muestra de la variable discriminatoria de los modelos expuestos en la tabla II-5, que han permitido la obtención de los diferentes estadísticos evaluadores de los modelos. Como pauta general, todos los modelos han definido mejor los lotes extremos, (A y E), a excepción de la forma de presentación CLS, que ha alcanzado los menores niveles de confusión con los tratamientos D y E. Los resultados obtenidos han sido bastante positivos, sobre todo si se tiene en cuenta que en todos los modelos la mayoría de las muestras que no se han clasificado correctamente se encuentran en grupos contiguos al suyo. Además, en el proceso de elaboración de los diferentes tratamientos, es posible que el mezclado no fuese suficientemente homogéneo (carne de ibérico y de blanco) por el tipo de pieza magra utilizada, por lo que en la población muestral pueden darse solapes reales entre tratamientos, que justifican parte del error de clasificación cometido. Finalmente, se debe añadir la gran heterogeneidad y complejidad que presentan estos tipos de productos. 2.3.3.3.2 Chorizo y salchichón Se incluyeron muestras de salchichón, con el objetivo de estudiar el comportamiento que tendrían los mismos modelos discriminantes obtenidos en el apartado anterior, para obtener diferenciaciones de calidades de embutidos en general, incluyendo en éstos los productos chorizo y salchichón. De este modo, se empleó un colectivo de muestras de salchichón que siguió la misma estrategia de elaboración del producto chorizo (2.3.2.1.1) (N=75), pero con los ingredientes propios de este producto. Por lo tanto, en este caso se dispone de un colectivo para el desarrollo de los modelos de 150 muestras (75 de cada producto). Estas muestras de salchichón pertenecían a una fase inicial de desarrollo del proyecto en el que se enmarca el presente estudio (Utilización de la Tecnología NIRS como método rápido para la certificación de embutidos tradicionales elaborados con cerdo ibérico, CAL00-001). En primer lugar, se obtuvieron modelos discriminantes empleando todos los tratamientos, y producto CHI, que fue el que obtuvo los mejores resultados con el producto chorizo. Se emplearon 4 grupos de validación cruzada, resultando la clasificación que se expone en la tabla II- 6. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 114 Tabla II-6. Modelos seleccionados mediante Análisis Discriminante para clasificar embutidos (chorizo y salchichón) en producto curado, homogeneizado y analizado en el modo de visión inferior Pretr. Señal Matriz de Clasificación Deriv. Corrección “Scatter” N Factores PLS A B C D E Estadístico  Error Clasif. (E) (%) Ē (%) 1, 4, 4 SNV-DT 150 26 A B C D E 24 4 2 0 0 6 23 1 0 0 1 3 23 2 1 0 1 6 21 2 0 0 0 3 27 73 20 23 23 30 10 21,2 Como cabría esperar, los resultados disminuyeron sensiblemente en comparación con los obtenidos con los modelos para chorizo (τ = 83,3% vs. τ = 73; Ē = 13,3 vs. Ē = 21,2), aunque la matriz de clasificación reconoce en todos los tratamientos el mayor número de muestras en su grupo, obteniendo un rango de error de clasificación comprendido entre 20-30%. De nuevo, casi todas las muestras mal clasificadas se incluyen en clases contiguas a las originales, clasificándose tan solo 5 muestras de las 150 en grupos más lejanos. Por lo que en principio parece viable la obtención de modelos que clasifiquen calidades de embutidos en conjunto, para chorizo y salchichón, aunque a costa de una pérdida de precisión en los mismos. Continuando en la misma línea, pero desde un punto de vista de aplicación práctica de la tecnología a este tipo de productos, se continuó desarrollando modelos que permitieran clasificar embutidos en conjunto, pero, observando que con la forma de presentación que obtiene el menor error, éste ascendió hasta el 21,2%, se creó oportuno simplificar la estrategia de clasificación a tratamientos que diferenciaran blanco de ibérico (tratamientos E y A). Además, se trabajó validando en este caso los modelos obtenidos externamente. Para ello se empleó un amplio colectivo (270 muestras, 135 blancas y 135 ibéricas), para intentar simular una situación en la industria real. Los espectros de estas muestras procedían de un proyecto de investigación previo, en colaboración con el IFAPA-Centro de Palma del Río. Así, el colectivo de validación externa era totalmente ajeno al empleado para el desarrollo de los modelos. Del mismo modo, se empleó como forma de presentación producto intacto (CLI, curado, loncheado y analizado en el modo de visión inferior). En el desarrollo de estos modelos, en todos los casos, el error de clasificación fue del 0% (perfecta discriminación entre ibérico y blanco), obteniendo asimismo un error de validación externa próximo al 0%. La tabla II-7 expone los mejores resultados obtenidos, tanto en fase de calibración, como en validación externa. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 115 Tabla II-7. Modelos seleccionados mediante Análisis Discriminante para clasificar embutidos (chorizo y salchichón) blancos e ibéricos en producto curado, loncheado y analizado en modo de visión inferior, con colectivo de validación externa Pretr. Señal Validación Externa Clasificación Deriv. Corrección “Scatter” N Factores PLS Ē (%) N A E Ē (%) 1,4,4 SNV-DT 60 9 0 270 134 136 0,4 2,5,5 SNV-DT 60 8 0 270 139 131 1,48 2,10,5 SNV-DT 60 9 0 270 141 129 2,22 Estos resultados pueden indicar el comienzo para el desarrollo de una aplicación práctica real en la industria cárnica para el control de calidad de embutidos, autentificando productos ibéricos y permitiendo la detección de posibles fraudes. Un mayor grado de comprensión se puede obtener mediante la figura II-14, en la que se representan los resultados obtenidos en la validación externa con el mejor modelo. CALIDAD: Cerdo Blanco CALIDAD: Cerdo Ibérico Fraude ¿? Fraude ¿? Figura II-14. Distribución de calidades en validación de embutidos (chorizo, salchichón) con modelos desarrollados para diferenciar blanco e ibérico en producto curado, loncheado y analizado en modo de visión inferior Como se observa, cada muestra se representa en función de los valores que posea su variable discriminatoria. De este modo, el eje de abscisas se corresponde con los valores que Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 116 alcanza una determinada muestra en el colectivo A (Ibérico), y el eje de ordenadas con los del colectivo E (Blanco). En esta representación, se aprecia como el criterio de discriminación empleado con este tipo de Análisis Discriminante (Ecuaciones de Regresión Múltiple mediante factores PLS), esto es, cuando se supere el valor de 1,5 de la variable discriminatoria en un grupo se considera correctamente clasificada, es bastante correcto, ya que, si se observan los delimitadores que establece el programa en cada caso (ejes de líneas continuas), se encuentran en torno a 1,5. La muestra que está más próxima al colectivo de cerdos blancos (círculo rojo), es la que se corresponde con el error de clasificación en validación externa, pero, como se puede observar, está próxima a su clase original, es decir, al grupo formado por cerdos blancos. De este modo, se puede apreciar que si un embutido al ser validado por el modelo se enclava en el cuadrante superior izquierdo, se le atribuiría calidad de cerdo blanco. Si por el contrario, se ubica en el cuadrante inferior derecho, sería ibérico. De otro modo, si se encuentra en los otros cuadrantes, y se afirmara que se trata de un producto ibérico, habría que plantearse la posibilidad de adulteración de la misma (estudiando el valor individual de su variable discriminatoria). 2.3.3.4 Modelos de predicción de mezclas Una vez efectuado el filtrado espectral para este tipo de producto, y mediados los espectros, se procedió al desarrollo de un Análisis de Componentes Principales, como paso previo a la obtención de los modelos predictivos, siguiendo la estrategia expuesta en el apartado 2.3.2.4.5. 2.3.3.4.1 Análisis de Componentes Principales La figura II-15 representa los valores (scores) obtenidos para las dos primeras Componentes Principales, en cada muestra y forma de presentación, además de la varianza explicada por cada una de ellas. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 117 Figura II-15. Representación del Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2) en cada forma de presentación de muestras CHI -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,5 1 1,5 2 CP1 (48.6%) CP 2 ( 29 .3% ) CHS -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0 0,5 1 1,5 2 CP1 (55.8%) CP 2 ( 29 .8% ) CLI -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 CP1 (60.4%) CP 2 ( 27 .9% ) CLS -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 CP1 (47.9%) CP 2 ( 37 .1% ) FHI 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 2,1 -1,3 -0,8 -0,3 0,2 CP1 (59.9%) CP 2 ( 23 .9% ) FHS -1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 CP1 (66.1%) CP 2 ( 22 .6% ) FPI -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 CP1 (59.3%) CP 2 ( 33 .7% ) FPS -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 CP1 (51.1%) CP 2 ( 39 .3% ) Trat A Trat B Trat C Trat D Trat E Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 118 Mediante este análisis se observa como se produce una agrupación por tratamientos con cierto nivel de solapamiento entre los grupos más cercanos. Asimismo, es de destacar el comportamiento observado por el tratamiento E en las formas de presentación curadas (CLI, CLS, CHI, CHS), el cual se encuentra con mayor grado de dispersión, destacando tres muestras que se incluyen en el tratamiento opuesto, es decir, el representado por las muestras 100% ibéricas (A). Estas muestras pertenecen al primer periodo o fase de elaboración de este producto, y la particularidad que presentan posiblemente se deba a que su composición en cuanto a constituyentes mayoritarios (grasa, humedad y proteína) es diferente con respecto a la media de su grupo, ya que poseen los valores más elevados en grasa, y los inferiores en proteína y humedad. La tabla siguiente (tabla II-8) expone los valores medios de este tratamiento (E), comparados con los individuales de las muestras comentadas. Tabla II-8. Valores medios de Grasa, Humedad y Proteína del tratamiento E comparados con muestras características del mismo tratamiento Muestra Grasa (%) Humedad (%) Proteína (%) E11 41,1 30,9 23,6 E16 40,8 30,8 22 E18 42,6 31,1 21 Emedio 20,3 39,1 33,21 Los anómalos espectrales obtenidos (H>3, apartado 2.3.2.4.2), junto con las Componentes Principales seleccionadas y la varianza explicada en cada forma de presentación de muestras, se muestra en la tabla II-9. Tabla II-9. Anómalos espectrales (H>3), Componentes Principales (CPs) seleccionadas y Varianza Explicada (VE) de cada forma de presentación de muestras FHI FHS FPI FPS CHI CHS CLI CLS Anómalos - - - 1 2 2 3 1 CPs 10 12 8 8 10 10 9 9 VE (%) 99,6 98,9 99,6 99,5 99,7 99,7 99,6 99,4 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 119 Como se observó en la figura II-15, la mayor heterogeneidad presentada por las muestras curadas frente a aquellas procedentes de masa fresca, se plasma en esta tabla mediante el mayor número de anómalos con las formas de presentación curadas. Estas muestras fueron excluidas del colectivo de calibración para el desarrollo de los modelos. Existen trabajos NIRS en cárnicos a través de los cuales obtuvieron interesantes resultados mediante la aplicación de Análisis de Componentes Principales. Así, en 1992 [153] obtuvieron relaciones entre diferentes parámetros que definen la calidad de la carne de cerdo (pH, color, proteína y contenido en pigmentos). Al igual que en la presente Tesis, los autores de aquel trabajo encontraron diversas pautas de comportamiento, anómalos espectrales, y clases que diferenciaban calidades. Otros autores, en 1996 [154], produjeron embutidos con 7 mezclas distintas de harina de leche desnatada, harina de leche con elevado contenido en sodio, caseinato sódico y suero proteico. El ACP redujo el número de atributos de análisis sensorial a 5. Recientemente, en 2005 [155], prediciendo la textura y color de jamón curado mediante VIS-NIR, aplicaron ACP y obtuvieron resultados muy similares a los obtenidos en el presente estudio, ya que, con 117 muestras, se seleccionaron 8 CPs, explicando el 99,3% de la variación y distinguiendo a su vez 2 grupos, esto es, muestras con o sin apariencia pastosa. 2.3.3.4.2 Ecuaciones de predicción En el procedimiento de cálculo, como se ha comentado, con el colectivo de calibración se empleó validación cruzada, utilizando 6 pases o grupos de validación. En todas las ecuaciones se seleccionó un máximo de 8 términos o factores PLS, pero, cuando un determinado modelo seleccionaba todos los factores, se recalculaba de nuevo el mismo incrementando en dos unidades los 8 seleccionados inicialmente. Esta metodología se llevó a cabo para evitar el fenómeno de sobreajuste (overfitting) en los modelos. La tabla II-10 sintetiza todos los modelos que han sido seleccionados en cada forma de presentación de muestras, con los estadísticos empleados para su evaluación, así como el tratamiento matemático aplicado en cada caso sobre los espectros. Según los resultados obtenidos, los mejores modelos se obtuvieron con las muestras curadas y homogeneizadas (CHI, CHS), alcanzando, por el contrario, los mayores errores el producto intacto, tanto en fresco (FPSETVC = 5,28) como en curado (CLSETVC = 5,99), ambos analizados en el modo de análisis superior. Como se ha comentado en otras ocasiones, en la Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 120 forma de presentación CLS, se encuentran las muestras particularmente diferentes al resto, ya que se presentan al equipo envasadas al vacío. Este factor es el que pudo causar un incremento en los errores predictivos. Cuando estos modelos se evaluaron mediante las predicciones efectuadas con el colectivo de validación externa, se obtuvieron los resultados que muestra la tabla II-11. Tabla II-10. Modelos seleccionados para predicción de mezclas en salchichón para cada forma de presentación de muestras Formas de Presentación Pretratamientos Matemáticos Factores PLS N ETC (%) R 2 ETVC (%) r 2 FHI 2,5,5 SNV-DT 11 71 1,66 1 2,48 1 FHS 1,4,4 MSC 12 79 2,56 1 4,1 0,98 FPI 2,10,5 MSC 9 78 3,26 0,99 4,31 0,99 FPS 3,5,5 MSC 6 78 4,05 0,99 5,28 0,98 CHI 2,10,5 SNV-DT 10 67 1,54 1 1,96 1 CHS 0,0,1 12 67 1,6 1 2,28 1 CLI 2,4,4 MSC 9 69 1,9 1 2,84 0,99 CLS 3,10,10 SNV-DT 6 71 4,77 0,98 5,99 0,97 Tabla II-11. Validación Externa de los modelos seleccionados para predicción de mezclas en salchichón para cada forma de presentación de muestras ETP R2VE Error de Clasificación (%) FPI 4,8 0,98 0 FPS 5,34 0,98 0 FHI 3,09 0,99 0 FHS 4,32 0,99 0 CLI 5,36 0,98 5 CLS 5,79 0,97 0 CHI 2,89 0,99 0 CHS 2,78 0,98 0 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 121 Los errores de predicción obtenidos con los colectivos de validación externa siguen la misma pauta de comportamiento que los obtenidos en fase de calibración, exceptuando la forma de presentación CLI, que en este caso es la única que clasifica erróneamente el 5% de las muestras del colectivo de validación externa. Por lo tanto, se han obtenido resultados muy positivos, ya que si se aplica el sistema de clasificación de muestras expuesto (figura II-6, apartado 2.3.2.4.4), ninguna muestra se obtendría como mal clasificada, a excepción del error comentado en la forma de presentación CLI. En un trabajo efectuado en el año 2000 [97], se obtuvo un porcentaje de muestras correctamente clasificadas del 96% en la aplicación de espectros NIRS junto con redes neuronales para predecir la presencia del gen RN- en cerdos, el cual es responsable del incremento del contenido de glicógeno en músculo. Trabajando también con carne de cerdo (músculo Longissimus dorsi), otros autores [96] categorizaron al 100% la capacidad de retención de agua, diferenciando pérdidas por goteo <5% o >7%. Como se puede observar, la precisión en las clasificaciones (muestras correctamente clasificadas) en carne de cerdo en estos estudios fue similar al 95%. Otro trabajo [156], empleó diversos tipos de carne (vacuno, cordero y mezclas de ambos), analizando en el visible (VIS), infrarrojo cercano (NIR) e infrarrojo medio (MIR). En este artículo se obtuvieron predicciones del porcentaje de cordero con el mismo algoritmo utilizado en la presente Tesis Doctoral (regresiones MCPM). La mayoría de los modelos que seleccionaron fueron obtenidos con infrarrojo medio combinado con segunda derivada. El ETP = 4,1% (rango en cordero 0-100%), inferior al obtenido con las formas de presentación de muestras FPI, FPS, FHS, CLI y CLS, y superior al de FHI, CHI y CHS (tabla II-11). Como se ha expuesto, el porcentaje de precisión de los modelos obtenidos en el presente documento es similar al de otros trabajos, a pesar de que en este se ha trabajado con producto transformado y terminado (embutidos curados), y un número considerable de grupos de clasificación (A, B, C, D y E). La figura II-16 representa gráficamente el resultado individual obtenido con el colectivo de validación externa, en cada una de las formas de presentación, permitiendo observar su distribución, teniendo en cuenta que, de las 20 muestras que conforman dicho colectivo, se distribuyen originariamente cuatro muestras en cada uno de los tratamientos (A, B, C, D y E). Se aprecia la muestra mal clasificada perteneciente a la forma de presentación CLI, asignada a un grupo diferente, es decir, una muestra del tratamiento E ha sido clasificada en su grupo contiguo (D). Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 122 CHS -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (%Ib.) Va lo re s d e R ef . ( % Ib .) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) CHI -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (%Ib.) Va lo re s d e R ef . (% Ib .) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) CLI -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (%Ib.) Va lo re s d e R ef . (% Ib .) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) CLS -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (%Ib.) Va lo re s d e R ef . (% Ib .) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) FHI -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (Ib.%) Va lor es de R ef . ( % Ib .) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) FHS -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (Ib.%) Va lo re s d e R ef . ( % Ib. ) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) FPI -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (%Ib.) Va lo re s d e R ef . ( % Ib. ) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) FPS -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 -12,5 12,5 37,5 62,5 87,5 112,5 NIRS (%Ib.) Va lo re s d e R ef . ( %I b. ) E 0%Ib D 25%Ib C 50%Ib B 75%Ib A 100%Ib) Va lo re s d e R ef . ( % Ib .) Va lo re s d e R ef . (% Ib .) Va lo re s d e R ef . (% Ib .) Va lo re s d e R ef . (% Ib .) Va lor es de R ef . ( % Ib .) Va lo re s d e R ef . ( % Ib. ) Va lo re s d e R ef . ( % Ib. ) Va lo re s d e R ef . ( %I b. ) Figura II-16. Clasificaciones obtenidas con los colectivos de validación externa aplicando los modelos seleccionados para predicción de mezclas en salchichón en cada forma de presentación de muestras Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 123 2.4 Caracterización de embutidos mediante predicciones de constituyentes mayoritarios (Grasa, Humedad, Proteína) Tras la finalización del trabajo de investigación que constituyó el presente apartado, se redactaron dos artículos, uno en la revista Food Chemistry, titulado ‘Proximate análisis of homogenised and minced pork sausages by NIRS’, y otro en Meat Science, con el título ‘Quantitative analysis of pork dry-cured sausages to quality control by NIR spectroscopy’. El contenido de ambos compone el Anexo 3. 2.4.1 Antecedentes El sector cárnico juega un papel importante en la industria agroalimentaria, contribuyendo al sistema económico aportando gran cantidad de valor añadido. En España, el sector porcino supone el 32,9% de la Producción Final Ganadera, y el 12,4% de la Producción Final Agraria [157]. Por otro lado, España es el segundo productor de carne de cerdo en la Unión Europea, tras Alemania, contribuyendo con el 14,9% de la producción total, y el 3,2% a nivel mundial [157]. Un tipo de productos muy importantes obtenidos a partir de la carne de cerdo, son sus embutidos curados, ampliamente consumidos en España, siendo particularmente importante la producción de salchichón. En la normativa española [158], se encuentran todos los embutidos crudos-curados perfectamente normalizados y tipificados, donde se recogen las características que deben reunir los productos (en cuanto a composición y calidad, características organolépticas, etc.), así como su clasificación por categorías y las normas de etiquetado. En este sentido, esta normativa clasifica a los embutidos curados según su contenido en grasa, humedad y proteína. El contenido en grasa y proteína depende de la materia prima empleada, que no es homogénea, al tratarse de recortes obtenidos en el despiece de las canales. El contenido en humedad, inversamente relacionado con el contenido graso, dependerá de la humedad inicial, y del tiempo y condiciones de curación del producto. Por lo tanto, es un parámetro que interesa controlar en las fases de elaboración. Por ello, es importante que la industria pueda examinar de un modo eficiente los niveles de estos constituyentes, por un lado, en masa fresca antes de embutir, ajustándose a los niveles exigidos por legislación, y a su norma de calidad interna. Por otro, sobre producto terminado, donde no es frecuente la inclusión de información cuantitativa en la etiqueta del producto, por lo que en este caso el consumidor no tiene posibilidad de diferenciar entre productos con diferente composición nutricional básica. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 124 Si además de la situación expuesta, se parte de la problemática comentada en el apartado 2.3.1, en el presente apartado lo que se pretende es obtener una herramienta complementaria a los modelos ya obtenidos para autentificación de embutidos, es decir, desarrollar modelos que caractericen el producto mediante determinaciones de sus compuestos mayoritarios (grasa, humedad y proteína). Del mismo modo, se intenta que esta caracterización se pueda efectuar sobre dos puntos básicos del proceso de elaboración, esto es, masa fresca picada y producto curado. 2.4.2 Material y Métodos 2.4.2.1 Materia prima y diseño experimental Tanto la materia prima empleada, como el diseño experimental planteado, han sido descritos en los apartados 2.3.2.1.2 y 2.3.2.2.2, respectivamente. 2.4.2.2 Análisis NIRS Del mismo modo este procedimiento fue descrito en el apartado 2.3.2.3 (características del espectrofotómetro y formas de presentación de muestras). 2.4.2.3 Análisis químico La fase de obtención de información espectral finalizó con las muestras homogeneizadas (FH, CH) (figura II-4). Posteriormente, se obtuvo una cantidad representativa de cada muestra (50 g), para ser transportadas al Laboratorio Agroalimentario de Córdoba, perteneciente a la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía, donde se llevaron a cabo las determinaciones de los parámetros nutricionales grasa, humedad y proteína. La metodología de análisis empleada fue la oficial para productos cárnicos [159], según las normas ISO-1443, ISO-R-1442 e ISO R-937 [160- 162], para grasa, humedad y proteína respectivamente. 2.4.2.4 Análisis de datos El software empleado fue el descrito en el apartado en el apartado 2.3.2.4. 2.4.2.4.1 Filtrado espectral Procedimiento descrito en al apartado 2.3.2.4.1. 2.4.2.4.2 Análisis de Componentes Principales Procedimiento descrito en al apartado 2.3.2.4.2. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 125 2.4.2.4.3 Modelos predictivos: calibración y validación De la misma forma que se abordaron las ecuaciones de predicción de mezclas, para la obtención de este tipo de modelos también se dividió el colectivo inicial de cada forma de presentación (N = 100) en dos grupos. El primero estaba constituido por 80 muestras (colectivo de calibración) empleado para el diseño de los modelos; el segundo grupo lo conformaban 20 muestras seleccionadas al azar, tomando dos de cada tratamiento (A, B, C, D y E) en cada uno de los dos periodos de elaboración. Igualmente se emplearon 6 grupos de validación cruzada para evitar el fenómeno de sobreajuste. El método de regresión empleado, junto con los criterios de evaluación de los modelos, está descrito en el apartado 2.3.2.4.4, con dos salvedades. La primera es que los modelos seleccionados para cada parámetro en cada forma de presentación mediante la estrategia RMCPM (Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales Modificada) fueron contrastados con modelos de Regresión por Componentes Principales (RCP). La segunda particularidad está relacionada con la inclusión de otro estadístico para la evaluación de la capacidad predictiva de los modelos de calibración, el RPD (Residual Predictive Deviation). Este estadístico determina la relación entre la desviación estándar de los valores de referencia de la población con respecto al Error Típico de Validación Cruzada (ETVC). Si el RPD>3, se puede considerar que la capacidad predictiva del modelo es muy buena [163]. 2.4.2.4.4 Pretratamientos matemáticos aplicados a la señal espectroscópica La combinación de pretratamientos matemáticos empleados para la selección de los mejores modelos se encuentra representada en la figura II-17. Derivada1 0,0,1 1,4,4 1,5,5 1,10,5 2,4,4 2,5,5 2,10,5 3,5,5 3,10,5 3,10,10 Corrección Rad. Dispersa2 SNVDT MSC Id. Ecuación 1,2.....................20 1 #,#,# : orden de derivada, segmento de derivación, segmento de suavizado 2 SNVDT: Standard Normal Variate y De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction Figura II-17. Esquema representativo de los pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa aplicados en los modelos de predicción de Grasa, Humedad y Proteína en salchichón Como se puede observar, en base a la experiencia adquirida en el tratamiento de información espectral NIR con este tipo de productos, no se obtuvieron modelos excluyendo la Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 126 región del espectro visible, ya que en ningún caso mejoraron los resultados con respecto al empleo conjunto de las regiones VIS-NIR. 2.4.3 Resultados y Discusión 2.4.3.1 Valores de referencia Las tablas II-12 y II-13 exponen la media, desviación típica y rango de los valores de referencia de los 3 constituyentes analizados (grasa, humedad y proteína), para producto fresco y curado respectivamente, tanto para el colectivo de calibración, como el de validación. Tabla II-12. Valores de referencia de los colectivos de calibración y validación en producto fresco Colectivo Calibración Colectivo Validación Constituyente N Media DT Rango N Media DT Rango Grasa (%) 80 20,27 7,31 8-31,7 20 20,29 7,44 9,5-30,9 Humedad (%) 80 58,94 5,3 50,2-68,4 20 58,89 5,48 51-67,1 Proteína (%) 80 16,65 2 12,7-20,5 20 16,88 2,28 13,9-21,6 Tabla II-13. Valores de referencia de los colectivos de calibración y validación en producto curado Colectivo Calibración Colectivo Validación Constituyente N Media DT Rango N Media DT Rango Grasa (%) 80 31,71 8,59 11,7-43,2 20 30,65 8,98 16-42,1 Humedad (%) 80 35,23 3,51 29,5-45,2 20 35,56 3,33 30,9-41,2 Proteína (%) 80 26,74 4,51 20,1-36,1 20 27,37 4,87 21,3-35,4 Mediante la observación de ambas tablas, se puede apreciar cómo cuando la masa fresca fue embutida para la obtención del producto curado, tras 21 días de maduración y fermentación, los valores medios de los constituyentes se modificaron aproximadamente a 31%, 35% y 27% (tabla II-13), según se trate de grasa, humedad y proteína respectivamente. Obviamente, esta modificación se debe principalmente a la pérdida de humedad ocurrida durante el proceso de maduración. Por lo tanto, los valores medios para grasa y proteína expresados sobre materia seca se encuentran en torno a 48% y 42% respectivamente. Aplicando estos valores a la normativa española que clasifica en categorías de calidad el producto según su composición, obtendrían la Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 127 clasificación de ‘calidad extra’ [158]. Sin embargo, estos valores son medios, ya que el colectivo experimental completo abarca un amplio rango en cuanto a composición de los tres parámetros, representando gran parte de la variabilidad encontrada en la industria de elaboración de embutidos de cerdo española. Dicha dispersión se puede apreciar gráficamente en los histogramas que expone la figura II-18, según se trate de producto fresco o curado. Producto Curado - %Grasa 0 2 4 6 8 10 12 14 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Fr ec ue nc ia Producto Curado - %Humedad 0 5 10 15 20 25 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Fr ec ue nc ia Producto Curado - %Proteína 0 2 4 6 8 10 12 20,5 22,5 24,5 26,5 28,5 30,5 32,5 34,5 36,5 Fr ec ue nc ia Producto Fresco - %Grasa 0 2 4 6 8 10 12 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 Fr ec ue nc ia Producto Fresco - %Humedad 0 2 4 6 8 10 12 14 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 Fr ec ue nc ia Producto Fresco - %Proteína 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Fr ec ue nc ia Figura II-18. Distribución de los parámetros grasa, humedad y proteína en producto fresco y curado (salchichón) 2.4.3.2 Estudio de repetibilidad espectral La obtención de los valores límite del estadístico RMS para este producto, en cada forma de presentación de muestras, junto con el filtrado espectral posterior, se ha expuesto en el apartado Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 128 2.3.3.1.2. 2.4.3.3 Caracterización espectral De la misma forma, el análisis visual de los espectros correspondientes a este producto, en cada forma de presentación de muestras, se ha expuesto en el apartado 2.3.3.2.2. 2.4.3.4 Análisis de Componentes Principales El Análisis de Componentes Principales de este colectivo experimental coincide con el descrito en el apartado 2.3.3.4.1, con lo cual, se han obtenido los mismos anómalos espectrales (H>3). 2.4.3.5 Modelos de predicción de Grasa, Humedad y Proteína 2.4.3.5.1 Caracterización de los modelos Los pretratamientos matemáticos descritos en el apartado 2.4.2.4.4 fueron aplicados para el cálculo de las ecuaciones en cada forma de presentación de muestras. La tabla II-14 muestra las características de las ecuaciones seleccionadas para cada constituyente, es decir, el número de muestras final que compone cada modelo (N), el número de factores o términos de la regresión, el tipo de regresión (RCP ó RMCPM), y el pretratamiento matemático aplicado a la señal. En producto fresco, el número de anómalos obtenidos en los modelos varió entre 1,25% (1 muestra, humedad, FHI) y 7,5% (6 muestras, grasa, FPS). Este número aumentó en producto curado, donde se aprecian porcentajes comprendidos entre 7,5% (6 muestras, humedad, CLS) y 17,5% (14 muestras, grasa, CHS). La detección de estos anómalos es importante, ya que, sí se mantienen, tienen una influencia significativa en el modelo, pudiendo ocurrir desviaciones importantes con respecto a los valores que se esperan predecir [164]. El mayor número de anómalos obtenidos en producto curado se debe a la mayor heterogeneidad del mismo, que se traduce en mayor variabilidad. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 129 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 130 No se ha observado homogeneidad en los modelos obtenidos con respecto al pretratamiento matemático seleccionado en producto curado, si bien, en producto fresco, el tratamiento de corrección de radiación dispersa seleccionado fue SNV-DT, excepto para grasa en muestras FPS, donde el tratamiento MSC obtuvo un mejor comportamiento. Del mismo modo, tampoco se observó homogeneidad con respecto al número de factores de la regresión, variando entre 2-9 en producto fresco, y entre 2-10 en producto curado, aunque en el constituyente grasa, lo modelos predictivos tienen el mismo número de factores según se trate de producto curado loncheado (6) y producto curado homogeneizado (7). El método de regresión empleado en todos los modelos seleccionados fue RMCPM, excepto para el constituyente grasa, en muestras frescas picadas (tanto en el modo de visión superior como inferior) y en muestras curadas homogeneizadas y analizadas en el modo de visión inferior, las cuales aportaron mejores resultados la regresión en Componentes Principales (RCP). En bibliografía relacionada con la aplicación de la tecnología NIRS a productos cárnicos, no se observa uniformidad en cuanto a los pretratamientos matemáticos seleccionados. En 2002, obtuvieron modelos predictivos mediante regresiones RMCPM en grasa, humedad y proteína, a partir de muestras de lomo de cerdo (producto fresco) con el mismo equipo empleado en este estudio (Perten DA-7000), en modo de visión superior [165]. Los mejores modelos de calibración los obtuvieron con 10, 13 y 12 factores PLS en grasa, humedad y proteína respectivamente, con primera y segunda derivada. En el estudio del presente apartado, en producto fresco, los factores en el modo de visión superior estuvieron comprendidos entre 2-4, con lo que la complejidad de los modelos ha sido inferior. Por otro lado, en los modelos que se han seleccionado se encuentra más variación con respecto a tratamientos de derivada (sin tratamiento, primera, segunda y tercera) cuando se comparan con los obtenidos por estos autores, que seleccionaron primera y segunda derivada. En otros trabajos, segunda derivada sin corrección de radiación dispersa fue seleccionada para predecir constituyentes en embutidos curados, calidad de carne de cerdo y carne de vacuno [77, 166, 167 respectivamente]. Otros autores obtuvieron los mejores resultados únicamente aplicando primera derivada sobre jamón curado [155] y carne picada de vacuno [168]. Por otro lado, pretratamientos de Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 131 derivadas junto con corrección de radiación dispersa han sido aplicados en carne de cordero, vacuno y pollo [77, 145]. 2.4.3.5.2 Evaluación de los modelos Los estadísticos de las ecuaciones seleccionadas para predecir grasa, humedad y proteína, tanto en calibración como en validación (cruzada y externa), para todas las formas de presentación de muestras, se exponen en la tabla II-15. Para el parámetro nutricional grasa, en todas las ecuaciones seleccionadas, los coeficientes de determinación (R2, r2 y R2VE) fueron claramente superiores a 0,9. Esta pauta fue similar en el parámetro humedad, si bien se obtuvieron algunos valores ligeramente inferiores, sobretodo el alcanzado en validación externa con las muestras curadas, loncheadas y analizadas en el modo de visión superior (R2VE=0,88). Así, los valores inferiores de este estadístico se obtuvieron con el constituyente proteína en muestras frescas. Estos resultados fueron bastante precisos, ya que se estima un nivel de precisión muy elevado para modelos que alcanzan valores de R2≥0,9 [138]. Observando el resto de estadísticos empleados para la evaluación de los modelos (ETC, ETVC, RPD y ETP), se aprecian diferencias entre niveles de heterogeneidad del producto en los parámetros grasa y humedad, esto es, las muestras homogeneizadas obtienen inferiores errores típicos (ETC, ETVC y ETP), así como valores superiores de RPD, cuando se comparan con muestras picadas en producto fresco y loncheadas en producto curado. Por lo tanto, el producto homogeneizado aportó modelos más robustos para los parámetros grasa y humedad. En producto fresco, el mayor error típico se obtuvo con el constituyente grasa (ETP=1,41%, FPS), disminuyendo hasta ETP=1,01% (FPI) cuando se trató del parámetro humedad. Es importante destacar que esta comparación emplea valores absolutos, ya que el rango predictivo del constituyente grasa (8,2-31,7%) es superior al de humedad (50,2-68,4%), por lo que la magnitud de estos errores fue similar si se tienen en cuenta sus respectivos rangos predictivos. Del mismo modo, en producto curado los valores superiores de errores típicos fueron de ETP=1,64% para el parámetro grasa (CLS), y ETP=1,32% en humedad (CLS). Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 132 Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 133 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 134 Por el contrario, en el parámetro proteína se observaron diferencias de menor magnitud con la variación de homogeneidad del producto. Con respecto al estadístico RPD, para que un modelo sea considerado con muy buenas características predictivas, debe obtener un valor de RPD>3 [120]. Como se puede apreciar en la tabla II-15, todos los modelos seleccionados aportaron valores superiores a este límite, excepto para el constituyente humedad en la forma de presentación CLS, y el constituyente proteína en FPS, obteniendo valores en ambos casos ligeramente inferiores al límite (RPD=2,92). Si se comparan diferencias entre ambos modos de análisis, en producto fresco sería ligeramente más aconsejable usar el modo de visión inferior para predecir grasa, dadas las diferencias observadas en la última tabla en fase de validación externa (evaluado mediante el estadístico ETP). Estas diferencias no son prácticamente perceptibles en los parámetros humedad y proteína en producto homogeneizado, así como para los tres constituyentes en producto picado. Dadas las circunstancias, se aconsejaría emplear el modo de análisis que permita menor manipulación del producto así como mayor simplicidad en el análisis. Según estos criterios, se debería emplear el modo de visión superior, ya que únicamente sería necesario disponer la masa de carne fresca sobre la ventana circular, sin necesidad de colocarla en el interior del plato circular giratorio necesario para analizar en el modo de visión inferior (figura II-2). Cuando se trata de producto curado, con las muestras intactas (loncheadas), se obtuvieron modelos más robustos con el modo de visión inferior en grasa y humedad. Este aspecto se debe a un factor diferenciador entre estas dos formas de presentación (CLI, CLS), siendo el envasado al vacío presentado en la forma de presentación CLS. Los mismos resultados se obtuvieron con la predicción de proteína, excepto para el error típico de calibración (ETCCLI=0,81% vs. ETCCLS=0,74%). Las muestras homogeneizadas obtuvieron mejores resultados cuando se analizaron en el modo de visión superior, excepto para el error típico de predicción en grasa (ETPCHI=0,71% vs. ETPCHS=0,98%) y proteína (ETPFHI=0,95% vs. ETPFHS=1,02%). En bibliografía existen muy pocos trabajos en los que se haya empleado el espectrofotómetro Perten DA-7000 para desarrollar aplicaciones en productos cárnicos. Así, con producto fresco, en el año 2003 se llevó a cabo un trabajo [168] con el equipo Perten DA-7000, en el que se obtuvieron predicciones para grasa en carne de vacuno picada, empleando tanto una forma de presentación de muestras (FPI), como un rango predictivo (7,2%-24,4% vs. FPI 8-31,7%) Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 135 similar a la presente Tesis Doctoral. Obtuvieron valores de r2=0,96, ETVC=1%, R2VE=0,83 y ETP=2,15%. La pérdida de precisión de los modelos obtenidos por estos autores frente a los resultados del presente trabajo se puede deber al hecho que diseñaron un dispositivo de análisis específico para trabajar on-line, no empleando la posición natural del equipo. Otros autores [165] incluyeron predicciones de grasa, humedad y proteína en su estudio, como parámetros que caracterizan la calidad de la carne de cerdo. Del mismo modo, el equipo empleado fue el Perten DA-7000, analizando en el modo de visión superior. Los valores que obtuvieron en validación cruzada (r2) fueron de 0,76, 0,8, y 0,69, y ETVC, 0,62%, 0,58% y 0,43% respectivamente, para grasa, humedad y proteína. En el mismo orden, en validación externa obtuvieron un R2VE de 0,61, 0,69 y 0,7, y ETP de 0,62%, 0,63% y 0,42%. Si se comparan los valores de estos estadísticos con los obtenidos con las formas de presentación de muestras FPS y FHS (tabla II-14) se observa como, tanto en validación cruzada como externa, se han alcanzado mejores correlaciones entre valores observados y predichos en los 3 constituyentes. Sin embargo, los valores obtenidos por estos autores [165] para ETVC y ETP fueron inferiores a los alcanzados en el presente trabajo con FPS y FHS. Estas diferencias se deben en parte a que estos autores emplearon muestras de lomo de cerdo, producto con mayor grado de homogeneidad que la masa para embutir empleada para la elaboración de los embutidos curados. Pero, en mayor medida, estas diferencias fueron a causa del menor rango de variación y desviación típica de sus valores de referencia, particularmente para humedad (rango 67,1%-79%, DT=1,37%) y grasa (rango 19,3%- 24,3%, DT=0,8%), como se obtiene de la observación de la tabla II-15. En otro estudio [169], se obtuvieron predicciones para grasa, humedad y proteína sobre embutidos de carne de cerdo picada, pero empleando un espectrofotómetro con un rango espectral superior al del Perten DA-7000 (400-2500 nm). Sus valores de referencia fueron muy similares a los presentados en la tabla II-15, así como también los resultados predictivos de los modelos si se comparan con las presentaciones de muestras FPS y FPI. De este modo, obtuvieron valores de R2VE de 0,88, 0,93 y 0,54, y ETP de 1,53%, 1,15% y 1,12% para grasa, humedad y proteína respectivamente. Por otro lado, existen muy pocos estudios en los que se haya trabajado en la obtención de predicciones de constituyentes mayoritarios en embutidos curados. Así, en 1995 [170] se estudió la composición de tres tipos de productos cárnicos (embutidos ahumados, fiambre y emulsiones Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 136 para untar), analizando por espectroscopia NIR en transmitancia con un rango espectral entre 250- 1050 nm. El ETP corregido por el error sistemático o bias (ETP(C)) se encontró en torno a 3,8-8,8 g/kg. Estos valores fueron inferiores a los alcanzados en el presente trabajo, con la salvedad que en aquellos errores típicos se eliminó el efecto causado por el error sistemático. Ya en 1992 [171] se analizaron por NIRS muestras de carne de vacuno homogeneizadas y empaquetadas en plástico film de uso alimenticio. Los errores de predicción obtenidos fueron inferiores a la forma de presentación empleada en este trabajo que estaba envasada al vacío, concretamente ETPgrasa=0,37%, ETPhumedad=0,5% y ETPproteína=0,45%. Estas diferencias con mucha probabilidad sean a causa de que en la presente Tesis Doctoral se emplearon embutidos loncheados, producto mucho más complejo y heterogéneo que la carne de vacuno homogeneizada. En otro estudio que se llevó a cabo en 2001 [169], se analizaron otro tipo de embutidos de cerdo para obtener predicciones de grasa, humedad y proteína, tanto para producto fresco como curado. Todos los coeficientes de determinación fueron inferiores a los presentados en la tabla II- 15. Por otro lado, los valores de ETP en producto intacto fueron muy similares para humedad (ETPCLD=0,97% vs. ETP=1,01%) y grasa (ETPCLI=1,47% vs. ETP=1,41%), y ligeramente inferiores para proteína (ETPCLI=1,08% vs. ETP=0,77%). Sin embargo, los valores que obtuvieron con producto homogeneizado fueron superiores, así para humedad ETPFHS=0,41% vs. ETP=1,13%, para grasa ETPFHI=0,71% vs. ETP=1,44%, y para proteína ETPFHI=0,95% vs. ETP=1,12%. Los mismos autores, estudiaron el efecto de la homogeneización en la carne de cerdo, observando que el contenido en humedad se incrementaba con el grado de homogeneizado del producto, mientras que el de grasa y proteína descendía. El incremento en el contenido de humedad se debe a la excreción de la humedad intramuscular. El bajo contenido de grasa y proteína se debe a un efecto de dilución causado por el incremento de humedad. En los parámetros estudiados en esta Tesis Doctoral, las mayores diferencias entre los estadísticos empleados para evaluar los modelos se encontraron mediante la comparación de muestras homogeneizadas con loncheadas. Así, el ETP máximo para grasa fue de 1,47% en muestras loncheadas analizadas en el modo de visión inferior (CLI), aproximadamente dos veces el obtenido para muestras homogeneizadas (ETP=0,71%). Con producto intacto, se apreció una situación similar con el constituyente humedad, obteniendo un valor de ETPCLI=0,97% frente a Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 137 ETPCHS=0,41% en producto homogeneizado. Por último, con el parámetro proteína, estas diferencias no fueron tan notables, aunque se observó mayor precisión en muestras homogeneizadas (ETPCLI=1,08%, ETPCHI=0,95%). Esta falta de precisión en todos los modelos obtenidos a partir de producto intacto frente a producto homogeneizado, se debe, en primer lugar al mayor grado de heterogeneidad del producto intacto, como ya se ha comentado, y en segundo lugar, a los valores químicos de referencia empleados para el desarrollo de los modelos predictivos. Como se expuso en la figura II-4 del apartado 2.3.2.3.2, las muestras curadas intactas (loncheadas), una vez analizadas por NIRS, se homogeneizaban para obtener las formas de presentación curadas homogeneizadas. El paso siguiente consistía en el envío de las mismas al laboratorio para llevar a cabo las determinaciones de los parámetros estudiados. Por lo tanto, los valores de referencia obtenidos (a partir de producto homogeneizado) podrían diferir ligeramente de los valores que tendrían antes de homogeneizar, como se apuntó en el artículo Quantitative analysis of pork dry-cured sausages to quality control by NIR spectroscopy, que conforma parte del Anexo 3. En consecuencia, podría ser una razón por la que los modelos correlacionaron con mayor precisión los espectros del producto homogeneizado con los respectivos valores químicos de referencia. 2.5 Optimización de un proceso de adquisición espectral NIR con embutidos de cerdo comerciales loncheados, dispuestos en bandejas y cubiertos con plástico film de uso alimentario La realización del presente trabajo fue fruto de una colaboración entre la Universidad de Córdoba (Dpto. Bromatología y Tecnología de Alimentos) y el Área de Tecnología, Postcosecha e Industria Agroalimentaria del IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’. La filosofía de trabajo fue la aplicación conjunta de dos disciplinas científicas, el Diseño de experimentos y la Tecnología NIRS. Tras su finalización, se publicó en la revista Journal of Near Infrared Spectroscopy mediante el título ‘Detection of factors affecting the acquisition of visible-near infrared fibre-optic probe spectra of commercial meat products’, la cual conforma el Anexo 4 de la presente Tesis Doctoral. 2.5.1 Antecedentes Uno de los principales problemas en el diseño de modelos quimiométricos a partir de espectros NIRS, es la obtención de información espectral de buena calidad, la cual depende de numerosos factores, en ocasiones, muy difíciles de controlar. Así, para el desarrollo de aplicaciones eficientes, con elevados niveles de exactitud y precisión, es necesario la obtención de modelos robustos, es Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 138 decir, insensibles a variaciones de factores ambientales que no sean susceptibles de ser controlados. Especial importancia adquieren los factores asociados a una incorrecta definición de la forma de presentación de muestras de forma sistemática en el proceso de adquisición de información espectral. La exactitud y precisión en el análisis de espectroscopia NIR está influenciado aproximadamente por 30 factores relacionados con el proceso de muestreo, forma de presentación de la muestra al equipo o características propias de la muestra (temperatura, tipo de matriz, tamaño, tipo de material, características y tamaño de cápsula de análisis, composición, textura, materiales externos, compactación, estratificación, etc.) [172]. Además, la importancia de estos factores aumenta con el incremento de heterogeneidad del producto a analizar. El estudio de los factores que influyen en el proceso de adquisición de espectros NIRS, en la mayoría de los casos se ha realizado empleando la estrategia OVAT (One Variable At Time) [99, 145, 146, 169], la cual estudia una variable dentro de un intervalo de trabajo, mientras las demás permanecen constantes. Desafortunadamente, este método no permite determinar con certeza la influencia conjunta de las variables objeto de estudio (interacciones), no optimiza el proceso, así como posee baja eficiencia en el desarrollo del experimento [173]. A comienzos de la década de 1920’s, Fisher descubrió y describió un método de experimentación mucho más eficiente que el OVAT, basado en diseños factoriales [174]. En el diseño factorial (DF), un proceso de optimización debe realizarse en dos etapas diferenciadas. En primer lugar, se deben identificar los parámetros críticos o factores influyentes (ACF, Apparent Critical Factors) del experimento, para posteriormente, pasar a la etapa de optimización del mismo. De este modo, las técnicas de diseño de experimentos pueden aportar una poderosa herramienta para simplificar el análisis espectroscópico NIR [175, 176]. Así, las etapas consecutivas que se deben llevar a cabo para el proceso de estandarización del análisis NIR de producto terminado son, en primer lugar, establecer cuantos factores influyentes (ACF) son realmente importantes para el proceso de adquisición espectral, y en segundo lugar, determinar cuáles de los factores ACF son estadísticamente significativos como factores realmente críticos, para de este modo, encontrar el conjunto óptimo de valores de los factores influyentes que producirán no solo una cuantificación analítica eficiente de los parámetros analizados en el producto final, sino también el método más sensible de cuantificación. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 139 Para la consecución de la primera etapa, se desarrolló un diseño experimental Plackett- Burman factorial fraccionado 2(k-p) (donde k = número de factores a ser considerados en el diseño experimental, y p = la fracción 1/2p del diseño experimental 2k [177]) que puede emplearse para determinar con exactitud cuales de los factores inicialmente considerados afectan significativamente a una variable dependiente o respuesta. Para la obtención de la segunda etapa, se emplea la metodología RSM (Response Surface Methodology), la cual consiste en un conjunto de técnicas estadísticas y matemáticas para desarrollar, mejorar y optimizar procesos [178]. En la presente Tesis Doctoral se ha trabajado sobre la consecución de la primera etapa, por lo tanto, en el estudio del efecto de ciertos factores sobre la variabilidad que producen en el proceso de adquisición espectral, para obtener información adecuada para la fase posterior de desarrollo de modelos quimiométricos, y así determinar los principales efectos de los factores influyentes en la adquisición de datos NIRS. 2.5.2 Material y Métodos 2.5.2.1 Materia prima Se han empleado dos tipos de embutidos de cerdo crudos curados comúnmente consumidos en España, salchichón y chorizo. La tendencia en cuanto a la comercialización de estos tipos de productos cárnicos ha ido evolucionando de la venta de producto por piezas, a cantidades reducidas, las cuales se encuentran loncheadas y empaquetadas en bandejas con cubierta de plástico adecuado para uso alimenticio. De este modo, es palpable la importancia del desarrollo de tecnología capaz de controlar la calidad sobre este tipo de producto terminado, sin destrucción ni alteración del mismo. Para conformar el diseño experimental, fue necesario el empleo de dos piezas de cada tipo de producto, pertenecientes al mismo lote dentro de la misma marca comercial, para mantener la máxima homogeneidad dentro de cada producto. Al igual que otros tipos de embutidos crudos curados, el chorizo y salchichón poseen etapas comunes de elaboración, como son el picado, mezclado, embutido, fermentación y maduración. Además, poseen ciertos ingredientes comunes en su formulación, como carne y panceta de cerdo, sal, antioxidante (ascorbato sódico), conservador (nitrato potásico), colorante (Ponceau 4R E-124). Sin embargo, poseían ingredientes característicos de cada producto; así, el salchichón tenía lactosa, proteínas de leche, pimienta blanca y negra, y estabilizador (tripolifosfato Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 140 sódico), el chorizo presentaba pimentón, leche en polvo, dextrina, azúcar, dextrosa, especias, emulgente (difosfato sódico), conservador (nitrito sódico) y tratamiento de superficie (natamicina). Según las especificaciones aportadas por el fabricante, la carne de cerdo empleado para la elaboración del chorizo estaba compuesta por recortes de jamón y paleta (33,5%, con 10% grasa), panceta (34,4%, con 30% grasa) y paleta deshuesada (22,6%, con 10% grasa). El salchichón contenía carne de cerdo (no especificada) (66%, con 25% grasa) y corteza de tocino (26%, con 28% grasa). Las piezas de chorizo y salchichón fueron adquiridas en un mercado local y almacenadas a -18ºC hasta su análisis. Los espectros fueron obtenidos directamente sobre producto loncheado, dispuesto en bandejas (figura II-19) y empaquetado con plástico film de polietileno de uso alimenticio. d d d = 5 – 7 cm Figura II-19. Disposición del producto loncheado sobre las bandejas de análisis Esta forma de presentación de muestras, muy similar a como se encuentra en comercios, produce múltiples fuentes de variación en el análisis NIR. Por un lado, las características del loncheado y empaquetado, que se describen en la exposición del diseño experimental que a continuación se muestra. Por otro, la adquisición de información espectral, que se llevó a cabo previa estabilización de las muestras, en primer lugar mediante descongelado, y posteriormente 30 min. de adaptación a las condiciones ambientales de laboratorio, para controlar el factor temperatura, que puede aportar considerables niveles de ruido durante la adquisición de los espectros [179]. 2.5.2.2 Diseño experimental En las primeras etapas de desarrollo de una investigación, el objetivo en el diseño de experimentos es detectar o confirmar la importancia de variables o factores que influyen en ésta. En Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 141 quimiometría, un tipo de diseño de experimentos denominado Plackett-Burman [180] es usualmente empleado para identificar factores importantes (ACFs) de entre 6 a 40 variables. En el diseño de experimentos planteado en el presente trabajo, se consideraron como factores influyentes los que se exponen en la tabla II-16. Tabla II-16. Factores influyentes (Apparent Critical Factors, ACF) y rango experimental, para los dos niveles del diseño planteado a resolución IV Nomenclatura Levels ACF Código Sintaxis -1 +1 Tipo de Producto X1 TP Salchichón Chorizo Tiempo Previo de Descongelación, h X2 TPD 21 42 Tipo de Plástico Film1 X3 TPF A B Vueltas de Plástico alrededor de la Muestra X4 VPM 1 2 Grosor del Loncheado, mm X5 GL 2 4 Número de Capas de Lonchas X6 NCL 1 3 Número de Subescaneos en la adquisición de un Espectro X7 NSE 32 64 1 A y B son dos tipos diferentes de plástico film de polietileno para uso alimentario Se ha empleado un diseño experimental de Plackett-Burman 27-4III con incremento de resolución vía fold-over 27-3IV. Al emplear una Resolución IV, los principales efectos no serán confundidos con interacciones dobles (entre dos factores) pero sí algunas interacciones dobles podrían ser confundidas con otras del mismo nivel. El programa informático empleado para obtener los efectos estandarizados de las respuestas para cada ACF fue Design-Expert (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). El diseño experimental 27-3 ha dado lugar a la consecución de 16 ensayos, como se muestra en la tabla II-17. Así, las muestras de ambos tipos de productos cárnicos se prepararon bajo las condiciones específicas de cada factor considerado en el diseño experimental (tabla II-16). Las salidas fueron obtenidas al azar para asegurar que la persona que desarrolle el experimento no llegue a obtener conclusiones erróneas debidas a fuentes de variación extrañas o no conocidas [173, 181]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 142 Tabla II-17. Diseño Experimental Completo 27-3 empleado para determinar factores críticos en el proceso de adquisición espectral Salida Ensayo X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 3 1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 10 2 1 -1 -1 1 1 1 -1 7 3 -1 1 1 -1 -1 -1 1 15 4 1 1 1 1 1 1 1 5 5 -1 1 -1 1 -1 1 -1 4 6 -1 -1 1 1 -1 1 1 1 7 -1 -1 -1 1 1 -1 1 12 8 1 -1 1 -1 1 -1 1 9 9 1 -1 -1 -1 -1 1 1 2 10 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 13 11 1 1 -1 -1 1 -1 -1 11 12 1 -1 1 1 -1 -1 -1 16 13 1 1 1 -1 -1 1 -1 6 14 -1 1 -1 -1 1 1 1 14 15 1 1 -1 1 -1 -1 1 8 16 -1 1 1 1 1 -1 -1 2.5.2.3 ACFs en la preparación de la muestra A pesar de que alrededor de 30 factores están relacionados con la preparación de la muestra en la exactitud y precisión del análisis NIR [172], tan solo se seleccionaron siete (ACFs) en el presente trabajo (tabla II-16) en base a trabajos publicados y experiencias previas. Estos factores fueron los que a continuación se describen: ­ Tipo de Producto (TP), dos tipos de embutidos crudos curados comúnmente consumidos en España (chorizo y salchichón) que son elaborados mediante un proceso tecnológico similar y difieren en su formulación. ­ Tiempo Previo de Descongelación (TPD), ya que durante el proceso de descongelación en productos cárnicos se producen complejos cambios físicos, Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 143 químicos y bioquímicos, que se traducen en la modificación de la apariencia e intensidad de ciertas bandas de absorción en el espectro NIR. ­ Tipo de Plástico Film (TPF). Diferentes tipos de plástico poseen diferencias en sus propiedades físico-químicas que podrían afectar a los espectros NIR. ­ Vueltas de Plástico alrededor de la Muestra (VPM). Tanto el haz de luz incidente, como el reflejado tendrían que atravesar diferente grosor de un mismo tipo de plástico. ­ Grosor del Loncheado (GL). Este factor está relacionado con la capacidad de penetración de radiación en la muestra y con el efecto de radiación dispersa, entre otros. ­ Número de Capas de Lonchas (NCL). Factor relacionado con las variables descritas en el anterior. ­ Número de Subescaneos en la adquisición de un Espectro (NSE). Factor principalmente relacionado con características del espectrofotómetro. Como se puede observar en la tabla II-16, para cada factor incluido en el diseño experimental, se obtuvo una variable independiente codificada (Xi, i=1-7), ya que se aconseja transformar variables naturales a variables codificadas. En Diseño de Experimentos, variables estandarizadas o codificadas son a menudo empleadas debido a que el peso de los factores durante el análisis de los resultados podría verse modificado según el rango de la variable, por lo que nuevos factores estandarizados o codificados son obtenidos. Estos nuevos factores estandarizados producen efectos codificados o estandarizados en las respuestas. La codificación elimina las unidades de medida de los factores previa estandarización, por lo que las distancias medidas a lo largo de los ejes de las variables codificadas en un espacio de dimensión k son definidas bajo un mismo sistema de medida. El proceso de estandarización o codificación se describe mediante la expresión: iLiH iHiLi i XX XXXx   )(2 donde iLX y iHX son los niveles bajo y alto respectivamente de los factores iX . De este modo, los factores codificados son definidos sin dimensión, con media cero y la misma desviación estándar [182, 183]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 144 2.5.2.4 Análisis NIRS El proceso de adquisición espectral se desarrolló con un espectrofotómetro monocromador Foss NIRSystems 6500 SY-II (Silver Spring, MD, USA), equipado con un módulo de análisis con sonda de fibra óptica de 1,5 m de longitud (ref. R6539-A) y empleando una cerámica interna como referencia. El sensor consta de un cabezal de análisis (16 cm x 11,25 cm x 6,25 cm) de aluminio que posee una ventana de cuarzo de 5 cm x 5 cm. El espectrofotómetro interpola los datos adquiridos para producir un punto de información cada 2 nm entre 400 – 2500 nm, obteniendo un espectro con 1050 puntos de datos. El programa informático empleado tanto para el control del instrumento, almacenamiento de espectros y gestión de los datos fue ISIScan v1.25 (Infrasoft International, State Collage, PA, USA). 2.5.2.5 Respuestas Al ser el principal objetivo evaluar diferencias en el proceso de adquisición de información espectral debido a los factores expuestos en la tabla II-16, la respuesta a emplear debe evaluar diferencias entre espectros. Para calcular similitudes o diferencias en valores de absorbancia entre espectros, algunos programas informáticos que gestionan la información espectral de instrumentos NIRS (por ejemplo, ISI), están capacitados para calcular la raíz cuadrada del cuadrado medio del error (Root Mean Squared, RMS) entre las diferencias de los valores de log(1/R) de una submuestra y el valor log(1/R) del espectro medio de varias submuestras para el rango espectral completo del instrumento en cuestión. De este modo, este estadístico aporta información sobre diferencias espectrales entre replicados de una misma muestra, por lo que es considerado como un estimador adecuado de la repetibilidad espectral. En definitiva, es un estadístico útil para evaluar la eficiencia del proceso de adquisición espectral [184]. Para calcular el valor del estadístico RMS en cada uno de los 16 ensayos obtenidos, se empleó la siguiente expresión: nRMS n i ijj D   1 2 iYYD ijij  donde ijY es el valor de log(1/R) de la muestra “j” en la longitud de onda i (λi), iY es el valor de log(1/R) del espectro medio en la longitud de onda i (λi), y n es el número de longitudes de onda (punto de datos). Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 145 Los valores de RMS obtenidos fueron multiplicados por 106 para facilitar el manejo de los datos, evitando trabajar con valores excesivamente bajos. Para cada condición específica del diseño experimental (ensayos, tabla II-17), se obtuvieron tres replicados (espectros). A continuación, los valores RMS se calcularon bajo diferentes condiciones técnicas, como variación en el rango de longitud de onda, correcciones de radiación dispersa y tratamientos de derivadas. Se emplearon dos tipos de correcciones de radiación dispersa: Standard Normal Variate and Detrending (SNV-DT), la cual elimina el efecto de radiación dispersa o Scatter mediante la normalización de cada espectro a través de la desviación estándar de las repuestas a lo largo de todo el rango espectral [137]. El otro tratamiento de corrección de radiación dispersa empleado fue Multiplicative Scatter Correction (MSC), el cual supone que la dependencia de la longitud de onda con la radiación dispersa es diferente de la del constituyente [48]. Asimismo, como se ha comentado, se emplearon dos órdenes de derivadas, primera, la cual simplemente efectua una medida de la pendiente de la curva dibujada por el espectro en cada punto, y segunda derivada, la cual mide el cambio de la pendiente en la curva [185]. Además, se emplearon tres rangos espectrales: el primero, el propio del instrumento (400- 2500 nm), el segundo, se reduce desde 400-2000 nm, ya que a partir de los 1800 nm el ratio señal-ruido comienza a disminuir, por lo que este rango espectral posee mayores cotas de repetibilidad, y por último se empleó el rango comprendido desde 1100-2000 nm, el cual es idéntico al anterior, pero eliminando la región visible del espectro [83]. En la adquisición de los espectros se pueden apreciar ligeras fluctuaciones debidas al efecto de la radiación dispersa, ruido de fondo y desviaciones de la línea base [186]. Estas fluctuacines pueden ser minimizadas mediante la aplicación de pretratamientos matemáticos sobre la señal espectroscópica. En el presente trabajo se aplicaron los cálculos, además de sobre las combinaciones de los tratamientos ya comentados, sobre el espectro bruto, es decir, sin ningún tipo de corrección de radiación dispersa y sin ningún tipo de derivada. Por lo que finalmente se obtuvieron 5 combinaciones, que aplicadas cada una de ellas a los 3 distintos rangos espectrales expuestos, surge un total de 15 grupos de espectros diferentes, a los que a cada uno de ellos se les calculó la respuesta empleada en el presente estudio, es decir, el estadístico RMS. La tabla II-18 expone Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 146 todas las combinaciones de pretratamientos matemáticos sobre las que se obtuvieron las respuestas. Tabla II-18. Respuestas obtenidas con las combinaciones de pretratamientos aplicados R E S P U E S T A S Pretratamientos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 400-2500      400-2000      Rango Espectral (nm) 1100-2000      No    Primera       Derivada Segunda       No    MSC       Corrección Scatter SNV-DT       La siguiente expresión sintetiza todos los datos (respuestas) empleadas en el análisis: 16 ensayos (3 replicados por ensayo) x 15 respuestas (valor RMS medio de los 3 replicados) = 240 respuestas. 2.5.3 Resultados y Discusión El efecto de los ACFs sobre respuestas analizadas (R1, R2, R6, R,,), cada una representando diferentes condiciones de pretratamiento sobre los espectros (tabla II-18), se muestra en la tabla II- 19. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 147 Tabla II-19. Efectos estandarizados en cada factor (codificado), en respuestas con valores estadísticamente significativos. Un efecto se consideró como fuerte cuando p≤0,05 Respuestas R1 R2 R6 R11 Factores efecto p efecto p efecto p efecto p X1 -13,04 0,05 1 6,41 0,10 -2,48 0,24 -50,81 0,01 1 X2 -7,54 0,08 4,64 0,14 0,88 0,54 -28,27 0,02 1 X3 2,97 0,21 10,21 0,06 0,98 0,51 -7,58 0,08 X4 29,47 0,02 1 6,53 0,10 14,26 0,04 1 96,16 0,00 1 X5 15,41 0,04 1 7,42 0,09 11,85 0,05 1 78,74 0,01 1 X6 7,34 0,09 5,89 0,11 5,57 0,11 28,99 0,02 1 X7 8,41 0,08 1,40 0,39 5,74 0,11 13,77 0,05 1 X1 × X2 7,62 0,08 5,96 0,11 4,85 0,13 16,83 0,04 1 X1 × X3 -1,55 0,36 3,81 0,17 1,34 0,41 -15,76 0,04 1 X1 × X4 0,96 0,51 5,54 0,11 1,44 0,39 2,65 0,23 X1 × X5 4,90 0,13 3,67 0,17 6,49 0,10 43,23 0,02 1 X1 × X6 -2,00 0,30 4,35 0,14 1,44 0,39 -1,01 0,50 X1 × X7 -23,32 0,03 1 2,38 0,25 -13,68 0,05 1 -124,56 0,00 1 X2 × X5 18,11 0,04 1 5,72 0,11 8,71 0,05 1 50,21 0,01 1 1 Considerados como Factores Influyentes (FI) Estructura de confusión. X1X2=X3X6= X4X7 X1X3=X2X6= X5X7 X1X4=X2X7= X5X6 X1X5=X3X7= X4X6 X1X6=X2X3= X4X5 X1X7=X2X4= X3X5 X2X5=X3X4= X6X7 Para la obtención de un análisis NIRS robusto (en Diseño de Experimentos, el concepto de robustez se lleva empleando alrededor de 2 décadas, y deriva de la idea de elaboración de productos o procesos insensibles a efectos provocados por variaciones naturales, en nuestro caso, a los efectos de 7 factores influyentes en un proceso concreto de adquisición de información espectral NIR) es necesario obtener una respuesta para la cual la variabilidad espectral es Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 148 insensible al efecto de los parámetros estudiados. En base a los resultados obtenidos, las respuestas se clasificaron en tres grupos que a continuación se describen. 2.5.3.1 Grupo ‘Difícil Control’ (DC) Este grupo posee un gran número de respuestas (R4, R5, R7, R8, R9, R10, R12, R13, R14 y R15), en donde todos los efectos fueron estadísticamente significativos (p≤0,05). Todos los rangos espectrales empleados (400-2500 nm, 400-2000 nm, 1100 – 2000 nm) se incluyeron en este grupo de respuestas, y todas las respuestas estuvieron sometidas a un tratamiento de derivación y de corrección de scatter (tabla II-18). El tratamiento de derivada aplicado individualmente suele conducir a una disminución del ratio señal/ruido, pero unido a un tratamiento de corrección de scatter, se suele incrementar la resolución espectral [186], y, de este modo, incrementar la sensibilidad a variaciones externas, obteniendo los ACFs como factores realmente críticos. De este modo, todos los factores presentados en el diseño experimental deberían ser controlados, ya que variando uno de ellos, los espectros producidos serán significativamente distintos. En muchos estudios donde se desarrollan aplicaciones de la tecnología NIR sobre productos agroalimentarios, los mejores modelos se obtienen con combinaciones de tratamientos de derivada y corrección de scatter. Se ha afirmado que los mismos pretratamientos matemáticos aplicados en el presente trabajo mejoran la señal espectroscópica [187]. Otros autores sugieren que la combinación de primera derivada con un método de corrección de scatter, aporta resultados satisfactorios en numerosos productos agrícolas [188], incluso se afirma que la combinación derivada-corrección scatter permite la obtención de las mejores calibraciones [189, 190]. Por lo tanto, un modelo con cualquier combinación de tratamiento empleada en el presente trabajo, es susceptible a cualquiera de los ACFs estudiados, por lo que deberían ser controlados al analizar vía NIRS con sonda de fibra óptica, embutidos crudos curados, loncheados sobre bandejas, y cubiertos con plástico film de uso alimentario. En consecuencia, será muy importante sistematizar la forma de presentación de muestra para controlar el mayor número de factores cuando estos tratamientos matemáticos sean aplicados. Es por lo que estas condiciones se clasificaron como “Difícil Control, DC”. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 149 2.5.3.2 Grupo ‘Fácil Control’ (FC) Este grupo contiene respuestas en donde tan solo algunos ACFs (tabla II-16) obtuvieron un efecto significativo en la variabilidad espectral (R1, R6 y R11). Estas respuestas abarcan los distintos rangos espectrales empleados: 400-2500 nm (R1), 400-2000 nm (R6) y 1100-2000 nm (R11), tratándose además de espectros brutos, es decir, no fueron sometidos ni a tratamiento de derivadas, ni a corrección de scatter. De las tres respuestas de este grupo, R1 y R6 deberían ser más fáciles de controlar, ya que tan solo 3 y 2 factores respectivamente obtuvieron efectos primarios significativos. Estos factores fueron TP, VPM y GL (R1) y VPM y GL (R6). Por el contrario, la respuesta R11 presentó 6 de los 7 factores posibles con efectos primarios (tabla II-19). Los efectos observados en estas respuestas (tabla II-19) podían ser predecibles, si se tiene en cuenta que los tratamientos matemáticos favorecen la eliminación de numerosas fuentes de error, tales como diferencias en el tamaño de partículas, pequeños cambios en la intensidad de la lámpara, ligeras variaciones en la respuesta de los detectores del espectrofotómetro, leves cambios de temperatura, etc. [46]. Una vez se minimicen dichas fuentes de error mediante la aplicación de pretratamientos matemáticos, se detectan principalmente variaciones debidas a los ACFs. Por esta razón, los factores influyentes que han sido repetidamente detectados como causantes de efectos significativos en el grupo FC, esto es, vueltas de plástico alrededor de la muestra (VPM) y grosor de las lonchas (GL), serán los principales factores que se deben tener en cuenta durante el análisis NIR en la forma de presentación comentada, ya que, aún sin minimizar otras fuentes de error, han sido identificados como factores realmente críticos. Ambos factores están relacionados con las características del paso óptico, ya que VPM se relaciona con el grosor del plástico (una o dos vueltas alrededor de la muestra) y GL, con el grosor del loncheado. Así, este hecho provoca diferencias en la señal espectroscópica, principalmente a causa de variaciones en la penetración de la radiación en el producto. En el año 2004, se argumentó en un estudio que el grosor del loncheado puede verse afectado por la capacidad de penetración de la radiación [191]. Por otro lado, en el mismo año se observaron las interferencias producidas por los múltiples haces de radiación reflejados a partir de la superficie de capas finas de plástico en los espectros de infrarrojo cercano [192]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 150 La figura II-20 muestra los valores medios del estadístico RMS a partir de las condiciones descritas (tabla II-17) obtenidos en cada respuesta. Como se puede apreciar, las respuestas que no han sido sometidas a pretratamientos matemáticos (grupo FC), fueron claramente las que alcanzaron valores superiores. Es importante destacar que estos valores se encuentran próximos a los obtenidos en otro trabajo desarrollado en el IFAPA-Centro Alameda del Obispo (RMSlímite = 60x103), para conseguir espectros de calidad con la misma forma de presentación de muestras y espectrofotómetro descritos en el presente estudio, con la salvedad de que los embutidos eran de elaboración propia y no comerciales [193]. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 R e s p u e s t a s Va lo r M ed io R MS x 10 3 Figura II-20. Valor RMS medio de cada respuesta Los espectros empleados para el cálculo de este valor, tampoco fueron sometidos a tratamiento de derivadas ni de corrección de scatter. En el diseño experimental del trabajo, no evaluaron el efecto del grosor del loncheado (GL) como factor crítico, por lo que si hubieran mantenido un valor constante en el loncheado de los embutidos, probablemente el valor límite del estadístico RMS hubiera sido considerablemente inferior. 2.5.3.3 Grupo ‘Control Robusto’ (CR) Finalmente, el tercer grupo está compuesto por dos respuestas, R2 y R3 (en la tabla II-19 aparece como ejemplo la respuesta R2), en las cuales ningún ACFs ejerció un efecto significativo. Así, las condiciones de las respuestas R2 y R3 (rango espectral completo, primera derivada y ambos tratamientos de corrección de scatter, MSC y SNV-DT, tabla II-18), son condiciones de ‘Control Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 151 Robusto’, ya que la variabilidad espectral no se vio afectada por ninguno de los factores considerados en el estudio. La aplicación de primera derivada y corrección de scatter en el grupo CR aportaron características que hacen el proceso de adquisición espectral robusto, ya que la variabilidad espectral (RMS) no se vio afectada por los factores considerados. Conclusiones similares fueron obtenidas empíricamente por diversos autores, sin llevar a cabo una estandarización del proceso como se ha descrito en el presente trabajo. Dentro de los múltiples ejemplos susceptibles de ser citados, cabe destacar el trabajo que se llevó a cabo sobre lomo de cerdo Ibérico intacto, empleando el mismo equipo y el mismo módulo de sonda de fibra óptica [83], obteniendo los mejores resultados en sus modelos a partir de la combinación de primera derivada y corrección de scatter MSC para grasa intramuscular, y SNV-DT para proteína. En otro trabajo, en el que se estudiaba mediante tecnología NIRS el color de la carne de cerdo analizada de forma intacta [95], de forma similar se obtuvieron los mejores resultados mediante la aplicación del pretratamiento SNV-DT y primera derivada para el parámetro CIE b y SND-DT y segunda derivada para el parámetro CIE L. Por otro lado, para intentar discriminar entre carne de canguro y vacuno (de forma intacta), los menores errores de clasificación se obtuvieron con segunda derivada y SNV-DT, o simplemente con SNV-DT [105]. Del mismo modo, para la discriminación entre piezas de pollo procedentes de animales de crecimiento lento o de cebo industrial, los mejores resultados los aportaron los pretratamientos de primera derivada y SNV-DT para la clasificación de muslos con piel, segunda derivada con MSC para pechuga sin piel, y segunda derivada con SNV-DT para canales con piel [144]. Cuando se obtenga información espectral NIR con el mismo espectrofotómetro y forma de presentación de muestras del presente trabajo, y se apliquen las condiciones descritas por las respuestas del grupo CR (R2 y R3), indistintamente se podrían emplear cualquiera de los niveles pertenecientes a los factores estudiados: tipo de producto, en cualquiera de los dos tiempos de descongelación, tipo de plástico, una o dos vueltas de plástico alrededor del producto, 2 mm ó 4 mm de grosor de loncheado, una o dos capas de producto y cualquiera de las dos opciones de números de subescaneos en el proceso de adquisición espectral. De este modo, todos estos factores podrían ser susceptibles de variación sin afectar de forma significativa entre los espectros de una muestra (valor RMS). Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 152 Como resultado, esta información se podría emplear para sintetizar metodologías de análisis NIR. Por ejemplo, para expandir modelos generados con la combinación de pretratamientos matemáticos empleados en este grupo, no sería necesario tener en cuenta todos estos factores. Control de Calidad sobre Embutidos de Cerdo 153 BIBLIOGRAFÍA [50] I. Ben-Gera, K.H. Norris, J. Food Sci., 1968, 33(1), 64. [51] C.E. Byrne, G. Downey, D.J. Troy, D.J. Buckley, Meat Sci., 1998, 49(4), 399. [52] M. Prevolnik, M. Candek-Potokar, D. Skorjanc, Czech J. Anim. Sci., 2004, 49(11), 500. [53] W.G. Kruggel, G.A. Field, M.L. Riley, H.D. Radloff, K.M Horton, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1981, 64(3), 692. [54] E. Lanza, J. Food Sci., 1983, 48(2), 471. [55] E.V. Valdes, J.D. Summers, Poult. Sci., 1986, 65(3), 485. [56] J.A. Renden, S.S. Oates, R.B. Reed, Poult. Sci., 1986, 65(8), 1539. [57] M. Bellati, P. Rivaldi, G. Saccani, Ind. Conserve, 1991, 66(4), 301. [58] H. Eichinger, G. Beck, Arch. Tierz.-Arch. Anim. Breed., 1992, 35(1-2), 41. [59] D. Cozzolino, I. Murray, R. Paterson, J. 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[193] F. España, A.J. Gaitán, V. Ortiz, E.J. De Pedro, J. Pérez, Actas del III Congreso Español de ingeniería de Alimentos [CD-Rom], Pamplona, España, 2004. CAPÍTULO III CONTROL DE CALIDAD SOBRE ALGODÓN BRUTO Control de Calidad sobre Algodón Bruto 161 3.1 Introducción La realización de este trabajo se llevó a cabo mediante un Convenio de Colaboración entre el Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica (IFAPA), y la empresa Centro de Innovación y Tecnología Agroalimentaria, S.A. (CITAGRO), para el desarrollo de un Proyecto de Investigación denominado “La Tecnología NIRS como instrumento para el control de calidad del algodón bruto”, acogido a las ayudas del Programa de Fomento de la Investigación Técnica (PROFIT) del Ministerio de Industria, Turismo y Comercio, incluido en el Plan Nacional de Investigación Científica, Desarrollo e Innovación Tecnológica (2004-2007). Tras su finalización, fue objeto de una publicación en la revista Journal of Near Infrared Spectroscopy con el título ‘Near infrared applications in the quality control of seed cotton’, expuesto en el Anexo 5. 3.1.1 Antecedentes El algodón es la planta textil de fibra suave más importante del mundo, por lo que su producción va encaminada hacia la obtención de fibra, a pesar de que también se obtienen diversos productos, como aceites extraídos de su semilla, empleo del orujo o torta obtenido de esta extracción para alimentación animal (previa extracción del alcaloide tóxico gosipol), materias primas para fabricar jabón y pólvora, celulosa para cosméticos, fabricación de papel moneda, etc. El algodón en la Unión Europea es producido principalmente por Grecia y España, siendo un cultivo deficitario, ya que no genera excedentes y la demanda es superior a la oferta. A escala mundial, supone la mitad del consumo de fibra en la industria textil. Concretamente en esta industria, el control de calidad sobre la materia prima es determinante para la obtención del producto final, siendo la calidad del algodón sin desmotar (frutos del algodonero maduros y recogidos que contienen restos de cápsulas, de hojas y de materias terrosas) [194], una pieza clave para la obtención de una fibra con buenas calidades. En este sentido, los parámetros más importantes que intervienen sobre la calidad del algodón bruto son el contenido de humedad y el nivel de impurezas, entendiendo este último como todos aquellos cuerpos extraños, orgánicos (restos de hojas y tallos entrelazados en las fibras [195]) e inorgánicos, que no sea fibra o semillas de algodón, aunque sean de la propia planta. En Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 162 España se recogen niveles de estos parámetros en normativa, a través de los cuales se prima la calidad del producto mediante incentivos al productor. El protocolo para el control de partidas de algodón español, establece la determinación de humedad mediante un medidor portátil (precisión de medida 0,5%), y el contenido de impurezas mediante determinación gravimétrica. Ambas metodologías son independientes, consumiendo para su determinación tiempo y mano de obra. En el presente trabajo se propone la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) como tecnología alternativa para el control de calidad del algodón bruto mediante estos parámetros. En bibliografía, apenas se encuentran trabajos previos al respecto, ya que el empleo de NIRS en algodón ha sido para la evaluación de la calidad de la fibra (medidas de densidad lineal de la fibra, tasa de madurez, medida de la cantidad relativa de celulosa en un corte transversal de fibra, y Micronaire, instrumento de corriente de aire que aporta medidas de finura y madurez de las fibras de algodón) [196-199], sus propiedades [200, 201], así como para detección de mezclas [202-204]. Por lo tanto, se plantea la obtención de predicciones de humedad mediante NIRS, empleando como valores de referencia los obtenidos con el medidor portátil de humedad, y otros, obtenidos a partir de la determinación de humedad mediante estufa de laboratorio. De este modo, se podrían alcanzar ratios mas elevados en exactitud y precisión sobre la humedad del algodón bruto, parámetro clave para la cuantificación del régimen de ayudas de los agricultores, y que por lo tanto, posee importante repercusión económica, además de la influencia sobre la calidad de la fibra final. Similar importancia alcanza el grado de impurezas, mediante el cual se van a establecer modelos discriminatorios para la detección de algodón con índices inaceptables (en el presente trabajo, superiores al 3% de nivel de impurezas). Los análisis NIR se llevaron a cabo mediante el empleo de dos espectrofotómetros pertenecientes a diferentes generaciones de equipos, es decir, uno para trabajar a nivel de laboratorio, y otro, adecuado para controlar la recepción de materia prima próximo a la línea de procesado (at-line). Este último, se está implantando cada vez más a nivel industrial, a pesar de que la efectividad en su capacidad predictiva puede verse disminuida a causa de sus Control de Calidad sobre Algodón Bruto 163 características de aplicabilidad at-line. El principal motivo que llevó a comparar los modelos obtenidos entre ambos equipos fue debido a que la transferibilidad entre éstos es viable. 3.1.2 Material y Métodos 3.1.2.1 Colectivo experimental El colectivo experimental estuvo constituido por 100 muestras, procedentes de 8 desmotadoras distribuidas por Andalucía, con el objetivo de obtener un conjunto representativo de la variabilidad existente en la región. La recepción de las muestras se llevó a cabo en el IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’, en 4 periodos distintos, distribuidos en 38 días. Dentro de la planificación de la recogida de muestras, no fue posible obtener un número homogéneo por desmotadora, dada la escasa duración de la campaña de recogida (aproximadamente 1 mes), que además estuvo sometida a condiciones climatológicas adversas. Para obtener representatividad de cada unidad de transporte que llega a desmotadora, el proceso de recogida de muestras consistió en tomar un mínimo de porciones, de forma aleatoria, tomando en primer lugar de la parte delantera, intermedia y trasera del vehículo, y posteriormente, del interior del bloque de algodón descargado. El número de porciones es variable en función del tipo de vehículo. De este modo, se toman 5 porciones si se trata de vehículos pequeños, remolques y similares (aproximadamente hasta 4000 kg), 8 porciones si son vehículos medianos, canastas y remolques medianos (aproximadamente hasta 8000 kg), y 12 porciones en el caso de camiones trailer y vehículos que posean un peso superior a 8000 kg. Seguidamente se conformaba una muestra global que no debía ser inferior a 1,5 kg. A continuación, se procedía al proceso de mezcla y homogeneizado, obteniendo una parte representativa que se empaquetaba, identificaba y transportaba al IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’. Estas fueron las muestras empleadas para el desarrollo del presente trabajo, oscilando entre 200-350 g. Este procedimiento está descrito en el protocolo para la determinación de los criterios de aceptación para puesta bajo control de partidas de algodón sin desmotado, respecto al contenido de humedad e impurezas en desmotadoras españolas [205]. 3.1.2.2 Análisis de referencia 3.1.2.2.1 Humedad Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 164 Dada la importancia de este parámetro con respecto a la calidad de la fibra final, así como su repercusión económica en el sector, se han ensayado dos métodos de referencia para contrastar resultados. En primer lugar, se empleó el método actual recogido en los criterios de aceptación de las partidas. Dicho método emplea un medidor portátil de humedad, que, para el presente estudio fue un medidor digital Cotton Moisture Meter®, modelo C-2000 (Delmhorst Instrument Company, Towaco, N.J., U.S.A.). El resultado lo expresa como porcentaje de humedad (%) sobre algodón bruto, basándose las lecturas en la relación entre el contenido de humedad y una resistencia eléctrica. El electrodo empleado fue un Delmhorst® Cotton Electrode (modelo 37 E/C), recomendado para fibras en conos y madejas con 2,54 cm de penetración. El medidor de humedad necesita aproximadamente 3 s para la obtención de una medida estable. La determinación de humedad se realizó en el punto de descarga, a pie de camión, si bien se tomaron de nuevo los valores una vez recibidas las muestras en el IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’. El procedimiento consistió en la adquisición de 5 lecturas, eliminando las medidas extremas, y realizando la media de las tres restantes. El valor obtenido se redondea al medio punto más cercano. Este procedimiento de nuevo se describe en el protocolo para la determinación de los criterios de aceptación para puesta bajo control de partidas de algodón sin desmotado [205]. En las figuras siguientes (figura III-1) se ilustra como se disponían las muestras para su envío y recepción al centro (A), y como se efectuaban las lecturas con el medidor portátil de humedad (B). A B Figura III-1. Recepción de muestras (A); determinación de humedad en algodón bruto mediante medidor portátil (B) Control de Calidad sobre Algodón Bruto 165 El segundo método que se empleó para la determinación de humedad fue el estudio de las diferencias de peso de 15-20 g de muestra cuando se sometían a 100ºC durante 22-24 h en una estufa de laboratorio por convección natural y lectura digital de temperatura y tiempo (J.P. Selecta S.A., Barcelona, España, Digiheat 52L mod. 2001243). Los valores de humedad fueron expresados como porcentajes del peso inicial. Para estudiar la similitud de los resultados obtenidos entre ambos procedimientos, se efectuó un análisis de varianza (ANOVA) de ambos métodos (medidor portátil vs. estufa) con todo el colectivo experimental (100 repeticiones). El software empleado para tal fin fue Statistix v8.0 (Analytical Software, Tallahassee, FL, U.S.A.). 3.1.2.2.2 Impurezas La cantidad de muestra empleada para la determinación de impurezas mediante análisis gravimétrico fue el contenido total de muestra (especificado en el apartado 3.1.2.4), menos 15-20 g que se emplearon para la determinación del contenido de humedad mediante estufa de laboratorio. En primer lugar, la cantidad pesada se extendía sobre un papel de filtro de laboratorio (42 cm x 52 cm, figura III-1B), extrayendo manualmente (empleando pinzas) todas las materias que no fueran fibra o semillas de algodón (restos de plantas, trozos de ramas, cápsulas, hojas y materias terrosas, etc). Esta limpieza se efectuó siempre sobre impurezas que pudieran separarse fácilmente, sin arrastrar fibra. Tan solo quedará algodón que contenga “tabaquillo” (restos de hojas de diámetro igual o inferior a aproximadamente 3 mm). Una vez separadas las impurezas se procedió a su pesado, obteniendo el porcentaje en peso con respecto al total de la cantidad inicial. Del mismo modo, este procedimiento queda descrito en el protocolo para la determinación de los criterios de aceptación para puesta bajo control de partidas de algodón sin desmotado [205]. 3.1.2.3 Análisis NIRS Para la obtención de la información espectral se emplearon 80 g de cada muestra. Todas las muestras fueron analizadas por dos espectrofotómetros NIR. En primer lugar, los espectros fueron obtenidos con un espectrofotómetro modelo 6500 (Foss NIRSystems, Inc., Silver Spring, MD, U.S.A.) equipado con detectores de reflectancia en un Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 166 módulo de transporte (Transport module). Las muestras se disponían en una cápsula rectangular específica para análisis de producto intacto (Natural Products Sample Kit) con una ventana de cuarzo de 94,9 cm2 de superficie. Los 80 g se dividieron en dos porciones iguales que permitía el llenado de la cápsula por duplicado, obteniendo por lo tanto dos espectros de cada muestra. Una vez las muestras eran posicionadas en la cápsula, ésta se tapaba con un dispositivo ajustable a la misma, intentando ejercer siempre la misma presión en cada muestra. Los espectros fueron adquiridos en intervalos de 2nm sobre el rango de longitud de onda en el que trabajaba el equipo (400-2500 nm, región del espectro visible más infrarrojo cercano). El segundo equipo NIRS por el que se analizaron las muestras fue un InfraXact Lab (grupo Foss). Este espectrofotómetro obtiene información en un rango de longitudes de onda de 570-1850 nm, en intervalos de 2 nm, trabajando en modo de reflectancia. En esta ocasión la disposición de las muestras se efectuó en una cápsula circular (Large sample cup), con una ventana de borosilicato de 10,2 cm de diámetro (81.7 cm2). El procedimento de escaneado consistía en la adquisición de lecturas espectrales en 10 diferentes posiciones mientras la cápsula rotaba. El espectro final obtenido es la lectura media de todas las posiciones. Igualmente se emplearon dos cápsulas para el análisis, obteniendo por lo tanto dos espectros de cada muestra, con la misma cantidad que se empleó con el anterior equipo. Sin embargo, a diferencia del NIRSystems 6500, una vez llenadas las cápsulas, no se empleó ningún dispositivo para su cerrado y presión de la muestra, por lo que simplemente se introducía la cantidad de muestra descrita en el interior de la cápsula. Los espectros de ambos instrumentos fueron obtenidos usando un programa informático de análisis de rutina (ISIscan v2.81; Infrasoft International LLC., State Collage, PA, U.S.A.), y almacenados como valores de absorbancia [(log(1/R)]. 3.1.2.4 Sistemática en la metodología de análisis En el esquema siguiente (figura III-2) se exponen todos los pasos llevados a cabo, desde la obtención de muestras, hasta el almacenamiento de información espectral y análisis de referencia. Control de Calidad sobre Algodón Bruto 167 Muestra (M) 80g (M-80g)1 Análisis NIRS Foss NIRSystems 6500 Cáp1=Cáp2=40g InfraXact Lab Cáp1=Cáp2=40g 20g Determinación Humedad (estufa) 60g + (M-80g) = M-20g S-20g Determinación Humedad (med. portátil) S-20g Determinación Impurezas 1 Muestra restante Figura III-2. Descripción del procedimiento de análisis: muestra – análisis NIR – análisis referencia 3.1.2.5 Análisis estadístico A continuación se describen los procedimientos quimiométricos desarrollados para la obtención de modelos que permitan monitorizar el control de calidad de algodón bruto mediante tecnología NIRS. El software empleado para las distintas aplicaciones ha sido WinISI III v1.50e (Infrasoft International). 3.1.2.5.1 Root Mean Squared (RMS) En ambos equipos se han obtenido dos espectros por muestra, cada uno obtenido sobre 40 g de algodón bruto perteneciente a la misma muestra. Como paso previo al mediado de los mismos, para la obtención de un espectro representativo de cada muestra, se calculó el estadístico RMS [19], estableciendo un límite de dicho estadístico para la forma de presentación característica de cada equipo, con la finalidad de asegurar una buena calidad del dato espectral [123]. En este sentido, se eliminaron en primer lugar las muestras que superaron dicho límite. Una vez eliminadas estas lecturas, se obtuvieron otras, consiguiendo nuevos valores RMS. Si se superaba de nuevo el valor límite establecido, se consideraba que la muestra en cuestión no era apta para incluirla en el colectivo de calibración. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 168 El procedimiento de cálculo fue el descrito en el apartado 2.3.2.4.1 (Filtrado de espectros). 3.1.2.5.2. Análisis de Componentes Principales (ACP) Para reducir el número de variables [log(1/R)], eliminando la colinealidad e información redundante existente entre las mismas, se efectuó un ACP. A continuación, se calculó la distancia de cada muestra al centro del modelo generado en el nuevo espacio vectorial definido por las componentes principales. La distancia empleada para tal efecto fue la de Mahalanobis (H), y el criterio empleado para considerar una muestra como anómalo espectral fue H>3 [19]. Se efectuaron cinco ACPs para cada forma de presentación de muestras (equipo NIRSystems 6500 y equipo InfraXact Lab), aplicando en cada uno de ellos un tratamiento matemático sobre la señal espectroscópica (derivada y/o corrección de radiación dispersa). Se consideraron muestras anómalas aquellas que al menos se presentaban como tales, en tres de los cinco tratamientos matemáticos aplicados. 3.1.2.5.3 Modelos de predicción El colectivo experimental (N=100) se dividió mediante selección al azar en un grupo de calibración (N=80) y otro de validación (N=20). Se empleó Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales Modificada (RMCPM) para desarrollar los modelos de calibración, con 6 grupos o pases de validación cruzada para evitar el fenómeno de sobreajuste. De este modo, el colectivo de calibración se dividía en 6 grupos, 5 para el desarrollo de un modelo y uno para validación del mismo, de forma iterativa hasta que todas las muestras hubieran participado tanto en fase de calibración como de validación. El programa informático selecciona el modelo que aporta menor error de validación cruzada. Los pretratamientos matemáticos aplicados sobre la señal espectroscópica incluyeron primera y segunda derivada, con diferentes tamaños de suavizado y segmentos de derivación, corrección de radiación dispersa Multiplicative Scatter Correction (MSC) y Standard Normal Variate and Detrending (SNV-DT), junto con el empleo de dos regiones de longitud de onda, VIS+NIR y NIR. Se obtuvieron predicciones de humedad sobre los datos obtenidos en las dos metodologías empleadas para su determinación (medidor portátil y estufa), y sobre los datos obtenidos en los dos equipos empleados (NIRSystems 6500 e InfraXact Lab). Se determinaron un total de 34 ecuaciones con los datos de cada metodología, 32 como resultado de las combinaciones de los Control de Calidad sobre Algodón Bruto 169 pretratamientos descritos, y dos modelos obtenidos a partir de espectros brutos (sin aplicación de derivadas ni corrección de radiación dispersa). Los pretratamientos aplicados a partir de las combinaciones de derivada y corrección de radiación dispersa vienen representados en la figura III- 3. Tratamiento de Derivada1 1,4,4 2,4,4 1,5,5 2,5,5 1,8,4 2,8,4 1,10,5 2,10,5 Tratamiento de Derivada1 1,4,4 2,4,4 1,5,5 2,5,5 1,8,4 2,8,4 1,10,5 2,10,5 X Corrección Radiación Dispersa2 SNVDT MSC Corrección Radiación Dispersa2 SNVDT MSC RangoEspectral NIRSystems 6500 InfraXact VIS+NIR (400 – 2498nm) (570 – 1848nm) NIR (1100 – 2498nm) (1100 – 1848nm) RangoEspectral NIRSystems 6500 InfraXact VIS+NIR (400 – 2498nm) (570 – 1848nm) NIR (1100 – 2498nm) (1100 – 1848nm) 1 #,#,# : Orden derivada, segmento derivación (nm), suavizado 2 SNVDT: Standard Normal Variate and De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction X Figura III-3. Pretratamientos aplicados sobre los espectros para la obtención de modelos predictivos de humedad sobre algodón bruto Para la evaluación de los modelos se empleó el Error Típico de Validación Cruzada (ETVC) y el coeficiente de determinación (r2), en fase de calibración. En fase de validación externa, se empleó el coeficiente de determinación (R2VE), el Error Típico de Predicción (ETP), y la pendiente de los valores predichos en validación externa. La expresiones que definen estos estadísticos se encuentran en el apartado 2.3.2.4.4 (Modelos de predicción de mezclas). Además, para completar la evaluación de la capacidad predictiva de los modelos, se determinó también el estadístico RPD (Residual Predictive Deviation), expuesto el apartado 2.4.2.4.3 (Modelos predictivos: Calibración y Validación). 3.1.2.5.4 Modelos de diferenciación entre niveles de impurezas Estos modelos se diseñaron para establecer un sistema de detección de muestras que identifique un determinado nivel de impurezas a partir del cual se considera una merma en la calidad del algodón bruto analizado. El nivel de impurezas que presentaba el colectivo experimental (N=100) estaba comprendido entre 0,6%-6,45%. El nivel actualmente reconocido en la industria algodonera española es del 5% [206]. El límite que se estableció en el presente trabajo fue del 3%, principalmente por dos razones. En primer lugar que el 97% del algodón español se produce en Andalucía, y los niveles de impurezas que aquí se registran se encuentran entre 1,6%-3% [207]. La otra razón es evidente, ya que si los modelos consiguen discriminar entre niveles de impurezas del 3%, prácticamente se asegura el éxito en la diferenciación del 5%. Los algoritmos empleados fueron análisis discriminantes mediante ecuaciones de regresión por mínimos cuadrados parciales (AD-MCP). Se obtuvieron modelos ensayando con los mismos Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 170 pretratamientos matemáticos sobre la señal que los descritos en la figura III-3. Los mismos colectivos (calibración y validación) que se emplearon para el desarrollo de los modelos predictivos, fueron seleccionados para el diseño de estos modelos. De las 80 muestras empleadas para fase de calibración, 46 poseían menos de un 3% de impurezas, y 34 el porcentaje era superior. 3.1.3 Resultados y Discusión 3.1.3.1 Características de espectros VIS-NIR de algodón bruto La figura III-4 muestra los espectros medios de algodón bruto de los colectivos que conforman los dos niveles de impurezas generados, obtenidos con cada instrumento. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 570 790 1010 1230 1450 1670 Longitud de onda (nm) log (1 /R ) Nivel Impurezas < 3% Nivel Impurezas > 3% B log (1 /R ) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 400 620 840 1060 1280 1500 1720 1940 2160 2380 Longitud de onda (nm) log (1 /R ) Nivel Impurezas < 3% Nivel Impurezas > 3% A log (1 /R ) Figura III-4. Espectros medios característicos de los niveles de impurezas en algodón bruto (<3%, >3%) obtenidos a partir del equipo NIRSytems 6500 (A) e InfraXact Lab (B) Todos los espectros medios presentaron patrones similares, encontrando escasas diferencias en valores de absorbancias. A pesar de ello, estas diferencias fueron mayores en la región visible del espectro (400-800 nm). En menor medida, se apreció también cierta diferencia en ambos instrumentos en las regiones comprendidas entre 1420-1550 nm, y 1650-1848 nm. Concretamente, entre los espectros obtenidos con el equipo NIRSystems 6500 se observaron además ligeras diferencias en la región comprendida entre 1920-2030 nm, y en las bandas de absorción en torno a 2230 nm y 2400 nm. Estas variaciones se debieron a diferencias en tamaño de partícula y composición, debidas principalmente a diferentes niveles de impurezas en el algodón. Del mismo modo, las impurezas poseen un color totalmente distinto a las fibras de algodón, por lo que espectros con diferentes niveles de impurezas, presentaron diferencias en la región del espectro visible. Por otro lado, la fibra de algodón contiene más de un 90% de celulosa, razón que justifica las diferencias apreciadas en regiones espectrales de absorción en la región Control de Calidad sobre Algodón Bruto 171 visible e infrarrojo cercano, que son características de este compuesto (758 nm, 816 nm, 914 nm, 982 nm, 1004 nm, 1428 nm, 1588 nm, 1636 nm, 1702 nm, 1748 nm, 1828 nm, 1930 nm) [179]. 3.1.3.2 Estudio de repetibilidad espectral Como se ha comentado, para la obtención de información espectral de calidad, se estableció un límite del estadístico RMS en cada una de las formas de presentación empleada con cada espectrofotómetro. Este valor evalúa la similitud entre los espectros de cada muestra, así, un valor de RMS bajo es indicativo de una elevada similitud entre espectros de una muestra. El límite establecido para el equipo NIRSystems 6500 fue 20000. Cinco muestras superaron este valor, por lo que se analizaron de nuevo para decidir si estos valores iniciales fueron causa de fuentes de error debidos a la metodología de análisis (alto nivel de heterogeneidad de la materia prima, imprecisiones en el empaquetado de las muestras en la cápsula, diferencias en tamaño de partícula, área escaneada, etc.) o si por el contrario, presentaban características que sistemáticamente causaban elevados valores del estadístico RMS, y por lo tanto debían ser eliminadas del colectivo experimental. En la obtención de los nuevos espectros, la repetibilidad entre submuestras (RMS) se encontraba dentro del límite establecido (<20000), por lo que sí se incorporaron al colectivo experimental. En el caso del equipo InfraXact Lab, el valor límite ascendió a 55000, superando 6 muestras este valor. Cuando se repitieron los análisis, en ningún caso se superó el límite establecido, por lo que también fueron incluidas en el colectivo. La figura III-5 representa los valores individuales obtenidos del estadístico RMS a partir de la información espectral de muestras de algodón bruto con cada uno de los equipos empleados. La línea horizontal representa el valor frontera RMSlímite calculado en cada caso. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 172 0 50000 100000 150000 200000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 20000 NIRSystems 6500 0 50000 100000 150000 200000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 55000 InfraXact Lab Figura III-5. Valores individuales del estadístico RMS en algodón bruto Como se observa, los valores RMS obtenidos con el equipo Infraxact Lab son generalmente superiores con respecto a los obtenidos con el NIRSystems 6500. También se aprecia una menor variabilidad de los datos obtenidos a partir del NIRSystems 6500. Esta homogeneidad probablemente se deba al efecto que produce la compactación de la muestras, es decir, como se apuntó, todas las muestras que fueron analizadas en la forma de presentación empleada con el equipo NIRSystems 6500, se compactaban mediante el cerrado de la cápsula con una tapa ejerciendo una fuerza de compactación similar, y siempre introduciendo la misma cantidad (40 g). Esta compactación no se lleva a cabo en la forma de presentación de muestras del equipo Infraxact Lab, ya que la cápsula empleada para su análisis no dispone de tapa. Este hecho además causó un incremento en la repetibilidad de la señal en el equipo NIRSystems 6500 con respecto al InfraXact Lab. En 1994, llevando a cabo un estudio para predecir características de la fibra de algodón mediante tecnología NIRS, en modo de reflectancia, ya indicaron la importancia del área de muestra escaneada y la fuerza aplicada para presionar las fibras en la cápsula de análisis [208]. Estos autores confirmaron que el encapsulado manual del algodón bruto causaba anómalos espectrales resultantes de la inestabilidad de dicho empaquetado y de las diferencias intrínsecas entre el mismo material. 3.1.3.3 Análisis de Componentes Principales Tan solo una muestra presentó una distancia de Mahalanobis (H) con respecto al centro de su grupo superior a 3, con la consecuente denominación de anómalo espectral. Esta muestra pertenece al grupo de espectros obtenidos con el equipo NIRSystems 6500. La figura III-6 representa los valores individuales de cada muestra sobre las tres primeras Control de Calidad sobre Algodón Bruto 173 componentes principales, previa aplicación de primera derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT sobre la señal espectroscópica. Estos gráficos permiten apreciar si el colectivo experimental presenta alguna pauta de agrupamiento. Figura III-6. Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2 y CP3) con pretratamiento de primera derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT sobre la información espectral de NIRSystems 6500 (A) e InfraXact Lab (B) para muestras de algodón bruto procedentes de ocho industrias desmotadoras (I1-I8) Se observa un agrupamiento entre muestras de diferentes orígenes (industrias desmotadoras de algodón). Esta caracterización se debe a que en cada desmotadora se recepcionaban muestras procedentes de diferentes orígenes geográficos, con lo cual lleva asociado diferencias en composición condicionadas, en primer lugar, por factores agroclimáticos propios de cada zona (precipitaciones, temperaturas, horas de sol, características edafológicas, años de cultivo, incluso prácticas culturales), y en segundo lugar por diferencias en cuanto a variedades empleadas. La información relativa a variedades no se conocía, dado que el Documento de Control de Entrega de algodón sin desmotar, perteneciente a la Coordinación Técnica de actuaciones para la gestión de las ayudas comunitarias en el sector del algodón para las campañas 2006/2007 y siguientes, publicado en su día por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, no recoge este tipo de información. 3.1.3.4 Predicciones de humedad Se efectuó en primer lugar una comparación mediante un Análisis de Varianza (ANOVA), entre los valores de humedad obtenidos por las dos metodologías empleadas, esto es, el medidor portátil de Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 174 humedad y la estufa de laboratorio. Los resultados mostraron que la probabilidad de obtener un valor al azar de F=5,31 fue P=0,02 (P<0,05), en consecuencia, los valores obtenidos mediante ambas metodologías eran significativamente distintos. Así, los valores de humedad obtenidos mediante estufa de laboratorio fueron más amplios y con mayor variabilidad (mayor rango y DT). De este modo, se encontraron unas diferencias en porcentajes entre sus medias de 7,39%. Es probable que estas diferencias fueran debidas a la menor precisión en la determinación de humedad del medidor portátil, ya que en el Protocolo para la determinación de los criterios de aceptación para puesta bajo control de partidas de algodón sin desmotado, respecto al contenido de humedad e impurezas en desmotadoras españolas, los valores de humedad deben ser obtenidos con un medidor portátil, en la que todas determinaciones deben ser redondeadas al medio punto más cercano. Aunque por otro lado, el método de estufa de laboratorio para determinación de humedad podría estar sesgado, como se admite en los métodos ASTM, debido a la pérdida de materiales volátiles (compuestos orgánicos), tenidos en cuenta como si se tratara de humedad. La tabla III-1 expone los estadísticos relativos a los contenidos de humedad de las muestras pertenecientes a los colectivos de calibración y validación. Asimismo, las tablas III-2 y III-3 muestran los resultados de los modelos seleccionados para la predicción del contenido de humedad con los equipos NIRSystems 6500 e InfraXact Lab respectivamente. Tabla III-1. Valores de referencia (media, rango y desviación típica, DT) del contenido de humedad (%) en algodón bruto, para los colectivos de calibración y validación Calibración (N = 80) Validación (N = 20) Análisis de Referencia Media Rango DT Media Rango DT Medidor Humedad 8,94 6,5 - 13 2,07 9,32 5 - 13 2,35 Estufa 9,67 5,83 -14,96 2,27 9,91 6,83 - 13,47 2,39 Control de Calidad sobre Algodón Bruto 175 Tabla III-2. Modelo de predicción seleccionado para la determinación del contenido de humedad de algodón bruto mediante el equipo NIRSystems 6500 Pretratamientos Calibración Validación Análisis de Referencia Derivada Correción “Scatter” Región espectral Factores MCP ETVC (%) R 2 ETP (%) Pte. r 2 RPD Medidor Humedad 2,10,5 MSC VIS+NIR 5 0,44 0,95 0,46 1,12 0,97 5,11 Estufa 1,10,5 SNV-DT VIS+NIR 3 0,43 0,96 0,44 1,03 0,97 5,43 Tabla III-3. Modelo de predicción seleccionado para la determinación del contenido de humedad de algodón bruto mediante el equipo InfraXact Lab Pretratamientos Calibración Validación Análisis de Referencia Derivada Corrección “Scatter” Región espectral Factores MCP ETVC (%) R 2 ETP (%) Pte. r 2 RPD Medidor Humedad 1,5,5 MSC NIR 5 0,45 0,95 0,49 1,15 0,97 4,78 Estufa 1,4,4 MSC VIS+NIR 6 0,46 0,95 0,46 1,09 0,97 5,2 El equipo NIRSystems 6500 produjo modelos ligeramente superiores que el InfraXact Lab, tanto con los datos obtenidos a partir del medidor portátil de humedad, como con la estufa de laboratorio. Observando las tablas III-2 y III-3, se comprueba como el equipo NIRSystems 6500 obtuvo valores inferiores de ETVC, ETP, pendientes más próximas a la unidad, así como valores superiores de RPD, aunque en todos los casos dichos valores fueron superiores a 3. Es probable que estos resultados se deban a las diferentes regiones de trabajo en las que obtiene información cada espectrofotómetro. Así, el NIRSystems 6500 trabaja entre 400-2498 nm, recogiendo información de todas las bandas de absorción de agua localizadas en el infrarrojo cercano (nivel de absorción fuerte: 1410, 1460 y 1906 nm; nivel de absorción medio: 718, 758 y 964 nm; nivel de absorción débil: 810, 894, 1116, 1154, 1778 y 2208 nm) [179]. Sin embargo, el equipo InfraXact Lab adquiere espectros entre 570-1850 nm, no obteniendo información por tanto de absorciones (fuerte y débil) localizadas a 1906 nm y 2208 nm. Por otro lado, la forma de presentación de muestras del equipo InfraXact Lab aportó mayor variación entre espectros de una misma muestra (menor repetibilidad). Además, la superficie de ventana de análisis era inferior que la del NIRSystems 6500 (81,7 cm2 vs. 94,9 cm2). Otros autores ya tuvieron en cuanta estos factores [208], argumentando que la precisión espectral para el Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 176 algodón bruto está fuertemente relacionada con el área escaneada y la fuerza aplicada para presionar las fibras sobre la ventana de la cápsula de análisis. Si se contrastan resultados entre métodos de referencia, los valores de humedad obtenidos mediante la estufa de laboratorio, aportaron resultados ligeramente superiores en validación (ETP y pendiente) que los obtenidos con los del medidor portátil de humedad. El mejor modelo predictivo se obtuvo con el equipo NIRSystems 6500, empleando los valores de humedad obtenidos con la estufa de laboratorio, alcanzando un Error Típico de Predicción de 0,44%. El pretratamiento que se le aplicó a este modelo fue primera derivada y corrección de radiación dispersa o Scatter SNV-DT. Pretratamientos análogos se han observado en trabajos con similares productos (fibra, industria textil, etc.). De este modo, en un estudio reciente (2007) [209], donde se ensayaban diferentes aproximaciones en la selección de variables de modelos multivariables NIR para predecir el contenido de algodón sobre diversos tejidos, emplearon SNV y segunda derivada. El mismo pretratamiento fue practicado por otros autores [210] para controlar mediante infrarrojo cercano el proceso de fabricación de fibra acrílica. Otros [211], en la clasificación de productos textiles mediante información espectral NIR, también aplicaron corrección de radiación dispersa SNV, sin indicar el pretratamiento de derivada. 3.1.3.5 Diferenciación entre niveles de impurezas Los modelos seleccionados para la detección de muestras de algodón bruto con niveles de impurezas superiores al 3% se muestran en las tablas III-4 (pretratamientos) y III-5 (estadísticos en calibración y validación). Tabla III-4. Pretratamientos aplicados a los modelos discriminantes seleccionados para detectar niveles de impurezas en algodón bruto superiores al 3% Pretratamiento Intrumento Derivada Correc. “Scatter” Región espectral NIRSystems 6500 1,8,4 MSC NIR InfraXact Lab No No NIR Control de Calidad sobre Algodón Bruto 177 Tabla III-5. Modelos discriminantes seleccionados para detectar niveles de impurezas superiores al 3% en algodón bruto Calibración Validación Intrumento Fact. MCP Incorrect. Clasif. Correct. Clasif. Exactitud (%) Incorrect. Clasif. Correct. Clasif. Exactitud (%) NIRSystems 6500 7 16 64 80 4 16 80 InfraXact Lab 4 23 57 71 6 14 70 En cuanto a los modelos discriminantes obtenidos a partir de espectros de algodón bruto para diferenciar niveles de impurezas, se obtuvo un mejor comportamiento cuando se excluyó la región del espectro visible para su cálculo. En este caso, el equipo NIRSystems 6500 obtuvo el mejor modelo empleando primera derivada y corrección de radiación dispersa Multiplicative Scatter Correction (MSC). En cambio, el equipo InfraXact Lab lo obtuvo a partir de espectros brutos, sin ningún tipo de pretratamiento. Entre ambos modelos, los resultados más optimistas se obtuvieron con los del equipo NIRSystems 6500, alcanzando en calibración un error de clasificación del 20% frente al 29% obtenido por el InfraXact Lab. Cuando estos modelos se validaron externamente los errores respectivos de clasificación fueron del 20% y 30% según se tratase del equipo NIRSystems 6500 e InfraXact Lab. Como ya se ha comentado, estas diferencias se deben al mayor rango espectral, y a la mayor repetibilidad en el proceso de adquisición de la señal espectroscópica del equipo NIRSystems 6500. La figura III-7 muestra la distribución que presentaba el colectivo de calibración en cuanto a sus niveles de impurezas. Se aprecian 12 muestras próximas al límite establecido (3%), seis entre 2,8% - 3%, y seis entre 3%-3,2%. Este grupo de muestras representan un porcentaje importante del colectivo de calibración (15%). Por lo tanto, este hecho, junto con el proceso manual empleado como método de referencia, incrementó notablemente los errores de clasificación obtenidos. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 178 0 1 2 3 4 5 6 7 0,6 1 1,4 1,8 2,2 2,6 3 3,4 3,8 4,2 4,6 5 5,4 5,8 6,2 6,6 Impurezas (%) Fr ec ue nc ia Figura III-7. Distribución del contenido en impurezas del colectivo de calibración (<3%, n = 46; >3%, n = 34) 3.2 Síntesis Los valores de humedad de muestras de algodón bruto obtenidos mediante diferencias de peso en estufa de laboratorio fueron significativamente distintos a los obtenidos por el método actualmente empleado para el control de calidad de algodón bruto (medidor portátil de humedad). Las predicciones de humedad obtenidas mediante tecnología NIRS en algodón bruto aportaron elevados valores de exactitud y precisión, empleando como método de referencia, tanto estufa de laboratorio como medidor portátil de humedad, en ambos espectrofotómetros (NIRSystems 6500 e InfraXact Lab). De estos resultados, el mejor modelo se obtuvo cuando se empleó como método de referencia estufa de laboratorio y equipo NIRSystems 6500. De este modo, se puede justificar el uso de la tecnología NIRS en la industria algodonera para predecir niveles de humedad, parámetro básico en su control de calidad. Por otro lado, el equipo NIRSystems 6500 diferenció muestras de algodón bruto con diferentes niveles de impurezas. Así, el establecimiento de un sistema de alerta para la detección de ciertos niveles de impurezas es viable, aunque es necesario alcanzar mayores cotas de precisión en los modelos obtenidos. Control de Calidad sobre Algodón Bruto 179 BIBLIOGRAFIA [194] Reglamento (CE) Nº 1051/2001 del Consejo, de 29 de Mayo de 2001. DOCE L 148, 1. [195] J.G. Montalvo, T. Von Hoven, Near-Infrared Spectroscopy in Agriculture, C.A. Roberts, J. Workman and J.B. Reeves III (Eds.), American Society of Agronomy, Crop Science Society of America and Soil Science Society of America, Madison, Wisconsin, USA, 2004, p. 671. [196] C.S. Suh, Proceedings of the 3rd Asian textile conference research and development in the Pacific Rim, Vol. 1, Hongkong, 1995, p. 105. [197] W.J. Jasper, E.T. Kovacs, Text. Res. J., 1994, 64(8), 444. [198] H.N. Feng, S.Z. Jin, B. Gan, Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering, Vol. 6031, Art. N. 603116, Bellingham, USA, 2006. [199] J.A. Thomasson, S.A. Shearer, Trans. ASAE, 1995, 38(4), 1005. [200] B. Tennigkeit, T. Schneider, Melliand Textilberichte, 1996, 77(1-2), 18. [201] J.G. Montalvo, S.E. Faught, H.H. Ramey, S.E. Buco, J. 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En la capa más externa, el epicarpio, conocido como flavedo, destaca la localización de células que contienen carotenoides que le aportan el color característico al fruto, así como vesículas superficiales que contienen aceites esenciales que protegen al fruto del ataque de agentes externos. Bajo el epicarpio, se sitúa el mesocarpio o albedo, capa generalmente gruesa, blanca y esponjosa. El albedo consta de un gran número de células parenquimatosas que son ricas en sustancias pécticas y hemicelulósicas. El flavedo y albedo en conjunto constituyen el pericarpio. Conocido comúnmente como cáscara o piel del fruto [212]. Variedades de naranjas con la cáscara más fina, facilitan el pelado y cortado para consumo en fresco, y por el contrario, requieren una manipulación más delicada y tiempo limitado para el almacenamiento, siendo un inconveniente para el procesado de las mismas. La porción comestible o endocarpo (la pulpa del fruto) está compuesta por segmentos o carpelos. Dentro de cada segmento se localizan muchas vesículas alargadas compuestas a su vez por células que almacenan grandes vacuolas que contienen el zumo, constituido principalmente por azúcares y agua cuando el fruto madura, además de ácido cítrico que se produce en la mitocondria y también se acumula en la vacuola [213]. Segmento Vesículas (aceites) Albedo Flavedo Vesículas de Zumo Figura IV-1. Naranja dulce Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 184 Numerosos compuestos químicos se distribuyen entre los tejidos que conforman el fruto, en diferentes concentraciones según su localización. Así, glicósidos flavonoides se encuentran en mayor concentración en el albedo que en las vesículas de zumo o en el flavedo, los compuestos que aportan sabor amargo al fruto y al zumo (limonina principalmente) se encuentran en las semillas y albedo. En el proceso de maduración, la piel cambia de color, pasando de verde a amarillo y al naranja característico. El contenido en acidez desciende y el grosor de la piel aumenta. En el desarrollo del fruto, los principales cambios en constituyentes químicos se dan en el color (carotenoides), nitrógeno total, azúcares, ácidos orgánicos, flavonoides y limonoides, lípidos, compuestos volátiles, ceras, esteroides, terpenos, vitaminas y minerales [212]. Figura IV-2. Estructura de una célula de zumo de naranja de una vesícula del endocarpio (adaptación de D.A. Kimball) [213] 4.1.2 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en Control de Calidad de Zumos El análisis NIRS en líquidos presenta ciertas particularidades con respecto al análisis de productos sólidos, destacando la forma de presentación y preparación de las muestras, que condiciona la interacción con la radiación. Así, en lugar de trabajar en reflectancia, son la transmitancia y transflectancia las formas de análisis empleadas [214]. Tradicionalmente, la aplicación de la tecnología NIRS en líquidos ha implicado diluciones, suspensiones y procesos de homogeneización de la muestra, como etapas previas al análisis. No menos importante ha sido el control de factores ambientales, principalmente la temperatura. En el mercado, se encuentran diversas cápsulas de análisis para líquidos, que incluyen en su diseño, sistemas de control de temperatura que permiten incrementar la reproducibilidad de las medidas. En la literatura relacionada con aplicaciones de la tecnología NIRS en bebidas, se suele establecer la división entre bebidas alcohólicas y no alcohólicas. Dentro de las bebidas no alcohólicas, destacan trabajos sobre zumos de frutas, café, té y refrescos. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 185 Concretamente, las aplicaciones sobre zumos de frutas, se pueden clasificar en trabajos de determinaciones de constituyentes, y otros dedicados a autentificación del producto, si bien los primeros en ocasiones han servido para los objetivos perseguidos por los segundos, Por ejemplo, mediante el desarrollo de modelos predictivos de sólidos solubles (º Brix), permite establecer detecciones de adulteraciones de un tipo de zumo en otro, o la adición de azúcares [215]. 4.1.2.1 Predicciones de constituyentes Los parámetros químicos que adquieren mayor importancia en los zumos de frutas son los azúcares, totales o individuales, y la acidez. Los azúcares totales se suelen cuantificar como sólidos solubles mediante medidas refractométricas (º Brix), debido a que son los principales componentes como tales en zumos de frutas, concretamente en forma de glucosa, fructosa y sacarosa. Existen trabajos donde se ha intentado obtener modelos para predecir azúcares totales e individuales válidos para diversos tipos de zumos. Siempre se ha llegado a la conclusión de que es recomendable obtener modelos individuales para cada tipo de zumo, ya que disminuían los errores predictivos [216, 217]. En el desarrollo de aplicaciones NIRS sobre este tipo de productos, surge el problema del gran contenido en agua, que puede disminuir la calidad de las predicciones de parámetros que se presentan en concentraciones relativamente bajas, ya que las medidas NIRS sobre sistemas acuosos producen interferencias debidas a las anchas bandas vibracionales del agua [219]. Por esta razón, una de las estrategias que se llevaron a cabo cuando se comenzó a aplicar el infrarrojo cercano sobre estos productos, fue la desecación del zumo (técnica DESIR, Dry Extract System for InfraRed), tomando posteriormente la información espectral en modo de reflectancia [218]. Pero, a pesar de que en la mayoría de frutos el contenido en agua ronda el 80-85%, el análisis en el infrarrojo cercano puede ser más fácil que en otras regiones del espectro electromagnético, como el infrarrojo medio, ya que la intensidad de absorción de éste es mucho mayor. Para salvar el problema del agua, otra estrategia comúnmente empleada, que evita la desecación del producto, se basa en la eliminación de zonas próximas a las cuatro bandas de absorción intensas de esta molécula (970, 1190, 1450 y 1950 nm), reduciendo el rango de lectura [220]. La tabla IV-1 expone a modo de resumen, los mejores resultados obtenidos sobre trabajos en esta temática. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 186 Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 187 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 188 Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 189 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 190 En comparación con otros productos de la industria agroalimentaria, el volumen de trabajos en control de calidad de zumo de frutas mediante tecnología NIRS existente en bibliografía científica, no es muy extenso. La gran mayoría han sido sometidos a procesos de homogeneización, genéricos como centrifugación, o más específicos, como filtración mediante gasa [230], para minimizar la cantidad de sólidos en suspensión, evitando fenómenos de radiación dispersa y obtener modelos más robustos. Este hecho ha limitado la existencia de aplicaciones NIRS que sean transferibles a la industria agroalimentaria. Como ejemplo, podemos destacar la obtención de una ecuación global para determinación de azúcares sobre once tipos de zumo centrifugados, en donde la disminución de la exactitud de la ecuación, se justificaba por el contenido de sólidos disueltos que aún quedaban en el zumo de piña una vez centrifugado, produciendo un incremento en la cantidad de luz dispersa que provocaba una disminución de la capacidad predictiva del modelo [217]. En conjunto, se observan muy pocos trabajos que determinen sólidos solubles y acidez, parámetros básicos para el control de calidad en este tipo de productos, que influyen sobre la apreciación del consumidor para la selección de los mismos [226, 228, 229, 231]. Si de estos estudios, se tiene en cuenta los que han trabajado sobre zumo intacto, prácticamente son inexistentes las aplicaciones desarrolladas. Un aspecto generalizado en todos los estudios, ha sido la pérdida de precisión en los modelos NIRS, si se comparan con métodos de análisis de referencia como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High-performance liquid chromatography), la electroforesis capilar o la espectrometría de masas y ultravioleta. Sin embargo, siempre es preferida la tecnología espectroscópica del infrarrojo cercano dada la asombrosa reducción de tiempo y coste de análisis, así como la elevada velocidad de respuesta, no empleo de reactivos químicos y posibilidad de control de producto de forma intacta. Un factor crítico en el desarrollo de aplicaciones con estos productos, ha sido la determinación del paso óptico óptimo, ya que, con el incremento del mismo se produce un aumento en la sensibilidad para la determinación del analito, pero causa una reducción fuerte del rango de longitud de onda en el que se pueden obtener medidas de absorbancia sin saturación. En un trabajo en el que se compararon agua pura con concentraciones de glucosa, se consideró que Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 191 un paso óptico adecuado para soluciones azucaradas era como máximo de un milímetro, donde tan solo se obtenían medidas saturadas entre 1850 y 1975 nm [220]. Como se ha comentado, el azúcar del zumo de frutas generalmente está compuesto por glucosa, fructosa y sacarosa. En casi todos los trabajos se ha prestado especial atención en la detección de longitudes que adquieren mayor importancia para el desarrollo de los modelos. Para la estimación de azúcares en zumos de naranja, piña-uva y melocotón-uva, se consideraron adecuados los rangos comprendidos entre 1325 – 1800 nm y 2020 – 2390 nm [220]. Por otro lado, analizando azúcar total en zumo de naranja comercial, la región comprendida entre 780 – 1100 nm parece que no contribuyó significativamente a disminuir los errores de predicción tanto en transmitancia como en transflectancia [223]. En la estimación de sólidos solubles en zumos, se obtuvieron modelos con valores predictivos adecuados, en los que tan solo participó una longitud de onda para su desarrollo, 2270 nm [215]. Con el tiempo, los trabajos empleaban mayor nivel de concreción en la selección de las longitudes de onda. Así, en el análisis de azúcar de zumo de manzana, consideraron las longitudes de onda más importantes en 912 y 938 nm, relacionadas con el tercer sobretono del enlace C-H, concluyendo que las longitudes de onda efectivas para la determinación del contenido total de azúcar en zumo de manzana se encontraban entre 900 – 940 nm [224]. En otros trabajos se han observado variaciones a lo largo del espectro en torno a 1600 – 1800 nm asociados al primer sobretono del enlace C-H, concretamente a 1660, 1685, 1695, 1725 y 1780 nm [227, 230]. Esta información está relacionada con el contenido de azúcar y acidez, concretamente con los ácidos cítrico y málico, presentes en numerosos zumos de fruta y con enlaces C-H en su estructura química [227]. Otros autores afirmaron que tienen particular importancia el rango comprendido entre 970 – 990 nm para sólidos solubles y entre 910 – 925 para acidez [231]. Un aspecto habitual observado en casi todos los trabajos NIRS para predecir parámetros en zumos de frutas, ha sido la aplicación de pretratamientos sobre la señal, tanto de derivada (primera y segunda), como de corrección de la radiación dispersa. 4.1.2.2 Autentificación y diferenciación En el desarrollo de la tecnología NIRS para la autentificación de zumos de frutas, las primeras Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 192 investigaciones fueron desarrolladas sobre la década de 1990’s. Una apreciación observada casi en la totalidad de los trabajos realizados, fue la no distinción de la característica a estudiar (tratamiento térmico, fenómeno de oxidación, efecto de la variedad, adulteración, etc.) mediante un análisis visual previo de los espectros brutos que constituían el colectivo experimental. En 1995 se estudió la posibilidad de detección de adulteraciones en concentraciones del 10% y 5% en zumo de naranja concentrado. Las del 10% consistían en pulpa residual procedente de naranjas exprimidas y pomelo. Las adulteraciones del 5% estaban conformadas por los productos descritos, y una mezcla de azúcares y ácidos sintéticos. Empleando Análisis Discriminante Factorial (ADF), se detectaron las incorporaciones en el zumo de naranja con una precisión media del 90%, destacando que ninguna muestra adulterada se incluyó en el grupo de zumo de naranja auténtico [235]. Posteriormente, con zumos de manzana, se empleó Análisis de Componentes Principales para efectuar clasificaciones que se explicaban por diferencias en concentraciones de parámetros químicos (azúcares y acidez), así como para la detección de muestras anómalas [222]. Mediante las predicciones de azúcar en zumos de frutas (totales e individuales) que en diversos trabajos se iban obteniendo, se apreciaba la posibilidad de desarrollar aplicaciones rápidas, precisas y no destructivas para monitorizar adulteraciones y/o contaminaciones [219], como se comentó al comienzo del presente apartado. El grueso de aplicaciones cualitativas de la tecnología NIRS en zumos de frutas se concentra en el último lustro. En 2005 se estudió la utilidad de la tecnología NIRS para la detección y cuantificación de azúcares añadidos en zumos de manzana, mediante la elaboración de dos soluciones adulterantes que simulan la composición en azúcares del zumo: sirope de maíz con 45% de fructosa y 55% de glucosa, y una mezcla de 60% fructosa, 25% glucosa y 15% de sacarosa de caña. Las adulteraciones variaron en porcentajes del 10% al 40%. Se obtuvieron modelos para predecir el porcentaje de adulteración. Así, la primera solución se predecía con R2=0,88 y ETVC=4,8, la segunda con R2=0,59 y ETVC=9,4, y la combinación de ambos R2=0,66 y ETVC=8,73. Estos resultados aportaron una utilidad práctica limitada, por su escasa exactitud en la predicción. Del mismo modo se desarrollaron modelos discriminantes (AD-MCP) para diferenciar entre zumos Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 193 adulterados de los no adulterados, empleando todo el colectivo experimental que constituían los dos grupos generados junto con una combinación de ambos. Dentro de los grupos no adulterados se obtuvo un porcentaje de éxito del 86%, ascendiendo para los zumos adulterados al 96% [236]. En otro trabajo realizado sobre zumo de manzana [237] se intentó detectar la aplicación de un tratamiento térmico mediante microondas (900 W, 30 s) sobre muestras de 15 ml de zumos procedentes de cuatro variedades, mediante el cual alcanzaban temperaturas comprendidas entre 85-90ºC. Realizando Análisis Discriminante con regresión MCP (AD-MCP), se diferenciaron correctamente el 77,2% entre muestras tratadas y no tratadas térmicamente. Empleando el mismo análisis quimiométrico, pero para intentar diferenciar entre variedades, los porcentajes medios de muestras correctamente clasificadas ascendían a 92,35%. Los resultados obtenidos descendieron sustancialmente cuando se intentó diferenciar mediante Análisis Discriminante Lineal (ADL), de forma que las muestras correctamente clasificadas en la detección del tratamiento térmico fueron el 41,2%, y en la diferenciación de variedades, el 61%. El empleo de una huella espectral (fingerprint analysis) basada en las cargas y/o coeficientes de la regresión de parámetros químicos como contenido de sólidos solubles y pH [226], o ácidos cítrico y tartárico [229], permitió el reconocimiento de características en zumos de naranjas, como la detección de calidades. En este último trabajo [229], también se empleó al Análisis de Componentes Principales como herramienta para observar las tendencias primarias de los datos. Permitió una clara diferenciación entre las muestras que pertenecían a tres marcas comerciales de zumo puro de naranja, de las que contenían además del zumo, diversos aditivos. En zumo de tomate, se intentó diferenciar dos situaciones que modifican la calidad final del producto a través de procesos oxidativos. Para ello se analizaron dos colectivos: zumos de tomates recién cosechados, exprimidos, centrifugados y filtrados; zumos en los que se efectuó el mismo procedimiento de extracción, pero transcurrió un mes antes de su análisis, en donde permanecieron a temperatura ambiente. Con un Análisis de Componentes Principales, el colectivo experimental se dividió casi en su totalidad en las dos poblaciones. Los resultados mejoraron cuando se diseñaron modelos de regresión MCP (AD-MCP), mediante los cuales se obtuvieron un porcentaje de muestras correctamente clasificadas del 100%, tanto en calibración, como en la validación externa efectuada [238]. En un estudio reciente, se intentó diferenciar zumo puro de Yangmei (bayas chinas), de Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 194 otros en los que se añadió agua en porcentajes del 10% y 20%. Se emplearon como herramientas quimiométricas, Análisis de Componentes Principales (ACP) y un tipo de análisis mediante Redes Neuronales Artificiales (RNA). El ACP se empleó para llevar a cabo un examen preliminar de los datos, mediante el cual, si bien no se apreció un agrupamiento claro de los grupos (sin distinción de fronteras y elevado nivel de solapamiento) sí se discernían ciertos subgrupos. Con los modelos RNA se alcanzó una precisión en la clasificación entre muestras de zumo puro frente a muestras adulteradas, del 97,62%. En cambio, no fue posible distinguir entre los dos niveles de adulteración de agua empleados [239]. Para identificar el origen de zumos procedentes de 22 variedades de cítricos, se empleó un algoritmo RNA, combinado posteriormente con un Análisis de Correspondencia como método de visualización estadístico (sistema de asociaciones entre los elementos de dos grupos mediante cálculo de distancias). Como método previo de exploración de los datos, de nuevo se aplicó ACP, sin aportar en este caso información, ya que no fue capaz de diferenciar entre las diferentes variedades. Mediante el algoritmo de RNA, la mayoría de espectros de las variedades fueron correctamente clasificados (80%). Posteriormente, basándose en las probabilidades obtenidas de pertenencia de una muestra a un grupo, los autores desarrollaron el análisis de correspondencia empleando distancias euclídeas. Se concluyó que se podían predecir el origen de los cítricos por aproximaciones a muestras similares [234]. 4.1.3 Aplicaciones de la Tecnología NIRS en Control de Calidad de Fruta Intacta El análisis de fruta intacta con tecnología NIRS lleva realizándose más de medio siglo, existiendo abundante información en esta temática, aunque sus avances han sido lentos. Los primeros trabajos comenzaron a desarrollarse en la región del visible, para intentar correlacionar cambios en el color de la piel de manzanas con su maduración, mediante espectros de reflectancia desde 400 a 700 nm [240]. Sobre este tipo de fruto recae el mayor número de estudios realizados. En el desarrollo de aplicaciones sobre fruta intacta, de nuevo surge el problema del elevado contenido en humedad. En 1968, quién se considera el padre de la tecnología NIRS, K.H. Norris, junto con otro investigador (D.R. Bittner), advirtieron que el agua era el principal compuesto en cuanto a absorción de energía en los espectros NIR de fruta intacta [241]. Por lo tanto, diferentes tipos de frutas muestran patrones espectrales similares, dominados por el espectro del agua, sobre todo a 760, 960, 1450 y 1940 nm. Por este motivo, adquiere gran relevancia el empleo de Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 195 sofisticadas técnicas estadísticas de análisis multivariante, necesarias para extraer información útil de este tipo de matrices [242]. A diferencia de otros productos agroalimentarios como granos, forraje o semillas oleaginosas, no comienzan a observarse resultados significativos hasta la década de 1980’s. Uno de los primeros estudios de aplicación de la tecnología mediante análisis multivariante con programas informáticos, se efectuó para la determinación del contenido de sólidos solubles en papaya [243]. A partir de este momento, fueron surgiendo estudios para el control de calidad NIRS sobre fruta intacta mediante la determinación de numerosos constituyentes, parámetros físico-químicos y defectos: carotenoides, clorofila, ácido cítrico, firmeza, fructosa, glucosa, ácido málico, humedad, nitrógeno, sorbitol, sólidos solubles, sacarosa, sólidos totales (materia seca), daños mecánicos, impurezas, decoloración interna, hendiduras, etc. [244]. La tecnología continuó evolucionando, y en la década de 1990’s comenzaron a comercializarse sensores NIRS on-line, para medir la calidad interna de la fruta. Uno de los primeros equipos NIRS comerciales, se empleó para determinar dulzor en manzanas, melocotones y peras japonesas a una velocidad de 3 piezas/s [245]. Dentro de los aspectos claves para el desarrollo de la espectroscopia NIR en fruta intacta, destaca el conocimiento de la geometría de la señal espectroscópica. La radiación NIR que penetra en el tejido de la fruta, disminuye exponencialmente con la profundidad. Se ha encontrado una profundidad de penetración de hasta 4 mm en el rango de 700 – 900 nm y 2–3 mm entre 900 – 1900 nm, en manzanas [242]. Otros autores, que definían la profundidad de penetración como aquella en donde se perdía el 99% de la intensidad de radiación, afirmaron que en manzanas, en el rango de 700 – 900 nm se podía alcanzar una penetración de hasta 25 mm, si bien desde 1400 – 1600 nm bajaba hasta menos de 1 mm [246]. Sin embargo, por las características y grosor de su piel, los cítricos ofrecen una mayor barrera para la penetración de la luz, adquiriendo por lo tanto dificultad el desarrollo de aplicaciones para detectar defectos internos o parámetros de calidad en el interior del fruto mediante medidas de reflectancia o interactancia [247]. Se debe tener en cuenta que la información aportada no es comparable entre sí, dado que las configuraciones ópticas de los equipos empleados son distintas. Un factor importante al respecto es la intensidad de la fuente de radiación. Por ejemplo, trabajar en transmisión con determinadas Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 196 frutas, haría falta una intensidad de radiación que podrían causar quemaduras en el fruto [242]. Repasando los estudios más recientes en los últimos cinco años sobre tecnología NIRS aplicada en fruto intacto, se encuentra diversidad en cuanto a tipo de frutos, si bien dominan los relacionados con cítricos, melón y sandía, peras y manzanas. 4.1.3.1 Aplicaciones en varios tipos de frutos En el presente apartado se incluyen trabajos recientes sobre fruto intacto (últimos cinco años), relacionándose con diferentes tipos de frutos. Por ejemplo, el que se llevó a cabo para determinar firmeza y sólidos solubles en nectarinas mediante un equipo portátil, llegando a la conclusión que en este tipo de determinaciones se deberían obtener modelos individualizados para los distintos tipos de cultivares y tamaño de fruta [248]. En albaricoque, además de calibraciones para sólidos solubles, se obtuvieron modelos de clasificación para estudiar la posibilidad de diferenciar entre frutas antes de someterse a almacenamiento en frío, y una vez que éstas permanecieron durante 4 semanas. La precisión alcanzada fue del 69% [249]. En un trabajo muy reciente sobre el mismo fruto, se desarrollaron modelos predictivos de sólidos solubles, acidez titulable, firmeza, etileno, azúcares individuales y ácidos orgánicos, a partir de 877 albaricoques pertenecientes a ocho cultivares y diferentes estados de maduración. El equipo empleado fue un FT-NIR, obteniendo resultados positivos con los parámetros sólidos solubles y acidez titulable, disminuyendo la calidad de los estadísticos en orden decreciente según se tratara de ácido cítrico, glucosa, sacarosa, etileno, fructosa, ácido málico y firmeza [250]. Empleando otro tipo de fruta de hueso de características similares, melocotón, se han obtenido modelos discriminantes para autentificar variedades con calidad diferenciada, pertenecientes a una región particular de China, con una precisión cercana al 95% [251], modelos predictivos para el contenido total de azúcar [252], así como determinaciones de firmeza [253]. Trabajando con arándanos, se evaluó la tecnología para predecir un índice de maduración, basado en el contenido de sólidos solubles, y propiedades nutraceúticas midiendo fenoles, flavonoides, antocianos y ácido ascórbico. Los autores destacaron la capacidad de la espectroscopia infrarroja para predecir sólidos solubles, en cambio, los resultados que obtuvieron con compuestos fenólicos no alcanzaron los niveles esperados, sobre todo con el ácido ascórbico Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 197 [254]. La determinación de acidez en bayas chinas (yangmei), midiendo pH [255], y la diferenciación de tres tipos de variedades con una precisión del 100% [256], posicionaron a la tecnología con un potencial adecuado para el control de calidad de este tipo de fruta. Sobre diferentes variedades de uvas, midiendo parámetros indicadores de madurez con un instrumento NIRS portátil, se obtuvieron calibraciones con excelentes resultados para grados Brix y madurez, siendo prometedores los valores de antocianos, aunque se demandaba un procedimiento más preciso para la obtención de los valores de referencia [257]. Para evaluar la calidad del mango sobre el árbol, se obtuvieron predicciones de sólidos solubles, sacarosa, glucosa y fructosa, ácido cítrico y diversos minerales con un instrumento portátil. Los mejores resultados se obtuvieron con glucosa y sacarosa, disminuyendo para el resto de constituyentes, hasta llagar a valores de R2=0,22 para el elemento sodio. A pesar de ello, se podían evaluar con mayor precisión otros compuestos minerales (Mg, S, K) que permitían una mejora en el cultivo [258]. En otro trabajo, con el mismo tipo de fruto, valorando la capacidad predictiva de los azúcares individuales, se obtuvieron resultados similares con respecto a la fructosa, pero fueron inferiores en glucosa y sacarosa [259]. Estos resultados se debieron a que en éste trabajo el rango de variabilidad en el fruto era muy amplio, ya que se tomaron lecturas sobre frutos sin madurar hasta pasados unos días del punto de maduración óptimo. 4.1.3.2 Aplicaciones en cítricos Respecto a los últimos estudios realizados con cítricos, un porcentaje importante se centró específicamente en la obtención de predicciones de sólidos solubles. De este modo, se ha evaluado la sensibilidad de estos modelos a importantes factores como fluctuaciones en la temperatura de análisis [260], empleado dos estrategias: diseño de ecuaciones predictivas que cubrieran todo el rango de variación, y otros que trabajaran tan solo sobre rangos estrechos de temperatura. Los autores destacaron el primer tipo, dado que mostraban insensibilidad a este importante factor tan influyente sobre la obtención de espectros en fruto intacto, y requería para su desarrollo menor número de muestras. Los sólidos solubles se predicen sobre cítricos en forma intacta con unos coeficientes de determinación en torno a R2=0,8, y unos errores de predicción alrededor de ETP=0,7 (reflectancia) Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 198 [215] y ETP=0,55 (transmitancia) [262]. En otro estudio [263], se observó una pérdida en los coeficientes de determinación y errores de predicción del 7% y 17% respectivamente, si se obtenían los espectros sobre fruto intacto con respecto a fruto sin piel. Otros estudios, además de sólidos solubles, han determinado el contenido en materia seca [264], acidez total, pH [265], luminosidad y evaluación de la pérdida del contenido de agua aparente [266]. El contenido en materia seca arrojó errores de predicción ligeramente superiores al 1,5%, siendo correctamente aceptados por los autores. Sin embargo, los valores obtenidos sobre acidez total y pH no se consideraron aceptables, argumentando los bajos niveles de estos constituyentes en cítricos. Del mismo modo, los coeficientes de determinación para los colectivos de validación empleados con los parámetros luminosidad y pérdida del contenido de agua aparente fueron R2VE=0,5 y R2VE=0,09 respectivamente, atribuyendo estos pobres resultados a la imprecisión del método de referencia empleado. En un trabajo se intentó modelar la identificación de la vida útil de los cítricos, obteniendo unos resultados muy esperanzadores, ya que la precisión en la predicción fue del 80% [267]. 4.1.3.3 Aplicaciones en melón y sandía Prácticamente la totalidad de los estudios desarrollados sobre tecnología NIRS en análisis de melón y sandía de forma intacta, se han orientado hacia la predicción de sólidos solubles [264, 268-271]. Los errores de predicción de este parámetro en este tipo de frutos se encuentran en torno al 1%, si bien en sandía los modelos encontrados poseen una capacidad predictiva ligeramente inferior. De este modo, la tecnología NIRS se hace viable para clasificar melones según contenidos de dulzor alto, medio y bajo (melón r2=0,76, RPD=2,05; sandía r2=0,65, RPD=1,69) [271]. Del mismo modo, otros autores han corroborado la viabilidad de la tecnología para predecir la calidad interna de la sandía mediante medidas en transmitancia, tanto en fruto estático, como en movimiento (1,4 m/s) [268]. Pero, si el contenido de sólidos solubles es el principal parámetro evaluador de la calidad interna de melón, existen limitaciones para el desarrollo de los modelos, ya que, principalmente la concentración de este parámetro varía en gran medida en el interior del fruto. Además, se debe incluir también en el desarrollo de los modelos el factor estado de maduración (días antes de la cosecha) y tipo de cultivares. En cambio, el almacenamiento en frío del fruto no afectó a los modelos desarrollados [269]. Otros autores también tuvieron en cuenta la variación de sólidos Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 199 solubles dentro del fruto, por lo que desarrollaron modelos tomando lecturas únicamente de la parte ecuatorial, mejorando los resultados obtenidos [270]. Por otro lado, destaca un trabajo en donde se intentó predecir una de las principales características para evaluar la calidad de la sandía, la firmeza [272]. Las medidas se llevaron a cabo en modo de transmitancia, obteniendo resultados muy positivos, con un coeficiente de determinación de R2=0,94 y un error de predicción de 0,59 N. 4.1.3.4 Aplicaciones en peras Del mismo modo que con los frutos descritos hasta el momento, los trabajos recientes efectuados sobre peras, se han centrado principalmente en la determinación del contenido de sólidos solubles, de forma exclusiva [273, 274], o junto con la determinación de otros parámetros, como firmeza [275-277, 278], acidez titulable [279], o determinación de color y materia seca para seguir los cambios en la maduración del fruto vía NIRS [278]. Varios trabajos coinciden en que los mejores modelos se obtienen cuando se emplean los espectros adquiridos de la región ecuatorial del fruto [273, 276, 277]. Del mismo modo, también se observan coincidencias en cuanto a las conclusiones obtenidas en la predicción de sólidos solubles, afirmándose que se obtienen resultados precisos y reproducibles, encontrándose los valores de los coeficientes de determinación ligeramente superiores a R2VE =0,8. Los errores predictivos en validación externa se encuentran en torno a ETP=0,6 ºBrix, si bien en un trabajo realizado con un equipo FT-NIR con fibra óptica este estadístico descendió hasta ETP=0,32 ºBrix [279]. Se puede apreciar como va evolucionando la tecnología NIRS en estos tipos de estudios, al consultar un trabajo reciente en cuanto a la determinación de sólidos solubles en peras on-line, obteniendo medidas por transmitancia [274]. Para ello analizaron tres velocidades de fruto en la línea (0,3 m/s, 0,5 m/s, 0,7 m/s), concluyendo que los diferentes tipos de velocidades conseguían modelos ligeramente distintos, disminuyendo su calidad a medida que aumentaba la velocidad de desplazamiento del fruto. En este estudio on-line el coeficiente de determinación, con una velocidad de desplazamiento de 0,5 m/s, fue R2VE=0,92 y un ETP=0,53 ºBrix. Los resultados obtenidos en firmeza también son bastantes optimistas, ya que los valores de R2VE se encuentran cercanos a 0,75, encontrando mayor variabilidad en el estadístico ETP (ETP=1,23-2,95 N) [275-277]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 200 4.1.3.5 Aplicaciones en manzanas En manzanas, al ser el fruto con el que se han realizado más estudios, se encuentra mayor diversidad en los resultados. El contenido en sólidos solubles se ha predicho en diferentes modalidades de análisis: en reflectancia, aportando valores de R2VE=0,88, ETVC=0,85 [286], ETP=0,91 [280], ETP=0,45 [285], con un equipo FT-NIR, mediante el cual se adquirían los espectros mientras que las manzanas se encontraban en movimiento [281, 282] (R2VE=0,86, ETP=0,44), con un AOFT (Filtro acústico-óptico afinable) (R2=0,83) [283], o un FT-NIR equipado con sonda de fibra óptica [284] (R2VE=0,84, ETP=0,77). En la determinación de firmeza, los autores también coinciden en que la tecnología NIRS puede ser aplicada como método de análisis rápido para predecir este parámetro en manzanas [286, 287], aunque la capacidad predictiva con respecto a sólidos solubles disminuye, ya que el valor más elevado del coeficiente de determinación que se ha encontrado no ha superado R2VE=0,79. La predicción del contenido en humedad aportó valores superiores a los constituyentes comentados en este fruto hasta el momento: R2VE=0,92, ETVC=0,92% [286]. En la determinación de azúcares individuales, se observan resultados sorprendentes, ya que los autores obtuvieron predicciones NIR de glucosa, fructosa y sacarosa, con una precisión similar al método de referencia, en este caso Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). Estos modelos arrojaron valores de R2VE=0,9, R2VE=0,94, R2VE=0,94 y ETP=0,2, ETP=0,3, ETP=0,34, según se tratara de glucosa, fructosa y sacarosa, respectivamente. Con posterioridad a su determinación se encuentran trabajando en análisis de rutina en la Universidad de Zhejiang (China) [288]. Se han efectuado otros trabajos no orientados hacia la obtención de predicciones, sino por ejemplo en la diferenciación de daños mecánicos en la piel que causan modificaciones de color, textura y sabor. Cuando los espectros se tomaron 3 h después de causar el daño a la manzana, la tecnología NIRS diferenciaba al tejido sano del dañado con un error medio del 20,83%. A medida que avanzaba el tiempo de producción del daño, el error de clasificación disminuía hasta 1,97%, que se obtuvo cuando se tomaron los espectros 21 días una vez causado el daño [289]. Otro trabajo evaluó la tecnología NIRS para clasificar manzanas mantenidas en las estanterías del comercio o conservadas en frío, a lo largo del tiempo, empleando tres cultivares [290]. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 201 Discriminando entre el factor cultivar, el éxito en la clasificación fue superior al 95%. Este porcentaje, en la distinción entre diferentes tiempos, fue del 75% para las manzanas almacenadas en frío, y del 83% para las que se mantuvieron en estantería. 4.1.3.6 Tendencias de la Tecnología NIRS en fruta intacta Los avances en el desarrollo de la tecnología NIRS sobre fruto intacto están encaminados hacia técnicas de análisis de imagen hiperespectrales, las cuales permiten separar los fenómenos de absorción y de dispersión de la radiación [242]. Esta tecnología está obteniendo resultados positivos sobre todo en determinaciones de propiedades físicas y estructurales de la fruta. De este modo, existen buenas predicciones de firmeza en manzanas [291] y melocotones [292], trabajos sobre detección del daño bitter pit [293] o de defectos en la superficie de manzanas [294]. Otras tendencias que se observan como investigaciones futuras, están relacionadas con la definición de la geometría de la señal espectroscópica a través del tejido del fruto, mediante la generación de modelos que simulen el transporte de la luz. Del mismo modo, la implementación de microscopios NIR, aportando una mayor comprensión de la distribución de ciertos componentes a nivel celular [242]. Finalmente, cabe destacar que, a pesar del gran número de trabajos que se encuentran relacionados con fruto intacto, son pocos los que intentaron predecir constituyentes que se presentan en concentraciones minoritarias. Concretamente, con respecto a uno de los objetivos que se pretende en el presente capítulo de este documento, esto es, detección en fruto intacto de residuos de plaguicidas, no se encuentran trabajos en bibliografía. En un trabajo se aplicó la tecnología NIRS para controlar el fungicida imazalil on-line como tratamiento postcosecha, pero no se pretendía establecer un sistema de detección tomando lectura sobre el fruto, sino sobre las tuberías de lavado para intentar monitorizar la concentración de producto. Se desarrollaron modelos para predecir en un rango de 0,5-250 ppm, obteniendo un error en predicción de ETP=3,7 ppm [295]. En esta temática, midiendo sobre fruto intacto, los únicos trabajos existentes se desarrollaron aplicando la tecnología NIRS con la técnica DESIR (Dry- Extract System for InfraRed). Concretamente, en superficie de tomates se empleó para la detección de fungicidas en niveles de 2-90 ppm, utilizando como substrato, papel de filtro de microfibras de vidrio. El fungicida se extrajo del fruto mediante lavado con acetona, obteniendo un error de predicción de ETP=7,89 ppm [296]. Los mismos autores, en un trabajo posterior, evaluaron la Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 202 reproducibilidad del sistema mediante diversas pruebas que permitían reducir trabajo y tiempo, preparando soluciones de tres tipos de plaguicidas en acetona, en lugar de llevar a cabo el extracto del fruto anteriormente descrito. Se concluyó que el sistema empleado posibilitaba la implantación para el monitoreo de algunos plaguicidas en frutas [297]. 4.2 Objetivos Los objetivos planteados en el presente capítulo se centran en el Control de Calidad mediante Tecnología NIRS, tanto en zumo de naranja como en naranja intacta, con los enfoques que a continuación se describen. Objetivos en zumo de naranja:  Caracterización y diferenciación de información espectral procedente de zumos comerciales recién exprimidos, zumos comerciales concentrados y zumos recién exprimidos obtenidos de una planta de procesado.  Obtención de modelos predictivos de parámetros genéricos empleados para el control de calidad en zumo de naranja: contenido en sólidos solubles, acidez, pH.  Obtención de modelos predictivos del parámetro minoritario limonina.  Estudio de la variación producida en los modelos comparando zumo filtrado con zumo intacto. Objetivos en naranja intacta:  Determinación de tiabendazol en naranja intacta mediante modelos predictivos.  Detección de naranjas tratadas con tiabendazol mediante modelos discriminantes. 4.3 Control de Calidad en zumo de naranja mediante predicciones de ºBrix, Acidez, pH y Limonina 4.3.1 Antecedentes El consumo de zumos de frutas y hortalizas en España tiene un peso importante dentro del sector de las bebidas analcohólicas, destacando el zumo de naranja, que supone prácticamente un 25% del consumo total de este tipo de bebidas, alcanzando en los últimos años más de 4 l/persona/año. Concretamente, en 2006, el zumo de naranja fue el más consumido en España, ascendiendo a 182,7 millones de litros, superando ligeramente a los zumos de piña y melocotón. Si estos datos se extrapolan únicamente al consumo observado en los hogares españoles, las diferencias de aquel con respecto a estos tipos de zumos se incrementan [298]. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 203 En el R.D. 1518/2007 se establecen los parámetros mínimos de calidad en zumos de frutas y los métodos de análisis aplicables, con el fin de asegurar el control de su calidad comercial y evitar el fraude al consumidor y la competencia desleal [299]. Dentro de estos parámetros, en el zumo de naranja, destaca el contenido en grados Brix y la acidez, siendo el primero un parámetro absoluto de autenticidad y calidad, no admitiéndose tolerancia alguna respecto a los valores que se aportan. Por otro lado, un constituyente que no se recoge en la norma, pero que influye negativamente en el grado de aceptación del producto por parte del consumidor, es la limonina, compuesto responsable en gran medida del sabor amargo del zumo de naranja, que causa uno de los principales problemas en la industria citrícola. Se considera que niveles de limonina superiores a 6 mg/l no hacen aceptable un zumo para su comercialización, debido a su amargor [300]. Los parámetros descritos requieren de técnicas analíticas individuales para su determinación, haciendo el proceso laborioso, dilatado en el tiempo y costoso. Por lo tanto, como alternativa se plantea la tecnología NIRS como herramienta para la determinación simultánea de dichos parámetros, estudiando la posibilidad de predicción sobre producto intacto, para de este modo abrir una puerta hacia la monitorización en el control de calidad on line de este tipo de producto agroalimentario. Finalmente, se destaca la escasez de trabajos de investigación aplicada sobre zumo intacto de naranja mediante tecnología NIRS. La realización de este trabajo fue fruto de una colaboración entre dos centros del Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica (IFAPA), IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’ e IFAPA-Centro Palma del Río, y de la industria de zumo recién exprimido ubicada en Palma del Río (Córdoba) perteneciente al Grupo Leche Pascual. 4.3.2 Material y Métodos 4.3.2.1 Colectivo experimental El colectivo experimental empleado estaba constituido por tres grupos de zumos, uno procedente de zumo recién exprimido sin envasar, y dos grupos comerciales, uno procedente de zumo concentrado y otro de zumo de naranja exprimida. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 204 4.3.2.1.1 Grupo de zumos recién exprimidos sin envasar Consistió en 139 muestras pertenecientes a la campaña 2005, en principio almacenadas y transportadas en botes de cristal con contenidos comprendidos entre 300-500 ml. Estas muestras procedían de la fábrica de zumo recién exprimido del Grupo Leche Pascual de Palma del Río (Córdoba). Aquí, en periodo de cosecha, la fruta se recibe diariamente, sometiendo a cada camión, en la etapa de recepción, descarga y almacenamiento, a un control de calidad, consistente en la recogida de una cantidad representativa de 20 kg al azar, donde se extrae el zumo y se determinan parámetros de calidad en las condiciones requeridas por la industria. El zumo procedente de este muestreo es el que conformó el presente grupo de este trabajo. El periodo de recogida estuvo comprendido entre marzo y junio. Las muestras se transportaban de la fábrica al IFAPA-Centro Palma del Río, conservándose en refrigeración. Posteriormente técnicos del IFAPA-Centro ‘Alameda del Obispo’ transportaban las muestras a éste centro, almacenándose en congelación a -80ºC para producir la menor variación en las propiedades del zumo, hasta el momento de su análisis. Figura IV-3. Almacenamiento de muestras de zumo de naranja en -80ºC 4.3.2.1.2 Grupo de zumos comerciales a base de concentrado Este grupo estaba constituido por una representación de zumos de naranja presentes en el mercado que han sido elaborados a partir de zumos a los que se les eliminó el agua, para una posterior reconstitución. Como se puede observar en la tabla IV-2, este colectivo lo conformaron 17 zumos, con la particularidad de que cuatro de ellos no se consideran como tales, sino néctares. Los cuatro fueron elaborados a base de zumo concentrado (55% Granini y Júver, a excepción de la Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 205 marca Hero que indicaba ‘contenido en fruta 50% mínimo’), presentando además, el de la marca Granini, un 5% de pulpa de naranja. Por otro lado, es importante destacar que un zumo de Hacendado lo constituían mandarinas. De este modo, en la tabla siguiente se exponen todas las muestras que se incluyeron en este grupo, mostrando su nombre comercial, lugar de envasado y ciertas características a resaltar. La conservación de este colectivo se efectuó siguiendo las instrucciones del fabricante, por lo que ninguno de ellos precisó de frío, almacenándolos en lugar fresco y seco. Tabla IV-2. Nombre comercial, localización del envasado/sede social y observaciones de las muestras que conforman el “Grupo de zumos a base de concentrado” Nombre Comercial Envasado / Sede Social Observaciones1 Zumo de Naranja (zumo laranja). Carrefour Murcia - Zumo de Naranja. Carrefour Madrid - Zumo de Naranja Don Simón Murcia Enriquecido con Vit. C Zumo de naranja El Corte Inglés Murcia - Zumo de Naranja Cofrutos Murcia Enriquecido con Vit. C Zumo de Naranja Alteza Ciudad Real - Zumo de Naranja Hacendado Murcia - Zumo de Naranja Zumosol (Pascual) Burgos Enriquecido con Vit. C Zumo de Naranja Kasfruit Vitoria Enriquecido con Vit. C y E Zumo de Naranja Mandarina Clementina Hacendado Murcia Naranja Mandarina Néctar de Naranja a base de concentrado Hero Murcia Néctar con un 50% mínimo de contenido en fruta Néctar de Naranja DISFRUTA Júver Murcia Néctar con 55% zumo a base de concentrado. Sin azúcar añadido Néctar de Naranja Eroski Madrid Néctar con zumo a base de concentrado Zumo de Naranja Júver Murcia Enriquecido con Vit. C Zumo de Naranja Eroski Murcia - Zumo de Naranja Dia Madrid - Granini Naranja Barcelona Néctar con 55% zumo a base de concentrado. Con 5% pulpa de naranja 1 Estas observaciones se recogen del envase del producto Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 206 Tabla IV-3. Nombre comercial, localización del envasado/sede social y observaciones de las muestras que conforman el “Grupo de zumos de naranja exprimida” Nombre Comercial Envasado / Sede Social Observaciones1 Zumo de Naranja Natural. Consumer Murcia Con pulpa Puro Zumo de Naranja. Carrefour Madrid Naranjas exprimidas a las 48h de recogida. Algo de pulpa Zumo de Naranja. El Corte Inglés (Vidrio) Murcia Naranjas exprimidas a las 48h de recogida. 95% zumo, 5% pulpa Zumo de Mandarina exprimida Gran Selección. Don Simón Madrid Naranja Mandarina Zumo de Naranja exprimida Gran Selección. Don Simón Madrid - Zumo de Naranja Pascual Burgos - Solo Zumo de Naranja Pascual Burgos Con pulpa Zumo de Naranja Exprimida 100% Murcia Enriquecido con Vit. C Tropicana Pure Premium Naranja Murcia Con pulpa Tropicana Pure Premium Mandarina Murcia Naranja Mandarina Zumo de Naranja Exprimida 100%. Consumer Murcia Enriquecido con Vit. C Tropicana Pure Premium Sanguina Murcia Naranja Sanguina Naranja Fresca de Andalucía La Vega Antequera - Zumo de Naranja Exprimida Don simón Almería Con pulpa Zumo de Naranja Exprimida Carrefour Eco Madrid - Selección de Naranjas Exprimidas Zumosol (Pascual) Burgos - Zumo Natural de Mandarina Carrefour Madrid Naranja Mandarina Zumo de Naranja El Corte Inglés (Tetra Brix) Almería - Zumo de Mandarina Hacendado Almería Naranja Mandarina Zumo de Naranja 100% Exprimida Hacendado Almería - Zumo de Naranja Juice Carrefour Francia - Zumo de Naranja Vita Fresh Huelva Naranja directamente exprimida y congelada. Con pulpa Zumo de Naranja Exprimido Eroski Almería - 4.3.2.1.3 Grupo de zumos comerciales de naranja exprimida En este caso, se intentó obtener representatividad en el comercio, pero de un tipo de zumo reconocido como Zumo de Naranja Exprimida, siendo los zumos de origen industrial que más se Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 207 aproximan a los naturales, presentando incluso algunos la pulpa de la naranja. Normalmente están ligeramente pasteurizados, existiendo frescos (refrigerados) y de larga duración. La tabla IV-3 expone las 23 muestras que conformaban este grupo. El almacenamiento de estas muestras de nuevo se efectuó según las indicaciones del fabricante, esto es, unas a temperatura ambiente y otras en refrigeración, a excepción de un zumo que requería su almacenamiento en congelación. Por otro lado, se caracterizan cuatro zumos constituidos por mandarinas y uno por naranjas sanguinas. 4.3.2.2 Preparación de muestra: proceso de filtración Todas las muestras de zumo fueron sometidas a un proceso de homogeneización mediante un proceso de filtración con una unidad de filtrado perteneciente a la marca comercial Foss. La estructura funcional básica de este accesorio consiste en: una bomba de vacío que regula la velocidad de filtrado, un sistema de filtros compuesto por un filtro de papel (que se cambia entre cada muestra), y otro de acero inoxidable (que se lava con agua corriente y agua destilada en la filtración de cada zumo), y un sistema de recogida de muestra mediante un vaso de 50 ml que encaja perfectamente en la unidad de filtración para producir efecto de vacío. Figura IV-4. Unidad de filtración empleada para los zumos de naranja El papel de filtro empleado fue de la casa comercial Filter-Lab, papel de filtro para análisis cuantitativo endurecido, con 90 mm de diámetro, filtración lenta, 80 gr/m2, 0,16 mm de espesor y Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 208 porosidad entre 2-4 µm. La cantidad de muestra recogida de cada zumo era aproximadamente 40 ml. 4.3.2.3 Valores de referencia A continuación se procede a la descripción de los procedimientos llevados a cabo para las determinaciones de los parámetros sólidos solubles, pH, acidez y limonina, empleados como valores de referencia para el desarrollo de los modelos cuantitativos NIRS. 4.3.2.3.1 Determinación del contenido en sólidos solubles Se empleó un refractómetro de Abbe con compensación automática de temperatura. Precisa el índice de refracción (entre 1,3 – 1,7) y los grados Brix en un rango de temperatura entre 0 – 70ºC. Posee una precisión y resolución del 0,25%. El procedimiento de medida consistía en depositar unas gotas sobre el prisma fijo del dispositivo, doblar un prisma móvil superior y accionar el dispositivo de fijación. A continuación se procedía a girar un tornillo, hasta que se pudiera observar en el visor una línea de separación de ‘claro-oscuro’ en una escala inferior. El valor que aparece en la parte inferior de la escala es el índice de refracción del líquido analizado. Se efectuaron dos lecturas por muestra, obteniendo como valor la media de ambos. Entre cada lectura se procedía al lavado con agua y secado con paño de algodón del prisma fijo y móvil. Figura IV-5. Refractómetro de Abbe empleado para la determinación de sólidos solubles en zumo de naranja 4.3.2.3.2 Determinación del pH Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 209 Los valores de pH se obtuvieron con un pH-metro de laboratorio con compensación automática de temperatura y resolución de 0,01 pH, concretamente con el modelo Basic 20 de la casa comercial Crisol Instrument. Las lecturas se obtuvieron pos estabilidad, esperando en aproximadamente 10 s a que la medida se fije en pantalla. Figura IV-6. pH-metro de laboratorio empleado para la determinación de pH en zumo de naranja 4.3.2.3.3 Determinación de acidez La determinación de acidez se realizó mediante valoración ácido-base con hidróxido sódico (NaOH), empleando fenolftaleina como colorante. Los valores obtenidos corresponden a gramos de ácido cítrico anhidro pH 8,1/100 ml de zumo de naranja. El procedimiento seguido es el oficial en la normativa española para el establecimiento de parámetros mínimos de calidad en zumos de frutas y los métodos de análisis aplicables [299]. En dicha normativa se especifica que para la determinación de la acidez total se debe seguir la norma UNE-EN 12147:1997 [301]. 4.3.2.3.4 Determinación del contenido en limonina Los valores de limonina se obtuvieron siguiendo la metodología de Abbasi et al. [302] mediante procedimientos espectrofotométricos, tomando lecturas de absorbancia a 503 nm y empleando el Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 210 reactivo de Burnham (0,1 g 4-dimetilamina benzaldehido, 3 ml de ácido acético glacial y 2,4 ml de ácido perclórico). Las medidas de absorbancia se realizaron con un espectrofotómetro de ultravioleta/visible UV-2401PC Shimadzu conectado a PC Scenic para su control y manejo. En primer lugar se prepara una solución madre de limonina pura en acetonitrilo (25 mg en 5 ml) en alcohol etílico, hasta alcanzar una concentración final de 100 ppm. A continuación se preparan patrones con concentraciones entre 0 y 50 ppm. Las muestras de zumo se centrifugan a 3000 rpm durante 10 min a 27ºC. Se extrae 1 ml de sobrenadante añadiendo 2 ml de cloroformo para separación de sustancias polares. Posteriormente a la fase de separación, se extrae 1 ml de muestra y se añade a 1,5 ml de reactivo de Burnham. La mezcla debe conservarse a temperatura ambiente durante 30 min. Finalmente se efectúan las lecturas de absorbancia a 503 nm. En cada muestra se obtuvieron valores de limonina por triplicado. 4.3.2.4 Análisis NIRS En primer lugar, las muestras que estaban almacenadas en proceso de congelación, se sacaban a refrigeración durante 18-22 h (4ºC), y a continuación, a temperatura ambiente durante 2-3 h. Efectuados los análisis de referencia correspondientes, se almacenaba la información espectral NIR. El espectrofotómetro empleado fue un monocromador de espectro continuo, modelo 6500 de Foss NIRSystems SYII (Silver Spring, MD, USA). Realiza una interpolación de los datos adquiridos para producir un punto de información cada 2 nm entre 400 – 2500 nm, obteniendo un espectro con 1050 puntos de datos. Este equipo presenta una disposición modular, empleando para la realización del trabajo el módulo DCA (Direct Contanct of Food Analyzer), que permite analizar producto líquido, liofilizado, sólido, etc. Al ser un sistema de análisis de producto intacto no basado en fibra óptica, permite el uso de toda la región espectral del equipo (400-2500 nm). El módulo DCA presenta en su interior un diafragma que permite adaptar diversos tamaños de cápsulas circulares. Del mismo modo, Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 211 posee una referencia externa que debe ser analizada como paso previo al análisis esprectral (figura IV-7). La casa comercial Foss distribuye un kit de análisis para líquidos (Liquid sampling kit, NR- 6543) adaptable al módulo DCA, que consiste en unas cápsulas o vasos de diámetro 3,8 cm y fondo de cristal de cuarzo, en donde se depositaba la muestra (2-3 ml), para posteriormente cubrir con una placa soporte de material reflectante (oro), para de este modo obtener los espectros en modo de transflectancia (0,1 mm de paso óptico). Para cada muestra, tanto zumo intacto como filtrado, se obtuvieron dos espectros, un vaso por cada submuestra. Figura IV-7. Módulo DCA abierto para disposición de muestra El lavado de las cápsulas y placas soporte de material reflectante se realizaba entre muestra y muestra con agua jabonosa y posterior aclarado con agua destilada (figura IV-8). Los espectros fueron obtenidos usando un programa informático de análisis de rutina (ISIscan v2.81; Infrasoft International LLC., State Collage, PA, USA), y almacenados como valores de absorbancia [(log(1/R)]. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 212 MÓDULO DCA CÁPSULAS DE ANÁLISIS Figura IV-8. Etapa de lavado de placa soporte en el análisis de zumos con el módulo DCA (observar cápsulas empleadas y módulo DCA acoplado a espectrofotómetro) 4.3.2.5 Análisis de datos A continuación se describen los procedimientos quimiométricos desarrollados para la obtención de predicciones de los parámetros pH, acidez, grados Brix y limonina, sobre zumo de naranja intacto y filtrado. El programa informático empleado para las distintas aplicaciones ha sido WinISI III v1.50e (Infrasoft International). 4.3.2.5.1 Estudio de repetibilidad espectral El estudio de la repetibilidad espectral se efectuará siguiendo la metodología de cálculo descrita en el apartado 2.3.2.4.1. Se estudiarán los valores por separado entre intacto y filtrado. Asimismo, se observarán los valores límites obtenidos si se calculan a partir de todo el colectivo (tres grupos de zumos), o por el contrario, diferenciando entre zumos comerciales y recién exprimidos en industria, sin envasar. 4.3.2.5.2 Análisis de Componentes Principales Como se ha explicado en los apartados 2.3.2.4.2 y 3.1.2.5.2, del mismo modo se ha desarrollado un Análisis de Componentes Principales. Este análisis se abordará de forma individual para el colectivo de muestras de zumo filtrado y sin filtrar. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 213 En primer lugar, se observarán sobre los espectros brutos, en ambas formas de presentación (filtrado y sin filtrar) pautas de agrupamientos a priori, esto es, no supervisados, sin una definición previa. A continuación se detectarán anómalos espectrales mediante el procedimiento de distancia de Mahalanobis descrito en los apartados mencionados. En este cálculo, los ACPs se llevarán a cabo sobre los colectivos de calibración seleccionados al azar en cada estrategia de calibración que se describe en el siguiente apartado, para de este modo, simular una situación real, es decir, las muestras que se encuentren en el colectivo de validación externa no participarán en la detección de anómalos. Por otro lado, se desarrollarán tantos ACPs como combinaciones de longitudes de onda, tratamientos de derivatización y corrección de radiación dispersa se empleen para el cálculo de los modelos predictivos. Así, las muestras que surjan como anómalas espectrales para una combinación determinada, será excluida en el colectivo de calibración que se corresponde con tal combinación. 4.3.2.5.3 Modelos de predicción El tipo de algoritmo empleado para la obtención de los modelos y los criterios de evaluación se encuentran descritos en el apartado 2.3.2.4.4, con la inclusión en la evaluación de los mismos del estadístico RPD, descrito en el apartado 2.4.2.4.3. Se aplicarán 20 combinaciones como resultado de diferentes rangos espectrales, tratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa. De este modo, se combinarán 4 rangos espectrales con espectros brutos, tratamiento de primera derivada (1,5,5), tratamiento de segunda derivada (2,5,5), primera derivada con corrección de radiación dispersa SNV-DT (Standard Normal Variate and Detrending), segunda derivada con corrección de radiación dispersa SNV-DT. Los cuatro rangos espectrales estudiados surgen de las dos consideraciones siguientes: la eliminación de la región visible del espectro, y la eliminación de ventanas espectrales relacionadas con fuertes absorciones del agua (1450 nm, 1950 nm) [234] que dificultan el análisis NIRS en líquidos. Por lo tanto, los cuatro rangos espectrales son los que a continuación se exponen:  400 – 2500 nm  1100 – 2500 nm  400 – 1098 nm; 1100 – 1350 nm; 1550 – 1850 nm; 2050 – 2500 nm Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 214  1100 – 1350 nm; 1550 – 1850 nm; 2050 – 2500 nm La tabla IV-4 resume todas las combinaciones de tratamientos, empleando la terminología Trat.N (N=1-20) en todos los cálculos que se desarrollarán, de manera que un TratN determinado, se corresponderá con una combinación específica expuesta en la tabla IV-4. Tabla IV-4. Modelos predictivos desarrollados en zumo de naranja, según combinaciones de rango espectral, derivada y corrección de radiación dispersa Trat. Longitud Onda (nm) Trat. Derivada Correc. Rad. Dispersa 1 400-2500 2 1100-2500 3 400-1098; 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 4 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 - - 5 400-2500 1,5,5 6 1100-2500 1,5,5 7 400-1098; 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 1,5,5 8 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 1,5,5 - 9 400-2500 1,5,5 SNVDT 10 1100-2500 1,5,5 SNVDT 11 400-1098; 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 1,5,5 SNVDT 12 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 1,5,5 SNVDT 13 400-2500 2,5,5 14 1100-2500 2,5,5 15 400-1098; 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 2,5,5 16 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 2,5,5 - 17 400-2500 2,5,5 SNVDT 18 1100-2500 2,5,5 SNVDT 19 400-1098; 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 2,5,5 SNVDT 20 1100-1350; 1550-1850; 2050-2500 2,5,5 SNVDT Por otro lado, se estudiarán dos estrategias de obtención de modelos (en todos, el colectivo de calibración y validación es seleccionado el azar con unos porcentajes respecto del total de 80% y 20% respectivamente), tanto para zumos filtrados como sin filtrar:  Modelos con capacidad predictiva potencial tanto para diversos tipos de zumos comerciales, como para zumos recién exprimidos obtenidos en industria de elaboración (se emplean para su desarrollo los tres grupos conjuntamente). Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 215  Modelos con capacidad predictiva potencial para zumos exprimidos obtenidos en industria de elaboración. 4.3.3 Resultados y Discusión 4.3.3.1 Estudio de repetibilidad espectral 4.3.3.1.1 Zumo intacto Calculando los valores medios del estadístico RMS por separado para cada colectivo global de zumos, se obtuvieron unos resultados de 6601, 17787 y 31739 según se tratara del grupo procedente de concentrado, de naranjas exprimidas o de zumos recién exprimidos sin envasar, respectivamente. Esto indica que la repetibilidad en el proceso de obtención espectral varía según de qué tipo de zumo se trate. La menor variación entre espectros de una misma muestra en los zumos comerciales (los dos primeros valores) se puede deber, en primer lugar, a que todas las operaciones de proceso desde la recepción de materia prima, hasta el producto final en la industria agroalimentaria se enfocan para la obtención de un producto lo más homogéneo posible con identidad propia. Por otro lado, otro factor importante es el contenido de pulpa que presentan los zumos, así, en el grupo de zumos procedente de concentrado tan solo una muestra presentaba pulpa, que fue la que obtuvo un valor del estadístico RMS muy superior a la media de su grupo (83272). En el grupo de muestras de naranjas exprimidas, un 30% contenían en su composición pulpa de la naranja, observando un RMS medio 2,7 veces superior al grupo procedente de concentrado. Por último, en el grupo de naranjas recién exprimidas procedentes de la industria, todas las muestras se presentaban de forma natural, sin haberse sometido a ningún tratamiento posterior a la extracción, por lo que todos los zumos contenían diferentes porcentajes de pulpa, disminuyendo notablemente su repetibilidad espectral con respecto a los otros grupos. Esta observación es lógica, ya que la señal presentará una geometría más diversa entre submuestras de zumos con pulpa, dado que esta característica se distribuye de forma aleatoria en el producto, produciendo espectros de una misma muestra con mayores diferencias. Como se comentó en el apartado 4.1.2, numerosos autores han optado por realizar procesos de homogeneización de la muestra, para disminuir el efecto de radiación dispersa provocado por los sólidos en suspensión, y de este modo obtener modelos más robustos. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 216 Por lo tanto, se calcula un valor límite, para llevar a cabo el proceso de filtrado espectral, individual para cada tipo de zumo, ya que, si se calcula un valor global para todos los grupos, se puede incurrir en incluir espectros anómalos procedentes de zumos comerciales como normales, y al contrario, sería un valor restrictivo para los zumos del grupo recién exprimido sin envasar. Aplicando el procedimiento de cálculo para la obtención de los valores de RMSlímite en los grupos de zumos comerciales de naranja exprimida y recién exprimidos sin envasar, un porcentaje importante de espectros debían ser eliminados de los colectivos muestrales. Dado que no se disponía de muestras con calidad adecuada para repetir el análisis NIRS, se optó por incrementar el valor límite hasta los niveles que se recogen en la tabla IV-5. Tabla IV-5. Valores límite del estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados para cada grupo de zumos intactos RMSlímite Com. a base de Concent. Com. Naranja Exprimida Recién expr. sin env Teórico 21016 28494 40198 % espectros eliminados 5,88 30,43 32,37 Aplicado - 33500 45500 % espectros eliminados - 17,39 23,74 Mediante la aplicación de estos valores límite, se reducen los colectivos de partida de zumo intacto a 16, 19 y 106 según se traten de zumos comerciales a base de concentrado, de naranja exprimida o exprimidos sin envasar respectivamente. La distribución gráfica de los valores individuales RMS se puede observar en la figura IV-9. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 217 Zumos Comerciales a base de Concentrado 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 21000 Zumos Comerciales de Naranja Exprimida 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 33500 Zumos recién Exprimidos sin Envasar 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 45500 Figura IV-9. Valores individuales del estadístico RMS en zumo de naranja intacto En la gráfica de zumos comerciales procedente de concentrado se observa perfectamente como el valor límite calculado se puede encontrar sobredimensionado por el valor que alcanza una muestra, como se comentó con anterioridad. Además, este colectivo está compuesto por un número reducido de muestras, con lo cual, es complicado que recoja toda la casuística que se puede presentar en el proceso de adquisición espectral, lo que quiere decir, que si su número fuese muy superior, posiblemente obtendríamos tan solo esa muestra con ese valor, disminuyendo Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 218 por lo tanto el valor límite del estadístico RMS. 4.3.3.1.2 Zumo filtrado Con los zumos filtrados, los valores medios del estadístico RMS para cada colectivo fueron 3002, 3541 y 3977 según se tratara del grupo procedente de concentrado, de naranjas exprimidas o de zumos recién exprimidos sin envasar, respectivamente. En este caso, la repetibilidad en la adquisición espectral, si bien ha seguido la misma pauta ascendente en los valores, no se han producido grandes diferencias entre los grupos, sobre todo con respecto a los zumos procedentes de concentrado, como ocurrió con los espectros de zumo intacto. Esto es debido a que en el proceso de filtración, se han eliminado en gran medida las partículas en suspensión, produciendo mayor homogeneidad en la señal espectroscópica. Por lo tanto, en los zumos filtrados se consideró oportuna estimar un valor límite del estadístico RMS común para todos los tipos de zumos, eliminándose el porcentaje de espectros que se recoge en la tabla IV-6. Tabla IV-6. Valores límite del estadístico RMS y porcentaje de espectros eliminados para cada grupo de zumos filtrados RMSlímite Com. a base de Concent. Com. Naranja Exprimida Recién expr. sin env Teórico 3701 5972 3154 % espectros eliminados 23,53 13,04 41 Aplicado 5000 5000 5000 % espectros eliminados 23,53 17,39 20,14 En el grupo que se ha producido un mayor efecto en la inclusión de espectros que en un principio se podían considerar anómalos, fue en el de zumos recién exprimidos sin envasar, dado que es el que presenta mayor diferencia entre el valor aplicado y el teórico. De nuevo en este caso se ha optado por tomar una actitud permisiva en cuanto a la admisión de espectros que en un principio se podían considerar como anómalos, dada la imposibilidad de repetición del análisis espectral, quedando los colectivos de partida de zumo filtrado en 13, 19 y 111 según se traten de zumos comerciales a base de concentrado, de naranja exprimida o exprimidos sin envasar respectivamente. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 219 La figura IV-10 representa los valores individuales RMS, empleando la misma escala que para los zumos intactos. Zumos Comerciales a base de Concentrado 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 5000 Zumos Comerciales de Naranja Exprimida 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 5000 Zumos recién Exprimidos sin Envasar 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 MUESTRAS RM S x 1 06 RMSlímite = 5000 Figura IV-10. Valores individuales del estadístico RMS en zumo de naranja filtrado Mediante la observación de la figura IV-10, se confirma de nuevo el efecto que produce en la homogeneidad de la señal la eliminación del mayor porcentaje de pulpa presente en el zumo. 4.3.3.2 Caracterización espectral VIS-NIR de zumo de naranja Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 220 Los espectros medios característicos de cada grupo de zumos, tanto para filtrado como intacto, se muestran en la figura IV-11. Se exponen los espectros brutos, y los obtenidos al aplicar segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT. Figura IV-11. Espectros medios de zumos comerciales (procedentes de concentrado y de naranja exprimida), y de los recién exprimidos sin envasar (espectros brutos y con pretratamiento de 2ª derivada + SNV-DT) Visualmente, los tres grupos de zumos, tanto intacto como filtrado siguen patrones espectrales prácticamente iguales, con las bandas de absorción localizadas en las mismas posiciones. Aunque, como se puede apreciar en el gráfico de espectros brutos intactos, se confirman los comentarios efectuados en los apartados anteriores, ya que los distintos zumos producen diferencias en cuanto a niveles de absorbancia. Estas diferencias se eliminan mediante dos procedimientos: con el proceso de filtración y con el pretratamiento matemático de derivada y corrección de radiación dispersa (figura IV-11), corroborando el efecto en cuanto a la modificación de la señal que produce la pulpa y los sólidos en suspensión en el zumo. De este modo, es importante destacar la eliminación de ruido que ha producido el pretratamiento, anticipando que, Zumo Intacto -0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5 414 666 918 1170 1422 1674 1926 2178 2430 Longitud de onda (nm) 2ª D + SN V- DT Zumo Intacto 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 400 690 980 1270 1560 1850 2140 2430 Longitud de onda (nm) lo g( 1/R ) Zumo Filtrado -0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5 414 666 918 1170 1422 1674 1926 2178 2430 Longitud de onda (nm) 2ª D + SN V- DT Zumo Filtrado 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 400 690 980 1270 1560 1850 2140 2430 Longitud de onda (nm) lo g( 1/R ) Com. Concentrado Com. Naranja Exprimida Recién Exprimidos sin Envasar Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 221 probablemente, cause un efecto significativo en los modelos obtenidos, cuando se comparen con los que no se aplicó ninguna modificación. Los espectros brutos revelan tres bandas de absorción fuertes alrededor de 460, 1460 y 1940 nm, y otras más débiles aproximadamente en 1200 y 1790 nm. Diversas fuentes bibliográficas apuntan que los espectros de absorción NIR de zumos de diferentes productos como tomate [233], naranja [223] o ciruela japonesa [227], están dominados por las bandas de absorción del agua, en relación a los fuertes picos que aparecen en torno a 1460 y 1940 nm, enmascarando absorciones de compuestos que absorben radiación en regiones similares como los azúcares que componen el zumo. La banda detectada en torno a los 1200 nm se puede deber a las concentraciones de azúcares reductores, compuestos mayoritarios en el zumo de naranja después del agua. En 1984 [217], se seleccionó la longitud de onda a 1206 nm como una de las representativas de los azúcares reductores en zumo de naranja. Del mismo modo, la absorción encontrada alrededor de los 1790 nm, puede ser debida al tercer compuesto mayoritario en cuanto a composición del zumo, es decir, el disacárido sacarosa. En un trabajo en el que se disolvía este compuesto en agua [217], destacaron como longitud de onda principal 1772 nm, muy próxima a la banda de absorción débil detectada en el presente trabajo en 1790 nm. Por lo tanto esta banda de absorción se puede asociar con el primer sobretono del enlace C-H, que además de los azúcares, también se puede relacionar con los ácidos orgánicos [228], principalmente con el málico y el cítrico, que es el más abundante. Para la determinación del contenido de azúcar total en zumo, unos autores consideraron apropiada la región comprendida entre 1300-1800 nm [220], y otros entre 1200-2370 nm [223]. La fuerte absorción localizada alrededor de los 460 nm aporta diferencias entre los grupos de zumos. En esta región, se obtiene información relativa al color, parámetro fundamental en la evaluación de la calidad de productos agroalimentarios. Concretamente, esta región espectral se puede asociar en el zumo de naranja, con los pigmentos beta-carotenos, que registran dos picos de absorción entre los 400 y 500 nm, correspondiéndose con absorciones del azul y verde, reflejando luz roja, amarilla y/o anaranjada. Por otro lado, esta información del color puede emplearse para el establecimiento de correlaciones con componentes internos del zumo, como ya se ha efectuado en Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 222 algunos trabajos [228]. Si se observa la señal representada gráficamente mediante la aplicación de segunda derivada y corrección de radiación dispersa (figura IV-11), existen pequeñas variaciones en el último tramo espectral (a partir de los 2000 nm), que pueden relacionarse con el contenido de azúcares totales, como ha sido apuntado por diversos autores [215]. 4.3.3.3 Análisis de Componentes Principales Una vez que se eliminaron los espectros que superaron el valor límite calculado para el estadístico RMS, se mediaron para obtener un espectro por muestra. Posteriormente, cada grupo de zumos se dividió en colectivo de calibración y validación externa, como se describió en el apartado de Material y Métodos. Sobre las muestras pertenecientes al colectivo de calibración, se desarrolló el ACP con las diferentes combinaciones de tratamientos, tanto para todos los grupos en conjunto, como de forma independiente para el grupo de muestras pertenecientes a los zumos recién exprimidos sin envasar. De este modo, el colectivo experimental disponible para el análisis con zumo intacto fue de 13, 15 y 85 muestras según se trate de los grupos comercial procedente de concentrado, comercial procedente de naranja exprimida y zumos recién exprimidos sin envasar, respectivamente. El número de muestras para zumos filtrados fue de 10, 15 y 89 en el mismo orden. Al realizar el centrado, una vez efectuado el ACP para una combinación de tratamiento determinado, los anómalos detectados por presentar elevadas distancias de Mahalanobis (H>3) con respecto al centro de la población, eran eliminados, para ir repitiendo el proceso de forma reiterativa hasta que no se obtuviese ninguno. La tabla IV-7 expone el número de anómalos obtenidos en cada tratamiento, tanto para zumo filtrado como intacto, en los dos colectivos estudiados, es decir, los tres grupos de zumo en conjunto, y las naranjas procedentes de zumos recién exprimidos sin envasar. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 223 Tabla IV-7. Anómalos espectrales (H>3), Componentes Principales (CPs) seleccionados y Varianza Explicada (VE) en zumo intacto y filtrado, para todos los grupos y para el grupo zumo recién exprimido sin envasar Intacto Filtrado Todos los grupos Recién exprimidos sin envasar Todos los grupos Recién exprimidos sin envasar Trat. H>3 CPs VE (%) H>3 CPs VE (%) H>3 CPs VE (%) H>3 CPs VE (%) 1 12 9 100 8 8 100 4 11 99,92 4 10 99,92 2 10 5 100 9 5 100 7 8 99,97 5 8 99,99 3 11 8 100 7 8 100 4 11 99,83 3 10 99,9 4 11 4 100 9 4 100 10 7 99,97 3 7 99,98 5 32 3 99,79 30 2 99,55 2 14 99,35 2 13 99,23 6 10 3 99,94 30 2 99,84 15 6 99,6 6 6 99,71 7 11 5 99,7 12 4 99,39 1 24 99,2 1 20 99,83 8 40 2 99,88 35 2 99,84 6 10 99,42 3 8 99,26 9 6 11 99,44 6 10 99,22 1 20 99,18 1 23 99,1 10 17 5 99,8 13 5 99,75 3 7 99,61 3 8 99,41 11 3 19 99,38 2 18 99,1 1 27 99,11 1 25 98,95 12 12 6 99,65 8 6 99,55 3 15 99,16 2 16 98,71 13 14 5 99,52 11 5 99,32 1 23 99,12 1 22 98,97 14 32 3 99,86 29 2 99,68 5 8 99,33 3 8 99,26 15 2 21 99,26 20 1 99,03 1 29 99,04 1 25 98,78 16 12 6 99,42 8 6 99,14 1 32 97,61 1 32 97,85 17 5 17 99,31 2 13 99,03 1 27 99,24 1 24 98,82 18 16 6 99,78 15 4 99,45 4 27 99,24 2 11 98,98 19 1 26 99,24 0 25 99,04 0 27 99,11 1 23 98,88 20 4 15 99,07 4 15 98,78 1 32 99,31 0 32 97,8 De nuevo es patente el efecto que produce la homogeneización del producto mediante la operación de filtrado, ya que si se comparan en el ACP ambos tipos de frutos (intacto vs. filtrado), en los 40 pares de combinaciones de tratamientos estudiados, siempre han surgido un mayor número de anómalos en zumos intactos, salvo en dos excepciones (tratamiento 6, todos los grupos y tratamiento 9, grupo recién exprimido sin envasar). Los tratamientos que han aportado en el análisis un mayor número de anómalos han sido, sobre todo, los que se han sometido a una aplicación de derivada, sin corrección de radiación dispersa (observar tratamientos 5, 8 y 14 en zumo intacto). La aplicación de derivadas produce un Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 224 aumento de la resolución espectral, a expensas de una disminución del ratio señal/ruido [186]. Por este motivo, es común la combinación de este tipo de tratamientos, con correcciones de radiación dispersa. De este modo, es posible que con la aplicación de derivadas de forma exclusiva, se haya generado un número de anómalos excesivo a causa de la disminución del cociente señal/ruido. En todos los análisis desarrollados, ha destacado un porcentaje muy elevado de variabilidad explicada (VE), con respecto a la variabilidad inicial de los datos, incluso en el análisis que ha seleccionado tan solo una CP (tratamiento 15, zumos intactos y grupo recién exprimidos sin envasar). Esta característica se aprecia en otros trabajos que emplearon el ACP como método de exploración inicial de los datos, explicando el 97,9% y 99,88% de la variabilidad inicial las CP1 y CP2, según se tratase de zumo de naranja [229] o de tomate [233] respectivamente, aunque otra investigación que empleó zumo de manzana, no superó el 73% de la variabilidad inicial [236]. Para visualizar pautas de agrupamiento, se representaron los valores de los coeficientes individuales (scores) de cada muestra sobre las tres primeras componentes principales (sistema de coordenadas espacial), previa aplicación de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT sobre la señal espectroscópica, una vez eliminados los anómalos del colectivo de calibración (figura IV-12). A pesar de que, como se ha venido comentando a lo largo del presente capítulo, los espectros NIR de zumos filtrados presentaron mayores niveles de repetibilidad, la representación gráfica del ACP de espectros procedentes de zumo intacto, realizó una definición con mayor claridad entre los grupos de zumos empleados. Por lo tanto, el proceso de filtración ha podido eliminar factores que influyen en tal diferenciación. En las visualizaciones mostradas de zumo intacto, se aprecia con claridad la región espacial ocupada por el grupo de zumos comerciales procedentes de concentrado, obteniendo mayor distancia con respecto a los otros dos grupos. Estos resultados son lógicos, ya que el otro grupo de zumos comerciales procede de naranjas exprimidas, más próximo al grupo de naranjas recién exprimidas en industria. Concretamente, el colectivo que presentó mayor variabilidad en su distribución fue el comercial procedente de naranjas exprimidas, ya que unas muestras se incluyeron dentro de la región definida por el grupo de naranjas recién exprimidas y otras en el procedente de concentrado. La interpretación de esta pauta de comportamiento se puede Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 225 encontrar en que las primeras presentaron características positivas, esto es, cercanía a los zumos que se encuentran recién exprimidos, y las segundas presentarían la duda en cuanto a la procedencia del zumo, concentrado o de naranjas exprimidas. Figura IV-12. Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2 y CP3) con pretratamiento de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT sobre la información espectral obtenida a partir de zumo de naranja intacto y filtrado Estas acepciones no se pueden trasladar a los resultados obtenidos con zumos filtrados, ya CP1 CP3 CP2 CP1 CP2 CP3 CP3 CP2 CP1 CP1 CP2 CP3 Zumo Intacto Zumo Filtrado Com. Concentrado Com. Naranja Exprimida Recién Exprimidos sin Envasar Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 226 que un porcentaje importante de las muestras se encuentran solapadas en regiones comunes. De este modo, se podrían generar librerías espectrales de zumo intacto que permitieran autentificar los zumos comerciales procedentes de naranja exprimida, cada vez más demandados en el mercado de zumos de frutas. En un estudio similar desarrollado sobre zumos de naranja, también emplearon el ACP para observar tendencias en los datos [229]. Su colectivo experimental estaba constituido por 107 muestras de zumos pertenecientes a 8 marcas comerciales, de las cuales cinco pertenecían a bebidas elaboradas a base de zumo de frutas o zumos de naranja a base de concentrado, y el resto eran zumos puros de naranja sin ningún tipo de aditivo. Mediante la representación en el plano de las CP1 y CP2, al igual que en el presente documento, se diferenciaron con claridad los dos tipos de zumos, aunque es importante destacar que estos autores añadieron agua a las muestras como proceso de homogeneización, para minimizar el efecto de sólidos en suspensión, evitando fenómenos de radiación dispersa. Otros autores, con otro tipo de zumos, obtuvieron información relevante a partir del ACP. Por ejemplo, en zumo de manzana, mediante la representación de las dos primeras CPs, detectaron muestras que se apartaban del colectivo global, por poseer elevados contenidos de azúcares y acidez titulable con respecto al resto [222]. Con el mismo tipo de zumo, manzana, se encontró la formación de dos grupos que respondían a los diferentes procedimientos empleados para el proceso de elaboración [236], o a los diferentes años de cultivo que pertenecían las manzanas que se emplearon para el colectivo experimental, traduciéndose en la detección del efecto que había producido el tiempo de almacenamiento [264]. En zumo de tomate, el ACP además de detectar muestras anómalas, se empleó para separar zumos que habían sido sometidos a procesos de oxidación de los que no [233]. Los espectros de estos zumos, habían sido tratados previamente con segunda derivada y corrección de radiación dispersa MSC, pretratamiento similar al empleado en la representación gráfica mostrada (figura IV-12). 4.3.3.4 Modelos de predicción de pH, Acidez, contenido en Sólidos Solubles (CSS) y Limonina 4.3.3.4.1 Valores de referencia Los resultados obtenidos por vía húmeda de los constituyentes empleados para el desarrollo de las predicciones, se encuentran en las tablas IV-8 y IV-9, según se trate de zumo intacto o filtrado Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 227 respectivamente, exponiendo en cada caso media, desviación típica y rango, tanto para los colectivos de calibración como de validación externa. Asimismo, dentro de cada tipo (intacto, filtrado) se diferencia entre los valores obtenidos empleando los tres grupos de zumos que constituían el colectivo experimental o el grupo de zumos recién exprimidos sin envasar. Como se puede apreciar, se han tratado de forma individual los tres valores obtenidos para el análisis del parámetro limonina, junto con el valor medio de los mismos. Esto se debe a la baja repetibilidad observada en dichos valores, considerando oportuno la obtención de ecuaciones predictivas individuales para cada una de las repeticiones, junto con otra, en la que se emplearon los valores medios de las mismas. En zumo intacto, ambos colectivos estudiados presentaron mayor dispersión de los datos los grupos de calibración, que los de validación externa. Asimismo, el rango de valores fue más extenso para las muestras que conformaron el grupo de calibración. En el desarrollo de una aplicación práctica, se persigue este objetivo, de modo que el colectivo de calibración constituya la mayor variabilidad dentro del constituyente a predecir. Por el contrario, esta característica no la presentaron las muestras que constituyeron los zumos filtrados. Como se puede observar, en todos los parámetros a excepción de la acidez y del pH en el Grupo de zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar, los colectivos de validación presentaban mayor dispersión que los de calibración. Además, en la mayoría de los casos el rango de validación era superado por alguno de los extremos con respecto al de calibración. Estas particularidades se dieron simplemente por la selección al azar que se llevó a cabo en ambos colectivos. A igualdad de diversos factores, se puede pensar que las predicciones en zumo intacto podrían ser más exactas, ya que presentan la variabilidad existente del colectivo de validación. Se aprecia en la tabla un dato erróneo correspondiente al valor inferior del constituyente pH, dentro del Grupo de zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar, en el colectivo de calibración. Este error posiblemente proceda de la fase de introducción de datos; por lo tanto, en el proceso de cálculo del modelo esta muestra será excluida en calidad de anómalo químico. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 228 Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 229 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 230 Mediante la observación de los valores de Media, DT y Rango en los diferentes resultados obtenidos en las determinaciones de limonina, se comprueba como se dan diferencias importantes en las tres repeticiones. De este modo, en los valores medios se aprecian diferencias de hasta el 15,37% (colectivo de validación del Grupo de zumos recién exprimidos sin envasar, filtrado) entre la primera (L1) y tercera repetición (L3). En este sentido, la repetibilidad del método de referencia empleado es cuestionable. Si a este hecho se le añade que este constituyente se encuentra en muy bajas concentraciones (órdenes de ppm, Rango en tablas IV-8 y IV-9), es posible que los modelos cuantitativos desarrollados no aporten la suficiente calidad. A continuación, la figura IV-13 muestra a modo de ejemplo, la distribución de los parámetros pH, acidez, sólidos solubles y los valores obtenidos a partir de la tercera repetición de limonina (L3), de los colectivos seleccionados para zumo filtrado, tanto para el Grupo de zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar, como para el Grupo de zumos recién exprimidos sin envasar. La distribución de los constituyentes mostrados sigue pautas similares, independientemente de la incorporación de los grupos comerciales a los colectivos (Zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar). Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 231 Colectivo Calibración Colectivo Validación Externa 1Con el objetivo de obtener una mejor apreciación de este constituyente, se eliminó la muestra que presentó un valor anormal de 0,71 Figura IV-13. Distribución presentada del colectivo experimental en zumo filtrado para los constituyentes pH, acidez, sólidos solubles y limonina Zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar Zumos recién exprimidos sin envasar 0 5 10 15 20 25 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0 4,4 pH Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 Acidez Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 Acidez Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 7,8 8,3 8,8 9,3 9,8 10,3 10,8 11,3 11,8 12,3 12,8 13,3 13,8 14,3 Sólidos Solubles Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 35 7,8 8,3 8,8 9,3 9,8 10,3 10,8 11,3 11,8 12,3 12,8 13,3 13,8 14,3 Sólidos Solubles Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 35 40 10 17 24 31 38 45 52 59 66 73 80 87 L3 Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 35 40 10 17 24 31 38 45 52 59 66 73 80 87 L3 Fr ec ue nc ia 0 5 10 15 20 25 30 35 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4,0 pH1 Fr ec ue nc ia Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 232 Todos los constituyentes han presentado en su recorrido tramos que no han sido representados con un número de muestras considerable, especialmente el parámetro limonina (L3). Dicho constituyente está representado sobretodo entre los valores 10-24 ppm, encontrándose en el resto de recorrido un número importante de muestras (superior al 50%) que se emplearon para conformar el colectivo de validación externa y que, presumiblemente, no podrán predecirse con exactitud. Por otro lado, la escasa desviación típica de los parámetros pH y acidez, invitan a que la repetibilidad del método de referencia expresada mediante el Error Típico de Laboratorio, sea muy reducida, para que de este modo se minimice la expresión (ETL/DT)2, ya que la diferencia de la unidad con respecto a esta expresión representaría la variación teórica en los datos que explica el modelo, esto es, el coeficiente de determinación teórico o potencial (R2) a obtener [303]. A excepción de la limonina, los constituyentes presentaron una distribución ajustada en mayor o menor medida a una distribución normal, especialmente el parámetro contenido en sólidos solubles. 4.3.3.4.2 Caracterización de los modelos La tabla IV-10 expone los modelos seleccionados en la predicción de cada parámetro, tanto para zumos intactos como filtrados, distinguiendo entre las ecuaciones obtenidas con todos los grupos y las que se obtuvieron empleando los zumos recién exprimidos sin envasar. La terminología empleada para citar las ecuaciones es la descrita en el apartado 4.3.2.4.3, concretamente en la tabla IV-4. Tanto el número máximo de términos o factores PLS, como los pases o grupos de validación cruzada seleccionados, fueron los que recomendó el programa, si bien, como ya se ha explicado, si un modelo seleccionaba todos los términos, se recalculaba ampliando en dos términos más el límite, y así sucesivamente. Cuando se obtuvieron las predicciones con los tres grupos de zumos, el número máximo de términos PLS fue 9, y 6 pases de validación cruzada. Estos valores descendieron a 8 y 5 respectivamente cuando se calcularon los modelos con los zumos recién exprimidos sin envasar. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 233 Tabla IV-10. Caracterización de los modelos predictivos seleccionados en zumo de naranja Zumo Intacto Zumo Filtrado Constituyente Zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar Zumos recién exprimidos sin envasar Zumos comerciales y recién exprimidos sin envasar Zumos recién exprimidos sin envasar pH Ec. 6 Ec. 18 Ec. 8 Ec. 13 Acidez Ec. 10 Ec. 20 Ec. 10 Ec. 10 Sól. Solubles Ec. 12 Ec. 11 Ec. 18 Ec. 4 Limonina1 Ec. 15 (L1) Ec. 9 (L1) Ec. 6 (L1) Ec. 8 (L1) 1 Modelos seleccionados entre los cuatro valores de limonina obtenidos: L1, L2, L3 y L medio Con respecto al parámetro limonina en todos los casos se han predicho de forma más eficiente los valores obtenidos con la primera repetición, es decir, L1. No se ha presentado una pauta de un modelo concreto seleccionado, ya que de las 20 combinaciones posibles, se han elegido 12 diferentes. En cuanto a la selección del rango de longitud de onda, destaca la eliminación de la región visible en 8 de los 12 modelos, incorporando dicha región en zumo intacto, los dos modelos seleccionados para el parámetro limonina y el modelo 11 de sólidos solubles, y en filtrado, el 13 para pH (tabla IV-4). Esta última ecuación fue la única que empleó todo el espectro continuo del instrumento (400-2500 nm). La eliminación del rango visible del espectro se puede encontrar en bibliografía en numerosos trabajos de aplicación de la tecnología sobre zumos, siendo práctica más habitual en aquellos que trabajaron con un amplio rango espectral [215, 219-221, 223, 227, 233, 237], si bien otros emplearon exclusivamente la región visible, para la determinación por ejemplo de ácidos orgánicos en zumos de naranja [229] o la calidad interna de bayas chinas [231]. Por otro lado, el 58,3% de las ecuaciones emplearon el rango espectral que excluía las bandas de absorción del agua (ecuaciones 4, 8, 11, 12, 15 y 20, tabla IV-4). Esta práctica es común en la selección de modelos que se obtengan a partir de zumos de frutas, sobre todo, la eliminación de la banda de absorción que se encuentra en torno a 1950 nm. De este modo, se encuentran estudios para la determinación del contenido de carbohidratos en distintas matrices de zumos que prescindieron de dicha zona del espectro [223], o para la determinación de ácidos Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 234 orgánicos en zumos de albaricoque [227] y la composición glucídica en zumos de ciruela japonesa [230]. Indiscutiblemente, el parámetro que presentó mayor homogeneidad en los modelos obtenidos fue la acidez, que repitió en tres de las cuatro ocasiones el modelo seleccionado. En todos los casos excluyó la región visible del espectro, aplicando tratamiento de derivada y corrección de radiación dispersa. El tratamiento de derivada fue seleccionado en todos los modelos, a excepción de la ecuación 4, para sólidos solubles en zumo filtrado. De los dos tipos de derivadas aplicadas, ha destacado la primera, ya que de las 16 ecuaciones seleccionadas (tabla IV-10), se ha aplicado en 10. La corrección de radiación dispersa se aplicó en 9 ecuaciones, combinadas en todos los casos con aplicación de derivadas. En trabajos donde se han ensayado con diversas combinaciones de pretratamientos sobre la señal, se pueden encontrar resultados similares. En consecuencia, trabajando con zumo de tomate centrifugado y filtrado, se seleccionó la aplicación del tratamiento de corrección de radiación dispersa MSC, Multiplicative Scatter Correction, sin derivada, para la predicción del contenido en sólidos solubles, y primera derivada sin corrección de radiación dispersa, para predecir pH [233]. La aplicación de primera derivada fue el tratamiento seleccionado en un estudio con zumo de frutas (naranja, melocotón-uva, piña-uva) diluido, centrifugado y filtrado, para predecir contenido de azúcar total añadido, y azúcares individuales (glucosa, fructosa y sacarosa) [220]. En la determinación del contenido de azúcar en zumo de naranja comercial filtrado, se obtuvieron los mejores resultados combinando primera derivada con MSC para la corrección de radiación dispersa, trabajando con una estrecho rango espectral (450-770 nm) [228]. Para la determinación del contenido en sólidos solubles en zumos comerciales (algunos se encontraban diluidos) se seleccionó la aplicación de segunda derivada. El mismo tratamiento se empleó para la determinación de glucosa, fructosa y sacarosa en zumos de naranja y manzana centrifugados y filtrados [219], o para cuantificar el contenido de ácido cítrico y málico [227], y azúcares totales e individuales [230] en zumo de ciruela japonesa. 4.3.3.4.3 Evaluación de los modelos Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 235 Los estadísticos empleados para la evaluación de los modelos seleccionados, junto con los términos o factores PLS y el número de muestras que los componen, se muestran en las tablas IV- 11 y IV-12, para zumos intactos, según se trate respectivamente de todo el colectivo experimental empleado (comerciales y recién exprimidos sin envasar) o recién exprimidos. Los mismos modelos se exponen en las tablas IV-13 y IV-14, pero en este caso se representan las predicciones que se obtuvieron cuando los zumos se sometieron al proceso de filtrado. En todas las ecuaciones se aprecian dos parámetros con elevada capacidad predictiva (acidez y contenido en sólidos solubles), y el resto (pH y limonina) con calidad cuestionable. No se observaron mejoras en las ecuaciones que se obtuvieron empleando el grupo de zumos recién exprimidos sin envasar (tablas IV-12 y IV-14), es decir, los que se obtuvieron directamente una vez exprimidas las naranjas en industria, excluyendo los grupos de zumos comerciales. Por lo tanto, las ecuaciones obtenidas con los dos grupos comerciales (naranja exprimida y concentrado) y el grupo de recién exprimidas sin envasar se pueden emplear para la obtención de predicciones, independientemente del tipo de zumo, sin necesidad de separar comerciales de los exprimidos en industria. El constituyente pH obtuvo los mejores resultados con zumo filtrado (tabla IV-13). En el apartado 4.3.3.4.1 ya se comentó la posibilidad de no explicar gran cantidad de la variabilidad inicial los modelos a obtener, dado la escasa desviación típica de los datos de partida. A pesar de ello, en la validación externa, se obtuvo un coeficiente de determinación que permite realizar una buena separación entre valores bajos, medios y altos [138], a pesar de no obtener un valor del estadístico RPD muy elevado (RPD=1,69). Trabajando con zumo de tomate [233] obtuvieron en validación cruzada valores de r2 similares a los aquí presentados (r2=0,59), disminuyendo el error a ETVC=0,05, inferior al alcanzado en los zumos de naranja filtrados del presente documento (ETVC=0,16), si bien el rango predictivo de éste se encuentra entre 2,84-3,93 frente al de aquel, 4,06-4,48. Estos autores asignaron una alta precisión a los modelos PLS que obtuvieron para predecir pH en zumo de tomate con espectros FT-NIR. En otro estudio, para predecir pH en zumo de bayas chinas, en validación cruzada obtuvieron valores de r2=0,74, y en validación externa R2VE=0,85 y ETP=0,19, que comparados con los aquí obtenidos en zumos de naranja alcanzaron un R2VE superior, pero con un error predictivo también ligeramente superior (tabla IV-13). Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 236 Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 237 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 238 Las carencias que se pueden encontrar en las predicciones de pH en productos agroalimentarios mediante NIRS pueden tener su origen en la propia definición del parámetro, esto es, el pH aporta la información sobre los iones libres de hidrógeno, por lo que, teniendo en cuenta que la tecnología obtiene básicamente información de los enlaces, OH, NH y CH, su determinación directa no es fácil, planteando que para sus predicciones posiblemente se obtengan a partir de correlaciones secundarias de otros parámetros. El parámetro acidez, expresado como gramos de ácido cítrico por 100 ml de zumo, obtuvo excelentes resultados en los modelos seleccionados cuando se emplearon los tres grupos del colectivo experimental (tablas IV-11 y IV-13), encontrándose coeficientes de determinación próximos a la unidad en calibración y validación cruzada, y a 0,9 en validación externa. Del mismo modo, los valores de ETP no superaron 0,08 g de ácido cítrico/100 ml. Asimismo, los valores de RPD fueron muy superiores a 3 en ambos casos (RPD=5,5; RPD=5,75). En otros trabajos publicados se obtuvieron resultados similares. En consecuencia, trabajando en modo de transmitancia con zumo de fresa [304], obtuvieron errores de predicción en acidez de 0,03 cuando se controlaba la temperatura de análisis, ascendiendo a 0,06 cuando se empleaban espectros obtenidos a diferentes temperaturas. Estos valores de los errores típicos de predicción fueron corregidos por el bias o error sistemático, disminuyendo por lo tanto la cuantía del error predictivo del modelo. Del mismo modo, trabajando con zumo de tomate [225], donde se ensayó con diversos colectivos de calibración y validación, obtuvieron unos valores de R2VE=0,86- 0,94, y ETP=0,03-0,08. En un estudio donde se empleó zumo de mandarina, obtuvieron errores de predicción similares a los aquí obtenidos, ETP=0,05, pero de nuevo fueron corregidos por el bias [305]. Al igual que con la acidez, las predicciones del contenido en sólidos solubles fueron bastante satisfactorias, destacando el modelo que determina dicho parámetro sobre zumo de naranja intacto, tanto para zumos comerciales como los recién exprimidos en industria (tabla IV- 11), dada su aplicabilidad. Como se disponían de duplicados en cuanto a la información del método de referencia de 20 muestras comerciales, se calculó la repetibilidad del mismo mediante el cálculo del Error Típico de Laboratorio (ETL), obteniendo un valor de ETL=0,18. Este valor es muy inferior a la desviación típica de las muestras empleadas para el desarrollo del modelo (tabla IV-11, DT=0,79), lo que Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 239 permite obtener una explicación potencial de la variación inicial de los datos en torno al 95% (R2=0,95). Como se puede apreciar en la tabla IV-11, el error de calibración es igual que el del método de referencia, alcanzando del mismo modo el R2 potencial (0,95). En fase de validación cruzada los resultados siguen siendo excelentes (ETVC=0,23; R2=0,92), al igual que en validación externa, si bien en esta etapa es cuando se produce un mayor distanciamiento con respecto al error (ETP=0,3) y al coeficiente de determinación (R2=0,83). Pero este distanciamiento no es tal, y a la vez enmascara los excelentes resultados que aportan las predicciones de este constituyente que lo hacen muy similar al método de referencia. El argumento que justifica esta afirmación se encuentra en la observación de dos muestras que pertenecen a cada colectivo de validación externa, esto es, zumos intactos y filtrados. Es decir, la muestra identificada como “32” del colectivo de validación externa de zumo intacto, sistemáticamente ha mostrado una diferencia importante entre el valor de laboratorio y el valor predicho en las 20 combinaciones de modelos ensayadas. Por otro lado, la muestra que presentó el mismo comportamiento, pero en el colectivo de zumos filtrados fue la denominada “31”. La tabla siguiente (tabla IV-15) expone los resultados de laboratorio y predichos que han presentado estas muestras en los modelos seleccionados. Tabla IV-15. Predicciones de muestras con sospecha de valores de referencia erróneos en zumos. Efecto de su eliminación sobre los valores de ETP y R2VE Muestra Grupo Zumo Valor Ref. Valor Pred. Resid. ETP R2VE 32 Comerciales + Recién expr. sin envasar Intacto 11,77 13,04 1,27 0,19 0,94 32 Recién expr. sin envasar Intacto 11,77 13,08 1,31 0,18 0,94 31 Comerciales + Recién expr. sin envasar Filtrado 13,37 11,8 1,57 0,42 0,87 31 Recién expr. sin envasar Filtrado 13,37 11,82 1,55 0,24 0,92 Como se puede apreciar, todo hace pensar que se produjo un error en la trascripción de los valores de referencia, dándole el valor obtenido de la muestra “32” a la “31” y viceversa. Asimismo, la tabla IV-15 expone los resultados que se obtendrían en validación externa cuando estas muestras fueron eliminadas de los respectivos colectivos, alcanzando entonces unos valores los estadísticos prácticamente iguales a los del método de referencia, sobre todo los modelos obtenidos a partir de los zumos intactos (ETP=0,19, ETP=0,18; R2VE=0,94). Estas pequeñas diferencias con respecto a los zumos filtrados hacen pensar que el proceso de filtración produce una retención de partículas que impide optimizar la correlación entre el contenido de sólidos Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 240 solubles y la señal espectroscópica NIR. En bibliografía no se aprecian en conjunto modelos predictivos del contenido en sólidos solubles en zumos de frutas con tan elevada exactitud y precisión como los obtenidos en la presente Tesis Doctoral. Una de las principales razones es que casi todos los trabajos llevados a cabo con zumos de frutas y NIRS, se efectuaron con un proceso de filtración u homogeneización, que parece que interfiere negativamente en el cálculo del contenido en sólidos solubles, como ya se ha comentado. Aún así, se observan errores en predicción inferiores a los aquí presentados, pero corregidos para el bias y con un rango predictivo más estrecho. Estos valores son de ETP(C)=0,09 [304] y ETP(C)=0,08 [305] según se trate de zumo de fresas y mandarina respectivamente. En otro trabajo con zumo de tomate [233], se obtuvo un valor de ETP=0,15, pero con unos coeficientes de determinación de R2=0,85 y r2=0,38 según fuese en fase de calibración y validación cruzada respectivamente, y un rango predictivo de 3,8-4,8. Por el contrario, en zumo de bayas chinas [231] y naranja [226], se apreciaron coeficientes de determinación de 0,9 y 0,96, pero con unos errores predictivos de ETP=0,4 y ETP=0,68 respectivamente. Con respecto al parámetro limonina, es con el que se han obtenido las predicciones de peor calidad. De los modelos seleccionados, el que puede aportar los resultados más satisfactorios es el de zumo de naranja intacto, grupo recién exprimido sin envasar (tabla IV-12). En este modelo, los coeficientes de determinación se encuentran en unos valores próximos a lo que se considera buena precisión (R2=0,7-0,89) [138], si bien se obtienen valores elevados de los errores predictivos (ETC=4,13; ETVC=5,51; ETP=6,5) e inferiores del estadístico RPD (RPD=1,57). En bibliografía no se encuentran estudios que hayan trabajado con este constituyente, pero si parece quedar claro que la tecnología NIRS produce una respuesta a las diferentes concentraciones de limonina. Sin embargo, la limitada exactitud y precisión de estos modelos puede deberse a un conjunto de circunstancias: la primera limitación, sobre la que no se puede aportar ninguna solución, son las bajas concentraciones en las que se presenta el constituyente (ppm), la segunda es que la distribución del colectivo de calibración empleada para el desarrollo de las predicciones no es nada buena (figura IV-13), ya que se concentran el mayor número de muestras en un rango muy estrecho. En este sentido se debería completar el rango con muestras que posean concentraciones en las que no están suficientemente representadas. Por último, el Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 241 método de referencia empleado no posee una elevada repetibilidad, ya que se calculó el error típico de laboratorio (ETL), y aportó un resultado de ETL=3,29. El ETP obtenido en el modelo que se ha comentado (ETP=6,5) no ha superado en dos veces la repetibilidad del método de referencia, por lo que, según este dato, el modelo adquiriría una aptitud de buena precisión. 4.4 Estudio de detección y cuantificación de Tiabendazol mediante Tecnología NIRS sobre naranja intacta Para la consecución de los objetivos planteados en el presente estudio se obtuvo financiación a partir del Proyecto de Investigación “Detección de residuos de fungicidas aplicados en postcosecha en naranja entera mediante espectroscopia NIR” (INIA 2005-00043-00-00). La producción científica generada del mismo se encuentra en dos participaciones en congresos:  Resumen y póster en “IV Congreso de Ingeniería y Tecnología de Alimentos” mediante el título “Estudio de viabilidad para el establecimiento de sistemas de control de tiabendazol en naranja intacta aplicando tecnología NIRS”.  Publicación y póster en el “V Congreso Iberoamericano de Tecnología Postcosecha y Agroexportaciones” mediante el título “Estudio sobre la respuesta espectroscópica en el Infrarrojo Cercano a niveles de tiabendazol inferiores al límite máximo de residuos sobre naranja intacta”. Toda esta información se encuentra recogida en el Anexo 6 de la presente Tesis Doctoral. 4.4.1 Antecedentes De nuevo en el presente apartado es necesario destacar el incremento en cuanto a sensibilización y exigencia que presenta el consumidor sobre la calidad de los productos agroalimentarios, adquiriendo especial importancia todo lo relacionado con la presencia de sustancias tóxicas. Concretamente, uno de los efectos que más preocupa es la presencia de residuos de plaguicidas en productos destinados directamente a consumo humano o alimento para el ganado, ya que tanto directa como indirectamente, forman parte de nuestra dieta [306]. En este sentido, los países desarrollados están siendo cada vez más exigentes con la aplicación de este tipo de productos en la agricultura. Concretamente, en la Unión Europea (UE), los alimentos destinados a consumo humano o animal están sujetos a un Límite Máximo de Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 242 Residuos de plaguicidas (LMR), para garantizar que la presencia de estos compuestos no constituya un riesgo para la salud de los consumidores. Así, la presencia de residuos fitosanitarios postcosecha presentes en el producto objeto del actual capítulo, naranjas, es un factor que afecta en gran medida tanto a la calidad final del consumo en fresco del producto, como al zumo obtenido. A escala mundial, España es uno de los principales productores de naranja, tomando cada vez mayor importancia Andalucía con respecto a la producción nacional, como se aprecia en la figura IV-14. 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 97 /98 98 /99 99 /00 00 /01 01 /02 02 /03 03 /04 04 /05 05 /06 06 /07 07 /08 Campaña Tm Resto de España Andalucía Datos obtenidos a partir de estimaciones del Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (97/98-00/01) y de la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía (01/02-07/08) Figura IV-14. Evolución de la producción de naranja de Andalucía frente al resto de España A pesar de que las naranjas empleadas en la preparación de zumos son las que llevan menos tratamientos de productos fitosanitarios para su conservación, en algunos casos proceden del destrío de centrales hortofrutícolas para consumo en fresco, y aunque respeten los plazos establecidos de los productos aplicados, es posible que lleguen a la industria extractora con concentraciones de fungicidas superiores a las permitidas. En la actualidad, no existen sistemas que permitan detectar en tiempo real residuos de productos fitosanitarios con elevada intensidad de muestreo. De este modo, se aprecia la necesidad de implantación de tecnologías que permitan un control postcosecha de forma rápida y eficiente. En este sentido se plantea la tecnología NIRS como alternativa para la detección de un plaguicida comúnmente aplicado en centrales hortofrutícolas, tiabendazol, sobre naranja intacta. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 243 La normativa vigente que regula los Límites Máximos de Residuos en la Unión Europea, establece la cantidad de 5 ppm como límite de tiabendazol en naranjas [307]. Como se ha comentado, a pesar de los trabajos descritos sobre la aplicación de la tecnología en fruta intacta, no se encuentra apenas información relacionada con residuos de plaguicidas. Por lo tanto, en primer lugar se llevará a cabo un estudio para comprobar la posibilidad de detección del producto, para posteriormente cuantificarlo mediante el establecimiento de predicciones con naranjas que presenten niveles de tiabendazol inferiores al LMR determinado por la Unión Europea (<0,05 ppm), para obtener fiabilidad en cuanto a la aplicabilidad de la tecnología. 4.4.2 Material y Métodos 4.4.2.1 Colectivo experimental 4.4.2.1.1 Recepción Se emplearon naranjas sanas de la variedad Valencia Late procedentes de una misma finca del término municipal de Palma del Río (Córdoba). En el momento de su recolección fueron transportadas al IFAPA Centro de Palma del Río en donde fueron sometidas a los diferentes tratamientos, en la línea de procesado disponible en dicho centro. Figura IV-15. Recepción de naranjas en el IFAPA Centro de Palma del Río (Córdoba) para realización de tratamiento con tiabendazol 4.4.2.1.2 Aplicación del tratamiento Las naranjas se dividieron en cinco grupos, según los tratamientos aplicados que se describen a continuación. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 244 En primer lugar, se asignó el tratamiento Blanco (B) a aproximadamente 20 kg de naranjas que no fueron sometidas a ningún tipo de proceso. El segundo grupo lo constituyeron aproximadamente 40 kg de naranjas que fueron lavadas en la línea, pasando por un tanque de lavado con una capacidad de 440 l, para ser posteriormente secadas; este grupo se denominó Lavadas (L). Figura IV-16. Grupo de naranjas lavadas (L) en el inicio de la etapa de lavado Para conformar el grupo siguiente, se trataron de la misma forma que el anterior otros 40 kg de naranjas, las cuales una vez secadas fueron sometidas a una segunda inmersión, pero en este caso en una emulsión de aceite-agua, a base de cera de polietileno y goma laca al 18% p/v (Citrosol A, abrillantador para cítricos, tratamientos post recolección). Seguidamente a la operación de encerado, fueron sometidas a una segunda etapa de secado. Este grupo se denominó LC. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 245 Figura IV-17. Abrillantador para cítricos empleado Figura IV-18. Inmersión de naranjas en emulsión de aceite-agua a base de cera de polietileno y goma laca Después se añadió en el agua de lavado tiabendazol, hasta llegar a una concentración del 0,5% p/v, o lo que es lo mismo, 5000 ppm. Esta cantidad es la que usualmente se adiciona en industria para que se obtenga sobre la naranja una concentración entre 1-2 ppm, por debajo de los 5 ppm establecidos como Límite Máximo de Residuos para el tiabendazol. Con este tratamiento fueron tratados unos 40 kg de naranjas, denominadas LTBZ, las cuales finalmente eran sometidas a un proceso de secado. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 246 Figura IV-19. Detalle de etiqueta de tiabendazol empleado para el tratamiento de naranjas Figura IV-20. Aplicación de lavado y tratamiento de tiabendazol Finalmente el último grupo lo constituyeron otros 40 kg de naranjas tratadas de la misma forma que el anterior, pero además con la inmersión y posterior secado en la emulsión aceite-agua. Este grupo se identifica como LCTBZ. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 247 Figura IV-21. Etapa de secado La figura IV-22 expone a modo de resumen los grupos obtenidos en el proceso. Figura IV-22. Descripción esquemática del proceso para la elaboración de los grupos de naranja L, LTBZ, LC, LCTBZ Para la realización del estudio de detección de tiabendazol mediante Tecnología NIRS a través del desarrollo de modelos discriminantes, se emplearon tres categorías: grupo blanco o naranjas sin ningún tipo de tratamiento (B), grupo de naranjas lavadas, secadas y con aplicación de ceras (LC), y el mismo que el anterior, pero con la aplicación en el agua de lavado de tiabendazol a la concentración indicada (LCTBZ). Para la realización de modelos predictivos mediante tecnología NIRS se emplearon dos grupos, naranjas lavadas con aplicación de tiabendazol (LTBZ), y el mismo tratamiento pero con el proceso de encerado (LCTBZ). Esta elección se llevó a cabo con el objetivo de obtener predicciones válidas tanto para la industria de consumo en fresco, como para la de producción de zumo, dado que el proceso de encarado en las naranjas únicamente se efectúa cuando se destinan para consumo en fresco, representando así la variabilidad encontrada en ambos tipos de industrias. Lavado Lavado + tbz 0,5% p/v Secado Grupo L Grupo LTBZ Encerado Grupo LC Grupo LCTBZ Secado Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 248 4.4.2.1.3 Conservación y preparación de muestras Una vez efectuados los tratamientos, las naranjas se conservaron en refrigeración a 4ºC y 80% de humedad en el IFAPA Centro de Palma del Río. Para la realización de los análisis se transportaron en refrigeración al IFAPA Centro Alameda del Obispo, donde fueron identificadas, calibradas y pesadas individualmente. Se llevó a cabo una clasificación por peso en cuatro grupos, para que en el análisis se recogiera variabilidad en tamaño/peso: Grupo S < 150 g Grupo M 150 – 175 g Grupo L 175 – 200 g Grupo XL > 200 g Posteriormente, para minimizar el efecto que pudiera producir en el análisis el factor heterogeneidad de la piel, debido a malformaciones o daños causados por diversos agentes, se eliminaron aquellas naranjas que presentaban defectos visuales. La figura IV-23 expone muestras tipo eliminadas, en este caso principalmente por presentar pequeñas lesiones en la epidermis a causa de daños mecánicos o abrasiones causados por oleocenosis, es decir, liberación de los aceites esenciales de la corteza debido a pequeños impactos en operaciones de recolección o transporte. Figura IV-23. Naranjas eliminadas del colectivo experimental por presentar defectos Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 249 Finalmente las naranjas fueron almacenadas en refrigeración hasta el día de su análisis NIRS. 4.4.2.2 Análisis NIRS El espectrofotómetro, junto con el módulo de análisis empleado fue el mismo que el descrito en el apartado 4.3.2.4 del presente capítulo, ya que permite analizar producto intacto. La apertura de ventana circular seleccionada en este caso fue de 2,5 cm de diámetro. La figura IV-24 muestra en detalle la apertura del diafragma que constituye la ventana de análisis. Figura IV-24. Ventana de análisis (2,5 cm) para la adquisición de información espectral sobre naranja intacta Las muestras se acondicionaron a temperatura ambiente durante 18-22 h previamente al análisis NIRS. Se seleccionaron tres estrategias de desarrollo y tratamiento de datos, en función de la zona de adquisición de información espectral, esto es, del posicionamiento del fruto en el equipo, dando lugar a un total de 8 espectros/muestra:  Lecturas del ecuador. La naranja se posiciona en el equipo de forma que la información espectral se adquiere de la zona del ecuador, realizando 6 lecturas equidistantes 60º. Para sistematizar el análisis y no repetir lecturas se efectuaba el giro entre cada una de ellas siempre en el sentido de las agujas del reloj.  Lecturas de la base. La naranja se posiciona en el equipo con el extremo distal en donde se encuentra el pedúnculo en la posición superior, de forma que la lectura se efectúa en el extremo opuesto. En dicha posición se obtuvieron dos espectros/muestra, girando la naranja 90º entre cada lectura.  Lecturas suma de las dos anteriores: 6 espectros del ecuador + 2 espectros de la base. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 250 La figura IV-25 exhibe gráficamente a modo de ejemplo los puntos de lectura espectral efectuados por muestra. Figura IV-25. Puntos de lectura de información espectral efectuados sobre cada naranja Asimismo, las imágenes que conforman la figura IV-26 muestran el posicionamiento de las naranjas en la realización de lecturas sobre el ecuador (A) y la base (B). A B Figura IV-26. Obtención de información espectral sobre zona del ecuador (A) y base (B) en naranja intacta Para el proceso de adquisición y gestión de información espectral, se empleó el programa informático de análisis de rutina ISIscan v2.81 (Infrasoft International LLC., State Collage, PA, USA), almacenando los espectros NIR como valores de absorbancia [(log(1/R)]. 4.4.2.3 Análisis de referencia Para la realización de los modelos predictivos fue necesaria la determinación de los niveles de tiabendazol en las muestras destinadas para tal fin. Una vez obtenidos los espectros NIRS, las muestras se envasaban en bolsas de plástico de uso alimenticio, congelándose a -20ºC hasta el momento del análisis de referencia. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 251 Para las determinaciones analíticas de los niveles de tiabendazol, las muestras fueron enviadas al Laboratorio Agroalimentario de Córdoba. La técnica empleada fue cromatografía líquido-masas (CL-EM), con un límite de detección en la medida de 0,02 mg/kg. 4.4.2.4 Análisis de datos A continuación se describen las pautas seguidas en los diferentes cálculos quimiométricos para la obtención de modelos que permitan la detección de tiabendazol sobre naranja intacta y predicciones para su cuantificación. El programa informático empleado para las distintas aplicaciones ha sido WinISI III v1.50e (Infrasoft International). 4.4.2.4.1 Estudio de repetibilidad espectral El estudio de la repetibilidad espectral se efectuó siguiendo la metodología de cálculo descrita en el apartado 2.3.2.4.1. Por lo tanto, para la obtención de un espectro representativo por muestra, se determinó un valor límite del estadístico RMS para naranja intacta en cada forma de análisis, esto es, sobre espectros obtenidos en la región distal de la base, en la región del ecuador y en la suma de ambas. 4.4.2.4.2 Análisis de Componentes Principales Como se ha explicado en los apartados 2.3.2.4.2 y 3.1.2.5.2, se ha desarrollado un Análisis de Componentes Principales. En este caso se efectuaron análisis para los colectivos conformados por los espectros obtenidos de la región de la base, del ecuador, y suma de ambos. Se realizaron sobre espectros brutos, es decir, sin aplicación de tratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa sobre la señal. El principal objetivo para el que se obtuvieron componentes principales con este tipo de información espectral fue para la detección de anómalos mediante la aplicación de la distancia de Mahalanobis tras el centrado de la población. 4.4.2.4.3 Análisis discriminante. Detección de Tiabendazol El cálculo de los modelos discriminantes fue el mismo que se describió en el apartado 2.3.2.4.3. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 252 En el presente estudio no se validaron externamente los modelos, empleando como método evaluador la validación cruzada, aportando el error obtenido en esta fase (ETVC), el número de muestras mal clasificadas y el error de clasificación. Se planteó la discriminación entre tres grupos para satisfacer el objetivo planteado, esto es, grupo de referencia constituido por muestras a las que no se les aplicó ningún tratamiento (grupo B), muestras lavadas con aplicación de cera (LC) y el tratamiento anterior con aplicación del producto fitosanitario. De este modo, se puede obtener una aplicación práctica de aproximación a la realidad del problema, ya que lo importante es diferenciar entre naranjas lavadas con aplicación de cera de las que poseen además tiabendazol, debido a que en el mercado de consumo en fresco la mayoría se encuentran lavadas y con aplicación de cera. Se ensayaron 18 tipos de modelos como resultado de combinaciones de tratamientos de derivada, corrección de radiación dispersa sobre la señal y rango espectral, como puede apreciarse en la figura IV-27. Tratamiento de Derivada1 0,0,1 1,4,4 2,4,4 Tratamiento de Derivada1 0,0,1 1,4,4 2,4,4 X Corrección Radiación Dispersa2 Sin Correc. SNVDT MSC Corrección Radiación Dispersa2 Sin Correc. SNVDT MSC RangoEspectral VIS+NIR (400 – 2498nm) NIR (1100 – 2498nm) RangoEspectral VIS+NIR (400 – 2498nm) NIR (1100 – 2498nm) 1 #,#,# : Orden derivada, segmento derivación (nm), suavizado 2 SNVDT: Standard Normal Variate and De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction X Figura IV-27. Pretratamientos aplicados sobre los espectros para la obtención de modelos discriminantes para la detección de tiabendazol en naranja intacta 4.4.2.4.4 Modelos de predicción El tipo de algoritmo empleado para la obtención de los modelos, junto con los criterios de evaluación se encuentran descritos en el apartado 2.3.2.4.4. Los grupos empleados para este trabajo fueron los que contenían el fungicida, es decir, naranjas lavadas con aplicación de cera y tiabendazol (LCTBZ) y el mismo grupo sin cera (LTBZ). De este modo se plantea la posibilidad de predecir tiabendazol indistintamente para la industria de naranjas empleadas para consumo en fresco (aplicación de ceras), como para la industria destinada a la producción de zumo (sin aplicación de ceras). Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 253 El colectivo experimental empleado se dividió al azar entre grupo de calibración (90% del total) y grupo de validación externa (10% del total). Además de las 20 combinaciones de pretratamientos aplicados sobre la señal espectroscópica descritos en la figura IV-28, se aplicaron dos más sobre espectros brutos (sin derivar y sin aplicar ningún tipo de corrección de radiación dispersa), en ambas regiones ensayadas, dando lugar por lo tanto a un total de 22 modelos predictivos. Tratamiento de Derivada 1,5,5 1,10,5 2,5,5 2,8,6 3,10,10 Tratamiento de Derivada 1,5,5 1,10,5 2,5,5 2,8,6 3,10,10 X Corrección Radiación Dispersa2 SNVDT MSC Corrección Radiación Dispersa2 SNVDT MSC RangoEspectral VIS+NIR (400 – 2498nm) NIR (1100 – 2498nm) RangoEspectral VIS+NIR (400 – 2498nm) NIR (1100 – 2498nm) 1 #,#,# : Orden derivada, segmento derivación (nm), suavizado 2 SNVDT: Standard Normal Variate and De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction X Figura IV-28. Pretratamientos aplicados sobre los espectros para la obtención de modelos predictivos de tiabendazol en naranja intacta 4.4.3 Resultados y Discusión 4.4.3.1 Estudio de repetibilidad espectral Para la determinación de este estadístico se empleó un colectivo constituido por 166 naranjas en el que se recogía gran variabilidad en cuanto al factor variación de tamaño. La distribución en los grupos descritos en el apartado 4.4.2.13 según tamaño fue la siguiente: Grupo S: 36 muestras Grupo M: 41 muestras Grupo L: 35 muestras Grupo XL: 54 muestras Dado que el mayor porcentaje de naranjas pesaban más de 200 g, el grupo XL constituyó el mayor número de naranjas. En primer lugar, se calculó la repetibilidad espectral media de cada región donde se obtuvo información espectral, obteniendo los siguientes valores: RMSmedio (base) = 7294 RMSmedio (ecuador) = 21348 RMSmedio (base + ecuador) = 28000 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 254 A la vista de la diferencia de la repetibilidad en cuanto a la adquisición de espectros de una región u otra, se consideró oportuno obtener un valor límite del estadístico RMS de cada zona, como se expone en la tabla IV-16. Tabla IV-16. Valores límite del estadístico RMS, teórico y aplicado, en las regiones espectrales de la base, ecuador y suma de ambas RMSlímite Región de la Base Región del Ecuador Región Base + Ecuador Teórico 9300 24036 25352 Aplicado 9500 30000 30000 Por lo tanto, para la obtención de un espectro medio de calidad por muestra, cada región fue tratada individualmente según los valores descritos. Las diferencias tan importantes obtenidas entre ambas zonas (base y ecuador) radica en el propio proceso de adquisición espectral, es decir, en la zona del ecuador se producía un giro en la naranja aproximado de 60º entre cada espectro, obteniendo información de zonas totalmente diferenciadas. En cambio, para la obtención de los espectros de la base se producía un giro de 90º entre cada espectro, pero sobre el eje vertical de la naranja (figura IV-25), por lo que es probable que se solaparan zonas de lectura, siendo obvio el aumento de repetibilidad en este caso. De los grupos empleados para estudiar la posibilidad de detección de tiabendazol mediante NIRS, se partía de los siguientes espectros, eliminándose los que superaron el valor límite RMS, quedando finalmente el número de muestras que a continuación se expone:  Lecturas de la región de la base: Grupo B = 56 espectros, 28 muestras Grupo LC = 66 espectros, 33 muestras Grupo LCTBZ = 70 espectros, 35 muestras Al aplicar el valor RMSlímite, se eliminó el 26% de la población espectral (50 espectros). Como esta forma de presentación obtenía 2 espectros por muestra, 25 naranjas fueron eliminadas por no presentar el dato espectral suficiente calidad, 11 pertenecientes al grupo LC, 9 al LCTBZ y 5 al B, quedando finalmente 22, 26 y 23 naranjas de los grupos LC, LCTBZ y B respectivamente.  Lecturas de la región del ecuador: Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 255 Grupo B = 168 espectros, 28 muestras Grupo LC = 198 espectros, 33 muestras Grupo LCTBZ = 210 espectros, 35 muestras En este caso fueron eliminados un total de 17,7%, lo que supone 177 espectros. Sin embargo, ninguna muestra fue eliminada ya que en ninguna los 6 espectros que se tomaban por muestra en esta forma de presentación superaron el valor límite. Por lo tanto, el colectivo muestral se mantuvo.  Lecturas de la región de la base + ecuador: Grupo B = 224 espectros, 28 muestras Grupo LC = 264 espectros, 33 muestras Grupo LCTBZ = 280 espectros, 35 muestras Al igual que con las anteriores lecturas ninguna muestra superó el valor límite en sus 8 espectros, por lo que se mantuvo el número de muestras del colectivo inicial, a pesar de eliminar 205 espectros en el proceso de filtrado espectral, lo que supone el 26,7%. Cuando se estudian los espectros eliminados en el proceso de filtrado espectral sobre las muestras empleadas para la obtención de modelos predictivos de tiabendazol, se obtuvieron los siguientes resultados:  Lecturas de la región de la base: Grupo LTBZ = 110 espectros, 55 muestras Grupo LCTBZ = 114 espectros, 57 muestras Se eliminaron 35 muestras del colectivo inicial (70 espectros, 31,3%), quedando una población de N=77.  Lecturas de la región del ecuador: Grupo LTBZ = 330 espectros, 55 muestras Grupo LCTBZ = 342 espectros, 57 muestras A pesar de eliminar 128 espectros (19%), ninguna muestra se descartó del colectivo inicial por superar sus 6 espectros el valor límite.  Lecturas de la región de la base + ecuador: Grupo LTBZ = 440 espectros, 55 muestras Grupo LCTBZ = 456 espectros, 57 muestras Se descartó el 29% de toda la información inicial (260 espectros), pero de nuevo ninguna muestra Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 256 fue excluida. 4.4.3.2 Análisis de Componentes Principales Cuando se efectuó este tipo de análisis para los grupos de muestras empleados en la obtención de análisis discriminantes, se obtuvieron 6 anómalos (2 grupo LC, 4 grupo LCTBZ) a partir de los espectros obtenidos de la base del fruto, ninguno en los espectros de la región del ecuador y 4 en la suma base + ecuador (4 grupo LC). En recientes trabajos de aplicación de la tecnología NIRS para control de calidad en productos agroalimentarios, se continua empleando esta metodología para detección de anómalos espectrales. Por ejemplo, en tomates intactos detectaron 12 anómalos sobre un colectivo de 312 muestras, previamente al desarrollo de modelos para evaluar su calidad interna [308]. Del mismo modo, se eliminaron 24 muestras del colectivo de calibración constituido por 218 para la determinación de azúcares reductores en el proceso de maduración, vinificación y envejecimiento de vinos blancos y tintos [309]. En cambio, no se obtuvo ningún anómalo espectral sobre el colectivo empleado para la obtención de predicciones. Si en este colectivo, se representa cada grupo (base, ecuador, base + ecuador) en un espacio tridimensional, en función de las tres primeras componentes principales (figura IV-29), se aprecia como no se efectúa una distinción clara entre los dos grupos, los cuales se diferencian en la aplicación de ceras. Grupo LTBZ Grupo LCTBZ Base Ecuador Base + Ecuador Figura IV-29. Representación en el Análisis de Componentes Principales (CP1, CP2, CP3) del colectivo experimental empleado para la obtención de modelos predictivos de tiabendazol sobre naranja intacta Por lo tanto, el diseño de modelos predictivos de tiabendazol con ambos grupos (naranjas analizadas indistintamente con la aplicación de ceras: LTBZ vs. LCTBZ) en principio parece que no Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 257 se verán afectados en su capacidad predictiva, ya que no se aprecia una distinción clara entre ambos grupos, por lo que no sería necesario calibrar de forma independiente. Por lo que la distribución de las muestras en función de las tres primeras Componentes Principales posiblemente se deba a características inherentes a las mismas, como puede ser el estado de maduración, humedad retenida en la epidermis, o incluso a las diferencias en cuanto al contenido en tiabendazol. Por ejemplo, determinando la calidad de albaricoques, mediante Análisis de Componentes Principales, observaron que la primera componente (CP1) discriminaba las frutas según estados de maduración, representando las variaciones en el color de la piel la segunda (CP2) [250]. Del mismo modo, en otro trabajo se ha empleado la representación de los Scores de las dos primeras componentes principales para diferenciar entre 4 variedades de bayas chinas analizadas de forma intacta mediante NIRS [310]. 4.4.3.3 Análisis discriminante. Detección de Tiabendazol El colectivo final empleado para la elaboración de estos modelos estuvo constituido por las muestras que se exponen en la tabla IV-17. Tabla IV-17. Muestras seleccionadas para el desarrollo de modelos discriminantes que permitan la detección sobre naranja intacta de tiabendazol Grupo (Tratamiento Naranjas) Grupo (Región Espectral) B LC LCTBZ Base 23 20 22 Ecuador 28 33 35 Base + Ecuador 28 29 35 Los modelos seleccionados en cada región de toma de lecturas, a partir de las combinaciones de pretratamientos sobre la señal descritas en el apartado 4.4.2.4.3, se muestran en la tablas IV-18 (caracterización de los modelos) y IV-19 (evaluación). En todos se llevaron a cabo 6 pases o grupos de validación cruzada, seleccionando 12 como número máximo de términos PLS. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 258 Tabla IV-18. Caracterización de los modelos discriminantes seleccionados para detectar tiabendazol sobre naranja intacta Grupo (Región Espectral) Derivada Corr. Rad. Dispersa Región Espectral PLS Base 0, 0,1 No VIS + NIR 6 Ecuador 2,4,4 SNVDT VIS + NIR 6 Base + Ecuador 2,4,4 SNVDT VIS + NIR 12 Tabla IV-19. Evaluación de los modelos discriminantes seleccionados para detectar tiabendazol sobre naranja intacta Grupo (Región Espectral) ETVC Muestras Mal Clasificadas Error de Clasif. (%) Base 0,36 11 16,9 Ecuador 0,32 7 7,3 Base + Ecuador 0,33 13 14,1 Todos los modelos seleccionados han empleado la región espectral completa (VIS+NIR). En cuanto a los pretratamientos aplicados, los espectros obtenidos a partir de la región de la base mostraron un comportamiento distinto, ya que para el modelo destacado de este grupo, no precisó de ningún tratamiento matemático. Por el contrario, los otros dos grupos coincidieron con el tratamiento seleccionado de segunda derivada y corrección de radiación dispersa SNV-DT, si bien aportaron los mismos resultados con la combinación de segunda derivada y corrección de radiación dispersa MSC. Como se puede observar (tabla IV-19), el modelo que presentó el mejor comportamiento fue el calculado a partir de los espectros obtenidos de la región del ecuador, obteniendo el menor error típico (ETVC=0,32) y el menor error de clasificación (7,3%). Para observar con mayor nivel de detalle este modelo, se adjunta la matriz de clasificación, donde se muestra la distribución del colectivo experimental en los diferentes grupos (tabla IV-20). El grupo blanco queda perfectamente diferenciado del resto, clasificándose de forma errónea tres muestras del grupo LC como si presentaran trazas de tiabendazol (grupo LCTBZ). Esta particularidad se puede presentar a causa del efecto que producía la cera en el fruto. De hecho, las naranjas que quedaron almacenadas en refrigeración sin analizar, se observó como la cera se iba agrietando distinguiéndose perfectamente la capa que ésta producía. Por lo tanto, quizá el Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 259 tratamiento de cera se aplicó en cantidad excesiva y fue el motivo de confusión de algunas muestras en la clasificación. Tabla IV-20. Matriz de Clasificación del modelo discriminante seleccionado para detectar tiabendazol sobre naranja intacta B LC LCTBZ B 28 0 0 LC 0 30 4 LCTBZ 0 3 31 Total 28 33 35 Por otro lado, 4 muestras del grupo LCTBZ se clasificaron en el grupo LC como si no presentaran restos de producto fitosanitario. Posiblemente dichas muestra no alcanzaban una concentración de tiabendazol mínima de detección por la tecnología, y de este modo, las incluía en el grupo más parecido. La figura IV-30 representa gráficamente el posicionamiento que adquirían las muestras de este modelo en el espacio. Grupo L Grupo LC Grupo LCTBZ Figura IV-30. Representación gráfica del modelo discriminante seleccionado para detección de tiabendazol en naranja intacta Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 260 Los resultados mostrados en la figura respaldan los comentarios efectuados con respecto a la matriz de clasificación, ya que se observa como cada grupo ocupa una región en el espacio perfectamente definida, si bien el grupo B está más distanciado de LC y LCTBZ, presentando una pequeña confusión entre estos grupos, que fue el motivo del error de clasificación obtenido. Como ya se ha comentado, no se encuentran trabajos en bibliografía de aplicación mediante tecnología NIRS, en la detección de productos fitosanitarios sobre fruta intacta. En cambio se pueden consultar algunos resultados, donde se aplica análisis discriminante sobre producto intacto. De este modo, se ha aceptado la tecnología para clasificar tomates según la producción de etileno [311]; manzanas, diferenciando tres periodos de almacenamiento, en donde obtuvieron un error de clasificación similar al obtenido en el presente documento, con los espectros obtenidos a partir de la base + ecuador, es decir, 13,9% [312]; clasificando variedades de fruta se han obtenido resultados con porcentajes de muestras correctamente clasificadas cercanos al 100%, como por ejemplo en peras [313], kiwis [314], entre otros. 4.4.3.4 Modelos de predicción de Tiabendazol El colectivo de calibración empleado para el desarrollo de estos modelos estuvo constituido por 102 muestras para los grupos de espectros obtenidos de la región del ecuador y la suma de la región de la base y ecuador, seleccionando al azar 10 muestras para validación externa. Con los espectros obtenidos a partir de la región de la base estos colectivos fueron de 70 y 7 muestras respectivamente según se tratase del grupo de calibración y validación externa. El colectivo experimental abarcaba un rango en cuanto a la concentración de tiabendazol comprendido entre 0,2-3,9 ppm. La distribución que presentaron las muestras en dicho rango se representa en la figura IV-31. A pesar de la diferencia en cuanto a individuos que constituyen el número de poblaciones, comparando los espectros obtenidos a partir de la región de la base con el resto, la distribución es muy parecida en ambos casos, concentrándose el mayor número de muestras entre los valores 0,3-0,7. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 261 0 5 10 15 20 25 30 35 0,3 0,7 1,1 1,5 1,9 2,3 2,7 3,1 3,5 3,9 Tiabendazol (ppm) Fr ec ue nc ia Región Ecuador Región Base + Ecuador 0 5 10 15 20 25 30 35 0,3 0,7 1,1 1,5 1,9 2,3 2,7 3,1 3,5 3,9 Tiabendazol (ppm) Fr ec ue nci a Región Base Figura IV-31. Distribución de tiabendazol del colectivo experimental empleado el desarrollo de modelos predictivos a partir de espectros obtenidos de la región de la base, ecuador o suma de ambos en naranja intacta Aplicando las combinaciones de pretratamientos descritas en el apartado 4.4.2.4.4, se seleccionaron los modelos que se exponen en la tabla IV-21. Tabla IV-21. Modelos seleccionados para la predicción de tiabendazol sobre naranja intacta Calibración Validación Grupo (Región Espectral) N PLS ETC R2 ETVC r2 ETP R2VE Base 67 3 0,52 0,56 0,59 0,45 0,33 0,1 Ecuador 94 6 0,3 0,83 0,37 0,74 0,33 0,85 Base + Ecuador 92 6 0,32 0,79 0,39 0,7 0,36 0,73 El modelo que obtuvo los mejores resultados fue el desarrollado a partir de los espectros de la región del ecuador, si bien estos junto con la suma de los espectros de la base aportaron resultados similares. Ambas predicciones se obtuvieron aplicando previamente tercera derivada sobre los espectros (3,10,10) y correcciones de radiación dispersa SNV y MSC, respectivamente. Del mismo modo el modelo obtenido a partir de los espectros del ecuador empleó toda la región espectral (VIS + NIR), desestimando la región del visible el seleccionado a partir de los espectros de la base y ecuador. Como se ha comentado en anteriores apartados, un modelo posee buena precisión cuando su coeficiente de determinación se encuentra entre R2=0,7-0,89 [138]. Por lo tanto, las ecuaciones seleccionadas a partir de los espectros del ecuador y suma del ecuador con el extremo distal cumplen dicho requisito. En cambio, los autores que proponen esta evaluación, clasificarían al modelo seleccionado a partir de los espectros obtenidos de la base con aptitud para diferenciar Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 262 entre valores bajos, medios y altos. Mediante la observación de la tabla IV-21, la evaluación de la validación externa mediante el error típico de predicción del modelo obtenido a partir de los espectros de la base, es prácticamente igual que los otros modelos, sin embargo, las muestras empleadas para esta validación representan tan solo el 10% de su variabilidad (R2VE=0,1), por lo que no lo haría viable para una posible ampliación del estudio para aplicaciones futuras en proceso. Aunque previamente, sería importante desarrollar modelos ampliando tanto los colectivos de calibración como de validación externa, para que de este modo se evaluaran predicciones que realmente cubran el rango a estudiar, ya que en este caso, este factor puede ser una carencia importante (figura IV-31). La validación externa en los otros dos grupos de estudio (espectros del ecuador y espectros de la base + ecuador) fue bastante satisfactoria, ya que las predicciones que realizaron sobre el colectivo de muestras empleado para evaluar externamente los modelos produjeron residuales que hacen pensar que es viable el diseño de modelos que permitan actuar como sistemas de alerta en tiempo real para detectar naranjas que superen el límite máximo de residuos (LMR=5 ppm) de tiabendazol. Así, a modo de ejemplo, la tabla IV-22 compara los valores de referencia con los predichos en el colectivo de validación comentado, con el modelo desarrollado a partir de los espectros obtenidos en la región del ecuador. Tabla IV-22. Predicciones individuales de tiabendazol en naranja intacta del colectivo de validación externa a partir del modelo seleccionado (espectros obtenidos en la región del ecuador) Muestra Valor Referencia Valor Predicho Residual 1 1,84 1,7 0,14 2 0,48 0,84 -0,36 3 0,29 0,52 -0,23 4 0,76 0,65 0,11 5 1,83 2,12 -0,29 6 1,96 1,58 0,38 7 0,48 0,94 -0,46 8 0,63 0,97 -0,33 9 0,42 0,85 -0,43 10 0,3 0,69 -0,38 Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 263 Empleando la tecnología NIRS para determinar el fungicida imazalil en cítricos, mediante control on-line [295], se obtuvieron buenas correlaciones (ETC=0,6 y ETP=3,7). Como se aprecia, estos errores fueron superiores a los presentados en la presente Tesis Doctoral, si bien su rango predictivo fue muy superior (0,5 – 250 ppm). Sin embargo, es importante comentar que el trabajo citado se desarrolló para monitorizar la concentración de producto en tuberías de lavado, por lo que no se analizaba fruta, sino solución. Otros autores [296] determinaron fungicidas en superficies de tomates mediante NIRS, pero tampoco fue sobre fruta intacta, sino empleando la técnica de análisis sobre extracto seco (DESIR) citada en apartados anteriores. En este caso el rango predictivo se encontraba entre 0 – 107 ppm, obteniendo un error de predicción de ETP=7,89 ppm. Si se compara con el rango empleado en este trabajo (0,2-3,9 ppm), la capacidad predictiva obtenida por estos autores fue ligeramente superior, no obstante se debe tener presente que en la presente Tesis el rango se enmarca en concentraciones muy bajas, con la dificultad añadida de análisis directo sobre fruta intacta. Debido al carácter anisótropo que presentan las frutas, en otros trabajos de aplicación de la tecnología NIRS también se han estudiado alternativas o posibilidades en cuanto a las zonas o regiones de lectura espectral. Concretamente, existe un estudio específico sobre este tema en determinaciones de firmeza en melocotones [253], en donde se almacenaban 9 lecturas por fruto, divididas en grupos de 3 longitudinales y 3 latitudinales. Los autores concluyeron que la obtención de la información espectral en diferentes longitudes y latitudes de la fruta mejoraba los modelos, junto con pretratamientos de corrección de radiación dispersa y derivada. En el presente estudio, sin embargo, los mejores resultados se obtuvieron, tanto en modelos cualitativos como cuantitativos, con los espectros almacenados únicamente de la región del ecuador de la naranja. Esta diferencia puede encontrarse en los diferentes objetivos de ambos trabajos, ya que, en el trabajo que se describe sobre melocotones, se determinó la firmeza del fruto, mientras que en la presente Tesis fue la concentración de tiabendazol, que se podía presentar de forma más homogénea en la zona del ecuador. En cambio, existen otros trabajos en los que también afirman que los mejores resultados se obtienen a partir de espectros obtenidos de la región del ecuador del fruto. De este modo, determinando la calidad interna de peras mediante predicciones RMCP del contenido en sólidos Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 264 solubles y firmeza [277], desarrollaron modelos a partir de espectros obtenidos en las regiones de los extremos del fruto y del ecuador, afirmando que el modelo seleccionado en ésta última posición aportó resultados ligeramente superiores. Finalmente, otros estudios directamente obtienen la información espectral a partir de la región del ecuador, en tres posiciones equidistantes, sobre bayas chinas para discriminar entre variedades [310], o sobre tomates para predecir parámetros de calidad (contenido en sólidos solubles, pH y firmeza) [315]. Control de Calidad sobre Zumo de Naranja y Naranja Intacta 265 BIBLIOGRAFIA [212] P.N. Kale, P.G. Adsule, Handbook of Fruit Science and Technology, D.K. Salunkhe and S.S. Kadam (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 1995, p. 39. [213] D.A. Kimball, Citrus Processing, Aspen Publishers, Inc., Gaithersburg, Maryland, 1999, p. 7. [214] L.R. Kington, T.M. 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La aplicación de modelos para diferenciar embutidos procedentes de carne de cerdo blanco, cerdo ibérico y tres niveles de mezclas de los mismos, fue más precisa cuando se emplearon algoritmos cuantitativos de predicción de mezclas frente a análisis discriminante, ya que permitieron una diferenciación absoluta del producto prácticamente en todas las formas de presentación empleadas. 4. Las predicciones obtenidas para caracterización de embutidos (salchichón) mediante determinaciones de constituyentes mayoritarios (grasa, humedad y proteína), exigidos en la normativa española para su clasificación en categorías de calidad, obtuvieron elevadas cotas de exactitud y precisión, tanto para masa fresca (picada y homogeneizada) como para producto curado (loncheado y homogeneizado). CONTROL DE CALIDAD SOBRE ALGODÓN BRUTO 5. Los resultados obtenidos justifican el uso de la Tecnología NIRS en la industria algodonera para determinaciones de humedad (parámetro básico en su control de calidad), alcanzando valores de exactitud y precisión más elevados que los conseguidos en la actualidad mediante los instrumentos exigidos en el protocolo para la determinación de los criterios de aceptación para la puesta bajo control de partidas de algodón sin desmotar (medidores portátiles de humedad). 6. Asimismo, fue posible la diferenciación de muestras de algodón bruto con diferentes niveles de impurezas, aunque se deben alcanzar mayores niveles de precisión en los modelos para hacer viable el establecimiento de un sistema de alerta. Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 274 CONTROL DE CALIDAD SOBRE ZUMO DE NARANJA 7. Se han obtenido excelentes resultados predictivos con los parámetros acidez y contenido en sólidos solubles en los tres tipos de zumos empleados (comerciales recién exprimidos, comerciales a base de concentrado y procedentes de industria). En cambio, no alcanzaron el nivel suficiente para controlar la calidad del zumo los modelos que predicen los parámetros pH y limonina. 8. No se ha detectado una pérdida de calidad en los modelos cuando se emplea para su elaboración todos los grupos de zumos estudiados (comerciales recién exprimidos, comerciales a base de concentrado y procedentes de industria), con respecto a su determinación de forma individual. Por lo tanto, se recomienda la inclusión de variabilidad de tipo de zumos en los modelos con el objetivo de obtener mayor aplicabilidad. Del mismo modo, no se apreció una mejora en la capacidad predictiva cuando se aplicó un proceso de homogeneización (filtrado), con respecto a producto intacto. 9. Es necesario prestar especial atención al método de referencia empleado para la determinación del parámetro limonina (procedimientos espectroscópicos y reactivo de Burnham), debido a la baja repetibilidad observada. Se plantea como alternativa la puesta a punto para su determinación mediante Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC). CONTROL DE CALIDAD SOBRE NARANJA INTACTA 10. La Tecnología NIRS ha permitido la detección del fungicida postcosecha tiabendazol sobre naranja intacta. Asimismo, parece viable el diseño de modelos que permitan el establecimiento de sistemas de alerta en la detección de naranjas que superen el Límite Máximo de Residuos (LMR) de tiabendazol, ya que se obtuvieron predicciones satisfactorias sobre naranjas fortificadas con niveles de tiabendazol inferiores al LMR. CAPÍTULO VI ANEXOS ANEXO I V. Ortiz-Somovilla, F. España-España, E.J. De Pedro-Sanz, A.J. Gaitán-Jurado. “Meat mixture detection in Iberian pork sausages” Meat Science, 2005, 71(3), 490-497 Meat mixture detection in Iberian pork sausages V. Ortiz-Somovilla a,*, F. Espan˜a-Espan˜a a, E.J. De Pedro-Sanz b, A.J. Gaita´n-Jurado a a IFAPA, CIFA Alameda del Obispo, Avda. Mene´ndez Pidal, s/n, PO Box 3092, 14080 Co´rdoba, Spain b Departmento de Produccio´n Animal, E.T.S.I.A.M., Universidad de Co´rdoba, Avda. Mene´ndez Pidal s/n, 14004 Co´rdoba, Spain Received 17 March 2004; received in revised form 4 April 2005; accepted 18 April 2005 Abstract Five homogenized meat mixture treatments of Iberian (I) and/or Standard (S) pork were set up. Each treatment was analyzed by NIRS as a fresh product (N = 75) and as dry-cured sausage (N = 75). Spectra acquisition was carried out using DA 7000 equipment (Perten Instruments), obtaining a total of 750 spectra. Several absorption peaks and bands were selected as the most representative for homogenized dry-cured and fresh sausages. Discriminant analysis and mixture prediction equations were carried out based on the spectral data gathered. The best results using discriminant models were for fresh products, with 98.3% (calibration) and 60% (validation) correct classification. For dry-cured sausages 91.7% (calibration) and 80% (validation) of the samples were correctly classified. Models developed using mixture prediction equations showed SECV = 4.7, r2 = 0.98 (calibration) and 73.3% of validation set were correctly classified for the fresh product. These values for dry-cured sausages were SECV = 5.9, r2 = 0.99 (calibration) and 93.3% correctly classified for validation. C211 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: NIRS; Qualitative analyses; Iberian pork; Meat mixture; Sausages 1. Introduction In Spain, sausage made from Iberian pork is consid- ered a very high quality food product, mostly due to the intrinsic characteristics of the raw material used. Final quality standards will depend on: the suitability of the sausage formula; the technological conditions of the manufacturing process; the chemical/physical modifica- tions of the mixtures; and the characteristics and quality of the raw material utilised. This raw material comes di- rectly from Iberian pigs as well as from F1 hybrids from crosses between specimens of this breed with Duroc pigs. These animals are slaughtered at a late age, with high weights and after having exercised their muscula- ture for some time on the rangeland where they are raised. Some months before slaughtering, these pigs feed either freely on the fallen acorns and natural grass of the oak forests of the West and South West of Spain (‘‘montanera’’ pigs) or on a combination of acorns and commercial feed formulas (‘‘recebo’’ pigs) or solely on the latter (Cava et al., 1997). Before slaughter the animals are tracked via a recording and identification system. After slaughter, the traceability of the manufac- tured products is of great importance, and is based mainly on chemical, physical, microbiological and tech- nological characterisation. Recently, a need has arisen for a technique that is able to carry out quick determinations to trace the end product by identifying the presence and amount of dif- ferent lower-priced meats in allegedly Iberian pork dry-cured sausages. This could eventually become an authentication technique, which could be very helpful for the economic development of the pork industry, based mainly on the promotion of 100% Iberian pork 0309-1740/$ - see front matter C211 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.meatsci.2005.04.028 * Corresponding author. Tel.: +34 957 016 001; fax: +34 957 016 043. E-mail address: victor.ortiz@juntadeandalucia.es (V. Ortiz-Somo- villa). www.elsevier.com/locate/meatsci MEAT SCIENCE Meat Science 71 (2005) 490–497 products. At the same time, this technique will enable sausage producers to display different sets of certified products, containing different quantities of both Iberian and Standard pork meat, which could be aimed at con- sumers with different standards of living. Manufacturers who submit their products to an authentication tech- nique will undoubtedly have a clear advantage over those who do not wish to undergo this procedure. In recent years, a series of methods have been devel- oped in order to determine the composition of meat mix- tures: electrophoresis, immunochemical systems, nuclear magnetic resonance, gas and liquid chromatography, mass spectrometry, DNA fingerprinting and near infra- red reflectance spectroscopy (NIRS). During the 90 s, this technique was utilised to measure different parame- ters on manufactured meat products (Thyholt, Indahl, Hildrum, & Ellekjaer, 1997). Perten developed a system (Perten DA 7000), which allows NIRS/NIT determinations on a wide array of products: from liquid samples to non-ground raw materials, using a non-contact technique and without the need for specific sample preparation. Samples are merely presented on a Petri dish or in a plastic bag. This hardware has been successfully used to discrimi- nate different chicken meats of standard and slow growth chickens (Fumie`re, Sinnaeve, & Dardenne, 2000) and different types of fresh forages (Dardenne & Fe´me´nias, 1999). The main goal of this study was to develop and vali- datemultivariatemodelsbasedonNIRStechnologyable to differentiate Iberian pork meat from standard pork meat and to detect any mixture levels of them in homo- geneous fresh sausage meat used to manufacture dry- curedsausages,and inhomogeneousdry-curedsausages. 2. Material and methods 2.1. Meat The meat used in this study consisted of lean Stan- dard pork (S) meat and Iberian pork (I). Standard pork meat was obtained from known herds of Landrace pigs, slaughtered at a similar age and weight (approximately 6 months and 95 kg). The Iberian pork meat was obtained from a set of individuals registered in the Iberian breed genealogical catalogue and which came from the same farm. When these animals were slaughtered, they were older and heavier than the standard pigs used (approxi- mately 13 months and 145 kg). 2.2. Additives The additives used in this study (salt, pepper, red pepper, dextrose, nitrite, wine and ascorbic acid) were those routinely employed in the Spanish dry-cured sausage industry. These additives improve the matura- tion process and are characterised by having very spe- cific organoleptic effects (smell, taste, etc.). They were added to the meat mixture in accordance with the Martin Bejarano formula (Martı´n, 1992). 2.3. Experimental design Five treatment groups were set up, consisting of different percentages of Iberian pork meat and/or Standard pork meat. Samples with only Iberian and Standard pork meat were labelled treatments A and E, respectively. The mixed treatments were B, C and D, with 75%, 50% and 25% of Iberian pork meat and 25%, 50% and 75% of Standard pork meat, respectively. 2.4. Processing the meat mixtures Meat of both origins was thawed at room tempera- ture. Ground meat was then mixed according with the treatment designs. Later, meat mixture was kneaded manually for 15 min and then mechanically for 20 min. At this time, additives were added, and then the meat mixture was left to rest for 24 h. All the equipment was carefully cleaned and dried after the handling of each treatment. The whole meat mixture of each treat- ment was split into two parts: one (300 g) to be analyzed as a fresh product and the second which was stuffed into artificial tubes to produce traditional sausages (300– 350 g). All of them were left to age for 21 days, then ana- lyzed by NIRS. This process was repeated five different times (periods) over a 6-month cycle. 2.5. Analyses All NIRS measurements were performed on all treatments of the fresh product as well as on the dry-cured sausages, for the complete five periods of production. 2.5.1. NIRS measurements 2.5.1.1. NIRS instrument. Spectra acquisition was car- ried out with a DA 7000 (Perten Instruments, Huddinge, Sweden), which produces simultaneous measurements from 400 to 1700 nm (NIR/VIS). The design of this equipment produces spectra from two different spec- trometer sample positions (upper and lower view). The lower one was used in this study by placing samples in a circular capsule of 127 mm diameter. This allows spec- tra measurements to be taken at different points of the sample as the capsule rotates for a 6-s analysis, during which, 1800 separate observations with different orienta- tions are made. Capsule spinning provides a means of improving sample homogenisation and reducing the ef- fect of sample surface variability. V. Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 491 2.5.1.2. Spectra development procedure. (a) Homogenized fresh meat samples (HF): samples of ground fresh meat were homogenized with a commercial blender (MoulinexC210) equipped with horizontal blades. (b) Homogenised dry-cured meat samples (HC): sau- sages belonging to each treatment were cut into thin slices about 3–4 mm thick, they were placed in two layers inside transparent plastic bags, which were vacuum sealed and frozen until the spectra were obtained. Then samples were thawed and homogenized in a blender as above. 2.6. Sampling arrangement and spectra number Three samples from each treatment were taken, thus resulting in a total of 15 samples of fresh and dry-cured products. Since the experiment was repeated five times in different periods, a total of 75 samples of each prod- uct were scanned. Since five spectra were taken per sam- ple a total amount of 375 spectra of each product were taken, totalling 750 spectra for the whole experiment. Out of the five periods for the fresh and dry-cured prod- ucts, the first four were taken to develop the prediction models, thus resulting in a calibration set of 60 samples. The fifth period (15 fresh/15 dry-cured samples), was used as a collective external validation. 2.7. Statistical analysis All statistical analyses were carried out using the WinISI III v1.50e program (Infrasoft International, Port Matilda, PA, USA). Before obtaining discriminant models, the amount of information was reduced via a Principal Components Analysis (PCA), then the Mahalanobis distance (H) be- tween each sample and the population centre was calcu- lated. Those samples with H values higher than 3 were defined as anomalous (Shenk, Workman, & Westerhaus, 1991) and therefore were not used to estimate the classi- fication models. 2.7.1. Discriminant analysis Spectra files were arranged so as to make up as many spectra files as groups to discriminate. In this study, three for each sample presentation: spectra from 100% Iberian pork samples (a), spectra from samples with dif- ferent percentages of Standard and Iberian pork mix- tures (b = 75I/25S; c = 50I/50S; d = 25I/75S) and spectra from 100% Standard pork samples (e). The ‘‘Discriminant equations’’ option of the software develops modified partial least squares equations (MPLS). With this algorithm, a calibration matrix (tem- porary file) is created with all the samples making up the model, assigning to each spectrum a value called a ‘‘dummy’’ variable (or discriminant variable). Thus, new variables were obtained through the development of the calibration equation where each sample takes a new value between 1 and 2. A sample showing a value close to 1 will not belong to a particular group. If the va- lue is close to 2, the sample is included in that group. In order to determine the correct number of PLS fac- tors in each equation, as well as to avoid overfitting, cross validation was carried out for each developed model. The software picked out the equation presenting the lowest cross validation error. Different pre-treat- ments of spectra were applied before developing the models. The standard normal variate and detrend (SNVD) or the multiplicative scatter correction (MSC) methods were applied to correct the scatter radiation ef- fect on the spectra, then 1st or 2nd derivatives were ta- ken along with a smoothing process in order to increase spectral resolution. The gaps of derivation and smoothing were changed to obtain different combi- nations of treatments. These factors follow the nomen- clature: (#derivative, #range of data points, #of points used for smoothing). Therefore, (1,1,1) means a 1st derivative taken in range of 1 point and carried out in a one-point smoothing operation. The combina- tion of pre-treatments applied to the models is detailed in Fig. 1. The criteria to select between the different discrimi- nant models were based on the lowest standard error of cross validation (SECV) and the highest percentage of correctly classified samples. 2.7.2. Mixtures prediction equations In order to obtain equations for predicting different mixtures in both fresh and dry-cured sausage meat, a modified partial least squares (MPLS) analysis was car- ried out. The best number of regression factors was Derivatization: 0,1,11 ,1,1 2,1,1 1,3,3 2,3,3 1,5,3 2,5,3 Scatter correction MSCST Scatter correction SNVDT Spectra from: - Discriminant Analysis - Prediction Equations Spectra from: - Dry-Cureds amples - Fresh samples Fig. 1. Derivative and Scatter correction treatments in the models. 492 V. Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 obtained after cross validation of the model. As a result of the cross validation process, the standard error of cross validation was obtained. This value was useful to evaluate the precision and accuracy of the equations. Mathematical and smoothing treatments similar to the ones used in the discriminant analysis were applied. The precision and accuracy of these quantitative models rely very much on the exactness of the reference method; in our case, this is represented by the precision in putting together the different fractions of meats in the mixtures. Obviously, this cannot present the same accuracy as an analytical method for analysing a chemical constituent, but in spite of this limitation, these equations could be very useful. For instance, a sample of treatment a (100I) is predicted with a value of 110%, which is clearly not close to 100%; however, it can be stated that such a sample belongs to that treatment. For external validation, the criteria followed to ascer- tain the treatment group to which the sample belongs, was if the value of a sample was higher than the average of the contiguous group reference values. Thus, one sample would belong to treatment a, if its predicted va- lue is higher than 87.5%. This value for treatment b should be between 87.5% and 62.5%, and for treatments c C0 d in the ranges of 62.5%–37.5%/37.5%–12.5%, respectively. Finally, a sample will belong to treatment e if the value predicted is lower than 12.5%. 3. Results and discussion 3.1. Spectral characterization Spectra measurement data were taken as log (1/R) (R = reflectance). Fig. 2 shows a comparison between average spectra of fresh and dry-cured samples. In spite of the fact that samples from both products were fully homogenized, those from fresh mixtures showed a higher degree of uniformity; this is probably due to the fact that during the ageing process of sau- sages, a splitting of fat and muscle takes place, increas- ing the heterogeneity of the sausage meat. This allows a deeper penetration of radiation, which is noticeable as an increase in the absorbance values of the cured samples. Although both spectra follow similar patterns, some differences are fairly marked, mainly for the absorption bands indicated (Fig. 2). These differences could very likely be due to the physical and chemical modifications that occur during the curing process. Three absorption bands are common to both types of samples: – At about 975 nm related to the second overtone of the O–H bond, therefore related to water. – Near to 1210 nm, a band of fat absorption can be found, related to the second overtone of the C–H bond. – At 1455 nm, also related to water in response to the first overtone of the O–H bond. Fumie`re et al. (2000), in their analysis of chicken meat samples using a similar spectrometer (Perten DA- 7000), indicated the same absorption bands. In addition to these bands, small variations in the vis- ible region, between 515 and 700 nm, were noticeable. These absorption bands are mainly related to myoglo- bin, the protein responsible for muscle colour, and depending on the oxidation level of the protein, different pigments are produced: myoglobin, oxymyoglobin, met- myoglobin and deoxymyoglobin. (Kinsman, Kotula, & Breidemstein, 1994; Cozzolino & Murray, 2002; Mit- sumoto, Maeda, Mitsuhashi, & Ozawa, 1991). During the process of sausage ageing, a reddening of the masses is produced mostly due to the redox reactions of the myoglobin (Liu & Chen, 2001). Likewise, a small absorption band is observed at 930 nm in the dry-cured samples, which is not detected, in the fresh ones. This wavelength is related to lipid compounds, so the differ- ence might be due to oxidation reactions of lipids during the ageing process. With the intention of simplifying the spectral infor- mation of those wavelengths that could be useful for model development, a mathematical treatment (2nd derivative) and a correction of the scatter radiation (SNVDT) was applied to the spectral data. The resulting average spectra are shown in Fig. 3. With this treatment, a reduction in the vertical deviation over the baseline is obtained, smoothing the effect of the scattered radiation, produced by factors such as different particle size, water content, different sample packing density, etc., as well as decreasing the absorbance peak overlapping. Thus, nearly all the effects due to homogeneity differences were abolished. These treatmentshavebeen appliedindifferent studies on meat products (Alomar, Gallo, Castan˜eda, & Fuchslocher, 2002; Cozzolino & Murray, 2002; 0,15 0,35 0,55 0,75 0,95 1,15 1,35 515 640 765 890 1015 1140 1265 1390 1515 1640 Wavelength (nm) Log (1/R) HF HC 550 975 1210 1455 930 Fig. 2. Mean spectra of both fresh (HF) and cured (HC) samples. V. Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 493 Cozzolino, Martins, & Murray, 2002; Murray, Aucott, & Pike, 2001). 3.2. Principal component analysis (PCA) In order to carry out a PCA analysis, a first derivative and a treatment for correcting the scatter radiation (SNVDT) were applied to all spectra. Since no anoma- lous values were detected, the original number of samples in the calibration group for both fresh and dry-cured products was maintained (60). Fig. 4 shows the loading values taken by the first three PC variables for each wavelength. The spectral region in the visible section (515–800 nm) is clearly significant, since it is in this re- gion that the highest loading values were obtained, espe- cially with the 1st and 2nd PC. Thyholt, Enersen, and Isaksson (1998) highlighted this fact when studying beef samples and pointed out that colours (visible region) provided the most useful information in their prediction models. The third PC also provided interesting spectral information, gaining the highest values in the NIR (1100–1650 nm) region and also with important values in the VIS–NIR transition region (800–1100 nm). The most relevant loading peaks were in the: – Visible region (515–800 nm): 530, 560, 600 and 685 nm; this was true for both types of presentation. Fresh samples produce noticeable peaks at 650 and 660 nm, whereas dry-cured samples do so at 710– 730 nm. – Transition region VIS–NIR (800–1100 nm). With bands of 945–965 nm and 1010–1040, common for both types of products. – NIR region (1100–1560 nm): the 1140–1150 band particularly stands out for both types of presentation. Two peaks were particularly characteristic of dry- cured samples: 1195 and 1230 nm, whereas the two typical bands of fresh samples were between 1390 and 1415 nm and around 1505 nm. 3.3. Discriminant analysis All discriminant equations were developed based on a maximum number of PLS factors (12). When the soft- ware recommended all terms, and in order to avoid over- fitting, equations were redesigned, increasing by only 2 PLS terms. If the software again suggested all terms in the equation, only two additional ones were added, and so on successively. The thirteen models were developed after 5 cross validations. Tables 1 and 2 show the results obtained for the calibration group and for the collective validation for both types of products, respectively. 3.3.1. Calibration Clearly, in the calibration group of fresh samples, the percentage of samples correctly classified was nearly 100% (98.3), whereas for dry-cured samples this percent- age decreased to 91.7%. In both cases, these values were obtained when pre-treating spectra by taking the 2nd derivative and correcting the scatter radiation using the MSCST. Classification errors arise from the sorting of samples into groups around the target ones. HF -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 530 645 760 875 990 1140 1255 1370 1485 1600 Wavelength (nm) 530 645 760 875 990 1140 1255 1370 1485 1600 Wavelength (nm) Loading HC -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 Loading Fig. 4. Loadings values for the first (–), second (—) and third (---) principal component of spectra of both type of products. –0,4 –0,3 –0,2 –0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 515 640 765 890 1015 1140 1265 1390 1515 1640 Wavelength (nm) 2nd Derivative HF HC Fig. 3. Second derivative of mean spectra of both fresh (HF) and cured (HC) samples. 494 V. Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 3.3.2. Validation Tables 1 and 2 show the classification results when the models are externally validated. 3.3.2.1. Fresh samples. This product presented the same classification error (40%) regardless of the equation used. Errors occurred in the misclassification of six sam- ples, three from treatment a (100I) and 3 from treatment e (100S) which were graded b, c or d. This lack of sensi- tivity in the models could very well be due to the differ- ent number of samples in each discriminating group (a = 15; mixtures (b, c, d) = 45 and e = 15) or also to the strong similarity between the validation samples and those from the mixture treatments in the calibration set. Nonetheless, it is noteworthy that the discriminatory variable values obtained by the validation samples were always different, accordingly with their treatment group. This fact suggests the possibility of establishing limits Table 1 Classification of calibration (cross validated) and external validation sets of fresh samples Mathemat. treatm. PLS factors Calibration set (n = 60) Validation set (n = 15) Derivative Scatter Correctly classified SECV Correctly classified n % n % 0,0,1 None 8 52 86.7 0.29 9 60 1,1,1 SNVDT 11 57 95 0.26 9 60 1,1,1 MSCST 11 57 95 0.26 9 60 1,3,3 SNVDT 9 57 95 0.27 9 60 1,3,3 MSCST 8 56 93.3 0.27 9 60 1,5,3 SNVDT 7 57 95 0.28 9 60 1,5,3 MSCST 8 56 93.3 0.23 9 60 2,1,1 SNVDT 11 59 98.3 0.24 9 60 2,1,1 MSCST 11 59 98.3 0.24 9 60 2,3,3 SNVDT 12 58 96.7 0.24 9 60 2,3,3 MSCST 12 58 96.7 0.24 9 60 2,5,3 SNVDT 7 58 96.7 0.29 9 60 2,5,3 MSCST 7 58 96.7 0.28 9 60 Table 2 Classification of calibration (cross validated) and external validation sets of cured samples Mathemat. treatm. PLS factors Calibration set (n = 60) Validation set (n = 15) Derivative Scatter Correctly classified SECV Correctly classified n % n % 0,0,1 None 12 42 70 0.38 11 73.3 1,1,1 SNVDT 10 48 80 0.33 9 60 1,1,1 MSCST 11 50 83.3 0.32 10 66.7 1,3,3 SNVDT 11 45 75 0.37 11 73.3 1,3,3 MSCST 11 46 76.7 0.36 12 80 1,5,3 SNVDT 5 47 78.3 0.37 10 66.7 1,5,3 MSCST 11 45 75 0.38 11 73.3 2,1,1 SNVDT 11 54 90 0.29 11 73.3 2,1,1 MSCST 13 55 91.7 0.29 12 80 2,3,3 SNVDT 13 50 83.3 0.32 9 60 2,3,3 MSCST 13 51 85 0.32 9 60 2,5,3 SNVDT 3 47 78.3 0.36 12 80 2,5,3 MSCST 13 47 78.3 0.34 9 60 Fig. 5. Discriminant variable values for validation set of fresh samples on the model ‘‘2,1,1-MSCST. V. Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 495 between classes, making it possible to discriminate among the three different external validation groups. This fact is evident from Fig. 5, which shows the dis- criminatory variable values in relation to the first 3 PLS factors. The discriminant equation is that obtained by 2,1,1-MSCST treatment. 3.3.2.2. Dry-cured samples. The external validation car- ried out on the dry-cured samples produced different re- sults depending on the models (Table 2). The best results were obtained with 80% of the samples correctly classi- fied. Only three samples were wrongly classified. Two of them belonging to treatment b (75I/25S) were placed in a, and the other was a d sample (25I/75S) assigned to treatment e (100S). 3.4. Mixture prediction equations In developing these models, the same algorithm used in the discriminant analysis, was employed. Likewise, the same procedure for selecting the best number of PLS factors was applied as well as 6 runs of cross validation. 3.4.1. Fresh samples Classification errors ranged between 73.3% (1,3,3- SNVDT; 2,1,1-SNVDT; 2,1,1-MSCST) and 26.7% (2,3,3-SNVDT). This last case can be seen in Fig. 6. Three samples from Treatment a (100I) were included in treatment b (75I/25S) and one sample from treat- ment b, was assigned to treatment c (50I/50S). It is worth mentioning that a similar (2,3,3-MSCST) model resulted in a 33.3% classification error. Although the error is higher than the latter, predictions were good, since the errors were very close to the established lim- its. Table 3 shows a comparison between the individ- ual predictions made by both models. Model ‘‘2,3,3- SNVDT’’ uses 12 PLS factors with a SEC = 2.6, SECV = 4.7 and r2 being 0.99 and 0.98, respectively. For the same model but using a scatter correction MSCST, 13 PLS factors are required, with the SEC and SECV being 2.2 and 4.7, respectively. R2 values remain the same. 3.4.2. Dry-cured samples Using the same methodology on the cured product, there was a net improvement in the results. Only one of the models presented a high classification error: ‘‘0,0,1-NONE’’ (73.3%). The minimum error figure was shown by the two models: ‘‘1,3,3-SNVDT; 1,5,3- MSCST’’, which only sorted one sample of the external validation group inaccurately. In both instances, this sample was the same: d (25I/75S), which was classified as c (50I/50S). Fig. 7 shows the classification obtained with the model ‘‘1,3,3-SNVDT’’. Of particular note is the high prediction accuracy of this model when detect- ing mixtures of both types of meat. The model used 14 PLS factors, presenting a SEC = 3.7 and SECV = 5.9 and r2 = 0.99 and r2 = 0.99. Other interesting models with low classification error figures were: ‘‘1,3,3- MSCST; 2,1,1-SNVDT or MSCST; 2,5,3-SNVDT or MSCST’’. NIRS vs % Mixtures –12,5 –12,5 12,5 12,5 37,5 37,5 62,5 62,5 87,5 87,5 112,5 112,5 NIRS (% I) Ref, values (% I) d (25% I) c (50% I) e (0% I) b (75% I) a (100% I) Fig. 6. Classification of the validation set of fresh samples using the best mixture prediction equation. Table 3 Individual prediction figures for the fresh product validation set using prediction equations ‘‘2,3,3-SNVDT’’ and ‘‘2,3,3-MSCST’’ a1 a2 a3 b1 b2 b3 c1 c2 c3 d1 d2 d3 e1 e2 e3 Reference values 100 100 100 75 75 75 50 50 50 25 25 25 0 0 0 Predicted values ‘‘2,3,3-SNVDT’’ 80.2 75.0 75.6 66.5 61.0 64.0 54.3 44.2 50.3 25.6 32.1 31.0 7.6 C03.4 4.1 Predicted values ‘‘2,3,3-MSCST’’ 87.6 86.8 84.1 75.0 73.0 74.4 65.0 53.7 60.4 31.2 38.0 37.0 13.2 6.3 12.3 d (25% I) c (50% I) b (75% I) a (100% I) e (0% I) NIRS vs % Mixtures –12,5 –12,5 12,5 12,5 37,5 37,5 62,5 62,5 87,5 87,5 112,5 112,5 NIRS (% I) Ref, values (% I) Fig. 7. Classification of the validation set of cured samples using the best mixture prediction equation. 496 V. Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 4. Conclusions The best mathematical models obtained in this study are good enough to detect genuine sausages from fake ones, since mixtures, in most cases, are made using a high fraction of lower-priced meats. Were the sausages formulated with a very low percentage of inexpensive meat, there would not be a significant effect on the sau- sage quality. These models were obtained by: C15 Carrying out a discriminant analysis. 92% of the sam- ples from the calibration collective were accurately classified as well as 80% of the samples from the external validation set. Incorrectly classified samples always fell within the correct nearest neighbouring group. C15 Developing equations of prediction of mixtures, a r2 = 0.99 and SECV = 5.9 were obtained. When car- rying out external validation of the model, only one sample was included in the wrong class, although adjacent to the correct one. Nevertheless, since the raw material is variable and the manufacturing process might also boost the hetero- geneity of the final product (sausages), it would be of great significance to improve the models by broadening the calibration groups with a larger number of samples, in order to obtain more robust models. The variability revealed by the diversity of products in the market, should be kept in a spectral library. This study also shows reveals important wavelengths in providing the most decisive information when differ- entiating pork meat mixtures in sausages. This could al- low the producers of NIR equipments to design cheaper hardware, better suited to quality control in sausage production lines. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge: the director of the CIFA-Palma del Rı´o Jesus Pe´rez Aparicio and staff for their invaluable help. We also appreciate the kind- ness and skilful technical assistance of Antonio Lo´pez, Animal Production Laboratory–ETSIAM/UCO. This work was supported by the INIA project, number CAL00-001. References Alomar, D., Gallo, C., Castan˜eda, V., & Fuchslocher, R. (2002). Chemical and discriminant analysis of bovine meat by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Meat Science, 63, 441–450. Cava, R., Ruiz, J., Lo´pez-Bote, C., Martı´n, L., Garcı´a, C., Ventanas, J., et al. (1997). Influence of finishing diet of fatty acid profiles of intramuscular lipids, triglycerides and phospholipids in muscles of the Iberian pork. Meat Science, 45, 263–270. Cozzolino, D., & Murray, I. (2002). Effect of sample presentation and animal muscle species on the analysis of meat by near infrared reflectance spectroscopy. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 10, 37–44. Cozzolino, D., Martins, V., & Murray, I. (2002). Visible and near infrared spectroscopy of beef longissimus dorsi muscle as a means of discriminating between pasture and corn silage feeding regimes. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 10, 187–193. 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Ortiz-Somovilla et al. / Meat Science 71 (2005) 490–497 497 ANEXO II Valores individuales de la variable discriminatoria de los modelos seleccionados en el Análisis Discriminante para el tipo de producto chorizo Anexo II 289 Forma de presentación de muestras CHI Producto Curado, Homogeneizado, analizado en el modo de visión Inferior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,98 1,01 0,80 1,08 1,13 * 2 31a2 1 1,92 1,19 0,87 1,14 0,88 * 3 31a3 1 1,60 1,10 1,37 1,17 0,76 * 4 32a1 1 1,69 1,43 0,76 1,12 1,01 * 5 32a2 1 2,02 1,03 0,93 1,06 0,97 * 6 32a3 1 1,51 1,94 1,05 0,83 0,67 * * 7 33a1 1 1,73 1,30 0,91 0,87 1,20 * 8 33a2 1 1,62 1,46 1,03 1,08 0,81 * 9 33a3 1 1,77 1,41 0,71 1,20 0,91 * 10 34a1 1 2,10 0,70 1,31 1,10 0,78 * 11 34a2 1 2,27 0,94 0,96 0,72 1,11 * 12 34a3 1 1,72 1,42 1,35 0,79 0,73 * 13 35a1 1 1,75 1,41 1,14 0,98 0,71 * 14 35a2 1 1,86 1,15 0,83 1,15 1,02 * 15 35a3 1 1,55 1,05 1,27 1,13 1,00 * 16 31b1 2 1,10 1,67 1,24 0,57 1,42 * 17 31b2 2 1,42 1,64 0,46 1,22 1,26 * 18 31b3 2 1,31 1,17 1,31 1,22 1,00 19 32b1 2 1,26 1,67 1,12 0,91 1,04 * 20 32b2 2 1,16 1,58 1,11 1,08 1,08 * 21 32b3 2 1,17 1,90 1,05 0,93 0,95 * 22 33b1 2 1,55 1,49 0,50 1,07 1,39 * 23 33b2 2 1,19 1,43 1,36 0,99 1,02 24 33b3 2 1,38 1,28 1,08 1,02 1,24 25 34b1 2 0,81 1,79 1,14 1,36 0,90 * 26 34b2 2 1,30 1,67 1,11 0,98 0,94 * 27 34b3 2 0,97 1,93 0,85 1,25 1,00 * 28 35b1 2 1,24 1,59 1,09 0,95 1,14 * 29 35b2 2 1,40 1,90 0,96 0,34 1,40 * 30 35b3 2 1,30 1,21 1,47 1,15 0,88 31 31c1 3 0,95 1,40 1,65 0,90 1,10 * 32 31c2 3 1,38 0,52 1,89 1,19 1,02 * 33 31c3 3 0,83 1,17 1,65 1,32 1,03 * 34 32c1 3 1,30 0,65 1,60 1,39 1,06 * 35 32c2 3 0,95 0,79 1,80 1,50 0,98 * 36 32c3 3 1,08 1,18 1,58 1,10 1,07 * 37 33c1 3 0,95 0,93 1,79 1,37 0,95 * 38 33c2 3 0,98 1,25 1,55 1,39 0,83 * 39 33c3 3 1,13 1,10 1,50 1,25 1,02 * 40 34c1 3 0,62 1,53 1,62 1,44 0,79 * * 41 34c2 3 1,14 1,22 1,74 0,72 1,19 * 42 34c3 3 1,21 1,10 1,40 0,90 1,39 43 35c1 3 1,02 1,31 1,50 1,10 1,08 44 35c2 3 0,92 1,43 1,54 1,01 1,10 * 45 35c3 3 0,75 1,68 1,70 1,08 0,79 * * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 290 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 1,06 0,88 1,29 1,62 1,15 * 47 31d2 4 1,17 1,17 0,87 1,34 1,45 48 31d3 4 0,91 1,06 1,44 1,65 0,94 * 49 32d1 4 0,90 1,55 0,17 2,56 0,83 * * 50 32d2 4 0,99 0,97 0,73 2,10 1,21 * 51 32d3 4 0,85 0,94 1,80 1,80 0,62 * * 52 33d1 4 1,00 1,00 1,18 1,53 1,30 * 53 33d2 4 0,97 1,00 1,59 1,15 1,30 * 54 33d3 4 1,03 0,92 1,45 1,32 1,29 55 34d1 4 1,67 0,05 0,73 1,74 1,81 * * * 56 34d2 4 1,26 0,61 1,20 2,02 0,90 * 57 34d3 4 1,00 0,97 1,37 1,58 1,09 * 58 35d1 4 1,15 1,20 1,11 1,38 1,16 59 35d2 4 1,07 0,91 0,72 2,40 0,91 * 60 35d3 4 0,96 0,89 1,68 1,53 0,94 * * 61 31e1 5 1,16 0,48 1,26 1,47 1,63 * 62 31e2 5 1,01 1,03 0,86 1,19 1,91 * 63 31e3 5 0,57 1,54 1,18 1,08 1,63 * * 64 32e1 5 0,89 1,23 1,29 0,63 1,96 * 65 32e2 5 0,95 1,13 0,65 1,22 2,05 * 66 32e3 5 1,03 0,99 1,42 0,65 1,90 * 67 33e1 5 0,68 1,56 0,74 1,34 1,68 * * 68 33e2 5 1,00 1,16 0,81 1,09 1,94 * 69 33e3 5 1,08 1,05 0,98 1,11 1,78 * 70 34e1 5 0,61 1,65 0,40 1,26 2,09 * * 71 34e2 5 1,63 -0,09 1,17 1,14 2,16 * * 72 34e3 5 0,44 1,60 1,12 1,21 1,63 * * 73 35e1 5 1,12 0,72 0,82 1,32 2,01 * 74 35e2 5 1,05 0,48 1,24 1,56 1,67 * * 75 35e3 5 0,72 1,45 0,98 0,82 2,03 * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 291 Forma de presentación de muestras CHS Producto Curado, Homogeneizado, analizado en el modo de visión Superior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,38 1,26 1,25 1,15 0,97 2 31a2 1 1,65 1,34 0,92 1,29 0,80 * 3 31a3 1 0,87 1,50 1,99 1,18 0,47 * 4 32a1 1 1,67 1,25 0,88 1,06 1,14 * 5 32a2 1 1,85 1,37 0,88 1,06 0,84 * 6 32a3 1 1,63 1,41 1,52 0,50 0,94 * * 7 33a1 1 1,28 1,71 1,29 0,96 0,76 * 8 33a2 1 1,69 1,36 1,39 0,43 1,13 * 9 33a3 1 1,70 1,13 1,01 1,26 0,90 * 10 34a1 1 1,74 1,45 1,01 1,16 0,64 * 11 34a2 1 2,33 0,69 0,89 1,13 0,97 * 12 34a3 1 1,79 1,09 1,67 0,79 0,65 * * 13 35a1 1 1,61 1,05 1,18 0,85 1,33 * 14 35a2 1 1,61 1,26 1,44 0,66 1,02 * 15 35a3 1 1,40 1,24 1,46 0,73 1,18 16 31b1 2 1,19 1,39 1,31 0,89 1,22 17 31b2 2 1,57 0,80 1,32 1,29 1,02 * 18 31b3 2 1,58 1,74 0,32 1,80 0,57 * * * 19 32b1 2 1,59 1,64 0,66 1,10 1,01 * * 20 32b2 2 1,55 1,11 1,34 0,92 1,08 * 21 32b3 2 1,21 2,09 0,93 0,65 1,12 * 22 33b1 2 1,28 1,29 0,91 1,24 1,29 23 33b2 2 1,38 1,53 1,08 1,05 0,96 * 24 33b3 2 1,01 1,79 1,01 1,17 1,01 * 25 34b1 2 1,11 1,65 0,86 1,18 1,21 * 26 34b2 2 1,01 2,10 0,86 0,97 1,06 * 27 34b3 2 0,62 1,90 1,50 0,90 1,09 * * 28 35b1 2 1,33 1,04 1,29 1,11 1,22 29 35b2 2 1,73 0,90 1,39 -0,07 2,06 * * 30 35b3 2 1,23 1,65 0,94 1,33 0,86 * 31 31c1 3 0,72 1,42 1,95 0,71 1,19 * 32 31c2 3 0,69 1,17 2,02 1,19 0,93 * 33 31c3 3 1,07 1,40 1,12 1,32 1,08 34 32c1 3 1,27 0,49 1,66 1,19 1,39 * 35 32c2 3 1,28 0,74 1,43 1,28 1,28 36 32c3 3 1,34 1,47 1,10 1,12 0,98 37 33c1 3 1,02 1,13 1,72 1,15 0,98 * 38 33c2 3 0,96 1,01 1,68 1,39 0,96 * 39 33c3 3 1,62 1,03 1,05 1,04 1,25 * 40 34c1 3 1,67 0,80 0,96 1,68 0,88 * * 41 34c2 3 0,92 1,49 1,62 0,87 1,10 * 42 34c3 3 0,74 1,16 2,06 0,85 1,19 * 43 35c1 3 1,13 1,16 1,54 0,86 1,31 * 44 35c2 3 1,47 0,99 1,34 1,10 1,10 45 35c3 3 1,50 0,90 1,26 1,14 1,21 * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 292 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 1,11 0,89 1,12 1,46 1,42 47 31d2 4 1,14 1,26 0,94 1,54 1,12 * 48 31d3 4 0,95 1,37 0,86 1,44 1,37 49 32d1 4 1,10 1,29 0,40 1,75 1,46 * 50 32d2 4 1,08 0,62 1,44 1,47 1,38 51 32d3 4 0,71 1,03 1,23 1,90 1,13 * 52 33d1 4 0,75 1,29 1,18 1,19 1,60 * 53 33d2 4 1,05 0,93 1,23 1,18 1,61 * 54 33d3 4 0,95 1,01 1,06 1,65 1,34 * 55 34d1 4 1,17 1,13 0,57 1,97 1,16 * 56 34d2 4 0,93 1,12 1,42 1,47 1,07 57 34d3 4 1,22 0,97 1,12 1,48 1,22 58 35d1 4 0,90 1,15 1,32 1,97 0,66 * 59 35d2 4 0,99 0,95 1,03 2,07 0,96 * 60 35d3 4 0,98 0,84 1,43 1,88 0,87 * 61 31e1 5 0,58 1,24 1,21 1,61 1,35 * 62 31e2 5 1,32 0,56 1,11 1,46 1,56 * 63 31e3 5 1,03 1,31 0,35 1,57 1,75 * * 64 32e1 5 0,95 1,01 1,34 0,91 1,79 * 65 32e2 5 0,78 1,00 1,29 0,74 2,19 * 66 32e3 5 0,93 1,19 1,60 0,85 1,43 * 67 33e1 5 0,73 0,95 1,55 1,31 1,46 * 68 33e2 5 0,70 1,35 1,16 1,33 1,47 69 33e3 5 0,98 1,07 0,86 1,47 1,63 * 70 34e1 5 0,95 1,30 0,34 1,42 1,99 * 71 34e2 5 0,69 1,05 1,15 1,26 1,86 * 72 34e3 5 0,59 1,02 1,53 0,91 1,96 * * 73 35e1 5 0,82 0,91 1,30 1,20 1,77 * 74 35e2 5 0,79 1,30 1,16 1,34 1,41 75 35e3 5 0,59 1,98 0,65 0,81 1,98 * * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 293 Forma de presentación de muestras CLI Producto Curado, Loncheado, analizado en el modo de visión Inferior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,67 1,12 1,44 1,13 0,64 * 2 31a2 1 1,78 0,94 1,06 1,42 0,80 * 3 31a3 1 1,29 1,40 1,50 0,79 1,02 * 4 32a1 1 1,75 1,27 1,10 1,10 0,78 * 5 32a2 1 1,35 1,58 1,46 0,77 0,85 * 6 32a3 1 1,91 1,22 1,27 0,73 0,87 * 7 33a1 1 1,59 1,33 0,99 1,29 0,80 * 8 33a2 1 1,63 1,50 0,88 0,80 1,19 * 9 33a3 1 1,63 1,56 0,74 1,09 0,98 * * 10 34a1 1 2,17 1,20 0,79 0,85 0,99 * 11 34a2 1 1,98 0,94 1,29 1,08 0,72 * 12 34a3 1 2,07 1,17 0,95 0,75 1,05 * 13 35a1 1 1,64 1,20 1,30 0,97 0,89 * 14 35a2 1 1,62 1,22 1,09 1,02 1,06 * 15 35a3 1 1,36 1,48 1,24 1,06 0,86 16 31b1 2 1,51 1,17 1,22 1,02 1,09 * 17 31b2 2 1,37 1,45 1,14 1,28 0,76 18 31b3 2 1,15 1,26 1,52 0,88 1,19 * 19 32b1 2 1,29 1,51 1,04 1,44 0,73 * 20 32b2 2 1,23 1,19 1,14 1,61 0,83 * 21 32b3 2 1,11 1,76 1,30 0,99 0,84 * 22 33b1 2 1,27 1,41 1,11 1,18 1,03 23 33b2 2 1,09 1,70 1,25 1,00 0,96 * 24 33b3 2 1,41 1,41 1,33 0,85 1,01 25 34b1 2 0,84 1,71 1,48 1,31 0,67 * 26 34b2 2 1,28 1,45 1,27 1,22 0,78 27 34b3 2 1,42 1,19 1,18 1,23 0,98 28 35b1 2 1,27 1,33 1,56 0,69 1,15 * 29 35b2 2 1,50 1,27 1,06 1,08 1,10 30 35b3 2 1,51 1,02 1,05 1,21 1,21 * 31 31c1 3 0,73 1,49 1,95 0,86 0,97 * 32 31c2 3 1,07 1,28 1,37 1,08 1,20 33 31c3 3 1,32 1,18 0,91 1,20 1,39 34 32c1 3 1,05 1,54 1,15 0,97 1,30 * 35 32c2 3 0,98 1,62 1,54 0,46 1,41 * * 36 32c3 3 1,56 0,90 0,94 1,27 1,33 * 37 33c1 3 1,03 1,04 1,55 1,23 1,15 * 38 33c2 3 1,06 1,40 1,55 0,85 1,15 * 39 33c3 3 1,01 1,40 1,23 1,26 1,10 40 34c1 3 1,22 1,13 1,45 1,14 1,06 41 34c2 3 1,07 1,03 1,74 1,13 1,03 * 42 34c3 3 1,27 0,98 1,39 1,00 1,37 43 35c1 3 1,07 1,34 1,57 1,29 0,73 * 44 35c2 3 1,02 1,22 1,59 1,35 0,83 * 45 35c3 3 1,09 0,93 1,41 1,60 0,98 * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 294 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 1,06 1,12 1,03 1,40 1,39 47 31d2 4 1,39 0,96 1,22 1,12 1,32 48 31d3 4 0,95 1,04 0,98 1,51 1,53 * * 49 32d1 4 0,96 1,33 0,62 1,94 1,15 * 50 32d2 4 0,99 0,97 0,94 1,76 1,34 * 51 32d3 4 1,23 0,99 0,75 1,73 1,31 * 52 33d1 4 0,81 0,90 1,74 1,33 1,22 * 53 33d2 4 1,06 1,21 1,13 1,13 1,48 54 33d3 4 1,10 1,16 1,33 0,99 1,43 55 34d1 4 1,29 1,10 0,92 1,39 1,30 56 34d2 4 0,95 1,13 1,30 1,38 1,24 57 34d3 4 0,88 0,98 1,58 1,49 1,08 * 58 35d1 4 0,57 1,57 1,40 1,65 0,81 * * 59 35d2 4 0,97 1,13 0,78 2,03 1,09 * 60 35d3 4 0,68 1,07 1,52 1,98 0,76 * * 61 31e1 5 0,78 1,23 0,94 1,17 1,88 * 62 31e2 5 0,84 1,64 0,79 1,17 1,55 * * 63 31e3 5 0,70 0,92 1,25 1,35 1,78 * 64 32e1 5 0,82 1,04 1,27 1,28 1,59 * 65 32e2 5 1,11 0,34 1,56 1,39 1,61 * * 66 32e3 5 1,21 0,61 1,20 1,03 1,95 * 67 33e1 5 0,65 0,94 1,53 1,21 1,68 * * 68 33e2 5 0,81 1,16 0,98 1,06 2,00 * 69 33e3 5 0,93 1,10 1,29 1,13 1,55 * 70 34e1 5 1,31 0,80 0,53 1,54 1,81 * * 71 34e2 5 1,09 0,82 0,62 1,17 2,30 * 72 34e3 5 0,72 0,86 1,51 1,36 1,56 * * 73 35e1 5 0,91 0,91 1,45 1,29 1,45 74 35e2 5 1,00 1,01 1,11 0,95 1,93 * 75 35e3 5 1,09 0,80 1,10 1,36 1,66 * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 295 Forma de presentación de muestras CLS Producto Curado, Loncheado, analizado en el modo de visión Superior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,38 1,22 1,27 0,97 1,16 2 31a2 1 1,35 1,15 1,30 1,40 0,81 3 31a3 1 1,62 1,07 0,78 1,47 1,06 * 4 32a1 1 1,56 1,39 1,43 0,63 1,00 * 5 32a2 1 1,71 1,33 1,03 1,38 0,54 * 6 32a3 1 1,55 1,58 1,38 0,41 1,09 * * 7 33a1 1 1,73 1,43 1,02 1,03 0,80 * 8 33a2 1 1,56 1,79 0,82 0,94 0,90 * * 9 33a3 1 1,43 1,42 0,92 0,95 1,28 10 34a1 1 1,46 1,52 1,13 1,31 0,58 * 11 34a2 1 1,58 1,13 1,48 0,76 1,06 * 12 34a3 1 1,85 1,79 0,84 0,79 0,74 * * 13 35a1 1 1,52 1,34 1,24 0,96 0,95 * 14 35a2 1 1,43 1,55 0,80 1,00 1,22 * 15 35a3 1 1,30 1,58 1,19 0,62 1,32 * 16 31b1 2 1,49 1,30 0,88 1,36 0,98 17 31b2 2 1,47 1,34 1,25 1,06 0,88 18 31b3 2 1,21 1,20 1,42 1,06 1,11 19 32b1 2 1,52 1,02 1,49 0,93 1,03 * 20 32b2 2 1,38 1,52 1,13 1,08 0,89 * 21 32b3 2 1,44 1,40 0,84 1,31 1,02 22 33b1 2 1,57 1,28 1,02 1,16 0,98 * 23 33b2 2 0,91 1,70 1,13 1,49 0,78 * 24 33b3 2 1,30 1,37 1,17 0,91 1,25 25 34b1 2 1,35 1,20 1,12 1,28 1,06 26 34b2 2 1,34 1,31 1,06 1,18 1,11 27 34b3 2 1,48 0,92 1,69 1,06 0,85 * 28 35b1 2 1,61 1,42 0,90 1,14 0,93 * 29 35b2 2 1,27 1,31 1,19 1,10 1,13 30 35b3 2 1,49 1,30 0,88 1,36 0,98 31 31c1 3 0,93 1,34 1,37 1,05 1,30 32 31c2 3 0,77 1,44 1,47 0,91 1,41 33 31c3 3 0,95 1,41 1,76 0,84 1,04 * 34 32c1 3 1,45 1,20 1,17 1,26 0,92 35 32c2 3 1,35 1,16 1,11 1,26 1,12 36 32c3 3 1,52 1,30 0,90 1,34 0,93 * 37 33c1 3 0,86 1,42 1,46 1,01 1,26 38 33c2 3 1,12 1,41 1,25 0,40 1,83 * 39 33c3 3 1,02 1,15 1,37 1,16 1,30 40 34c1 3 1,39 0,78 1,43 1,04 1,36 41 34c2 3 1,20 1,07 1,44 0,95 1,34 42 34c3 3 1,35 1,31 1,46 0,92 0,97 43 35c1 3 1,15 1,29 1,21 1,48 0,87 44 35c2 3 1,23 1,16 1,60 1,14 0,88 * 45 35c3 3 1,32 1,22 1,18 0,94 1,34 Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 296 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 1,81 1,49 0,32 1,78 0,59 * * 47 31d2 4 0,94 1,15 1,08 1,58 1,24 * 48 31d3 4 0,85 0,85 1,04 2,02 1,24 * 49 32d1 4 1,02 1,17 0,69 1,43 1,69 * 50 32d2 4 0,82 1,34 1,48 1,72 0,65 * 51 32d3 4 0,80 1,28 1,14 1,58 1,19 * 52 33d1 4 0,84 1,17 1,20 1,60 1,19 * 53 33d2 4 0,83 1,18 1,19 1,55 1,24 * 54 33d3 4 1,11 1,00 1,02 1,42 1,45 55 34d1 4 1,06 1,43 0,09 2,01 1,42 * 56 34d2 4 0,97 1,23 1,18 1,21 1,40 57 34d3 4 0,87 1,10 1,43 1,85 0,75 * 58 35d1 4 0,84 1,11 1,43 1,71 0,92 * 59 35d2 4 0,96 0,69 1,43 1,66 1,26 * 60 35d3 4 1,81 1,49 0,32 1,78 0,59 * * 61 31e1 5 1,00 1,10 1,09 1,16 1,65 * 62 31e2 5 1,00 0,97 1,17 1,08 1,78 * 63 31e3 5 1,10 0,86 1,16 1,24 1,63 * 64 32e1 5 1,16 1,12 1,23 0,87 1,62 * 65 32e2 5 1,16 0,71 1,29 0,98 1,86 * 66 32e3 5 1,49 0,68 1,17 0,96 1,70 * 67 33e1 5 0,87 1,15 1,21 1,33 1,44 68 33e2 5 0,46 1,21 1,45 1,40 1,48 69 33e3 5 0,69 1,24 1,27 0,55 2,26 * 70 34e1 5 0,86 0,73 0,71 1,12 2,59 * 71 34e2 5 1,00 1,10 0,73 1,29 1,89 * 72 34e3 5 1,02 0,82 1,15 1,35 1,67 * 73 35e1 5 0,62 1,22 1,39 1,57 1,21 * 74 35e2 5 1,09 1,18 1,34 1,26 1,13 75 35e3 5 0,84 1,06 1,38 1,15 1,58 * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 297 Forma de presentación de muestras FHI Producto Fresco, Homogeneizado, analizado en el modo de visión Inferior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 2,17 0,74 0,59 1,15 1,36 * 2 31a2 1 1,98 0,56 1,49 1,07 0,90 * 3 31a3 1 1,90 1,36 1,00 0,74 0,99 * 4 32a1 1 1,67 1,38 0,82 0,90 1,23 * 5 32a2 1 1,60 1,44 1,12 0,97 0,87 * 6 32a3 1 1,78 1,31 0,76 1,44 0,70 * 7 33a1 1 1,75 1,47 0,66 0,89 1,22 * 8 33a2 1 1,87 1,34 0,87 0,98 0,94 * 9 33a3 1 2,04 1,28 0,55 0,95 1,19 * 10 34a1 1 1,83 1,50 0,90 1,00 0,77 * * 11 34a2 1 2,09 0,75 1,13 1,08 0,96 * 12 34a3 1 2,22 0,56 1,23 0,99 1,00 * 13 35a1 1 1,74 1,40 0,69 1,35 0,81 * 14 35a2 1 1,56 1,44 1,29 0,48 1,22 * 15 35a3 1 1,58 1,55 0,83 0,91 1,14 * * 16 31b1 2 1,00 1,46 1,48 0,97 1,10 17 31b2 2 1,18 1,60 1,08 1,43 0,72 * 18 31b3 2 1,06 1,68 1,60 0,90 0,76 * * 19 32b1 2 0,85 1,89 1,23 1,47 0,57 * 20 32b2 2 1,17 1,59 0,88 1,91 0,46 * * 21 32b3 2 1,17 1,36 1,40 1,23 0,85 22 33b1 2 1,27 1,52 1,19 1,09 0,94 * 23 33b2 2 1,24 1,61 1,43 0,79 0,93 * 24 33b3 2 1,18 1,56 1,55 0,80 0,91 * * 25 34b1 2 1,36 1,30 1,20 1,04 1,11 26 34b2 2 1,08 1,52 1,43 0,93 1,04 * 27 34b3 2 1,31 1,28 1,50 1,13 0,79 28 35b1 2 1,37 1,33 1,09 1,23 0,98 29 35b2 2 1,38 1,45 1,23 0,69 1,25 30 35b3 2 1,40 1,27 1,16 1,26 0,91 31 31c1 3 0,87 1,42 1,76 1,06 0,88 * 32 31c2 3 0,97 1,31 1,33 1,11 1,28 33 31c3 3 1,15 1,28 1,25 1,40 0,93 34 32c1 3 0,81 1,34 1,75 0,83 1,27 * 35 32c2 3 1,05 1,26 1,76 0,71 1,24 * 36 32c3 3 1,06 1,30 1,60 0,85 1,20 * 37 33c1 3 1,09 1,10 1,32 1,53 0,97 * 38 33c2 3 0,76 1,38 1,72 1,15 0,99 * 39 33c3 3 1,08 1,08 1,29 1,37 1,18 40 34c1 3 1,02 1,26 1,55 0,96 1,21 * 41 34c2 3 0,95 1,24 1,83 0,83 1,15 * 42 34c3 3 0,67 1,56 1,74 1,06 0,96 * * 43 35c1 3 1,10 1,51 1,24 1,03 1,13 * 44 35c2 3 0,96 1,18 1,68 1,00 1,18 * 45 35c3 3 0,84 1,60 1,62 0,84 1,11 * * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 298 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 1,04 1,23 0,81 1,49 1,43 47 31d2 4 1,00 1,09 1,16 1,24 1,51 * 48 31d3 4 1,44 0,76 1,00 1,32 1,47 49 32d1 4 0,98 1,29 0,79 1,66 1,28 * 50 32d2 4 0,89 1,26 1,20 1,70 0,94 * 51 32d3 4 0,95 1,15 0,93 1,63 1,35 * 52 33d1 4 0,91 1,03 1,20 1,62 1,25 * 53 33d2 4 0,96 0,92 1,12 1,72 1,28 * 54 33d3 4 1,08 0,86 1,33 1,50 1,22 * 55 34d1 4 1,10 1,11 1,10 1,83 0,87 * 56 34d2 4 0,82 1,17 1,15 2,20 0,66 * 57 34d3 4 0,94 1,17 1,17 1,71 1,01 * 58 35d1 4 1,01 1,12 0,97 1,75 1,16 * 59 35d2 4 0,95 1,23 1,05 1,54 1,24 * 60 35d3 4 0,89 1,25 1,25 1,39 1,22 61 31e1 5 1,12 0,85 0,88 1,38 1,78 * 62 31e2 5 0,98 0,58 1,37 1,36 1,71 * 63 31e3 5 0,88 0,73 1,48 1,04 1,88 * 64 32e1 5 1,21 0,43 1,44 1,50 1,43 65 32e2 5 1,17 0,65 1,46 0,96 1,77 * 66 32e3 5 1,15 0,56 1,35 1,10 1,84 * 67 33e1 5 0,71 1,25 1,03 1,31 1,71 * 68 33e2 5 1,12 0,93 1,04 1,19 1,72 * 69 33e3 5 1,12 0,85 1,07 0,94 2,03 * 70 34e1 5 1,54 1,06 0,42 0,43 2,55 * * 71 34e2 5 0,85 1,12 0,76 1,33 1,95 * 72 34e3 5 0,56 1,20 1,09 1,23 1,93 * 73 35e1 5 1,23 0,62 0,85 1,79 1,51 * * 74 35e2 5 0,88 0,95 1,20 1,25 1,72 * 75 35e3 5 1,00 0,69 1,42 1,32 1,57 * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 299 Forma de presentación de muestras FHS Producto Fresco, Homogeneizado, analizado en el modo de visión Superior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,36 1,61 1,14 0,86 1,03 * 2 31a2 1 1,97 0,96 0,70 1,81 0,56 * * 3 31a3 1 1,81 0,90 1,25 1,37 0,67 * 4 32a1 1 1,91 1,05 1,40 0,48 1,17 * 5 32a2 1 1,84 1,05 1,32 0,64 1,16 * 6 32a3 1 2,05 1,27 0,68 0,33 1,67 * * 7 33a1 1 1,88 1,38 0,76 1,11 0,87 * 8 33a2 1 1,94 1,36 0,95 1,06 0,69 * 9 33a3 1 1,80 1,57 0,67 1,03 0,93 * * 10 34a1 1 1,83 1,20 1,37 0,76 0,84 * 11 34a2 1 1,04 2,65 0,81 -0,20 1,70 * * 12 34a3 1 2,29 0,71 1,45 0,31 1,24 * 13 35a1 1 1,87 1,02 0,56 1,25 1,30 * 14 35a2 1 1,61 1,22 1,18 0,85 1,15 * 15 35a3 1 1,58 1,27 1,06 1,04 1,05 * 16 31b1 2 1,11 1,60 1,35 0,95 0,99 * 17 31b2 2 1,30 1,38 1,22 1,21 0,90 18 31b3 2 1,29 1,38 1,35 1,26 0,73 19 32b1 2 1,03 1,47 1,33 1,19 0,99 20 32b2 2 1,17 1,41 1,14 1,20 1,08 21 32b3 2 1,01 1,59 1,15 1,32 0,93 * 22 33b1 2 1,17 1,62 0,85 1,41 0,96 * 23 33b2 2 1,14 1,69 1,27 1,04 0,87 * 24 33b3 2 1,24 1,64 1,08 1,22 0,82 * 25 34b1 2 1,23 1,37 1,61 1,11 0,68 * 26 34b2 2 1,02 1,58 1,40 1,20 0,80 * 27 34b3 2 1,00 1,50 1,68 1,05 0,77 * * 28 35b1 2 1,49 1,17 1,00 1,30 1,04 29 35b2 2 1,19 1,45 1,31 1,03 1,02 30 35b3 2 1,28 1,25 1,26 1,28 0,92 31 31c1 3 0,84 1,46 1,57 1,05 1,08 * 32 31c2 3 1,12 1,17 1,37 1,26 1,08 33 31c3 3 0,72 1,55 1,77 1,21 0,75 * * 34 32c1 3 0,88 1,43 1,70 0,92 1,08 * 35 32c2 3 1,05 1,33 1,52 1,07 1,04 * 36 32c3 3 1,27 1,13 1,42 1,22 0,96 37 33c1 3 0,93 1,18 1,37 1,05 1,48 38 33c2 3 0,86 1,21 1,89 0,75 1,29 * 39 33c3 3 1,00 1,17 1,24 1,18 1,42 40 34c1 3 1,01 1,07 1,60 1,34 0,98 * 41 34c2 3 0,81 1,26 1,40 1,43 1,10 42 34c3 3 0,84 1,32 1,70 0,94 1,20 * 43 35c1 3 1,08 1,42 1,45 0,97 1,09 44 35c2 3 0,95 1,21 2,03 0,89 0,92 * 45 35c3 3 1,28 1,10 1,90 1,17 0,56 * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 300 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 1,04 1,06 1,08 1,52 1,30 * 47 31d2 4 0,99 1,04 1,31 1,33 1,32 48 31d3 4 1,13 1,12 0,97 1,43 1,35 49 32d1 4 0,96 1,17 1,16 1,30 1,41 50 32d2 4 0,94 1,28 1,00 1,64 1,14 * 51 32d3 4 1,05 1,25 0,75 1,93 1,03 * 52 33d1 4 1,10 0,83 1,10 1,55 1,43 * 53 33d2 4 0,73 1,06 1,82 0,97 1,42 * 54 33d3 4 1,05 1,04 0,95 1,64 1,32 * 55 34d1 4 1,14 1,30 1,10 1,38 1,07 56 34d2 4 0,58 1,76 1,03 1,44 1,20 * 57 34d3 4 0,91 1,71 0,88 1,12 1,38 * 58 35d1 4 0,58 1,15 1,22 1,93 1,12 * 59 35d2 4 0,78 1,23 1,57 1,35 1,07 * 60 35d3 4 0,69 1,35 1,20 1,70 1,07 * 61 31e1 5 0,71 0,77 1,57 1,07 1,88 * * 62 31e2 5 1,08 0,86 1,14 0,91 2,02 * 63 31e3 5 1,47 0,65 0,88 1,21 1,79 * 64 32e1 5 1,05 0,83 1,03 1,47 1,63 * 65 32e2 5 1,06 0,95 1,09 1,31 1,59 * 66 32e3 5 1,02 0,91 1,22 1,25 1,61 * 67 33e1 5 1,03 1,02 0,85 1,32 1,79 * 68 33e2 5 0,92 1,26 1,22 1,07 1,54 * 69 33e3 5 1,08 1,13 1,21 0,99 1,60 * 70 34e1 5 1,23 0,65 0,68 1,57 1,87 * * 71 34e2 5 1,27 0,21 1,19 2,03 1,30 * 72 34e3 5 1,07 0,67 0,96 1,20 2,10 * 73 35e1 5 1,13 0,88 0,48 1,87 1,64 * * 74 35e2 5 0,89 1,02 1,26 1,27 1,56 * 75 35e3 5 0,91 1,05 1,35 1,16 1,53 * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 301 Forma de presentación de muestras FPI Producto Fresco, Picado, analizado en el modo de visión Inferior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,18 1,88 0,86 1,35 0,73 * 2 31a2 1 1,61 1,08 1,40 1,15 0,76 * 3 31a3 1 1,52 1,46 1,09 1,06 0,87 * 4 32a1 1 1,59 1,47 1,43 0,52 0,99 * 5 32a2 1 1,52 1,61 0,93 0,55 1,40 * * 6 32a3 1 2,61 -0,03 1,05 1,20 1,17 * 7 33a1 1 1,98 1,00 0,84 1,07 1,12 * 8 33a2 1 1,72 1,74 0,63 0,72 1,18 * * 9 33a3 1 2,23 1,14 0,78 0,99 0,86 * 10 34a1 1 2,16 1,01 1,30 0,63 0,91 * 11 34a2 1 2,08 1,03 1,28 0,67 0,93 * 12 34a3 1 1,21 1,87 1,21 0,94 0,77 * 13 35a1 1 1,80 0,91 0,90 1,19 1,20 * 14 35a2 1 1,73 1,55 0,40 0,87 1,45 * * 15 35a3 1 1,53 0,95 1,28 1,24 1,00 * 16 31b1 2 1,04 1,79 1,12 1,12 0,93 * 17 31b2 2 1,34 1,11 1,44 1,41 0,70 18 31b3 2 1,27 1,40 1,28 1,17 0,88 19 32b1 2 0,85 1,73 1,09 1,60 0,74 * * 20 32b2 2 1,61 1,59 0,84 1,16 0,80 * * 21 32b3 2 1,37 1,62 1,35 0,80 0,86 * 22 33b1 2 1,37 1,37 1,26 1,24 0,77 23 33b2 2 1,19 1,84 1,15 0,29 1,53 * * 24 33b3 2 1,47 1,40 1,34 1,26 0,54 25 34b1 2 1,37 1,49 1,07 1,14 0,93 26 34b2 2 1,58 1,17 1,21 1,03 1,01 * 27 34b3 2 1,08 1,52 1,51 0,79 1,11 * * 28 35b1 2 1,17 1,79 0,88 0,68 1,49 * 29 35b2 2 1,65 1,08 1,29 0,91 1,08 * 30 35b3 2 1,16 1,42 1,06 1,32 1,04 31 31c1 3 0,94 1,47 1,09 1,08 1,43 32 31c2 3 1,12 1,27 1,30 1,09 1,22 33 31c3 3 1,39 1,29 1,04 1,38 0,89 34 32c1 3 1,25 0,73 1,14 1,77 1,11 * 35 32c2 3 1,26 1,05 1,21 1,48 1,01 36 32c3 3 0,78 1,72 1,59 0,27 1,65 * * * 37 33c1 3 0,91 1,24 1,60 1,33 0,92 * 38 33c2 3 0,95 1,13 1,99 1,10 0,83 * 39 33c3 3 0,81 1,40 1,76 1,21 0,82 * 40 34c1 3 0,92 1,15 1,65 1,09 1,19 * 41 34c2 3 1,22 0,73 1,98 1,03 1,04 * 42 34c3 3 0,79 1,44 1,48 1,10 1,19 43 35c1 3 0,95 1,50 1,67 0,81 1,07 * 44 35c2 3 0,79 1,55 1,65 1,17 0,84 * * 45 35c3 3 0,96 1,47 1,51 1,06 1,00 * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 302 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 0,81 1,18 1,34 1,20 1,47 47 31d2 4 0,91 1,23 1,32 1,26 1,28 48 31d3 4 1,11 1,23 1,04 1,19 1,42 49 32d1 4 0,84 1,28 1,54 1,12 1,22 * 50 32d2 4 1,09 0,96 1,05 1,60 1,30 * 51 32d3 4 0,44 2,87 0,07 0,78 1,85 * * 52 33d1 4 0,80 1,27 0,86 2,00 1,06 * 53 33d2 4 0,77 1,31 1,12 1,50 1,30 54 33d3 4 0,95 1,28 0,71 1,64 1,42 * 55 34d1 4 0,86 1,75 0,90 1,97 0,52 * * 56 34d2 4 1,22 1,11 0,99 1,48 1,20 57 34d3 4 0,89 0,97 1,33 1,47 1,35 58 35d1 4 0,93 1,00 1,45 1,86 0,76 * 59 35d2 4 0,77 0,80 1,47 1,62 1,33 * 60 35d3 4 0,81 1,17 1,38 1,68 0,95 * 61 31e1 5 0,94 0,99 1,25 1,23 1,60 * 62 31e2 5 1,26 0,60 1,42 1,30 1,43 63 31e3 5 1,13 0,66 0,78 2,59 0,84 * 64 32e1 5 1,01 1,25 1,00 1,09 1,65 * 65 32e2 5 0,90 0,79 0,75 1,82 1,74 * * 66 32e3 5 0,79 0,63 2,17 0,55 1,87 * * 67 33e1 5 1,21 0,89 0,47 1,84 1,59 * * 68 33e2 5 1,17 0,89 1,10 1,12 1,72 * 69 33e3 5 0,68 0,28 1,35 1,58 2,11 * * 70 34e1 5 0,77 1,42 1,02 0,49 2,30 * 71 34e2 5 0,81 1,28 0,89 1,19 1,83 * 72 34e3 5 0,88 1,08 1,28 1,05 1,72 * 73 35e1 5 1,03 0,96 1,32 0,87 1,82 * 74 35e2 5 1,16 0,99 0,81 1,13 1,90 * 75 35e3 5 1,29 0,54 0,68 1,76 1,73 * * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo Anexo II 303 Forma de presentación de muestras FPS Producto Fresco, Picado, analizado en el modo de visión Superior Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 1 31a1 1 1,11 1,84 1,08 1,59 0,38 * * 2 31a2 1 1,55 1,22 1,46 0,88 0,90 * 3 31a3 1 1,87 0,95 1,30 0,86 1,02 * 4 32a1 1 2,05 0,85 1,21 0,64 1,25 * 5 32a2 1 1,75 1,28 1,24 0,82 0,91 * 6 32a3 1 2,28 1,19 0,74 0,69 1,10 * 7 33a1 1 1,96 0,95 0,62 1,40 1,07 * 8 33a2 1 1,80 1,55 0,50 1,28 0,88 * * 9 33a3 1 1,95 1,20 1,02 1,02 0,81 * 10 34a1 1 2,17 0,74 1,62 0,57 0,90 * * 11 34a2 1 1,46 1,68 1,26 1,06 0,54 * 12 34a3 1 1,54 1,90 1,05 0,34 1,17 * * 13 35a1 1 1,94 0,51 1,11 1,03 1,42 * 14 35a2 1 1,67 1,26 1,27 1,11 0,69 * 15 35a3 1 1,40 1,06 1,50 1,04 1,00 16 31b1 2 1,32 1,46 0,95 1,43 0,84 17 31b2 2 1,36 1,89 1,10 1,01 0,65 * 18 31b3 2 1,41 1,00 1,46 1,19 0,95 19 32b1 2 1,08 1,83 0,72 1,23 1,15 * 20 32b2 2 1,59 0,69 1,62 1,17 0,94 * * 21 32b3 2 0,95 2,09 0,98 0,64 1,35 * 22 33b1 2 1,26 1,22 1,43 1,03 1,06 23 33b2 2 1,62 1,16 1,27 0,76 1,19 * 24 33b3 2 0,96 1,84 1,76 0,74 0,70 * * 25 34b1 2 1,10 1,94 0,96 0,93 1,07 * 26 34b2 2 1,08 1,65 1,29 0,82 1,16 * 27 34b3 2 0,70 1,75 1,38 0,87 1,30 * 28 35b1 2 1,16 1,15 1,14 1,59 0,96 * 29 35b2 2 1,41 1,53 1,28 0,89 0,89 * 30 35b3 2 0,84 1,75 0,99 1,26 1,17 * 31 31c1 3 0,84 1,44 1,28 0,40 2,05 * 32 31c2 3 0,98 1,44 1,63 1,00 0,95 * 33 31c3 3 1,29 1,18 1,27 1,67 0,59 * 34 32c1 3 0,86 1,87 1,47 0,61 1,20 * 35 32c2 3 1,09 0,98 1,42 1,69 0,82 * 36 32c3 3 1,16 1,24 1,53 0,81 1,27 * 37 33c1 3 1,13 1,06 1,57 1,33 0,92 * 38 33c2 3 1,24 0,71 1,68 1,37 1,01 * 39 33c3 3 0,81 1,54 1,78 1,20 0,66 * * 40 34c1 3 1,25 1,29 0,68 1,85 0,93 * 41 34c2 3 1,39 0,82 1,42 1,28 1,10 42 34c3 3 1,11 1,22 1,12 1,00 1,56 * 43 35c1 3 0,92 1,50 1,60 0,59 1,40 * 44 35c2 3 1,17 1,10 1,69 0,74 1,30 * 45 35c3 3 1,01 1,45 1,50 1,24 0,80 * Antonio J. Gaitán Jurado Tesis Doctoral 304 Posic. Muestra Grupo LT A LT B LT C LT D LT E LT A LT B LT C LT D LT E 46 31d1 4 0,87 0,87 1,51 1,64 1,11 * * 47 31d2 4 0,95 1,37 1,13 1,44 1,11 48 31d3 4 1,10 1,21 0,73 1,53 1,43 * 49 32d1 4 0,94 1,36 0,97 1,37 1,36 50 32d2 4 1,17 1,00 0,67 1,79 1,38 * 51 32d3 4 0,80 1,21 1,55 1,31 1,12 * 52 33d1 4 0,91 1,35 0,69 1,44 1,62 * 53 33d2 4 0,87 1,23 1,06 1,42 1,42 54 33d3 4 0,99 0,60 1,50 2,00 0,92 * 55 34d1 4 1,40 0,52 1,10 1,60 1,38 * 56 34d2 4 0,95 0,78 1,50 1,73 1,04 * * 57 34d3 4 0,93 1,19 1,19 1,41 1,28 58 35d1 4 0,90 1,20 1,02 1,45 1,43 59 35d2 4 0,90 0,69 1,65 1,85 0,91 * * 60 35d3 4 0,91 0,92 1,44 1,79 0,95 * 61 31e1 5 1,07 0,80 0,70 1,02 2,42 * 62 31e2 5 1,14 0,79 1,15 1,22 1,70 * 63 31e3 5 0,68 1,64 0,67 1,64 1,37 * * 64 32e1 5 1,08 0,88 0,92 1,40 1,73 * 65 32e2 5 1,06 0,85 0,95 1,26 1,88 * 66 32e3 5 1,08 0,52 1,31 1,49 1,60 * 67 33e1 5 1,04 1,62 0,55 1,02 1,78 * * 68 33e2 5 1,09 1,10 1,13 1,17 1,51 * 69 33e3 5 0,40 1,07 2,04 0,84 1,65 * * 70 34e1 5 0,96 1,40 0,81 1,19 1,64 * 71 34e2 5 0,76 1,19 1,45 1,27 1,33 72 34e3 5 0,71 1,52 0,97 1,02 1,78 * * 73 35e1 5 0,86 1,25 1,18 0,59 2,12 * 74 35e2 5 1,09 1,17 0,54 1,39 1,81 * 75 35e3 5 1,08 1,11 0,94 0,93 1,94 * *Nota: Se considera una muestra clasificada en un grupo, cuando alcanza el valor más elevado de la variable discriminatoria en dicho grupo ANEXO III V. Ortiz-Somovilla, F. España-España, A.J. Gaitán-Jurado, J. Pérez-aparicio, E.J. De Pedro-Sanz. “Proximate análisis of homogenised and minced pork sausages by NIRS’” Food Chemistry, 2007, 101(3), 1031-1040 A.J. Gaitán-Jurado, V. Ortiz-Somovilla, F. España-España, J. Pérez-aparicio, E.J. De Pedro-Sanz,. “Quantitative analysis of pork dry-cured sausages to quality control by NIR spectroscopy” Meat Science, 2008, 78(4), 391-399 Proximate analysis of homogenized and minced mass of pork sausages by NIRS V. Ortiz-Somovilla a,*, F. Espan˜a-Espan˜a a, A.J. Gaita´n-Jurado a, J. Pe´rez-Aparicio b, E.J. De Pedro-Sanz c a IFAPA, CIFA ‘‘Alameda del Obispo’’ (A´ rea de Tecnologı´a Postcosecha e Industrias Agroalimentarias), Avda. Mene´ndez Pidal, Apdo. Correos 3.092, 14080 Co´rdoba, Spain b IFAPA, CIFA ‘‘Palma del Rı´o’’(A´ rea de Tecnologı´a Postcosecha e Industrias Agroalimentarias), Avda Rodrı´guez de la Fuente s/n, Apdo. 29, 14700 Palma del Rı´o, Co´rdoba, Spain c Universidad de Co´rdoba, Departamento de Produccio´n Animal, Campus Rabanales, Edificio Produccio´n Animal, 14014 Co´rdoba, Spain Received 15 August 2005; received in revised form 23 February 2006; accepted 23 February 2006 Abstract Near infrared spectroscopy was employed to analyse samples of pork sausage meat used in the manufacturing of typical Spanish sau- sages (minced and homogenized product). As well, two modes of analysis for the instrument were compared. Data from proximate anal- ysis (fat, moisture and protein) were put into a calibration model by a diode array NIR spectrometer. The spectral range used was 515– 1650 nm and different mathematical pre-treatments on the signal (derivatives and scatter corrections) were also compared. Different mathematical pre-treatments caused considerable changes in the statistics of the models (coefficients of determination and standard errors). R2 (calibration) and standard errors of prediction (SEP, external validation) in minced sausage meat for fat, moisture and protein were 0.98, 0.98 and 0.93 (R2) and 1.38%, 1%, 0.83% (SEP), respectively. These values in homogenised sausage meat for fat, moisture and protein were 0.99, 0.98 and 0.93 (R2), and 0.94%, 0.76% and 0.87% (SEP), respectively. C211 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Pork processed; Proximate analysis; NIRS; Quality control; Sample presentation 1. Introduction The meat trade plays an important role in the food and agricultural industry overall, providing added value to its economy. Specifically, in Spain, the pork trade is of partic- ular importance, making up 30.2% of the final livestock production and 10.4% of the final agrarian production (MAPA, 2004). Thus, Spain is the second largest producing country in the European Union, after Germany, account- ing for 18.6% of the total production in 2003, and 3.8% on a global scale. Dry-cured pork sausages are widely consumed in Spain, and the production of the typical ‘‘salchicho´n’’ sausage is particularly important. This sausage is obtained in the same way as other dry-cured sausages, after mixing, casing, fermentation and ripening. In order to manufacture this 0308-8146/$ - see front matter C211 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.foodchem.2006.02.058 Abbreviations: CIFA, Research and Development Agrarian Center of Andalusia Government; HD, sample presentation Homogenized ‘Down- view’; HU, sample presentation Homogenized ‘Up-view’; IFAPA, Anda- lusia Institute of Research and Development Agrarian, Fishing, Food and Ecologic Production; MD, sample presentation Minced ‘Down-view’; MPLS, modified partial least squared; MSC, multiplicative scatter corre- ction; MU, sample presentation Minced ‘Up-view’; PCA, principal com- ponent analysis; PCR, principal components regression; R2, coefficient of determination in calibration; r2, coefficient of determination in cross val- idation; RMS, root mean squared; RPD, residual predictive deviation; SEC, standard error of calibration; SECV, standard error of cross valid- ation; SEP, standard error of prediction; SNDDT, Standard normal variate and detrend; STD, standard deviation. * Corresponding author. Tel.: +34 957 016001; fax: + 34 957 016043. E-mail address: victor.ortiz@juntadeandalucia.es (V. Ortiz-Somovilla). www.elsevier.com/locate/foodchem Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 Food Chemistry type of sausage, several cuts of lean and fatty meat are used, generally excluding meat that is of higher commercial value, in other words, ham, shoulder and loins. According to the Spanish quality standard (BOE 21/03/1980), the commercial category awarded to dry-cured sausages is mainly based on their fat, moisture and protein contents. The fat and protein contents depend on the raw material used, which is not homogeneous, since the cuts of meat are obtained when the carcasses are carved up. The mois- ture content, which is inversely related to the fat content, will depend on the initial moisture, and the time and con- ditions in which the product is ripened Therefore, it is a parameter that should be controlled during manufacturing. Hence, it is important for industry to be able to control the levels of these constituents in fresh sausage meat in an effi- cient way, before it is made into actual sausages, so it can be adjusted to legally required levels and internal quality standards. Currently, quantitative information about the composi- tion of the product is not often included on the label. This lack of information has an important effect on consumers, since they are unable to differentiate between products with different nutritional contents when purchasing. Consumers demand accurate and fast quality control in the different phases of the manufacturing process of these sausages. Hence, near infrared spectroscopy (NIRS) has emerged as a tool for quality assurance by determining the basic nutritional compounds that make up the product: it is quick, reliable, requires no chemicals and is easy to operate (Thyholt, Indahl, Hildrum, & Ellekaer, 1997). NIR technology is used in the meat industry for proxi- mate analysis. Specific instruments are available to deter- mine the fat, moisture and protein contents of ground meat and meat products (Osborne, 2000). How the sample is handled in relation to the instrument is critical in NIR analysis. Flexibility of measurement modes may be important to the success of developing a method (Stark & Luchter, 2003). Therefore, in this study, a NIR instrument was sought that could be quickly adapted in order to analyse the various different phases in the manufacturing of the target product (‘‘salchicho´n’’), that is to say, minced sausage meat, homogenised sausage meat, and the cured product. Hence, we opted for a Perten diode array reflectance spectrometer (DA-7000 model) since the measurements are very quick and non-invasive, covering the range 400–1700 nm. Solberg (2000) used reflectance measurement with a Per- ten DA-7000 on unskinned and filleted salmon. She stated that it might be possible to grade the whole salmon and sal- mon fillets on-line with greater accuracy according to the fat content. Subsequently, Solberg (2003) studied the use of this diode-array NIR measurement as a screening method to determine the crude fat content in live-farmed Atlantic salmon, making it suitable for on-line analysis. Anderson and Walker (2003) studied the incorporation ability of Perten DA-7000 VIS/NIR analysis of ground beef for process control and they concluded that the equip- ment is suitable for on-line measurements. Using the same diode-array NIR analysis in the meat industry, Fumie`re, Sinnaeve, and Dardenne (2000) investigated how to differ- entiate between ‘slow-growing’ and ‘industrial’ chicken strains. These authors discuss the possibility of integrating the technique into an analytical system of surveillance for certified meat products. Chan, Walker, and Mills (2002) used this NCR instrument to assess the quality of fresh pork loin. They obtained calibration models for moisture, fat and protein contents, concluding that NIR reflectance can be used to predict some quality traits for whole fresh raw pork chops. Geesink et al. (2003) also achieved high- quality predictions for pork quality attributes using NIRS, but with a different spectrometer. Our study measured visible/near-infrared spectra in the fresh sausage meat – minced and homogenised – used for manufacturing dry-cured pork sausages (‘‘salchicho´n’’). Spectra from the finished product (cured, then fermented and ripened) will be discussed in a later paper. Our aim was to evaluate the accuracy of prediction models for fat, moisture and protein, using four sample presentations with a diode array Perten DA-7000 spectrometer, and to study the most suitable sample presentation. 2. Material and methods 2.1. Raw material/preparation 2.1.1. Meat and experimental design The pork meat used consisted of lean meat from the breeds most commonly used in Spain for manufacturing sausages. These breeds were Iberian and Standard. The Iberian pigs were obtained from a set of individuals regis- tered in the Iberian breed genealogical catalogue. The Stan- dard pigs were obtained from known herds of Landrace pigs. As soon as the meat was received from the slaughter- house it was immediately frozen and stored that way until the experiments began. In order to study a wide range of variability on the raw material most commonly used in the Spanish meat indus- try, in this study, two trials (manufacturing stages) were designed, and treatments using different percentages were set up as follows: Trial 1: Five treatments were set up for different combi- nations of meat from Iberian (I) and/or Standard(S) pork. These treatments were A (100% I), B (75% Table 1 Iberian and Standard pork used in each treatment Treatment A B C D E Iberian (kg) 18 (100%) 13.5 (75%) 9 (50%) 4.5 (25%) 0 (0%) Standard (kg) 0 (0%) 4.5 (25%) 9 (50%) 13.5 (%) 18 (100%) 1032 V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 I–25% S), C (50% I–50% S), D (25% I–25% S) and E (100% S). Trial 2: The same design was repeated after 8 days. In each trial, 45 kg of Iberian pork and 45 kg of Standard pork were used in the proportions indicated in Table 1. 2.1.2. Meat additives Standard additives commonly used in the Spanish meat industry were also applied in our experiments and included in the sausage meat. In each treatment (18 kg) the follow- ing were included: fine salt (400 g), dextrose (18 g), thyme (36 g), nitrifier (36 g), wine (0.35 l), garlic (90 g), ground black pepper (45 g), polyphosphate (18 g) and ascorbic acid (9 g). These additives improve the ripening process and produce very specific sensorial effects on the smell, taste and flavour. 2.2. Meat processing and sampling In this study, we used the same ingredients and standard procedures as are commonly applied by the Spanish meat industry when manufacturing ‘‘salchicho´n’’ sausage. For this reason, all the stages were carried out in the meat pro- cessing plant of the IFAPA research centre. 2.2.1. Minced meat samples Raw meats, from both animal origins (Iberian and Stan- dard), were thawed at room temperature, subsequently and separately, and then ground with a meat grinder (Sam- micC210, Mod. G85 R-Olotinox 22). The ground meat was then mixed manually for 15 min and then mechanically with a kneader-mixer (Mainca, Equipamientos ca´rnicos S.L., Mod. BM 35) for 20 min. At this time the additives were added, according to the Martin–Bejarano formula (Martı´n, 1992). The sausage meat was then left to rest at 4 C176C for 24 h. Ten samples of each treatment were then immediately set up (300 g/sample), giving 50 samples for each trial or 100 samples for the whole study. After the minced samples were analyzed by NIRS, they were kept frozen (C020 C176C) prior to further analysis. 2.2.2. Homogenised meat samples In order to observe the effect of homogenisation on the accuracy of the NIR predictive models, the minced samples were thawed and homogenised using a standard commer- cial blender (MoulinexC210) equipped with horizontal blades, and shortly afterwards they were also analyzed by NIRS. Thus, a total of 100 homogenised meat samples were made (50 samples/period). 2.3. Spectra acquisition 2.3.1. Spectrometer The instrument used for spectra acquisition was a Diode Array NIR/VIS (Perten 7000, Perten Instrument, Hudd- inge, Sweden), which uses two diode arrays, simultaneously processing records of light reflected from a sample by the diode sensors. The first array detects from 400 to 950 nm, and the second from 950 to 1700 nm. The spectrometer interpolates the date to produce one point at every 5 nm from 400 to 1700 nm, giving a 261 data point spectrum. Accordingly, the DA-7000 takes a spectral measurement every 1/30 s, and 30 spectral readings were measured and averaged. When the computer processing time is factored in, the sampling time for the instrument is approximately 2 s. The DA-7000 emits a chopped, high intensity white light from a tungsten halogen lamp that is inside a cabinet. The light is directed at an angle through a rectangular win- dow toward the sample, which reflects light back down through the rectangular window into the detection module. The instrument design allows two modes of analyses: ‘‘Down-view’’ and ‘‘Up-view’’. The first uses a circular cap- sule with a diameter of 12.7 cm, taking spectral informa- tion at different points of the sample when the capsule spins. In order to use the second mode, the instrument was inverted and the sample was placed directly over a quartz window with a diameter of 12.7 cm. Fig. 1 shows both modes of analysis. 2.3.2. Sample presentation All the samples used in this study were analysed by both modes of analysis explained above. Two types of products were scanned with the two modes of analysis (minced and homogenised). Therefore, four sample presentations were used. First, the usage meat was mixed with the additives and then minced, thus obtain- ing ‘‘minced fresh sausage meat’’. This was the first prod- uct, which used for sample, presentations MD and MU (Minced ‘Down-view’ and Minced ‘Up-view’, respectively). Next, the ‘‘minced fresh sausage meat’’ was homogenised, giving ‘‘homogenised fresh sausage meat’’ for the HD (Homogenised ‘Down-view’) and HU (Homogenised ‘Up- view’) presentations. 2.3.3. Spectra Since the experiment was repeated twice in different peri- ods or phases, a total of 100 samples of each sample pre- sentation were scanned. Thus, 400 samples were analysed by 197 NIRS. All sample spectra were collected five times; thus a total of 2000 spectra were taken for this study. Subsequently, the spectral data treatment was performed on the average spectra. When taking spectra in the Up-view mode, each sample was placed on the uppermost spectrometer window as a flat coating, 2–3 cm thick, and the minced sausage meat was spun after every scan. For the Down-view mode, samples were inserted into the round spinning capsule, and the minced sausage meat was shaken after each scan. A similar procedure was followed to obtain spectra from the homog- enised sausage meat. V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 1033 2.4. Chemical analysis Once the spectral information was acquired, a repre- sentative amount of each sample was obtained (50 g), and then transported to the Regional Laboratory of the Department of Agriculture and Fishing (Andalusia’s Regional Government), located at the ‘‘Alameda del Obispo’’ campus, where the nutritional parameters fat, moisture and protein were determined. Official meat and meat product analysis methods were used (MAPA, 1993), in accordance with the ISO-1443 standard in order to determine fat, and the international standards ISO-R- 1442 and ISO R-937, in order to determine moisture and protein respectively. 2.5. Data analysis 2.5.1. General Spectra were exported to WinISI III file (v1.50, Infrasoft International, Port Matilda, PA, USA) for data processing and statistical techniques were applied. The chemometric analysis procedure consists of the following steps. 2.5.2. Spectral data quality In order to obtain a representative and quality spectrum per sample, the RMS (root mean squared) statistic was used (Shenk & Westerhaus, 1995a, 1995b), which calculates the similarity between different spectra of a sample, mini- mizing the various sources of error. In the present study, five spectra per sample were obtained, using the following expression in order to calculate them RMSj ¼ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiP n i¼1ðYij C0Y 2iÞ n s where n is the number of data (absorbance readings), Yij is the absorbance value log(1/R) for the sub-sample j at wavelength i (ki) and Yi is the absorbance value log(1/R) for the average spectrum of a sample at wavelength i(ki). The RMS value obtained in each case was multiplied by 106 in order to avoid working with excessively small values. In order to determine a RMS cut-off value in each sam- ple presentation, the average RMS value was calculated, along with the standard deviation (STD) per sample STD ¼ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi XN j¼1 ðRMSjÞ2 N C01= vu ut ¼ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi XN i¼1 Xn j¼1 ðYij C0YiÞ2 nðN C01Þ= vu ut where N is the number of sub-samples. Since the expression of STD (error variance) follows a v2 distribution, a limit was used STDlimit ¼ 1:036C2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi XK¼m K¼1 STD2K m= vu ut ¼ 1:036C2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi STD2 q where m is the number of samples. The STDlimit values were used to obtain RMScut off. Thus, any spectra in a sample that were above this limit were eliminated, and recalculations were performed until all the values found were below the RMScut off. 2.5.3. Principal component analysis Principalcomponentanalysis(PCA)wasusedtodevelop a study of the spectral population, before developing the predictive models.This analysis eliminatesredundant infor- mation resulting from high correlations between absorban- cies in different regions of the spectra. Therefore, a linear combination of variables is defined, in a benchmark system in which the axes are linearly independent. Thus, the initial information is synthesised, by reducing the number of vari- ables, explaining the same variability practically. Once the PCA was carried out on each sample presenta- tion, the centre of the spectral populations was determined in order to detect anomalies and samples with the charac- teristic behaviour. These anomalies could have a detrimen- tal effect on the quality of the calibration models (Pizarro, Esteban-Dı´ez, Nistal, & Gonza´lez-Sa´iz, 2004). After the centre of each population was calculated, the distance of each sample from the centre was subsequently determined. The Mahalanobis distance (H) (Otto, 1999) Fig. 1. Perten DA-7000 instrument modes of analysis (A: Down-view; B: Up-view) used in the spectral acquisition. 1034 V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 was used, and the limit established for a sample to be con- sidered anomalous was H > 3 (Shenk & Westerhaus, 1996). 2.5.4. Calibration and validation The collective employed in each sample presentation (N = 100 samples) was divided into two groups. The first one was constituted by 80 samples (calibration set) and they were used to develop the predictive models. The sec- ond one (validation set) consisted of 20 samples and they were used to validate the models. These samples were ran- domly selected, taking two of each of the five treatments (A, B, C, D and E) in each of the two periods described in Sections 2.1 and 2.2. First, calibration models were produced using modified partial least squared (MPLS) regression with internal cross validation (six cross validation groups) to avoid overfitting (Shenk & Westerhaus, 1995a, 1995b). For each of the four sample presentations, 20 equations were determined for each parameter, as a result of the different derivative and scattered radiation correction treatments applied to the spectra (Fig. 2). Once the best MPLS models had been selected for each parameter in each sample presentation, with a specific combination of treatments, regression models were applied to the principal components (PCR) using the same combination in order to compare the two calibra- tion strategies. The criteria used to select the best models were few stan- dard errors and a high regression coefficient of determina- tion, both in calibration (SEC, R2) and in cross validation (SECV, r2) (Workman, 2001). Furthermore, in order to evaluate the predictive ability of the calibration models, the residual predictive deviation (RPD) was used. The RPD is the relationship between the standard deviation (SD) of the population’s reference values and the standard error of cross validation (SECV). If the RPD > 3, the pre- dictive ability of the model could be considered very good (Williams & Sobering, 1996). In calibration, the software identifies chemical anoma- lies (T), that is to say, samples in which the reference values differ from those predicted by NIRS. These anomalies are identified using the student’s T statistic (quotient between the difference between the reference and the predicted value and the SEC). Samples with a value T > 2.5 were consid- ered chemically anomalous. The behaviour of the external validation group used in the different models was evaluated using the standard error of prediction (SEP) and the coefficient of determination in external validation ðR2EVÞ (Westerhaus, Workman, Reeves, & Mark, 2004). 3. Results and discussion 3.1. Reference values The reference values employed for developing the pre- dictive models were obtained from chemical analyses car- ried out at the Regional Laboratory of the Department of Agriculture and Fishing (Andalusia’s Regional Govern- ment) (Section 2.4). Table 2 shows the average values, standard deviation and the range of reference values for the three constituents analysed (fat, moisture and protein), for both the calibra- tion and validation sets. When the minced sausage meat was stuffed into artificial guts to complete the process of fermentation and ripening over 21 days in order to obtain the traditional dry-cured sausage,themeanvaluesforfat,moistureandproteinchan- ged approximately to 31%, 35% and 27%, respectively. Therefore, the average values for fat and protein in dry material should be approximately 48% and 42%, respec- tively. Bearing in mind the average values of these parame- ters, according to the Spanish legislation governing quality categories based on analytical composition, they would be classified as extra quality (BOE 21/03/1980). However, the experimental group, as a whole, spans a wide range, Fig. 2. Flow chart of derivative treatments and scatter corrections applied to the spectra. Table 2 Reference values of the calibration and validation sets Constituent Calibration set Validation set N Mean SD Range N Mean SD Range Fat (%) 80 20.27 7.31 8–31.7 20 20.29 7.44 9.5–30.9 Moisture (%) 80 58.94 5.3 50.2–68.4 20 58.89 5.48 51–67.1 Protein (%) 80 16.7 2 12.7–20.5 20 16.9 2.28 13.9–21.6 V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 1035 representingagreatdealofthevariabilityfoundintheman- ufacturing of these sausages in the Spanish meat industry. 3.2. Root mean squared (RMS) values The procedure described in Section 2.5.2 was used to obtain a cut-off value for the RMS statistic (RMScut off). Table 3 shows the RMScut off values obtained in the differ- ent sample presentations, together with the percentage of spectra eliminated in each of them by surpassing the said limit (RMScut off). The Up-view analysis mode establishes very slight differ- ences between RMScut off values; however, major differ- ences were observed between the two types of samples with the Down-view mode. Therefore, this mode has greater sensitivity in the acquisition of spectra with regard to product variation. On the other hand, lower RMScut off values were obtained using the Down-view analysis mode on both types of products. So, this analysis mode gives greater similarity between the spectra of a single sample (lower RMScut off values). Once the spectra that were over the RMScut off value were eliminated, the average was obtained of the rest of the spectra in each sample in order to obtain a represen- tative spectrum of the samples. As seen in Table 3, the per- centage of spectra eliminated in each sample presentation was between 21.4% (MD) and 23.5% (HU). Bearing in mind that, in each sample presentation, a total of 500 spec- tra were obtained, over 100 were eliminated from each of them. Despite this, no sample was completely eliminated, since at least one of them had two spectra readings. 3.3. Spectra interpretation Fig. 3 shows the average spectra of the four sample presentations. All the spectra were trimmed at the ends (400–515 nm; 1650–1700 nm) because of the low repeatability in these areas. The four presentations follow similar patterns, although agrouping into producttype (minced and homog- enised) can be discerned, with visual differences between the two. This grouping is more noticeable for minced samples, with minor differences between the average spectra ana- lysed with both modes of analysis (MD and MU). A visual study of spectra revealed that there were funda- mentally four important absorption bands in the four sam- ple presentations. In the visible band, there was one particularly noticeable band, between 560 and 585 nm. Within this range, absorptions are found related to muscle pigments (Cozzolino, Barlocco, Vadell, Ballesteros, & Gal- lieta, 2003; Cozzolino & Murray, 2004). Hence, this band can be explained by the blue region of the spectrum due to heme proteins, oxymyoglobin and myoglobin (Cozzo- lino & Murray, 2002; Mitsumoto, Maeda, Mitsuhashi, & Ozawa, 1991). Within the 965–1020 nm range, an absorption band in the transition area of the visible to near infrared zone is detected. This band is most likely due to water (Osborne, Fearn, & Hindle, 1993), related to the third overtone (Coz- zolino & Murray, 2004). In the NIR region, an absorption band 1195–1230 nm is observed, with a peak at 1215 nm. At wavelengths close to 1200 nm, the CAH bonds,which are afundamentalconstit- uent of fatty acid molecules, absorb strongly (Willians & Norris, 1987). Specifically, Shenk, Workman, and Wester- haus (2001) link the place, where the greatest intensity is achieved in this band (1215 nm) with the structure of CH2. These authors relate the absorbancies of 1195 nm and 1225 nm to CH3 and CH2, respectively. So, around 1200 nm, significant information is found related to fat (CH stretch second overtone). The final important band was observed at around 1450 nm. Shenk et al. (2001) relate this region to combination bands of the bond CAH (CH2 at 1440 nm and aromatic structure at 1446 nm), OH stretch first overtone and C@O stretch third overtone (1450 nm), andNHstretchfirstovertone(ureaat1460 nmandCONH2 at 1463 nm). In meat products, this band has been linked with water due to the OH bond (Cozzolino & Murray, 2004; Hoving-Bolink et al., 2004; Leroy et al., 2003; Liu & Chen, 2001; Realini, Duckett, & Windham, 2004). 3.4. Principal component analysis Principal component analysis (PCA) was applied to the over group of each presentation. The Mahalanobis distance was calculated from the centroid of each sample, Table 3 RMScut off and percentage of eliminated spectra (>RMScut off) in the sample presentations studied Up-view mode Down-view mode RMScut off %Spectra > RMScut off RMScut off %Spectra > RMScut off Minced samples 25,500 21.6 20,000 21.4 Homogenized samples 26,500 23.5 10,500 222.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 515 715 915 1115 1315 1515 Wavelength (nm) l o g ( 1 / R ) MD MU HD HU Fig. 3. Mean spectra of four sample presentations studied: Minced Down- view (MD), Minced Up-view (MU), Homogenized Down-view (HD) and Homogenized Up-view (HU). 1036 V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 defined by its population. By applying the limit discussed in Section 2.5.3 (H > 3), the possible appearance of spectral outliers was detected. An anomalous sample only occurred in one sample presentation (Minced Up-view, MU) although, in minced samples analysed in the Down-view mode, two displayed a value very close to the limit (H = 2.98). This same situation also occurred in a homog- enised sample analysed in the Down-view mode (H = 2.93). Togersen, Isaksson, Nilsen, Bakker, and Hildrum (1999) did not discover any apparent outliers in the PCA they conducted on meat samples (fresh ground pork and beef). The number of principal components (PCs) recom- mended by the software varied between 9 (minced samples, Down and Up-view) and 10 (homogenised samples, Down and Up-view). In all cases, the variance explained by the PCs selected was found to be close to 100% (from 99.5% for MU to 99.7% for HD and HU). Fig. 4 shows the evolu- tionofthevarianceexplainedbythePCAasPCswereadded. Cozzolino and Murray (2004), when carrying out a PCA on animal meat muscle samples (100 of beef and 140 of lamb), obtained similar variance accumulated as the PCs wereadded.Forinstance,withthefirstthreePCs,Cozzolino and Murray (2004) obtained 95% of variance explained. In this study, the first three PCs explained an accumulated variance of between 93.2% (HD) and 96.3% (MD). 3.5. Prediction equations 3.5.1. Characterisation of predictive models The treatments described in Section 2.5.4, were then applied in order to calculate the equations in each sample presentation. The greatest number of samples excluded in the calibra- tion development process because of chemical anomalies (T) occurred in the MU samples. This number is deter- mined by subtracting the number of samples selected for each predictive model and the number of spectral anoma- lies (H) from the initial calibration group (80). This is due to the greater heterogeneity of the minced samples, and the different strategies that the instrument used to store information, depending on which analysis mode was used (Down or Up-view). Table 4 shows the characteristics of the equations selected for each constitution, along with the number of samples that make up each model (N), the number of fac- tors or regression terms, type of regression (PCR or MPLS regression) and mathematical treatment applied to the sig- nal (derivatives and scatter correction). There was no homogeneity observed with regard the number of factors that made up the models – varying between 2 and 9 – or in the derivative treatment used on the signal. The regression method used for all the equations selected was minimum partial least squares (MPLS), except for the constituent fat in minced samples (Down and Up- view), in which principal component regression achieved better results. The scatter correction treatment selected was SNVDT, except for fat in MU, where MSC treatment achieved bet- ter behaviour. Chan et al. (2002) obtained PLS predictive models of fat, moisture and protein from whole pork loin samples with a Perten DA-7000 spectrometer in the Up-view mode. Their best calibration models were a 10,13,12-factor PLS model for fat, moisture and protein, respectively, with first and second derivative pre-processing. In this study, the PLS factors with the Up-view mode ranged from 2 to 4 PLS; therefore the complexity of the models was lower. On the other hand, in the selected mod- els, greater variation was found with regard to types of derivative treatments (none, first, second and third) when compared to those applied by Chan et al. (2002), who selected first and second derivatives. 40 50 60 70 80 90 100 110 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Principal Components Varianza Accumulated (%) MD MU HD HU Fig. 4. Accumulated variance of each sample presentation with the addition of the principal components. Table 4 Characterisation of selected equations for each sample presentation (Minced Down-view MD, Minced Up-view MU, Homogenised Down- view HD, and Homogenised Up-view HU) and constituent MD MU HD HU Fat N 77 74 77 77 Factors 7 3 3 4 Regressiona PCR PCR MPLS MPLS Derivative 2,4,4 3,10,5 2,4,4 0,0,1 Scatter correctionb SNVDT MSC SNVDT SNVDT Moisture N 77 75 79 78 Factors 6 2 9 3 Regressiona MPLS MPLS MPLS MPLS Derivative 2,4,4 2,5,5 0,0,1 3,5,5 Scatter Correctionb SNVDT SNVDT SNVDT SNVDT Protein N 78 75 77 79 Factors 5 4 2 2 Regressiona MPLS MPLS MPLS MPLS Derivative 1,4,4 1,5,5 2,4,4 2,5,5 Scatter correctionb SNVDT SNVDT SNVDT SNVDT a PCR: principal component regression; MPLS: modified partial least squared. b SNVDT: standard normal variate and de-trending; MSC: multiplica- tive scatter correction. V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 1037 Anderson and Walker (2003) also applied second deriv- atives in order to obtain on-line analysis PLS models for ground beef with nominal 50% and 15% fat contents. These authors also used a Perten DA-7000 spectrometer, with special position, similar to the Down-view mode. Fumie`re et al. (2000) used similar spectral treatments (scatter corrections and derivatives) to those used in this study in their attempt to authenticate cut pieces of chicken meat, using a Perten DA-7000 in the Up-view mode. In this case, their best models were obtained with first and second derivatives, along with SNV and SNVDT scatter correc- tions (legs with skin 1,5,3-SNV; skinless breasts 2,1,1- SNVDT; carcasses with skin 1,5,3-SNV). 3.5.2. Evaluation of predictive models 3.5.2.1. General. Table 5 shows the statistics of the equa- tions designed to predict fat, moisture and protein, both in calibration and validation (cross and external), for the four sample presentations. 3.5.2.2. Differences between constituents (fat, moisture and protein) and products (homogenized and minced) on the predictive models. With regard to the nutritional parame- ters fat and moisture, the coefficients of determination (R2) selected for both calibration and validation were over 0.9 in all the equations. Shenk and Westerhaus (1996) reported that any equations with values achieved that were equal to or higher than this value were extremely accurate. So far, from the other statistics used to evaluate the models (SEC, SECV, RPD and SEP), we can see that there are dif- ferences between the homogenised and minced sample pre- sentations. The homogenised samples presented models with lower typical errors (SEC, SECV and SEP), and higher RPD values, and are therefore more robust models. Consequently, greater heterogeneity is the product entailed a loss of accuracy in the equations; the highest typical error or prediction was obtained for the minced samples ana- lysed in the Up-view mode (SEP = 1.41%). This loss of accuracy in the prediction models for fat in minced product versus homogenised product was also observed for moisture, as we can see in Table 5. The great typical error obtained for this constituent was SEP = 1.01%, lower than that for fat (SEP = 1.41%). This comparison is made in absolute values, since the predictive range of fat is higher than that for moisture (fat 8.2–31.7% vs. moisture 50.2–68.4%); hence these prediction errors will be of a similar magnitude if the model’s predictive range is taken into account. The statistics obtained in the different sample presenta- tions for the nutritional compound protein did not reveal any differentiation between homogenised and minced sam- ples, as they did for fat and moisture. In calibration and cross validation, lower values were found for the typical errors, SEC = 0.51–0.57%, SECV = 0.53–0.65%, of the three predicted constituents. However, once again, it is important to underline that this assessment of the typical errors was carried out in terms of absolute values, since the predictive range in protein is considerably lower than that for moisture, and especially for fat. Furthermore, lower typical errors of prediction in external validation (SEP) were obtained for the parameter moisture (SEP = 0.76–0.77%) At the same time, the coefficients of determination obtained for protein in the four sample pre- sentations (both in calibration and cross and external vali- dation) were the lowest of the three constituents. The predictive capacity of the models selected for protein might be lower than those of fat and moisture. This evaluation gains greater force when observing the RPD statistic, Table 5 Statistics of selected equations in calibration (standard error of calibration, SEC; coefficient of determination in calibration, R2), cross validation (standard error of cross validation, SECV; coefficient of determination in cross validation, r2; residual predictive deviation, RPD) and external validation (standard error of prediction, SEP; coefficient of determination in external validation, R2EV) Range (%) SD Calibration Validation SEC (%) R2 Cross External SECV (%) r2 RPD SEP(%) R2EV Fat (%) MD 8–31.7 7.36 1.28 0.97 1.35 0.97 5.45 1.38 0.97 MU 8–31.7 7.34 1.16 0.98 1.17 0.97 6.27 1.41 0.97 HD 8–31.7 7.29 0.8 0.99 0.87 0.99 8.38 0.94 0.98 HU 8–31.7 7.26 0.81 0.99 0.89 0.99 8.16 1.18 0.98 Moisture (%) MD 50.2–68.4 5.37 0.74 0.98 0.95 0.97 5.65 1.01 0.97 MU 50.2–68.4 5.32 0.95 0.97 0.99 0.96 5.37 1 0.97 HD 50.2–68.4 5.31 0.71 0.98 0.84 0.98 6.32 0.77 0.98 HU 50.2–68.4 5.27 0.73 0.98 0.79 0.98 6.59 0.76c 0.98 Protein (%) MD 13.6–20.5 1.97 0.54 0.93 0.61 0.9 3.23 0.83 0.87 MU 13.7–20.3 1.9 0.56 0.91 0.65 0.88 2.92 0.84 0.87 HD 13.6–20.5 1.98 0.51 0.93 0.53 0.93 3.74 0.87 0.86 HU 13.6–20.5 1.96 0.57 0.92 0.6 0.91 3.27 0.87 0.86 1038 V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 which gave the lowest values for protein. Even the equation selected for protein for the minced samples analysed in the Up-view mode (MU), yielded a value that was just below (RPD = 2.92) the limit established by Williams and Sober- ing (1996) (RPD > 3) for a model to be classified as having very good predictive characteristics. Anderson and Walker (2003) obtained predictions for fat using ground beef in a sample presentation similar to the Minced Down-view (MD) used in this study, as well as a similar variation range (Anderson et al., 7.2–24.4% vs MD, 8–31.7%). They obtained values of r2 = 0.96 and SECV = 1% (cross valida- tion), and R2EV ¼ 0:83 and SEP = 2.15% (external valida- tion). Comparing these values with those shown in Table 5 for the MD sample presentation, a great similarity is observed between the values for r2; Anderson and Walker (2003) obtained lower values for SECV (Anderson et al., SECV = 1% vs. MD, SECV = 1.35%). However, the values obtained in the present study in external validation (SEP), were considerably lower (Anderson et al., SEP = 2.15% vs. MD, SEP = 1.38%). This loss of accuracy could be due to the fact that Anderson and Walker (2003) designed a spe- cific analysis device adapted to a transportation line, and did not use the natural position of the equipment. Chan et al. (2002) included predictions of fat, moisture and protein in their study of pork quality characteristics, using the Up-view mode. The values obtained in cross vali- dation(r2)were0.76,0.8and0.69,andSECV,0.62%,0.58% and0.43%,respectively,forfat,moistureandprotein.Inthe sameorder,inexternalvalidation,theyobtainedR2EV of0.61, 0.69 and 0.7, and SEP of 0.62%, 0.63% and 0.42%. Table 4 (Up-view modes: MU, HU) shows how, in both cross vali- dation (r2)andexternalvalidationðR2EVÞ,bettercorrelations wereobtainedbetweenpredictedandobservedvalues,inthe threeconstituents,thanthoseobtainedbyChanetal.(2002). However, the values obtained by these authors for SECV and SEP were lower than those obtained in this current study with MU and HU for the three constituents, and clo- ser to those obtained for the homogenised product (HU). These differences are partly rooted in the fact that Chan et al. (2002) used pork loin samples, a more homogeneous product than that used in this study, but were mainly due to the lower range of variation and standard deviation of their reference values, especially for moisture (range 67.1–79%, SD = 1.37%) and fat (range 19.3–24.3%, SD = 0.8%), as we can see Table 5. Kang, Park, and Choy (2001) obtained predictions for fat, moisture and protein in ground pork sausages using a NIR spectrophotometer with a greater scanning range (400–2500 nm). Their reference values were very similar to those described here. The results obtained in the equa- tions were also similar to the minced sample presentations (MD, MU), although less accurate. This can be quantified by comparing the values for MD and MU (Table 5) in external validation with those obtained by Kang et al. (2001); they obtained R2Ev of 0.88, 0.93 and 0.54 for fat, moisture and protein, respectively, and SEP of 1.53%, 1.15% and 1.12% in the same order. 3.5.2.3. Differences between modes of analyses (Down-view and Up-view) on the predictive models. To appreciate simi- larities and differences between both modes of analyses (Down and Up-view modes) for the three nutritional parameters predicted, the SEC (calibration stage), SECV (cross validation stage) and SEP (external validation stage) are inspected in Table 5. The differences between the two modes of analysis for the constituent fat in homogenised samples were barely noticeable in calibration (SECHD = 0.8% vs. SECHU = 0.81%) and cross validation (SECVHD = 0.87% vs. SECVHU = 0.89%). On the other hand, the difference in accuracy of the models in external validation is taken into account, and the Down-view analysis mode gave lower pre- diction errors (SEPHD = 0.94% vs. SEPHU = 1.18%). In the predictions of fat in the minced product, the Up-view mode gave better values in calibration (SECMD = 1.28% vs. SECMU = 1.16%) and cross validation (SECVMD = 1.35% vs. SECVMU = 1.17%). However, the behaviours of the prediction models in external validation were similar for both modes of analysis (SEPMD = 1.38% vs. SEPMU = 1.41%). For the parameter moisture, the values observed were notably different between the two modes of analysis for any statistic in the homogenised product (Table 5). In the minced product, the Down-view model selected for moisture particularly stood out, yielding better values in calibration (SECMD = 0.74% vs. SECMU = 0.95%), but barely noticeable differences in cross (SECVMD = 0.95% vs. SECVMU = 0.99%) and external validation (SEPMD = 1.01% vs. SEPMU = 1%). For protein, in both the homogenised and minced products, a slight improvement of the model used with Down-view was observed in calibration (SECHD = 0.51% vs. SECHU = 0.57%;SECMD = 0.54% vs. SECMU = 0.56%) and cross validation (SECVHD = 0.53% vs. SECVHU = 0.6%; SECVMD = 0.61% vs. SECVMU = 0.65%), although identical values were acquired in external validation (SEP = 0.87%) for the homogenised product, and practi- cally identical values for the minced product (SEPMD = 0.83% vs. SEPMU = 0.84%). Thus, for the homogenised samples, when dealing with fat predictions, it seems slightly more advisable to use the Down-view rather than the Up-view mode of analysis, given the differences in behaviour of the external predic- tion models (evaluated by SEP). These differences are not really noticeable in moisture and protein predictions for the homogenised product, or for the three constituents in the minced product. Hence, in this case, it would be more advisable to use the mode that allows less handling of the product as well as greater simplicity of analysis. Given these criteria, it would be sensible to use the Up- view mode of analysis, since it would only be necessary to place fresh meat mass on the circular glass plate (Fig. 1B) in order to analyse it, without having to put it into an analysis device (capsule) as with the Down-view mode. V. Ortiz-Somovilla et al. / Food Chemistry 101 (2007) 1031–1040 1039 Acknowledgements Sample preparation and manufacturing was mainly car- ried out at CIFA-Palma del Rı´o. We thank the meat pro- cessing plant staff at CIFA-Palma del Rı´o for their cooperation. We are also extremely grateful to the staff at the Food Technology Laboratory of CIFA-Alameda del Obispo, for their assistance during sample preparation and data collection. This work was financially supported by the INIA project, number CAL00-001. References Anderson, N. M., & Walker, P. N. (2003). Measuring fat content of ground beef stream using on-line visible/NIR spectroscopy. Transac- tions of the ASAE, 46, 117–124. BOE 21 marzo. (1980). Orden 7 febrero, por la que se regula la norma de calidad para productos ca´rnicos embutidos crudos-curados en el mercado interior. Chan, D. E., Walker, P. N., & Mills, E. W. (2002). Prediction of pork quality characteristics using visible and near-infrared spectroscopy. 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Pe´rez-Aparicio b, E.J. De Pedro-Sanz c a IFAPA-Center ‘‘Alameda del Obispo’’ (Postharvest and Food Technology Area), P.O. Box 3092, E-14080 Co´rdoba, Spain b IFAPA-Center ‘‘Palma del Rı´o’’ (Postharvest and Food Technology Area), Av. Rodrı´guez de la Fuente s/n, 29-14700, Palma del Rı´o, Co´rdoba, Spain c University of Co´rdoba, Campus Rabanales, Department of Animal Production, E-14014 Co´rdoba, Spain Received 14 July 2006; received in revised form 16 May 2007; accepted 2 July 2007 Abstract Near infrared spectroscopy technology (diode array instrument) was used to study the feasibility of applying quality controls to typ- ical Spanish sausages by performing a proximate analysis (fat, moisture and protein) on the finished product (intact and homogenized). This could be used to provide quality controls at various stages once the finished product was obtained: finished product, storage, dis- tribution and marketing. The selected models were calibrated and evaluated by cross and external validation. For intact products, coef- ficients of determination for calibration (R2) for fat, moisture and protein were 0.98, 0.93 and 0.97, respectively. These values for homogenised products were 0.99, 0.98 and 0.97, respectively. The standard errors of prediction (SEP) for external validation in intact products were 1.47%, 0.97% and 1.08% for fat, moisture and protein, respectively. In homogenised products, these values were lower: 0.71%, 0.41% and 0.95%, respectively. C211 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Dry-cured pork sausages; Proximate analysis; NIRS diode array; Quality control 1. Introduction Near infrared spectroscopy (NIRS) has proved to be a quick and effective tool in meat quality assessment (Monin, 1998). The first trials using NIRS technology on meat were performed over forty years ago, but the majority of research was carried out in the 1990s (Byrne, Downey, Troy, & Buckley, 1998). A great deal of research has been carried out on pork aimed at evaluating technological quality and chemical composition (Brøndum et al., 2000; Chan, Walker, & Mills, 2002; Cozzolino, Barlocco, Vadell, Ballesteros, & Gallieta, 2003; Geesink et al., 2003; Gonza´lez-Martı´n, Gonza´lez- Pe´rez, Herna´ndez-Me´ndez, Alvarez-Garcı´a, & Herna´n- dez-Andaluz, 2002; Hoving-Bolink et al., 2004; Kang, Park, & Choy, 2001; Meulemans, Dotreppe, Leroy, Istase, & Clinquart, 2003). However, the literature contains rela- tively little information on the use of NIRS on cured pork products. There are only a few papers that look at this area, for example, to predict the texture and colour of dry-cured ham (Garcı´a-Rey, Garcı´a-Olmo, De Pedro, Quiles-Zafra, & Luque de Castro, 2005) and to study the effect of grinding on the colour and chemical composition of pork sausages (Kang et al., 2001). Dry-cured pork sausages are widely consumed in Spain, and the production of the typical ‘‘salchicho´n’’ sausage is particularly important. This sausage is obtained in the same way as other dry-cured sausages: mixing, casing, cur- ing and ripening. The Spanish sausages of pork meat are basically made from two breeds: Iberian and white pigs 0309-1740/$ - see front matter C211 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.meatsci.2007.07.005 * Corresponding author. Tel.: +34 957 016070; fax: +34 957 016043. E-mail address: antonioj.gaitan.ext@juntadeandalucia.es (A.J. Gaita´n- Jurado). www.elsevier.com/locate/meatsci Available online at www.sciencedirect.com Meat Science 78 (2008) 391–399 MEAT SCIENCE (Standard). The main difference is the amount and compo- sition of the fat, since the Iberian pigs feed freely on the fallen acorns and natural grass of the oaks forests of Spain. According to the Spanish quality standard (BOE 21/03/ 1980), the commercial category awarded to dry-cured sau- sages is mainly based on their fat, moisture and protein con- tent.Thefatandproteincontentdependsontherawmaterial used, which is not homogeneous, since the cuts of meat are obtained when the carcasses are carved up. The moisture content, which is inversely related to the fat content, will depend on the initial moisture, and the time and conditions in which the product is ripened. The levels of these constitu- ents in fresh sausage meat were already controlled using NIRS predictions (Ortiz-Somovilla, Espan˜a-Espan˜a, Gai- ta´n-Jurado, Pe´rez-Aparicio, & De Pedro-Sanz, 2007). The present study evaluates the accuracy of NIRS tech- nology to determine fat, moisture and protein content in the finished product (dry-cured sausages), both intact and homogenised. This study would enable NIRS technology to be adapted for the various control checks during the manufacturing and distribution processes. Hence, several different sample presentation forms have been studied, in addition to the vacuum-packed product. 2. Materials and methods 2.1. Meat and samples The pork meat used consisted of lean meat from the breeds commented above. The standard pigs were obtained from known herds of Landrace pigs, slaughtered at a sim- ilar age and weight (approximately six months and 95 kg). The Iberian pigs were obtained from a group registered in the Iberian breed genealogical catalogue. When these ani- mals were slaughtered, they were older and heavier than the Standard pigs used (approximately 13 months and 145 kg). As soon as the meat was received from the slaughter- house it was immediately frozen and stored at C020 C176C until starting the experiments. In this study, we used the same ingredients and standard procedures commonly applied by Spanish meat industry when manufacturing ‘‘salchicho´n’’ sausage. The samples were prepared at the meat processing plant of an IFAPA research centre in Cordoba. Two manufacturing stages (trials) were designed, each one with five treatments (A, B, C, D and E) using different percentages of Iberian and/or Standard pork. The first trial was set up as follows: A (100% Iberian), B (75% Iberian – 25% Standard), C (50% Iberian – 50% Stan- dard), D (25% Iberian – 75% Standard) and E (100% Stan- dard). The same design was repeated after eight days for the second trial. This approach along with the use of two types of pork meat (Iberian and Standard) and the treatments set up enabled us to obtain NIRS predictions for fat, moisture and protein that represent a wide range of variability found in the Spanish pork dry-cured sausages. The fresh sausage meat used for each trial was divided into portions: 300 g of each sample were used as the fresh product (Ortiz-Somovilla et al., 2007); and 300– 350 g were stuffed in artificial skins and then cured and ripened for 21 days, in order to obtain traditional dry- cured sausages (‘salchicho´n’), the target product of this study. Before the fresh sausage meat was stuffed into the skins, it was ground with a meat grinder (SammicC210, Mod. G85 R- Olotinox 22) and was subsequently mixed manually for 15 min, and then mechanically with a kneader-mixer (Mainca, Equipamientos Ca´rnicos S.L., Mod. BM 35) for 20 min. At this time were added additives (fine salt, dex- trose, thyme, nitrifier, wine, garlic, ground black pepper, polyphosphate and ascorbic acid), according to the Mar- tin–Bejarano formula (Martı´n, 1992). The sausage meat was then left to rest for 24 h at 4 C176C. In order to observe the effect of homogenisation on the accuracy of the NIRS predictive models, samples were homogenised using a standard commercial blender (Moul- inexC210) equipped with horizontal blades, then they were analysed by NIRS. Ten samples of each treatment (A, B, C, D and E) were set up, giving 50 samples per trial. 2.2. Sample management 2.2.1. Spectra acquisition The instrument used for spectra acquisition was a Diode Array NIR/VIS (Perten 7000, Perten Instrument, Huddin- ge, Sweden), which uses two diodes array simultaneously, the first array detects from 400 to 950 nm, and the second from 950 to 1700 nm. The spectrometer interpolates the data to produce one point at every 5 nm, giving a 261 data point spectrum. The DA-7000 takes a spectral measure- ment every 1/30 second, and 30 spectral readings were mea- sured and averaged. When the computer processing time is added, the sampling time for the instrument is approxi- mately 2 s. The instrument design allows for two modes of analysis: ‘down-view’ and ‘up-view’. The first mode uses a circular capsule of 12.7 cm in diameter, which takes spectral infor- mation at different points in the sample when the capsule spins. The spectrum obtained is the mean of all readings taken by this circular movement. Samples were inserted into the round spinning capsule and were shaken after each scan. For the second mode, the instrument was inverted and the sample was placed directly on the uppermost spectrom- eter quartz window (12.7 cm diameter) as a flat coating. There is no moving element during spectral acquisition. Hence, the mean of the readings is obtained from fixed position scans made of the sample, which is modified by the analyst after the spectrum is obtained. In the present study, five spectra per sample were taken. 392 A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 2.2.2. Sample presentation All the samples used in this study were analysed by both modes of analysis explained above (‘down-view’ and ‘up- view). Two types of cured products (sliced and homogenised) were scanned with the two modes of analysis. Therefore, four sample presentations were used. Firstly, the sausage meat was mixed with the additives and then minced. This product was divided into two portions. The first portion was used to carry out the study for fresh sausage meat pro- posed by Ortiz-Somovilla et al. (2007). The second portion was stuffed into artificial skins in order to obtain dry-cured sausages (‘salchicho´n’). This was cured and ripened, thus acquiring a ‘cured sliced product’, which was analysed using the SD (sliced down-view) and SU (sliced up-view) modes. For the SU sample presentation, samples were vac- uum packed as they are in shops and supermarkets. Finally, this product was homogenised, providing a ‘homogenised product’ to be analysed using the down-view (HD) and up-view (HU) modes. Fig. 1 schematises the four sample presentations analysed. The experiment was repeated twice at the different man- ufacturing stages. Thus, a total of 100 samples for each sample presentation were scanned. Therefore, 400 samples were analysed using NIRS. 2.3. Chemical analysis Once the spectral information was obtained for the homogenised samples, a representative amount of each sam- ple was selected (50 g), then the nutritional parameters fat, moistureandproteinweredetermined.Officialmeatproduct analysis methods were used (MAPA, 1993), in accordance with the ISO-1443 standard in order to determine fat, and the international standards ISO-R-1442 and ISO R-937 in order to determine moisture and protein, respectively. 2.4. Data analysis The spectra were initially processed using Simplicity software (Perten SimplicityC210). They were then exported to a WinISI III file (v1.50, Infrasoft International, Port Matilda, PA, USA) for data processing and statistical techniques were applied. The che- mometric analysis procedure consisted of the following stages. 2.4.1. Root mean square (RMS) In order to obtain a representative and quality spectrum per sample, the RMS (root mean square) statistic was used (Shenk & Westerhaus, 1995), which calculates the similar- ity between different spectra in a sample, using the follow- ing expression: RMSj ¼ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiP n i¼1ðYij C0Y 2iÞ n s where n is the number of data (absorbance readings), Yij is the absorbance value log(1/R) for sub-sample j at wave- length i (ki) and Yi is the absorbance value log(1/R) for the mean spectrum of a sample at wavelength i (ki). The RMS value obtained in each case was multiplied by 106 to facilitate value management and processing. To determine a cut-off value (RMScutoff) of each sample presentation form, the mean RMS was calculated along with standard deviation (STD) per sample. STD ¼ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi XN j¼1 ðRMSjÞ2=N C01 vu ut ¼ ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi XN i¼1 Xn j¼1 ðYij C0Y2iÞ=nðN C01Þ vu ut where N are the number of sub-samples. Since the expression of STD (error variance) follows a v2 distribution, a limit was used: STDlimit ¼ 1:036C2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi XK¼m K¼1 STD2K=m vu ut ¼ 1:036C2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi STD2 q where m is the number of samples. The STDlimit values were used to obtain the RMScutoff. Hence, the different sources of variation which might cause irregular spectra were controlled, since, any spectra in a sample that were above this limit were eliminated, and recalculations were performed until all the values were below the RMScutoff. Then, the mean spectrum of each sample was calculated. Dry-Cured Sausages Slicing Process (Cured Sliced Product) (S) Vacuum packed slices SU1 (N=100) Intact slices SD2 (N=100) Homogenising Process (Cured Homogenised Product) (H) HD2 (N=100) HU1 (N=100) 1 SU,HU: Slicedand Homogenised samples analysed by instrument design ‘Up-view’ 2 SD,HD: Slicedand Homogenised samples analysed by instrument design ‘Down-view’ Fig. 1. Sample presentations and types of samples. A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 393 2.4.2. Principal component analysis Subsequently, a principal components analysis (PCA) was carried out and the spectral population centres were determined for the experiment as a whole (in each of the sample presentation forms). After the centre of each population was calculated, the distance of each sample from the centre was subsequently determined. The Mahalanobis distance (H) (Otto, 1999) was used, and the limit established for a sample to be con- sidered spectral anomalous was H > 3 (Shenk & Wester- haus, 1996). The aim was to detect samples that displayed character- istic behaviour, as well as to apply other spectral filtering which would eliminate most anomalous spectra in conjunc- tion with the RMScutoff statistic. Consequently, redundant information resulting from high correlations between absorbencies in different regions of the spectra was excluded. Therefore, PCA defines a new variables which are linear combination of the previous, in a reference system in which the axes are linearly independent. Thus, the initial informa- tion is synthesised, by reducing the number of variables, explaining practically the same variability. 2.4.3. Predictive models 2.4.3.1. Calibration. For each sample presentation form, an initial calibration group of N = 80 was used. Firstly, calibration models were produced using modi- fied partial least squared (MPLS) regression with internal cross validation (six cross validation groups) to avoid over- fitting. For each of the four sample presentations, 20 equa- tions were determined for each parameter, as a result of the different derivative and scattered radiation correction treat- ments applied to the spectra (Fig. 2). Once the best MPLS models had been selected for each parameter in each sample presentation, with a specific com- bination of treatments, regression models with principal components (PCR) were applied using the same combina- tion in order to compare the two calibration strategies. The criteria used to select the best models were low stan- dard errors and a high regression coefficient of determina- tion, both in calibration (SEC, R2) and in cross validation (SECV, r2). Furthermore, in order to evaluate the predic- tive ability of the calibration models, the residual predictive deviation (RPD) was used. The RPD is the relationship between the standard deviation (STD) of the population’s reference values and the standard error of cross validation (SECV). If the RPD was >3, the predictive ability of the model could be considered very good (Williams & Sober- ing, 1996). In calibration, the software identifies chemical anoma- lous (T), that is to say, samples in which the reference val- ues differ from those predicted by NIRS. These anomalous were identified using Student’s t-statistic (quotient between the difference between the benchmark and the predicted value and the SEC). Samples with a value t > 2.5 were con- sidered chemically anomalous. 2.4.3.2. Validation. The external validation set consisted of N = 20. This group of samples was selected at random, fol- lowing a homogeneous distribution, in other words, two samples from each treatment (A, B, C, D and E) and each of the two manufacturing stages. The predictions of the external validation group obtained in the different models were evaluated using the standard error of prediction (SEP) and the coefficient of determination in external validation ðR2EVÞ. 3. Results and discussion 3.1. Reference values Table 1 shows the mean, standard deviation and range of reference values for the three constituents analysed (fat, moisture and protein), both for the calibration and the validation set. In their analysis of fresh sausage meat used for the same product as in this study, Ortiz-Somovilla et al. (2007) pre- sented fat and protein levels of 8–31.7% and 12.7–20.5%, respectively. Table 1 shows that the range of these constit- uents has increased owing to the loss of moisture that occurs during the ripening process. 3.2. Root mean square (RMS) The procedure described in Section 2.4.1 was used to obtain a cut-off value for the RMS statistic (RMScutoff). Table 2 shows the RMScutoff values obtained in the different sample presentations, together with the percentage of spec- tra eliminated in each of them by applying this limit. In the experiment, 500 spectra were obtained per sample presentation form, so the spectra eliminated varied between 95 (19%, HD) and 125 (25%, SU). In spite of this, no sam- ples were completely eliminated, since none had values that exceeded RMScutoff in all five spectral readings. Derivative1 0,0,1 1,4,4 1,5,5 1,10,5 2,4,4 2,5,5 2,10,5 3,5,5 3,10,5 3,10,10 Scatter Correction2 SNVDT MSC Equation number 1,2.....................20 1 #,#,#: Derivative order, gapsize, amount of smoothing 2 SNVDT: Standard Normal Variate and De-Trending; MSC: Multiplicative Scatter Correction Fig. 2. Flow chart of derivative treatments and scatter corrections applied on the spectra. 394 A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 In both modes of analysis (down and up), the lowest val- ues were obtained for the homogenised product, therefore differences between the spectra of a sample increased with heterogeneity (sliced samples). Differences between the up- and down-view modes of analysis were observed in relation to the establishment of RMScutoff in a specific product (sliced and homogenised). For both products, the RMScutoff increases when the up- view mode is used (Table 2). These differences are the result of the procedure used by the instrument to obtain spectral information during analysis (Section 2.4.1). The similarity between the spectra of a sample will be greater in the down-view than in the up-view mode, since, when the down-view mode is used, information of each spectrum has been obtained from numerous points in sam- ple, and then averaged in order to obtain the corresponding spectrum. In contrast, with the up-view mode, each spec- trum is obtained from a fixed position and so greater differ- ences are observed between successive spectra. Major differences were noted in sliced samples (down view: 30,000; up view: 80,000), since, in addition to the inherent differences in the mode of analysis during the spectra acqui- sition process, there is a further cause of variation: the fact that the samples were vacuum packed in plastic bags for the up-view mode. Espan˜a, Gaita´n, Ortiz, De Pedro, and Pe´rez (2004) analysed the same product (sliced), which was placed on trays and covered with a plastic film. Using a Foss NIRSystems 6500 spectrophotometer equipped with a fibre-optic probe module, they obtained an RMScutoff value of 60,000. Therefore, the RMScutoff value should be calculated sep- arately for homogenised and intact products, and also depending on which mode of analysis is used (up-down). 3.3. Spectra interpretation Fig. 3 shows the mean spectra of the four sample presen- tation forms, once the spectra had been trimmed at the end (400–515 nm; 1650–1700 nm) owing to the low reproduc- ibility in these regions. The four mean spectra presented similar patterns, though the mean spectrum of sliced samples analysed with the up-view mode was different from the others, especially in the area between 700 and 1400 nm. This was the only sample presentation form that was vacuum packed during analysis. Hence, the effect of the plastic packaging causes major differences, more so than homogenisation, since, as Fig. 3 shows, the mean spectrum of sliced samples that were not vacuum packed (SD) is similar to mean spectrum of the homogenised presentation forms (HD and HU). A visual study of spectra revealed that there were basi- cally four prominent absorption bands, an observation that Ortiz-Somovilla et al. (2007) also made when analysing the same type of fresh sausage meat (prior to stuffing) as used in our study. In the visible area, there was one particularly noticeable band, between 550 and 580 nm. Within this range, absorptions are found related to muscle pigments, oxymyoglobin, myoglobin and the blue region can be explained by heme protein (Cozzolino & Murray, 2002; Cozzolino et al., 2003; Cozzolino & Murray, 2004). Within the 970–1020 nm range (the transition area between the visible and the near infrared area), an absorp- tion band was observed which is related to water content (Osborne & Fearn, 1986; Osborne, Fearn, & Hindle, 1993). In the NIR region, two prominent absorption bands were detected, between 1195 and 1230 nm and around 1450 nm. Willians and Norris (1987) found that CAH bonds absorb radiation in regions near to 1200 nm, which Table 1 References values of the calibration and validation sets Constituent (%) Calibration set Validation set N Mean SD Range N Mean SD Range Fat 80 31.71 8.59 11.7–43.2 20 30.65 8.98 16–42.1 Moisture 80 35.23 3.51 29.5–45.2 20 35.56 3.33 30.9–41.2 Protein 80 26.74 4.51 20.1–36.1 20 27.37 4.87 21.3–35.4 Table 2 RMScutoff and percentage of eliminated spectra on the sample presenta- tions studied RMScutoff Up-view mode Down-view mode Sliced samples 80,000 30,000 Percentage eliminated spectra 25% 23.2% Homogenized samples 30,000 15,000 Percentage eliminated spectra 20.4% 19% 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 515 715 915 1115 1315 1515 Wavelength (nm) log (1/R) SD SU HD HU Fig. 3. Mean spectra of four-sample presentation studied: sliced down view (SD), sliced up view (SU), Homogenized down view (HD) and homogenized up view (HU). A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 395 supplies information related to fat. In meat products, absorption located around the 1450 nm area has been linked to water (OH bond) (Cozzolino & Murray, 2004; Liu & Chen, 2001; Realini, Duckett, & Windham, 2004). In addition to these four regions, Fig. 3 shows that there was also an absorption band of lower intensity between 920 and 945 nm, which was not observed in the fresh pork sau- sage meat prior to stuffing (Ortiz-Somovilla et al., 2007). This band is related to the CH2 bond, which is characteris- tic of fat. This band did not appear in the fresh pork sau- sage meat prior to stuffing, due to the fact that its relative fat content is considerably lower that in the cured product (20% in fresh sausage meat in contrast to 32% in cured products). Hence it was not reflected in the NIR spectra. 3.4. Principal component analysis A principle component analysis (PCA) was applied to the total group of each presentation form in order to elim- inate redundant information. Then, using the new values generated (scores) in the vector space comprising the prin- cipal components, the Mahalanobis distance was calcu- lated from each sample to the centroid defined by its population. By applying the limit discussed in Section 2.4.2 (H > 3), the possible appearance of spectral outliers was observed. These anomalies could have a detrimental effect on the quality of the calibration models (Pizarro, Esteban-Dı´ez, Nistal, & Gonza´lez-Sa´iz, 2004). The highest number of spectral outliers was obtained with sliced sam- ples, analysed in the down-view mode (SD): four samples presented values that exceeded the limit (H > 3). On the contrary, sliced samples analysed with the up-view mode obtained the lowest number of spectral anomalous, and only one sample from the entire group was eliminated. The same number of spectral anomalous was detected in homogenised samples, since in the both modes of analysis (HD, HU), two samples were eliminated. The number of principal components (PCs) selected varied between 8 for the homogenised sample presentation forms (HD and HU) and 12 for the SU presentation form. In all the cases, the explained variance by the selected PCs for each analysis was found to be close to 100% (from 98.9% SU to 99.6% SD and HD). Fig. 4 shows the evolution of the explained variance by the PCA in each sample presentation form when the number of PCs increases. 3.5. Prediction equations 3.5.1. Characterisation of predictive models The treatments described in Section 2.4.3.1 were then applied in order to calculate the predictive models for each sample presentation form. Table 3 shows the characteristics of the equations selected for each constituent, that is to say, the number of samples that make up each model (N), the number of 40 50 60 70 80 90 100 110 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Principal Components Varianza Accumulated SD SU HD HU Fig. 4. Evolution of variance in the principal components analysis (PCA) of each samples presentation form. Table 3 Characterization of selected equations for each sample presentation (Sliced down view SD, sliced up view SU, homogenized down view HD, and homogenized up view HU) and constituent (fat, moisture and protein) CSD CSU CHD CHU Fat N 69 73 69 66 Factors 6 6 7 7 Regressiona MPLS MPLS PCR MPLS Derivative 1, 5, 5 1, 10, 5 2, 5, 5 0, 0, 1 Scatter correctionb MSC MSC SNVDT SNVDT Moisture N 71 74 73 70 Factors 5 2 6 3 Regressiona MPLS MPLS MPLS MPLS Derivative 1, 5, 5 2, 5, 5 1, 5, 5 3, 5, 5 Scatter correctionb SNVDT MSC SNVDT SNVDT Protein N 70 72 73 72 Factors 10 7 8 9 Regressiona MPLS MPLS MPLS MPLS Derivative 2, 4, 4 1, 5, 5 1, 4, 4 1, 10, 5 Scatter correctionb MSC MSC MSC SNVDT a PCR: principal component regression; MPLS: modified partial least squared. b SNVDT: standard normal variate and de-trending; MSC: multiplicative scatter correction. 396 A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 factors or regression terms, type of regression (PC or MPLS regression) and mathematical treatment applied to the signal (derivative and scatter correction). The number of outliers obtained in the models increased from 6 to 14 in sliced and homogenised samples, respec- tively, analysed in up-view mode. This accounted for 7.5% and 17.5% of the initial calibration set. Outliers are spectra that have a significant influence on the model and the occurrence of such spectra can lead to considerable deviations from normality (Griep, Wakeling, Vankeerberg- hen, & Massart, 1995). In a previous paper (Ortiz-Somovilla et al., 2007), which used the same set as this study but in fresh sausage meat, that is, before the process of stuffing and curing, a lower percentage of outliers was obtained, varying between 1.25% and 7.5%. The higher numbers of outliers obtained in cured samples is due to the increased heterogeneity of such samples, which is translated into greater variability. These outliers are obtained by subtracting to the number of samples from the initial calibration set (N = 80), the number of samples selected in each model, once the chem- ical anomalous (T) and the spectral anomalous (H) have been subtracted. For the constituent fat, the predictive models had the same number of factors or components in both sliced (six) and homogenised (seven) samples. This was not the case for the other parameters (moisture and protein). Homogeneity was not observed in the models obtained in relation to the mathematical treatment selected, for the derivative or the scatter correction. The regression method used for all the equations selected was modified partial least squares (MPLS), except for the fat constituent in homogenised samples analysed in the down-view (HD), which achieved better results in prin- cipal component regression (PCR). In the literature, on the application of NIRS technology to meat products, no uniformity is observed in relation to the mathematical treatment selected. Second derivative without scatter correction was selected for predicting constituents of dry sausages, pork quality and bovine meat (Alomar, Gallo, Castan˜eda, & Fuchslocher, 2002; Mishiro et al., 1995; Savenije, Geesink, van der Palen, & Hemke, 2006, respectively). The best results were obtained with only first-derivative spectra by Garcı´a-Rey et al. (2005) and Anderson and Walker (2003) analysing dry-cured ham and ground beef stream, respectively. On the other hand, pre-processing of derivatives along with scatter corrections were applied by Cozzolino and Murray (2002) (lamb, beef and chicken), Ortiz-Somovilla et al. (2007) (sausage meat), and Alomar et al. (2002) (bovine meat). 3.5.2. Evaluation of predictive models The statistics of the equations appointed to predicting fat, moisture and protein, in calibration, as well as in vali- dation (cross and external), for all the sample presentation forms, are expressed in Table 4. 3.5.2.1. Fat, moisture and protein predictions. The coeffi- cients of determination (R2, r2 and R2EVÞ for the fat and pro- tein nutritional parameters, both in calibration and validation, were in all selected equations equal to or more than 0.95. Shenk and Westerhaus (1996) stated that the equations which reached values of R2P0.9, were extre- mely accurate. For the moisture constituent, these coeffi- cients were also highly accurate, except the values obtained in cross and external validation for the SU sample presentation form (r2 = 0.88; R2EV = 0.88), which, accord- ing to Shenk and Westerhaus (1996) could be considered as good accurate between the range of R2 = 0.7–0.89. Observing the other statistics employed to evaluate the models (SEC, SECV, RPD and SEP), differences are observed between the sample presentation forms used for the fat and moisture nutritional parameters. Homogenised samples showed models with lower standard errors (SEC, Table 4 Statistics of selected equations in calibration (Standard error of calibration, SEC; coefficient of determination in calibration, R2), cross validation (standard error of cross validation, SECV; coefficient of determination in cross validation, r2; residual predictive deviation, RPD) and external validation (standard error of prediction, SEP; coefficient of determination in external validation, R2EVÞ Range (%) SD Calibration Validation Cross External SEC (%) R2 SECV (%) r2 RPD SEP (%) R2EV Fat (%) SD 15.3–43.2 8.49 1.32 0.98 1.36 0.98 6.24 1.47 0.98 SU 16–43.2 8.39 1.63 0.96 1.88 0.95 4.46 1.64 0.98 HD 15.3–43.2 8.57 0.9 0.99 0.96 0.99 8.93 0.71 1 HU 15.3–43.2 8.43 0.71 0.99 0.81 0.99 10.41 0.98 0.99 Moisture (%) SD 29.5–41.9 3.4 0.87 0.93 1.03 0.91 3.3 0.97 0.92 SU 29.5–42 3.32 1.03 0.9 1.13 0.88 2.92 1.32 0.88 HD 29.5–41.9 3.38 0.59 0.97 0.7 0.96 4.83 0.43 0.98 HU 29.5–41.9 3.4 0.49 0.98 0.53 0.98 6.42 0.41 0.99 Protein (%) SD 20.1–36.1 4.62 0.81 0.97 0.91 0.96 5.08 1.08 0.95 SU 20.1–36.1 4.38 0.74 0.97 0.93 0.96 4.71 1.13 0.95 HD 21.1–36.1 4.37 0.81 0.97 0.95 0.95 4.65 0.95 0.96 HU 20.1–35.6 4.31 0.72 0.97 0.85 0.96 5.07 1.02 0.96 A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 397 SECV and SEP), as well as higher values for residual pre- dictive deviation (RPD), therefore these samples consti- tuted more robust models (see Table 4). Thus, a decrease in accuracy and precision was observed with the increment of heterogeneity of the product, that is to say, with sliced sausages, reaching the highest standard error of prediction (external validation) with sliced plastic vacuum-packed samples (fat: SEPSU = 1.64%, moisture: SEPSU = 1.32%). This sample presentation form had a value of RPD=2.92 for moisture, slightly lower than the limit established by Williams and Sobering (1996) (RPD > 3), for a model to offer very good predictive characteristics. The statistics obtained with protein showed smaller dif- ferences between homogenised and cured samples. Comparing both modes of analysis (up-down view modes), the sliced samples obtained more robust models when analysed with the down mode for the fat and mois- ture constituents. This aspect was due to an additional dis- tinguishing factor between these two sample presentation forms (SD–SU), that is, the plastic vacuum packaging, which was exclusive to the SU presentation form. The same results were obtained with the prediction of protein, excepting for the standard error of calibration (SECSD = 0.81% vs. SECSU = 0.74%). The homogenised samples obtained better results when analysed with the up-mode, except for the standard error of prediction for fat (SEPHD = 0.71% vs. SEPHU = 0.98%) and protein (SEPHD = 0.95% vs. SECHU = 1.02%). 3.5.2.2. Predictions of proximate composition by other authors. There are few studies investigating the ability of NIRS to predict the major components, of dry-cured sau- sages, that is, fat, moisture and protein, . Hildrum, Ellekjaer, and Isaksson (1995) studied the composition of three types of meat products (smoked sau- sages, meat cold cuts, and emulsion spreads) from 24 differ- ent meat processors by NIR transmittance spectroscopy with a wavelength range from 350 to 1050 nm. The bias- corrected prediction errors (SEP(C)) for the estimates of protein, fat and water contents were in the range of 3.8 to 8.8 g/kgC01. These values were lower than those obtained in this study. But the errors of prediction were different because those obtained by Hildrum et al. had been bias corrected. Isaksson, Miller, and Naes (1992) recorded NIR mea- surement of meat through packing films. But the samples were homogenised beef, and the packed samples in this study were sliced (intact) dry-cured sausages. For this rea- son, the prediction errors obtained by Isaksson et al. (SEP- fat = 0.37, SEPmoisture = 0.5 and SEPprotein = 0.45) were lower than those obtained for the SU sample presentation. Kang et al. (2001), analysing processed pork (sausages) obtained models for predicting the moisture, protein and fat content of intact and homogenised products. All the coefficient determinations were lower than those obtained in this study. The SEP values of the intact product were very similar for moisture (SEPSD = 0.97 vs. SEP = 1.01) and fat (SEPSD = 1.47 vs. SEP = 1.49), and slightly higher for protein (SEPSD = 1.08 vs. SEP = 0.77). The SEP values obtained for the homogenised product were higher than those obtained in this study. For moisture SEPHU = 0.41 vs. SEP = 1.13, for fat SEPHD = 0.71 vs. SEP = 1.44 and for protein SEPHD = 0.95 vs. SEP = 1.12. Kang et al. (2001), studying the effect of homogenisation on pork sausages, discovered that the moisture content increased, whereas protein and fat contents decreased. The increase in moisture content was due to excretion of intramuscular moisture. The lower protein and fat content was due to a dilution effect caused by the increase in mois- ture content. In the three parameters studied in the present work, major differences were found between the evaluating statistics of the models when homogenised samples were compared with sliced samples. Thus, the maximum stan- dard error of prediction (SEP) of the nutritional parameter fat was 1.47% in sliced samples analysed in the down-view mode (SD), approximately two times higher than that the value obtained for homogenised samples (SEP = 0.71%). A similar situation was observed with the moisture param- eter, which, in the intact product, obtained a value of SEPSD = 0.97% as opposed to SEPHU = 0.41% obtained with the homogenised product. For protein, these differ- ences were not so extensive, but, greater accuracy was also observed in homogenised samples (SEPSD = 1.08%, SEPHD = 0.95%). This lack of precision in all models obtained with intact vs. homogenised product, is mainly due to the higher degree of heterogeneity of the intact product, and secondly, to the chemical reference values used in the development of the predictive models. As explained in Section 2, the samples were homogenised and then sent to the laboratory to determine the chemical values. Therefore, these values in relation to the homogen- ised product, as indicated by Kang et al. (2001), differ slightly when compared to the intact product. For that rea- son, the models correlated better the spectra of the homog- enised product with the reference chemical data. Acknowledgements The authors thank the meat processing pilot plant staff at CIFA-Palma del Rı´o for their cooperation. The authors are also grateful to laboratory staff at the CIFA-Alameda del Obispo Food and Agriculture Quality Laboratory, for their assistance during sample preparation and data collection. This study was financially supported by the INIA Project Number CAL00-001. References Alomar, D., Gallo, C., Castan˜eda, V., & Fuchslocher, R. (2002). Chemical and discriminant analysis of bovine meat by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Meat Science, 63(4), 441–450. Anderson, N. M., & Walker, P. N. (2003). Measuring fat content of ground beef stream using on-line visible/NIR spectroscopy. Transac- tions of the ASAE, 46(1), 117–124. 398 A.J. Gaita´n-Jurado et al. / Meat Science 78 (2008) 391–399 B.O.E. 21 marzo. (1980). Orden 7 febrero, por la que se regula la norma de calidad para productos ca´rnicos embutidos crudos-curados en el mercado interior. Brøndum, J., Munck, L., Henckel, P., Karlsson, A., Tornberg, E., & Engelsen, S. B. (2000). Prediction of water-holding capacity and composition of porcine meat by comparative spectroscopy. Meat Science, 55(2), 177–185. Byrne, C. E., Downey, G., Troy, D. J., & Buckley, D. J. (1998). 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España-España “Detection of factors affecting the acquisition of visible-near infrared fibre-optic probe spectra of commercial meat products” Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2008, 16(2), 111-119 Journal of near Infrared SpectroScopy 111 ISSn: 0967-0335 © IM publications llp 2008 doi: 10.1255/jnirs.770 all rights reserved near infrared (nIr) spectroscopy has been used for many years to determine the composition of foods, 1 because it offers a number of advantages: high speed, no need for reagents, freedom from pollution, excellent accuracy and precision, no sample destruction, ability to provide information about several analytes at once 2 and ease of sample preparation. nIr spectroscopy is currently used for a wide range of applications. In the meat industry, in addition to predicting the chemical parameters characterising a product, it is used to authenticate, type and distinguish products of various origins, 3–8 to predict organoleptic properties 9–12 and to enhance the technology required for direct on-line quality control. 13–16 However, one of the major problems in applying chem- ometric models to spectra is that the acquired spectrum of a sample is dependent on many different, sometimes uncontrollable factors, so in order for nIr applications to be effective, it is necessary to obtain robust models (insensi- tive to uncontrollable environmental factors) offering high levels of accuracy and precision. of particular importance in this respect is the control of various sources of error arising from the systematically incorrect definition of sample presentation when acquiring spectral information. these error sources involve numerous associated variables; the accuracy and the precision of nIr spectroscopy analysis are influenced by around 30 factors attributable to the sampling process, sample presentation or the samples themselves (for example, temperature, material to be sampled, physical nature of the material, sample size, type of material, compo- sition, physical texture, foreign material, sample cell type, sample cell size, stratification etc.) 17 and the importance Detection of factors affecting the acquisition of visible-near infrared fibre-optic probe spectra of commercial meat products Antonio J. Gaitán-Jurado, a Francisco Rincón, b Victor Ortiz-Somovilla a and Fidelina España-España a Ifapa-centro “alameda del obispo” (postharvest and food technology area), avda Menéndez pidal s/n, apdo. correos 3.092, 14080 córdoba, Spain. e-mail: antonioj.gaitan.ext@juntadeandalucia.es b university of córdoba, department of Bromatology, campus rabanales, Building c-1, 14014 córdoba, Spain Near infrared (NIR) spectroscopic analysis of sliced and packaged dry fermented sausages was standardised in order to identify the main sources of error during the spectrum acquisition process. The aim of the study was to ascertain how many of the apparent criti- cal factors (ACFs) were really significant key factors for spectrum acquisition. Using a 2 III 7–4 , Plackett–Burman experimental design, and enhancing resolution via a fold-over such as 2 IV 7–3 , seven ACFs were investigated to determine their effect on root mean square (RMS) values obtained using 15 combinations of spectral range and mathematical pre-treatment. The results showed that for the on-line control of products of this type, the spectrum acquisition process was not affected by the ACFs studied when using the whole spectral range of the instrument (400–2500 nm), with the first derivative and either of the scatter corrections examined here, since in these conditions control of factor variability proved unnecessary. Keywords: dry fermented sausages, on-line quality control, visible and near infrared spectroscopy, Plackett–Burman experimental design Introduction A. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 111–119 (2008) received: 26 September 2007 n revised: 14 february 2008 n accepted: 15 february 2008 n publication: 7 May 2008 112 Detection of Factors Affecting Acquisition of Spectra in Meat Products of most of these factors increases with increasing product heterogeneity. Studies of the factors influencing spectrum acquisition in nIr spectroscopy analysis tend to use the one-variable-at-a- time (oVat) strategy. 18–21 However, drawbacks to this strategy include inability to determine interactions, inability to deter- mine the optimum, and inefficiency of experimentation. 22 In the early 1920s, fisher 23 discovered and described a very much more efficient method of experimentation based on facto- rial designs (fd) so the oVat way of experimentation should now be discarded. on the basis of fd, a direct optimisation process must be realised in two steps. In the first step, critical parameters or influencing factors (apparent critical factors, acf) must be identified (screening phase) and, only when the first step is completed, must the second step be planned (optimisation phase). experimental design techniques provide a powerful tool for simplifying nIr spectroscopy analysis. 24,25 In this way, the consecutive steps for standardisation of nIr analysis for final products requires two consecutive steps: (1) to establish how many of the apparent critical factors (acf) are actually of major importance for spectrum acquisition; and (2) for statistically-significant or truly-critical acfs [later termed influencing factors (If)], to find the optimal set of If values that will yield not only an efficient analytical quantifi- cation of the parameters to be analysed in the final product, but also the most sensitive method of quantification. for step one, a 2 (k–p) fold-over plackett–Burman experimental design (where k = number of factors to be considered in the experimental design and p = the fraction 1/2 p of the 2 k experi- mental design 26 ) may be used to determine exactly which of the initially-considered factors significantly affect a depen- dent variable or response. for step two, response surface methodology (rSM)—a collection of statistical and mathe- matical techniques for developing, improving and optimising processes 27 —may be used. this paper only deals with step one and, thus, studies the effect of certain factors on the vari- ability of the spectrum acquisition process, in order to obtain adequate information for the subsequent calibration process and thus determine the main effects of the factors influencing nIr data acquisition, i.e. identify the If affecting the spectrum capture process. figure 1 schematises the aim of this paper. Material and methods Samples the present study used a sample set consisting of chorizo and salchichón, dry fermented sausages widely consumed in Spain. these meat products tend to be marketed in sliced, packed form, so there is considerable interest in the develop- ment of analytical methods enabling on-line quality control of the final product. like other dry fermented sausages, chorizo and salchichón were produced by certain common steps, including mincing, mixing, casing, fermentation and ripening. However, formu- lations were rather different: chorizo samples contained pork meat, back fat, nacl, paprika, powdered milk, dextrin, lactose, dextrose, spices, sodium and potassium di- phosphates, sodium ascorbate, colorant (ponceau 4r e-124), sodium and potassium nitrites, microbial starter and a natamycin- based surface treatment; salchichón samples contained pork meat, back fat, nacl, lactose, dextrose, caseinate, white and black pepper, sodium tritri-phosphate, sodium ascor- bate, colourant (ponceau 4r e-124), potassium nitrate and microbial starter. according to manufacturers’ specifications, the pork meat in chorizo comprised cuts of pork ham and shoulder (33.5%, with 10% fat), cuts of streaky bacon (34.4%, with 30% fat) and boned shoulder (22.6%, with 10% fat). the salchichón contained pork meat (66%, with 25% fat) and bacon rind (26%, with 28% fat). chorizo and salchichón samples were purchased in a local market and stored at –18ºc until analysis. Samples belonged to the same commercial batch to maintain homo- geneity within each product. Spectra were directly obtained on the sliced products, packed in plastic polyethylene film and placed on trays as shown in figure 2. this commercial presentation produces many sources of variation in nIr anal- ysis. Slicing and packaging were performed according to the experimental design described below. Spectra were acquired 8 50. D. Cozzolino, N. Barlocco, A. Vadell, F. Ballesteros and G. Gallieta, “The use of visible and near- infrared reflectance spectroscopy to predict colour on both intact and homogenised pork muscle”, Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 36, 195–202 (2003). 51. O. Fumière, G. Sinnaeve and P. Dardenne, “Attempted authentication of cut pieces of chicken meat from certified production using near infrared spectroscopy”, J. Near Infrared Spectrosc. 8, 27–34 (2000). Figure Captions Figure 1. Diagram of the aim of this paper Figure 2. Arrangement of slices on the tray before packing with plastic polyethylene film Aim of paper: to know how seven FACTORS affect the variability of the spectrum acquisition process spectrum acquisition process Inside the aim Outsude the aim Wet analysis Calibration model Validation Sample Figure 1. Diagram of the aim of this paper. 8 50. D. Cozzolino, N. Barlocco, A. Vadell, F. Ballesteros and G. Gallieta, “The use of visible and near- infrared reflectance spectroscopy to predict colour on both intact and homogenised pork muscle”, Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 36, 195–202 (2003). 51. O. Fumière, G. Sinnaeve and P. Dardenne, “Attempted authentication of cut pieces of chicken meat from certified production using near infrared spectroscopy”, J. Near Infrared Spectrosc. 8, 27–34 (2000). Figure Captions Figure 1. Diagram of the aim of this paper Figure 2. Arrangement of slices on the tray before packing with plastic polyethylene film dd d = 5 – 7 cm Figure 2. Arrangement of slices on the tray before packing with plastic polyethylene film. A. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 111–119 (2008) 113 following sample stabilisation for 30 minutes at laboratory temperature, i.e. nIr spectrometer temperature, since this factor can strongly affect background levels during spectrum acquisition. 28 Experimental design the design to be used depends on the stage of research; in the early stages, the goal is to detect or confirm the impor- tance of the variables or factors included in the experimental design. plackett and Burman 29 developed a screening experiment design type to estimate main effects and, some years later, Box and Hunter 30 demonstrated that resolution IV in these design types could be obtained by folding over the initial experiment. In chemometrics, a plackett–Burman (pB) experimental design 31 is typically used for screening from 6 to 40 variables in order to identify important factors (here termed apparent critical factors, acfs, and shown in table 1). for spectra acquisition, a 2 III 7–4 pB experimental design was used, with enhanced resolution via a fold-over such as 2 IV 7–3 . By using a resolution IV design, main effects will not be confounded by two-way interactions, although some two-way interactions may be confounded with other two-way interactions. the design-expert software package (Stat-ease, Inc., Minneapolis, Minnesota, uSa) was used to generate designs and to obtain the standard effects of acfs on responses. Both meat product samples were prepared according to the experimental design (runs 1 to 16, table 2) under the specific conditions for each factor considered in the experimental design (table 1). runs were performed in random order (trial order) since randomisation helps to ensure that the person performing the experiment does not reach erroneous conclu- sions due to extraneous sources of variability. 22,32 table 2 shows the full experimental design used. ACFs for sample preparation although around 30 factors relating to sample preparation may affect both precision and exactitude in nIr analysis, 17 only seven acfs were selected here (table 1) on the basis of published reports and the authors’ own experience. these factors were: 1. product type (pt), since chorizo and salchichón are made using a similar technological process, but differ in terms of formulation. 2. previous unfreezing time (pun), since the appearance and intensity increase of some nIr bands accompanied with meat thawing point to the involvement of complex physical, chem- ical and biochemical changes during the process. 19 3. plastic film type used for packaging (plt), since differences in physical and chemical properties might affect nIr spectra (see details below). (a) number of turns of the plastic film around the sample (ptS). (b) product slice thickness (pSt). (c) number of product layers (npl). (d) number of subscans for spectrum acquisition (SnS). the term “robustness” (20 year old concept in doe) derives from the idea of making products or processes insensitive or “robust” to the effects of natural variations—here, to the effects of the seven acfs on the nIr spectrum collection Symbol Levels ACFs Code Actual –1 +1 product type X 1 pt Salchichón chorizo previous unfreezing time, h X 2 pun 21 42 plastic type a X3 plt a B plastic turns around the sample X 4 ptS 1 2 product slice thickness, mm X 5 pSt 2 4 number of product layers X 6 npl 1 3 number of sub-scans for spectrum acquisition X 7 SnS 32 64 a a and B are different types of plastic polyethylene film Table 1. Seven apparent critical factors (ACFs) considered and experimental ranges, expressed in coded and actual units, considered for the two-level fold-over design at resolution level IV. Run Trial X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 3 1 –1 –1 1 –1 1 1 –1 10 2 1 –1 –1 1 1 1 –1 7 3 –1 1 1 –1 –1 –1 1 15 4 1 1 1 1 1 1 1 5 5 –1 1 –1 1 –1 1 –1 4 6 –1 –1 1 1 –1 1 1 1 7 –1 –1 –1 1 1 –1 1 12 8 1 –1 1 –1 1 –1 1 9 9 1 –1 –1 –1 –1 1 1 2 10 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 13 11 1 1 –1 –1 1 –1 –1 11 12 1 –1 1 1 –1 –1 –1 16 13 1 1 1 –1 –1 1 –1 6 14 –1 1 –1 –1 1 1 1 14 15 1 1 –1 1 –1 –1 1 8 16 –1 1 1 1 1 –1 –1 Table 2. Full experiment design 2 7-3 used to determine critical parameters during spectrum acquisition. 114 Detection of Factors Affecting Acquisition of Spectra in Meat Products process. taguchi’s ideas on quality suggest that experiments be conducted as part of the design process, to achieve insensitivity to the variation of inputs or factors (i.e. seven acfs). It thus becomes possible to obtain spectral information for the sample regardless of acfs (i.e. an insensitive or “robust” process). With regard to plt, the two types of plastic used (a and B, respectively) differed in terms of mean thickness (11 µm and 10 µm, respectively), coil width (450 mm and 300 mm, respec- tively), and coil weight (7.64 kg and 0.88 kg, respectively), giving rise to differences in tensile strength at break (Md: 45 n mmq –1 and 40 n mmq –1 and td: 20 n mmq –1 and 17 n mmq –1 , respec- tively, using aStM d 882), 33 elastic limit (Md: 11 n mmq –1 and 10 n mmq –1 and td: 10 n mmq –1 and 9 n mmq –1 , respectively, using aStM d 882), 33 elongation at break (Md: 300% and 274% and td: 600% and 552%, respectively, using aStM d 882 norm) 33 and impact resistance (90 gr and 83 gr, respectively, using aStM d 1709). 34 for each factor included in the experimental design, an X i coded independent variable for i = 1 to 7 was obtained, since it is advisable to transform natural variables into coded vari- ables. In doe coded or “standardised” variables are often used because the weight of factors during the analysis of results may be modified according to the variable range; so on the raw variables of factors new coded or standardised factors are obtained. these new standardised factors produce standard- ised or coded effects of factors on responses. coding removes the units of measurement of the input variables (factors) and subsequently the distances measured along the axes of the coded variables in a k-dimensional space are standardised (or defined in the same metric). the standardisation or coding process is described by the following expression: 2( ) i iL iH i iH iL XX X x XX -+ = - of where X iL and X iH are the low and high levels of X i . In this way these coded variables (factors) are defined as dimensionless with mean zero and the same spread or standard deviation. 27,35 Visible-NIR scanning Scanning was performed with a foss nIrSystems model 6500 Sy-II scanning monochromator (Silver Spring, Md, uSa), equipped with a remote reflectance fibre-optic module (1.5 m 210/7210 bundle fibre-optic probe, ref. r6539-a) using a ceramic plate as reference. the sensor consists of a head (16 cm × 11.25 cm × 6.25 cm), aluminium case and quartz window (5 cm × 5 cm sample area). the spectrometer inter- polates the data to produce one point at every 2 nm between 400 nm and 2500 nm, obtaining a 1050 data point spectrum. the software used to control the instrument, collect spectra and process the data was ISIscan v1.25 (Infrasoft International, State college, pa, uSa). Responses Since the main aim was to evaluate differences in the spec- trum acquisition process due to acfs (table 1), the response considered must evaluate difference spectra. to calculate similarities or differences in absorbance values between spectra, some software programs built into nIr instruments (for example, ISI) enable calculation of root mean squared (RMS) spectral errors, defined as the square root of the mean squared value of the difference between the log 1/R value of a specific sub-sample and the log 1/R value of the mean spectrum of various sub-samples for the whole range of wave- length values. this statistic provides information on the spec- tral differences between replicates from the same sample; it is therefore considered a suitable estimator of spectral repeat- ability and, in this way, is a useful statistic to evaluate the effi- ciency of the spectral acquisition process. 36 to calculate the RMS value for each trial, the following expression was used: 2 1 / n j ij ij ij i RMS D n D Y Yi = = =- å of which Y ij is the log(1/R) value for sample “j” at wavelength i (l i ), Y ¯ i is the log (1/R) value for the averaged spectrum at wavelength i (l i ) and n is the number of datapoints (wave- lengths). the RMS values obtained were multiplied by a factor of 10 6 in order to avoid working with excessively low values. for each specific condition of the experimental design (trials, table 2), three replicates (spectra) were obtained. then, RMS values were calculated under different technical conditions, such as wavelength range, light scattering correc- tion mode and derivative treatment. two scatter correction modes were used: standard normal variate and detrending (SnVdetr) which removes scattering by normalising each spectrum by the standard deviation of the responses across the entire spectral range 37 and multiplicative scatter correc- tion (MSc) which assumes that the wavelength dependency of the light scattering is different from that of the constituent absorption. 38 two derivative orders were used: first derivative which is simply a measure of the slope of the spectral curve at every point and second derivative which is a measure of the change in the slope of the curve. 37 Given these considerations, the spectral data were obtained using three spectral ranges: 1. the full wavelength range of the instrument (400– 2500 nm) 2. the range 400–2000 nm was used to enhance the repeat- ability of the spectroscopy signal, given that from 1800 nm the signal-to-noise ratio starts to decline. 3. the range 1100–2000 nm was used on the basis of elimina- tion of the visible range. 14 Spectral data were subsequently subjected to mathematical treatments. Slight fluctations frequently occur in the spec- trum acquisition due to light scattering, background noise and baseline drift. 39 these can be lessened by mathematical pre-treatment. the four widely-used treatments applied here were first and second derivative, SnVdetr and MSc; 39–41 raw spectra were also used. A. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 111–119 (2008) 115 the combination of the three spectral ranges (400–2500 nm, 400–2000 nm and 1100–2000 nm) with the five mathematical pre-treatments (raw spectra, SnVdetr, MSc, first and second derivatives) gave a total of 15 groups of RMS values (i.e. 15 responses), as shown in table 3. the RMS values were obtained from the RMS mean value of the three replicates. the following expression summarised all data (responses) used in the analysis: 16 trials (three replicates per trial) × 15 responses (rMS mean value of three replicates) = 240 responses. Results and discussion the effect of acfs on responses analysed, each representing different spectral-data processing conditions (table 3), are shown in table 4. In order to obtain a robust nIr analysis (see definition of “robustness”, in section below) it was necessary to obtain a response for which spectral variability was insensi- tive to the effect of the seven parameters studied. on the basis of the results obtained, responses were classified into three groups. Group “very difficult to control” (VDC) this group contained a large number of responses (r 4 , r 5 , r 7 , r 8 , r 9 , r 10 , r 12 , r 13 , r 14 and r 15 ) in which all effects were statis- tically significant (p ≤ 0.05). all the spectral ranges (400–2500 nm, 400–2000 nm, 1100– 2000 nm) were included in this group of responses and all responses were subject to one derivative treatment and to scatter correction (table 3). derivative treatment applied alone led to deterioration of the signal-noise ratio, but the joint application of both derivative and scatter correction enhanced spectral resolution 39 and, thus, enhanced sensitivity of the method to external variations, obtaining all acfs as truly critical. therefore, all factors presented in the experimental design should be controlled, because by varying one of them, the spectra produced would be significantly different. In many studies on the application of nIr technology in food and agricultural products, the better results were obtained with combinations of these mathematical treatments. Bertrand 42 report that the mathematical pre-treatments applied here and elsewhere improve the spectroscopic signal. Shenk and Westerhaus 43 suggest that the joint use of a first derivative and a scatter correction method provides satisfactory results for some agricultural products, while a number of authors, including park et al. 44 and naydenova et al. 45 report that the derivative-scatter correction combination provides the best calibrations. thus, a model with any combination of these treatments (responses) cannot be used for all possible acf values during on-line control. consequently, it was very important to systematise the sample presentation form to control the major number of factors when these mathematical treatments were applied. therefore, these conditions were classed as “Vdc”. Group “easier to control” (EC) the second group (table 4) contained responses in which only some acfs (table 1) displayed a significant effect on the spec- tral variability (r 1 , r 6 , and r 11 ). these responses corresponded to all spectral ranges employed: 400–2500 nm (r 1 ), 400–2000 nm (r 6 ) and 1100–2000 nm (r 11 ). these wavelengths were original, untreated spectra, since neither derivative treatment nor scatter correction were applied. of the three responses in this group, r 1 and r 6 would be easier to control, since only 3 and 2 factors obtained signifi- cant primary effects, respectively (table 4). these factors were pt, ptS and pSt (r 1 ) and ptS and pSt (r 6 ). the effects observed in these responses (table 4) might reasonably be expected, since mathematical treatments enable the removal of error sources such as differences in particle size, small changes in instrument lamp intensity, slight variations in instrument detector performance or in temperature etc. 46 once these sources of error were minimised using mathematical treatments, only acf-induced variations were compared (table 1). for this reason, the influencing factors repeatedly detected in the ec group, i.e. plastic turns around the sample (ptS) and product slice thickness (pSt), were the main factors to be taken into account during nIr analysis of samples presented in this way; even when other sources of error were minimised, these factors were identified Treatments Responses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Spectral range (nm) 400–2500      400–2000      1100–2000      derivative none    first       Second       Scatter correction none    MSc       SnVdetr       Table 3. Responses obtained with the combinations of spectral treatments applied. 116 Detection of Factors Affecting Acquisition of Spectra in Meat Products as influential. Both factors are related to light path length, since ptS identifies plastic film thickness (one or two turns of film around the sample) and pSt identifies slice thickness. differences in spectral data were prompted primarily by vari- ations in penetration depth. Meurens and lepoutre 47 suggest that slice thickness may be affected by penetrability of radia- tion, while Jeszenszky et al. 48 report interference produced by multiple reflected beams from the boundary surfaces of thin plastic foils in nIr spectra. Without scatter corrections, a high value of the RMS statistic was observed (figure 3). nevertheless, the responses of this group did not obtain higher values than 60 × 10 3 , reported as a limit value to get quality spectra by españa et al. 49 this value was calculated from spectra without derivative and scatter correction treatments. españa et al. did not evaluate the effect of pSt as a factor; it is therefore likely that by selecting a particular value for this factor (from 2 mm to 4 mm, table 1) the RMS limit value would be considerably lower. the response conditions of this group were classed as ec, particulary with regard to r 1 and r 6 (table 4). Group “most robust control” (MRC) finally, the third group contained two responses, r 2 and r 3 (example of r 2 on table 4), in which none of the acfs exerted a significant effect. thus, conditions for responses r 2 and r 3 , i.e. full spectral range, first derivative and both MSc and SnVdetr (table 3) are Mrc conditions, because spectral vari- ability was not affected by any of the factors considered in this study (table 1). application of first derivative and scatter correction in the Mrc group (r 2 and r 3 ) (table 3) yielded robust spectral data acquisition conditions, spectral variability not being affected by any of the acfs considered (table 1). Similar conclusions have been reached empirically by a number of authors, with no standardisation of the process such as that described here. González-Martín et al., 14 for example, in an analysis of intact Iberian pork loin using the same probe used here, obtained the best results with a combination of first derivative and MSc scatter correction for interfibrillar fat, and SnVdetr scatter correction for protein quantification. cozzolino et al., 50 in a study of intact pork muscle colour, similarly reported the best results with SnVdetr plus first derivative for cIe b and with SnVdetr plus second derivative for cIe l. ding and Xu 4 found that the best models for classifying intact kangaroo and beef samples were either second-derivative plus SnVdetr or SnVdetr alone. for the authentication of chicken pieces of “slow-growing” or “industrial” origin, fumière et al. 51 obtained the best results with first-derivative plus SnVdetr for classification of legs with skin, second-derivative plus MSc for breasts without skin, and second-derivative plus SnVdetr for carcasses with skin. When nIr spectra models were obtained with the same spectrometer and sample presentation form in this work, Responses Factors R 1 R 2 R 6 R 11 effect p effect p effect p effect p X 1 –13.04 0.05 a 6.41 0.10 –2.48 0.24 –50.81 0 . 01 a X 2 –7. 5 4 0.08 4.64 0.14 0.88 0.54 –28.27 0 . 0 2 a X 3 2.97 0.21 10.21 0.06 0.98 0.51 –7.58 0.08 X 4 29.47 0.02 a 6.53 0.10 14.26 0 . 0 4 a 96.16 0 . 0 0 a X 5 15.41 0.04 a 7.42 0.09 11.85 0 . 0 5 a 78.74 0 . 01 a X 6 7.34 0.09 5.89 0.11 5.57 0.11 28.99 0 . 0 2 a X 7 8.41 0.08 1.40 0.39 5.74 0.11 13.77 0 . 0 5 a X 1 × X 2 7.62 0.08 5.96 0.11 4.85 0.13 16.83 0.04 a X 1 × X 3 –1.55 0.36 3.81 0.17 1.34 0.41 –15.76 0.04 a X 1 × X 4 0.96 0.51 5.54 0.11 1.44 0.39 2.65 0.23 X 1 × X 5 4.90 0.13 3.67 0.17 6.49 0.10 43.23 0.02 a X 1 × X 6 –2.00 0.30 4.35 0.14 1.44 0.39 –1.01 0.50 X 1 × X 7 –23.32 0.03 a 2.38 0.25 –13.68 0.05 a –124.56 0.00 a X 2 × X 5 18.11 0 . 0 4 a 5.72 0.11 8.71 0 . 0 5 a 50.21 0.01 a a considered as influencing factor (If). confunding structure: X 1 ×X 2 = X 3 ×X 6 = X 4 ×X 7 X 1 ×X 3 = X 2 ×X 6 = X 5 ×X 7 X 1 ×X 4 = X 2 ×X 7 = X 5 ×X 6 X 1 ×X 5 = X 3 ×X 7 = X 4 ×X 6 X 1 ×X 6 = X 2 ×X 3 = X 4 ×X 5 X 1 ×X 7 = X 2 ×X 4 = X 3 ×X 5 X 2 ×X 5 = X 3 ×X 4 = X 6 ×X 7 Table 4. Standardised effects, in terms of coded factors, on responses with statistical significance. An effect was considered strong when p ≤ 0.05. A. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 111–119 (2008) 117 applying the spectral the conditions described by these responses (r 2 and r 3 ), was able to utilise indistinctly any of the following factors: product (pt factor), in any time of unfreezing (pun factor), type of plastic (plt factor), one or two returns of plastic (ptS factor), any thickness of the slice (tpS factor), one or two layers of product (npl factor), and number of sub- scans (SnS factor). So, all these factors would be able to vary without affect significantly to the variability between spectra of a sample (RMS value). thus, conditions for responses r 2 and r 3 were the Mrc. as a result, this information could be employed to synthe- size methodologies of nIr analysis. for instance, to expand models generated with the mathematical treatments applied in this group, it would not be necessary to keep in mind all these factors. Conclusions Sample presentation forms and numbers of variatable factors should be controlled and systematised when the combination of derivative treatment and scatter correction are applied, over the 400 nm to 2000 nm and 1100 nm to 2000 nm spectral ranges. With the raw spectra (without derivative treatment and scatter correction), two factors should be controlled [plastic turns around the sample (ptS) and product slice thickness (pSt)]. two responses were not affected by any of the factors considered. the treatments employed were full spectral range (400 nm to 2500nm), first derivative and both scatter correction employed (MSc and SnVdt). In summary, this paper reports on a procedure for stand- ardising spectral data acquisition and avoiding the effects of potential influencing factors, of which as many as seven were identified here in sliced, packaged meat products. the robust- ness of the models obtained using these conditions will be the object of a future study. References 1. B.G. osborne and t. fearn, Near infrared spectroscopy in food analysis. John Wiley & Sons, chichester, uK (1986). 2. M. Blanco and d. Valdés, “Influence of temperature on the predictive ability of near infrared spectroscopy mod- els”, J. 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Quality control of the raw material (unginned cotton) is crucial in order to obtain good quality fibre in the final product, as the harvested mature fruits contain remains of kernels, leaves and soil. 1 the most important parameters involved in the quality of seed cotton are the moisture content and level of impuri- ties. these impurities in seed cotton are all organic (leaf and stem entwined in the fibres) 2 and inorganic foreign particles, which are not cotton fibre or seeds although they are from the cotton plant itself. Spanish regulations include levels of these parameters, and producers are awarded incentives for quality. the quality control protocol for Spanish cotton batches establishes the assessment of moisture and the impurity content. the method currently used to determine the accept- ance criteria of batches in terms of moisture of seed cotton is by means of a portable moisture meter (precision of meas- urement, 0.5%). the impurity content is obtained by gravi- metric determination. Both methods are independent, time consuming and labour intensive. Near infrared applications in the quality control of seed cotton Antonio J. Gaitán-Jurado, a María García-Molina, b Francisco Peña-Rodríguez a and Victor Ortiz-Somovilla a a Ifapa-centro ‘alameda del obispo’ (postharvest and food technology area), avda. Menéndez pidal s/n, apdo. correos 3.092, 14080 cordoba, Spain. e-mail: antonioj.gaitan.ext@juntadeandalucia.es b cItaGro, parque tecnológico de andalucía, c/ Marie curie, nº4, local d1, 29590 Malaga, Spain In the cotton industry the most important parameters for quality of seed cotton (unginned, harvested cotton) are moisture content and impurity level. In Spain, these quality parameters are regulated and cotton producers are awarded incentives. This study was performed to investigate the potential of near infrared (NIR) spectroscopy for determining moisture content and impurity level of seed cotton. A total of 100 cotton samples collected from eight cotton ginners were used. Two spectrometers were employed, one a research level instrument (Foss NIRSystems 6500), the other with a reduced wavelength range more suitable for use at-line (InfraXact Lab). Moisture content was measured using a moisture meter, which is used in cotton industry, and by a drying oven technique. Impurity level was determined by gravimetric analysis. Partial least square regression and classification were performed for moisture and impurity level of cotton, respectively. In sample preparation, the NIRSystems 6500 with a back cover of the sample cell was better in repeatability of spectra than the InfraXact Lab with no back cover. For moisture, the best calibration was developed by using the reference values from the oven drying method and using the first derivative and standard normal variate and detrending as pre-processing of the spectral data, giving a standard error of 0.44% in the range of 5.83–14.96% moisture content. The classification model for the impurity level was developed with a combination of first derivative and multiplicative scatter correction of the spectral data and resulted in an accuracy of 80%. For both moisture and impurity parameters, using the NIRSystems 6500 instrument gave slightly better results than using the InfraXact Lab. Keywords: cotton, quality control, near infrared spectroscopy, moisture content, impurity levels Introduction A.J. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 421–429 (2008) received: 27 november 2007 n revised: 19 June 2008 n accepted: 4 July 2008 n publication: 28 august 2008 422 Quality Control of Seed Cotton In this paper, near infrared (nIr) spectroscopy is proposed as an alternative technology for the quality control of seed cotton using the parameters described above. there is very little work on this subject, although nIr spectroscopy has been used for evaluating the quality of the fibre in seed cotton (fineness, maturity and micronaire measurements), 3–6 their properties 7–8 as well as for detecting mixtures. 9–11 therefore, given the importance of moisture as regards the final fibre quality and its economic impact on the cotton sector, it was decided to measure moisture predictions by nIr spec- troscopy, using the reference values obtained by the current cotton industry determinations (moisture meter method), and other, such as moisture determination using the oven drying method. Hence, higher levels of accuracy and precision could be obtained for predicting moisture content of the seed cotton by nIr, which is a key parameter when assessing the amount of funding received by farmers, and therefore has important financial repercussions, as well as influencing the quality of the fibre obtained. Similar importance is given to the level of impurities, through which discriminatory models for the detection of cotton with unacceptable standards will be estab- lished (greater than 3% impurities). the nIr analyses were performed using two kinds of spec- trophotometers which belong to different generations of nIr instruments. one of them is suitable for working basically “at-laboratory”. the other is qualified for controlling raw material intake “at-line”, and its use in industry is growing, in spite of the fact that the predictive ability of the models may be lower. the transferability between both instruments is possible if necessary. thus, in this paper both instruments were compared to study the similarity of the obtained models. Material and methods Samples the experiment consisted of collecting a total of 100 samples from eight cotton ginners distributed throughout the region of andalusia (southern Spain), with the objective of obtaining a representative group. the samples were received at the Ifapa-centro ‘alameda del obispo’ (andalusian Institute of food and agriculture research) in four periods distributed over 38 days. the number of samples from each cotton ginner was not homogeneous due to the shortness of the cotton harvest season (approxi- mately 1 month), which was also affected by adverse weather conditions. to obtain variability, the sample collection process involved making an overall sample from three sub-samples taken from different points of each truck that arrived at the cotton ginner. these sub-samples were then mixed and homogenised to finally obtain a representative sample that was packaged, labelled and transported to the Ifapa-centro ‘alameda del obispo’. Samples ranged from 200 g to 350 g. this procedure is described in the Spanish standards. 12 Reference methods Moisture Moisture content was measured using a digital moisture meter (cotton Moisture Meter ® , c-2000 model; delmhorst Instrument company, towaco, nJ, uSa). It measures the moisture content (%) in seed cotton based on the relationship between moisture content and electrical resistance. the elec- trode used was a delmhorst ® cotton electrode (model 37 e/c) recommended for fibres on cones and skeins with a 2.54 cm penetration. the moisture meter takes approximately 3 s to obtain a stable reading. the determination of moisture was carried out in the unloading bay, next to the truck, though in this study, the values were measured again once the samples were received at the Ifapa-centro ‘alameda del obispo’. the analysis procedure consisted of taking five readings, then the highest and lowest readings were removed, and finally the average of the remaining three was calculated. the value obtained was rounded out to the nearest half point. this method is described in the national standards of Spain. 12 Figure 1. Author: Antonio J. Gaitán-Jurado Title: Near Infrared applications in the quality control of seed cotton A B 21 Figure 1. Sample reception arrangement (A); moisture determination by moisture meter (B). A.J. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 421–429 (2008) 423 the illustrations in figure 1 show how the samples were arranged for their reception at the centre (a), and how the readings with the moisture meter were performed (B). Moisture content was also determined by drying 15–20 g of sample at 100°c for 22–24 hours using an oven (J.p. Selecta Sa, Barcelona, Spain, digitheat 52l mod. 2001243, natural convection with temperature, time regulation and digital reading). the moisture values reported here are expressed as a percentage of the initial weight. In order to study the similarity of the results obtained between the two procedures (moisture meter vs oven drying) an analysis of variance (anoVa) was performed on both methods with the whole experimental sample (100 repeti- tions). the software used for this purpose was Statistix v8.0 (analytical Software, tallahassee, fl, uSa). Impurities the quantity used for the determination of impurities by gravi- metric analysis was the whole sample less the 15–20 g which was used to determine the moisture content by oven drying (figure 2). first, the quantity weighed was spread over a laboratory filter paper (42 cm wide, 52 cm length; figure 1, B), manually extracting (using tweezers) all the material that was not fibre or cotton seeds (plant remains, pieces of branches, kernels, leaves and soil etc.). this cleaning process was always carried out for impurities that could be separated easily, without removing fibre. this leaves cotton that only contains “tabaqillo” (leaf remains with a diameter equal to or lower than approxi- mately 3 mm). once the impurities were separated, they were weighed to obtain the percentage in weight with regard to the initial sample weight. this method is described in the national standards of Spain. 12 NIR analysis for the spectral information, 80 g of each sample were used. all samples were analysed by two nIr spectrophotometers. first, the spectra were recorded on a model 6500 (foss nIrSystems, Inc., Silver Spring, now laurel, Md, uSa) equipped with a reflectance detector with a transport module. Samples were placed in a rectangular transport cell (“natural products Sample Kit”) with a window surface of 94.9 cm 2 . the 80 g of cotton sample was divided into 40 g lots and duplicate spectra were collected from separately packed cells for each sample. When the samples were in place, the back of the rectangular transport cell was covered taking care to exercise the same pressure over the sample. the spectra were acquired at 2 nm intervals over a wavelength range from 400 nm to 2500 nm (visible plus nIr region). the second nIr instrument used was an InfraXact lab (foss group). the spectral data were collected in the reflectance mode over a range of 570–1850 nm at 2 nm intervals. Samples were packed in a large round cell (“large sample cup”) with a borosilicate window (10.2 cm diameter), giving a surface area of 81.7 cm 2 . the scanning process allowed spectral measurements to be taken at different points of the sample as the capsule was rotated to 10 different posi- tions. the recorded spectrum is the average of these posi- tions. also duplicate spectra were collected from separately packed cells for each sample. unlike the nIrSystems 6500 instrument, samples were not covered. the spectra of both instruments were collected using a routine analysis software (ISIscan v2.81; Infrasoft International llc., port Matilda now State college, pa, uSa) software and saved as absorbance values of log(1/R). Analysis procedure figure 2 shows all the steps carried out from obtaining the sample to the storage of spectral information and reference analysis. Statistics the chemometric procedures developed for obtaining models that allow the quality control of seed cotton to be monitored by means of nIr technology are set out below. the software used for the different applications was WInISI III v1.50e (Infrasoft International). Root mean squared (RMS) duplicate spectra per sample were obtained recording a spec- trum on 40 g of sample. as a first step to their measurement, the RMS statistic was calculated to obtain a representative Figure 2. Analysis procedure: sample–NIR analysis–reference determinations. 424 Quality Control of Seed Cotton spectrum of each sample. 13 for this purpose, a cut-off limit for the RMS statistic was established in order to guarantee good quality of the spectral data. 14 therefore, samples that exceeded the previously mentioned limits were initially eliminated. the following expressions were applied to calculate RMS values: 2 1 () (1) n ij i j Y Yi RMS n = - = å 2 1 ( ) 1 (2) N j j STD RMS N = =- å 22 limit 1 1.036 1.036 (3) Km K K STD STD m STD = = =´ =´ å where n is the number of data (absorbance readings), Y ij is the absorbance value log(1/R) for sub-spectrum j at wavelength i (l i ) and Y — i is the absorbance value log(1/R) for the average spectrum of a sample at wavelength i (l i ). the RMS value obtained in each case was multiplied by 10 6 to work with more manageable data. the STD limit (standard deviation limit) values were used to obtain RMS limit . once the spectra of samples that exceeded the cut-off limit were eliminated, other spectra were obtained on the same samples, obtaining new RMS values. If the new RMS value exceeded the limit again, this sample was marked as not suit- able to be included in the calibration set. pca (principal components analysis) to reduce the number of variables [log(1/R)], pca was carried out. this analysis eliminates collinearity and redundant infor- mation that exists between variables. afterwards, the distance from each sample to the centre of the model was calculated in the new vectorial space defined by the principal components. the Mahalanobis distance (H) was used and the criterion to consider a sample as spectrally anomalous was H > 3 . 13 five pcas were carried out on each sample presentation form (nIrSystems and InfraXact lab instruments). In each pca, mathematical treatment was carried out on the spectroscopy signal (derivative and/or scatter correction). Samples were considered anomalous if anomalies appeared in at least three of the five mathematical treatments applied. predictive model the original samples (N = 100) were divided into a calibration set (N = 80) and validation set (N = 20) by random selection. partial least squares (plS) regression was used to develop calibration models with internal cross validation (six cross validation groups) to avoid overfitting. In this way, the calibra- tion set was divided into six groups, five for calibration and one for validation. thus, one group of the calibration samples was removed. a calibration model was built on the remaining samples. this procedure was repeated for all groups. the software picked out the equation presenting the lowest cross validation error. the pre-processing for the spectral data included first and second derivatives with different gap and smoothing sizes, multiplicative scatter correction (MSc) and standard normal variate and detrending (SnVdt). two wavelength regions of vis+nIr and nIr were, respectively, used for both instruments. for each method (moisture meter and oven drying), a total of 34 calibration models were developed using each instru- ment, here 32 models were built with pre-processing (figure 3) and two models with no pre-processing (no derivative and no scatter correction). the performance of each plS model was reported as deter- mination coefficient (R 2 ) and standard error of cross validation (SECV). prediction performance was reported as a coefficient in external validation (r 2 ), standard error of prediction (SEP) and the slope. furthermore, to evaluate the predictive ability of the calibration models, the residual predictive deviation (RPD) was used. the RPD is the relationship between the standard deviation (SD) of the reference values and the standard error of prediction (SEP). If the RPD > 3, the predictive ability of the model could be considered very good. 15 Models of level differentiation these models were designed to establish a sample detec- tion system that identifies an impurity level considered to decrease the quality of seed cotton analysed. the impurity level of the original samples (N = 100) ranged from 0.6% to 6.45%. the level currently recognised in the Spanish cotton industry is 5%. 16 the established limit in this work was 3%, mainly for two reasons: one is that 97% of Spanish cotton is produced in the andalusia region and most of this percentage goes to industries with impurity levels ranging from 1.6% to 3%. 17 the other reason is that, if the models discriminate Figure 3. Author: Antonio J. Gaitán-Jurado Title: Near Infrared applications in the quality control of seed cotton Derivative Treatments 1 1,4,4 2,4,4 1,5,5 2,5,5 1,8,4 2,8,4 1,10,5 2,10,5 Derivative Treatments 1 1,4,4 2,4,4 1,5,5 2,5,5 1,8,4 2,8,4 1,10,5 2,10,5 X Scatter Corrections 2 SNVDT MSC Scatter Corrections 2 SNVDT MSC X Spectral Ranges NIRSystems 6500 Infra Xact VIS+NIR (400 – 2498n m) (570 – 1848n m) NIR (1100 – 2498nm) (1100 – 1848nm) Spectral Ranges NIRSystems 6500 Infra Xact VIS+NIR (400 – 2498n m) (570 – 1848n m) NIR (1100 – 2498nm) (1100 – 1848nm) 1 #,#,# : Derivative order, gap size (nm), amount of smoothing 2 SNVDT : St an dard Norm al Variat e an d De-T ren din g; M SC: M ult ip licat iv e Scatt er Co rrect ion 23 Figure 3. Pre-processing applied for the spectra to obtain the models. A.J. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 421–429 (2008) 425 between impurity levels of 3%, success in differentiating 5% will be higher. the algorithms used were discriminant analysis by means of plS regression equations (plS-da). the classification models were obtained using the same pre-processing shown in figure 3. the same sample sets (calibration and validation) employed to calculate predicting models were used for the development of these models. of the 80 samples used for calibration, 46 samples were lower than 3% and 34 samples higher than 3% in impurity percentage. Results and discussion Vis/NIR spectra features figure 4 shows the seed cotton spectra obtained from both nIr instruments. the average spectra of the groups with impurity levels greater and lower than 3% are plotted. all the spectra presented similar patterns, though the main differ- ences were found in the visible (400–800 nm) and in the lower near infrared region (800–1100 nm). other slight differences were found, using both instruments, at 1420–1550 nm and 1650–1848 nm. In the spectra obtained from the nIrSystems 6500 instrument (1920–2030 nm, 2230 nm and 2400 nm), some slight differences were found. these variations were due to the difference in particle size and composition, and the impurities contributed to these factors. the impurities and the cotton fibres are different in colour, so the mean spectra showed differences in the visible region. the cotton fibre possesses more than 90% pure cellulose; hence differences were observed in spectral regions where this compound absorbs vis/nIr radiation (758 nm, 982 nm, 816 nm, 914 nm, 1004 nm, 1428 nm, 1588 nm, 1636 nm, 1702 nm, 1748 nm, 1828 nm, 1930 nm). 18 Moreover, the water absorption bands also contributed to differentiate the spectra with different levels of moisture (810 nm, 894 nm, 964 nm, 1460 nm, 1778 nm, 2210 nm). 18 Spectral repeatability of sub-samples to obtain quality spectral information, the limit of the RMS statistic was calculated with the spectral information acquired from the two spectrophotometers used. this statistic value indicates the similarity between the spectra of each sample; a lower RMS value means more similarity. the cut-off limit established for the nIrSystems 6500 instrument was 20,000, and five samples exceeded this value. therefore, they were analysed again to detect whether their initial values were caused by error sources due to the anal- ysis method (seed cotton proves a high level of heterogeneity and packing this material into the cell is not a homogeneous process, differences in particle size, area scanned, force applied etc.) or they presented characteristics that systemati- cally caused high RMS values and hence they should be elimi- nated from the experimental group. the repeatability between sub-samples (RMS) in the new spectra obtained was within the established limit (<20,000), and they were subsequently included in the experimental group. With the InfraXact lab instrument, the cut-off limit was raised to 55,000, with six samples exceeding this value. When the spectral acquisition of these samples was repeated, no sample exceeded the limit, so they were also included in the group. figure 5 shows the individual RMS values obtained from the spectral data of the seed cotton samples scanned on both instruments, where the horizontal line is the RMS cut-off limit. as these figures show, the RMS values obtained with the InfraXact lab instrument are generally higher than those obtained with the nIrSystems 6500. also less variability can be seen in the data obtained from the nIrSystems 6500 spec- trophotometer. this is probably due to the difference in sample preparation for scanning. for the nIrSystems 6500 instru- ment, the samples were placed in the cell and compacted with a back cover, giving a similar force between samples. However, for the InfraXact lab instrument, samples were placed in the cell with no back cover; thus, the force between samples could be different. Montalvo et al. 19 theorised the importance of the area of samples scanned and the force applied to press the fibres into the sample cell. these authors confirmed that packing the raw fibres into the cell by hand caused spectroscopy outliers Figure 4. Author: Antonio J. Gaitán-Jurado Title: Near Infrared applications in the quality control of seed cotton 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 400 620 840 1060 1280 1500 1720 1940 2160 2380 Wavelength (nm) l o g ( 1 / R ) Impurity level < 3% Impurity level > 3% A , l o g ( 1 / R ) 0,2 0,3 0,4 0,5 570 790 1010 1230 1450 1670 Wavelength (nm) l o g ( 1 / R ) Impurity level < 3% Impurity level > 3% B l o g ( 1 / R ) 24 Figure 4. Mean spectra of the two impurity level groups (<3%, >3%) from NIRSystems 6500 (A) and InfraXact Lab (B). 426 Quality Control of Seed Cotton resulting from packing instability and the intrinsic differences in the material. Principal component analysis only one sample was eliminated from the experimental group due to the fact it had a Mahalanobis distance greater than H = 3, which came from an analysis carried out with the nIrSystems 6500 instrument. an important aspect was the clustering observed in the experimental group when the first three principal compo- nents were represented (figure 6). these representations were obtained once the pca was performed with a first-deriv- ative spectral pre-treatment and standard normal variate and detrend scatter correction. a level of clustering is observed between samples from different origins (eight cotton factories). this characterisation is due to differences in the geographic origin of the samples and differences in composition, conditioned by agroclimatic (rain, temperature, hours of sun, edaphological attributes, crop treatments, crop years etc.) and other factors such as varieties. the information related to varieties was not known because the delivery control document of seed cotton from andalusia cotton ginners does not contain this information. NIR moisture predictions by moisture meter and oven drying the moisture values from the moisture meter were compared to those obtained by calculating differences in weight (22–24 h at 100°c) using variance analysis (anoVa). the results showed that the probability of obtaining a random value of F = 5.31 was P = 0.02 (P < 0.05), consequently the two methods (moisture meter and oven drying) give significantly different values. as this comparison shows, the moisture values obtained by taking the samples to constant weight in the oven were higher and more varied (higher range and SD). thus, there was a percentage difference of 7.39% between the means of both methodologies. this difference was relative to the moisture meter results. to a certain extent, the differences were due to the lower accuracy of the moisture determination process by moisture meter, since, in the protocol for the determination of acceptance criteria for Figure 6. Author: Antonio J. Gaitán-Jurado Title: Near Infrared applications in the quality control of seed cotton 26 Figure 6. Principal Component Analysis (PC1, PC2 and PC3) with first derivative and SNV scatter correction pre-processing from NIRSystems 6500 (A) and InfraXact Lab (B) for samples from eight regions (numbers 11–18). Figure 5. Author: Antonio J. Gaitán-Jurado Title: Near Infrared applications in the quality control of seed cotton 0 50000 100000 150000 200000 SAMPLES R M S x 1 0 6 RMS limit = 20000 NIRSystems 6500 0 50000 100000 150000 200000 SAMPLES R M S x 1 0 6 RMS limit = 55000 InfraXact Lab 25 Figure 5. Root mean squared (RMS) values. A.J. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 421–429 (2008) 427 seed cotton samples in Spanish industries, the values obtained by moisture meter are rounded out to the nearest half point. In contrast, the oven method for moisture content could be biased, as admitted in the aStM methods. the major source of bias is the loss of other volatile material (organic compounds), all of which is taken as weight lost as water. table 1 shows the statistics of the moisture contents of the calibration and validation samples. tables 2 and 3 show the results of plS models for the prediction of moisture content using the nIrSystems 6500 and InfraXact lab instruments, respectively. the nIrSystems 6500 produced slightly better results than the InfraXact lab in both methods (moisture meter and oven drying), giving lower SECV, SEP and slopes closer to one, and higher RPD, although in all cases the RPD values were >3. this result may be due to the difference in the wavelength regions used and in sampling. the nIrSystems 6500 instru- ment worked in the range of 400–2498 nm, which includes all the information about water (level of strong absorption: 1410, 1460 and 1906 nm; level of middle absorption 718, 758 and 964 nm; level of weak absorption: 810, 894, 1116, 1154, 1778 and 2208 nm). 18 on the other hand, the InfraXact lab instrument worked in the range of 570–1850 nm, missing 1906 nm and 2208 nm. for sampling, the InfraXact lab had higher variation between samples (lower repeatability) than the nIrSystems 6500. In addition, the windows surface is slightly larger in this spectrophotometer compared to the InfraXact lab (94.9 cm 2 vs 81.7 cm 2 ). a previous study, 19 also reported that the spectral precision for seed cotton is strongly dependent on the area of sample scanned and the force applied to press the fibres into a smooth mat against the quartz surface of the sample cell. for the reference method, using the moisture value by the oven drying method gave slightly better results in valida- tion (SEP and slope) than using the value by moisture meter, indicating that oven drying method is more precise than the moisture meter for predicting moisture content. the best moisture model was developed from the nIrSystems 6500 and the reference value by oven drying and the SEP was 0.44%. the pre-processing used for the best model was 1 st derivative and SnVdt. Similar pre-processing has been described in studies of related products (fibre, textile industry etc.). thus, durand et al., 20 working on different approaches to select vari- ables to study nIr multivariate calibration of textile (cotton content), used SnV and second derivative. the same treat- Calibration (n = 80) Validation (n = 20) reference method Mean range SD Mean range SD Moisture meter 8.94 6.50–13 2.07 9.32 5–13 2.35 oven drying 9.67 5.83–14.96 2.27 9.91 6.83–13.47 2.39 Reference method Selected model PLS Calibration Validation Derivative Scatter correction Region SECV (%) R 2 SEP (%) Slope r 2 RPD Moisture meter 2,10,5 MSc Vis+nIr 5 0.44 0.95 0.46 1.12 0.97 5.11 oven drying 1,10,5 SnVdt Vis+nIr 3 0.43 0.96 0.44 1.03 0.97 5.43 Reference method Selected model PLS Calibration Validation Derivative Scatter correction Region SECV (%) R 2 SEP (%) Slope r 2 RPD Moisture meter 1,5,5 MSc nIr 5 0.45 0.95 0.49 1.15 0.97 4.78 oven drying 1,4,4 MSc Vis+nIr 6 0.46 0.95 0.46 1.09 0.97 5.2 Table 1. Mean, range and standard deviation (SD) of moisture content (%) (moisture meter and oven) of cotton for calibration and validation sample sets. Table 2. Results of calibration and validation for moisture content of seed cotton by the NIRSystems 6500 instrument. Table 3. Results of calibration and validation for moisture content of seed cotton by the InfraXact Lab instrument. Selected model PLS Calibration Validation Instrument Deriv. Scatter correc. Region Incorrect samples Correct samples Accuracy Incorrect samples Correct samples Accuracy nIrSystems 6500 1,8,4 MSc nIr 7 16 64 80% 4 16 80% InfraXact lab no no nIr 4 23 57 71% 6 14 70% Table 4. Discriminant models selected to distinguish impurity levels of 3%. 428 Quality Control of Seed Cotton ment was used by Blanco et al. 21 to control the acrylic fibre manufacturing process through near infrared. langeron et al., 22 when classifying textile products using nIr spectroscopy, also applied SnV to the spectra, but the derivative pre-treat- ment was not indicated. Differentiation of impurity level the models selected to detect samples with impurity levels greater than 3% are shown in table 4. In both instruments, the classification model was best performed with nIr region. In this case, the first derivative along with multiplicative scatter correction (MSc) was selected for the nIrSystems 6500 spectrophotometers. on the other hand, the best model for the InfraXact lab instrument was obtained from raw spectra. In these equations, the analysis carried out with the spectra obtained from the nIrSystems 6500 clearly performed better, obtaining a classification error of 20% compared to 29% from the InfraXact lab instrument. Similarly, the classification error obtained with the external validation set was 20% compared to 30% with the InfraXact lab instrument. as mentioned previously, this difference between instruments was due to two fundamental aspects: the larger working spectral range of the nIrSystems 6500 instrument; and the fact that each sample was more representative due to higher repeatability in the spectra acquisition process. figure 7 shows the distribution of the impurity level in the calibration set (N = 80). there are 12 samples closer to the established limit of impu- rities (3%); six samples between 2.8% and 3% and six between 3% and 3.2%. this sample group represent an important percentage (15%) of the calibration set. undoubtedly this fact and the handling process of the reference method increase the classification error obtained in the models. Conclusions the moisture values of the seed cotton samples determined by weight differences in the oven drying were significantly different to those obtained by the method currently used for the quality control of seed cotton (moisture meter). the nIr spectroscopy predictions of moisture in seed cotton gave high accuracy and precision for both reference methods employed (oven drying, moisture meter) and instruments (nIrSystems 6500 and InfraXact lab). the best results were obtained with the moisture calibrations by weight difference on oven drying and samples analysed with the nIrSystems 6500 spectrophotometer. the use of nIr technology for quality control in seed cotton in industry, through the models developed with moisture values determined from weight differences on oven drying, is justified. the nIrSystems 6500 instrument is capable of differen- tiating cotton samples with different levels of impurities. therefore the establishment of an alert/alarm system is feasible, although the models developed must be improved in order to increase their accuracy. 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Distribution of impurity levels of calibration set [n = 46 (<3%), n = 34 (>3%)]. A.J. Gaitán-Jurado et al., J. Near Infrared Spectrosc. 16, 421–429 (2008) 429 spectra”, Appl. Spectrosc. 60, 539–544 (2006). doi: 10.1366/000370206777412194 10. M. Sohn, d.S. Himmelsbach, d.e. akin and f.e. Barton II, “fourier transform near-infrared spectroscopy for determining linen content in linen/cotton blend products”, Text. Res. J. 75, 583–590 (2005). doi: 10.1177/0040517505057167 11. d.y. Jia and t.H. ding, “detection of foreign fibers in cot- ton using near-infrared optimal wavelength imaging”, Opt. Eng. 44, 076402 (2005). doi: 10.1117/1.1948377 12. coordinación técnica de actuaciones para la gestión de las ayudas comunitarias en el sector del algodón. circular nº 24/2006. Subdirección general de armoniza- ción normativa y sistema integrado (2006). 13. J.S. Shenk and M.o. Westerhaus, Routine operation, cali- bration, development and network system management manual. nIr Systems Inc, Silver Spring, Md, uSa (1995). 14. J. García-olmo, e.J. de pedro and a. Garrido-Varo, “Methodological aspects on near infrared analysis of Iberian pig fat using interactance-reflectance fiber optic mode”, J. Near Infrared Spectrosc. 6, 307–312 (1998). 15. p. Williams, Near-infrared technology—getting the best out of light. A short course in the practical implementation of near-infrared spectroscopy for the user, edn 5.3. pdK projects, Inc., nanaimo, canada (2008). 16. Mapa. organizaciones comunes de Mercado y regímenes de ayudas. régimen de ayudas al algodón. http://www.mapa.es/es/agricultura/pags/ocm/ayudas_ algodón.htm# 17. BoJa núm. 218, de 10/11/2006. orden de 25 de octubre de 2006, por la que se modifica el de 27 de noviembre de 2002, por la que se aprueba el reglamento especígico de producción Integrada de algodón. 18. p.c. Williams and K.H. norris (eds), Near-infrared tech- nology in the agricultural and food industries, 2 nd edn. american association of cereal chemists, St paul, Minnesota, uSa (2001). 19. J.G. Montalvo, S.e. Buco and H.H. ramey, “Studies to measure cotton fibre length, strength, micronaire and colour by vis/nIr reflectance spectroscopy. part II: principal components regression”, J. Near Infrared Spectrosc. 2, 185–198 (1994). 20. a. durand, o. devos, c. ruckebush and J.p. Huvenne, “Genetic algorithm optimisation combined with partial least squares regression and mutual information vari- able selection procedures in near-infrared quantitative analysis of cotton–viscose textiles”, Anal. Chim. Acta 595, 72–79 (2007). doi: 10.1016/j.aca.2007.03.024 21. M. Blanco, J. coello, H. Iturriaga, S. Maspoch and J. pagès, “use of near-infrared spectrometry in control analyses of acrylic fibre manufacturing proceses”, Anal. Chim. Acta 383, 291–298 (1999). doi: 10.1016/S0003- 2670(98)00804-6 22. y. langeron, M. doussot, d.J. Hewson and J. duchêne, “classifying nIr spectra of textile products with kernel methods”, Artif. Intell. 20, 415–427 (2007). doi: 10.1016/j. engappai.2006.07.001 ANEXO VI Resumen y póster “IV Congreso de Ingeniería y Tecnología de Alimentos” Ortiz,V., Peña, F., Gómez, L., Pérez, J., Gaitán, A.J. “Estudio de viabilidad para el establecimiento de sistemas de control de tiabendazol en naranja intacta aplicando tecnología NIRS” CESIA 2006, Libro de resúmenes (Innovación y seguridad) p 154 (ISBN 84-601-3263- 7). Publicación y póster en el “V Congreso Iberoamericano de Tecnología Postcosecha y Agroexportaciones. Tecnología, Calidad y Seguridad Hortofrutícola” F. PEÑA, J. PÉREZ, A. J. GAITÁN y V. ORTIZ “Estudio sobre la respuesta espectroscópica en el Infrarrojo Cercano a niveles de tiabendazol inferiores al límite máximo de residuos sobre naranja intacta” pp 248-258. ISBN: 978-84-95781-85-7 Anexo VI 353 ESTUDIO DE VIABILIDAD PARA EL ESTABLECIMIENTO DE SISTEMAS DE CONTROL DE TIABENDAZOL EN NARANJA INTACTA APLICANDO TECNOLOGÍA NIRS Ortiz,V. * ; Peña, F.; Gómez, L.; Pérez, J .; Gaitán, A.J . IFAPA – CIFA Alameda del Obispo Avda. Menéndez Pidal, s/n; A.C. 3092, 14.080 CÓRDOBA (España) victor.ortiz@juntadeandalucia.es La presencia de residuos fitosanitarios poscosecha presentes en naranjas, es un factor que afecta en gran medida a la calidad final del zumo obtenido de las mismas. En este sentido, se diseñó un experimento para detectar naranjas que presenten niveles superiores al Límite Máximo de Residuos (LMR) de tiabendazol, funguicida comúnmente aplicado en centrales hortofrutícolas. La tecnología empleada para tal fin fue la Espectroscopia de Infrarrojo Cercano (NIRS). Se trabajó con un colectivo inicial de 98 naranjas, agrupadas en tres categorías: naranjas sin ningún tipo de tratamiento (N=28), naranjas lavadas, secadas y con aplicación de ceras (N=33), y naranjas con el mismo tratamiento que las anteriores, pero con una concentración en el agua de lavado de 0.5% de tiabendazol. De cada naranja se obtuvieron 8 espectros, 6 tomados en puntos ecuatoriales, más 2 tomados de la base. Para el diseño de los modelos de discriminación se emplearon tres estrategias: cálculos con los 8 espectros obtenidos por muestra, tan solo con los espectros ecuatoriales, y solo con los espectros de la base. Asimismo, se aplicaron combinaciones de tratamientos matemáticos sobre la señal espectroscópica para corregir desviaciones de la línea base e irregularidades superficiales de las naranjas. El mejor modelo se obtuvo con los espectros ecuatoriales, alcanzando un error de clasificación de 7.29%. Este valor aumentó hasta un 14% cuando se trabajó con los 8 espectros / muestra, y hasta un 16% con los 2 espectros de la base. Según estos resultados, obteniendo información espectral NIR en zonas próximas al ecuador de las naranjas, se podría establecer un sistema de detección de residuos de tiabendazol sobre naranjas intactas ESTUDIO DE VIABILIDAD PARA EL ESTABLECIMIENTO DE SISTEMAS DE CONTROL DE TIABENDAZOL EN NARANJA INTACTA APLICANDO TECNOLOGÍA NIRS Ortiz,Victor*1; Peña, Francisco 1; Gómez, Lucas 1; Pérez, Jesús 2 y Gaitán, Antonio Jesús 1. 1. IFAPA – CIFA “Alameda del Obispo”. Córdoba Avda. Menéndez Pidal, s/n; A.C. 3092, 14.080 CÓRDOBA (España) 2. IFAPA – CIFA “Palma del Rio”. Córdoba Avda. Rodríguez de la Fuente, s/n - 14700 Palma del Río (Córdoba) España *victor.ortiz@juntadeandalucia.es INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN La presencia de residuos fitosanitarios postcosecha presentes en naranjas, es un factor que afecta en gran medida a la calidad final del zumo obtenido. Aunque las naranjas empleadas en la preparación de zumos son las que llevan menos tratamientos de conservación, es posible en algunos casos, que las naranjas procedan de centrales hortofrutícolas, en donde aunque se sigan adecuadamente, los plazos establecidos por las instrucciones de los productos aplicados en su tratamiento de conservación, se pueda dar el caso de que lleguen a la factoría, naranjas con altas concentraciones de los funguicidas empleados en ese tratamiento. En este sentido, se diseñó un experimento para detectar naranjas que presenten niveles superiores al Límite Máximo de Residuos (LMR) de tiabendazol (TBZ), funguicida comúnmente aplicado en centrales hortofrutícolas. Citrus sinensis (L.) Osbeck, var. Valencia Late TRATAMIENTOS SIN TRATAMIENTO (B) LAVADAS Y ENCERADAS (LC) LAVADAS ENCERADAS + TIABENDAZOL AL 0.5% (LCTBZ) Lectura en posición axial, empleando un equipo FOSS NIRSystems 6500 SYII, con el módulo Direct Contac Analyzer. LECTURAS EN VIS-NIR 2 Lecturas AXIALES (A) 400-2500 nm En total se obtuvieron 1343 espectros. Se eliminan con RMS alto, 215. A los espectros obtenidos se les aplicaron tratamientos de análisis multivariante, empleando WinISI III. 6 ECUATORIALES (E) TRATAMIENTOS SELECCIONADOS PARA ESPECTROS (VIS+NIR) OBTENIDOS EN POSICIÓN A Derivada Correciónscatter FactoresPLS ETVC Muestrasmal clasificadas Error clasificación (%) 0,0,1 Ninguna 6 0.36 11 16,9 1,4,4 Ninguna 6 0,40 15 23,1 0,0,1 SNV y DT 6 0,39 17 26,1 TRATAMIENTOS SELECCIONADOS PARA ESPECTROS (VIS+NIR) OBTENIDOS EN POSICIÓN A+E Derivada Correciónscatter FactoresPLS ETVC Muestrasmal clasificadas Error clasificación (%) 2,4,4 MSC 6 0.34 13 14,1 2,4,4 SNV y DT 6 0,33 13 14,1 2,4,4 Ninguna 5 0,35 14 15,2 TRATAMIENTOS SELECCIONADOS PARA ESPECTROS (VIS+NIR) OBTENIDOS EN POSICIÓN E Derivada Correciónscatter FactoresPLS ETVC Muestrasmal clasificadas Error clasificación (%) 2,4,4 MSC 12 0,32 7 7,3 2,4,4 SNV y DT 12 0,32 7 7,3 2,4,4 Ninguna 12 0,33 11 11,5 B LC LCTBZ B 100 0 0 LC 0 91 11 LCTBZ 0 9 89 INVESTIGACIÓN FINACIADA CON LOS FONDOS DEL PROYECTO INIA, RTA 2005-00043-00-00 Matriz de clasificación con porcentajes para el mejor tratamiento en posición E Los resultados, muestran la capacidad de la tecnología NIRS en la detección de residuos en fruta entera. A partir de los espectros NIR obtenidos en naranjas enteras, en sus zonas ecuatoriales, se podría establecer un sistema de detección rápida de tiabendazol B LCTBZ LC B LC LCTBZ A+E 28 29 35 A 23 20 22 E 28 33 35 Muestras por tratamiento V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 248 (S2-P130) ESTUDIO SOBRE LA RESPUESTA ESPECTROSCÓPICA EN EL INFRARROJO CERCANO A NIVELES DE TIABENDAZOL INFERIORES AL LÍMITE MÁXIMO DE RESIDUOS SOBRE NARANJA INTACTA F. PEÑA, J. PÉREZ, A. J. GAITÁN y V. ORTIZ IFAPA – CIFA Alameda del Obispo Avda. Menéndez Pidal, s/n; 3092, 14.080 CÓRDOBA (España) victor.ortiz@juntadeandalucia.es Telf./Fax +34 957 016 000 / +34 957 016 043 Palabras clave: naranjas – NIRS - control de calidad - límite máximo de residuos - tiabendazol RESUMEN En la unión europea, todos los alimentos están sujetos a un límite máximo de residuos de plaguicidas (lmr) para evitar riesgos sobre la salud. El tiabendazol es un fungicida comúnmente aplicado en centrales hortofrutícolas, fijando un lmr de 5ppm en naranjas. En el presente trabajo, se estudió la viabilidad de aplicación de la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS), obteniendo predicciones de tiabendazol sobre naranja intacta sobre niveles inferiores al LMR (0,2-3,9ppm). El colectivo experimental lo constituían naranjas lavadas con aplicación de tiabendazol en el agua de lavado, y naranjas a las que además se les aplicaron ceras. Se emplearon 3 estrategias para adquirir la información espectral: seis espectros obtenidos sobre puntos ecuatoriales, dos espectros obtenidos sobre la región de la base (extremo distal), y ocho espectros, suma de los anteriores. En el desarrollo de los modelos se emplearon regresiones múltiples PLS, utilizando 112 muestras con espectros del ecuador, e idénticos valores con la suma de la base y ecuador, descendiendo a 77 muestras, con los espectros de la base. Asimismo, se ensayaron combinaciones de tratamientos de derivadas y corrección de radiación dispersa sobre la señal espectroscópica. Según los resultados, los espectros del extremo distal (base) no fueron adecuados para predecir los niveles de tiabendazol planteados. En cambio, los modelos obtenidos con espectros del ecuador, o suma del ecuador y base, fueron válidos y similares. Los errores en calibración fueron ETC=0,3-0,36ppm, obteniendo un R 2 =0,83-0,79 respectivamente. La validación externa obtuvo unos valores de ETP=0,33-0,36ppm, y R 2 =0,85-0,73. De este modo, la tecnología NIRS permite cuantificar con buena precisión niveles de tiabendazol inferiores al LMR sobre naranja intacta. STUDY OF THE NEAR INFRARED SPECTROSCOPY RESPONSE TO THIABENDAZOLE LEVELS LOWER THAN THE MAXIMUM RESIDUE LIMIT ON INTACT ORANGE Key words: Oranges – NIRS - Quality Control - Maximum Residue Limit - Thiabendazole V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 249 In the European Union all food is subject to Maximun Residue Limit (MRL) to avoid health risks. Thiabendazole is a fungicide commonly applied in horticultural preparation centre, with a MRL of 5ppm in oranges. In the present study, the viability of near infrared spectroscopy has been studied, obtaining predictions of thiabendazole on intact oranges of lower levels of MRL (0,2-3,9ppm). The first experimental group of oranges was washed in water containing thiabendazole. The second group, were also treated with waxes. In order to obtain spectral information, three strategies were used: six spectra were obtained at equatorial points, two spectra were obtained on the base regions (distal extreme), and eight spectra, sum of the previous. There were used Modified Partial Least Squared Regressions (MPLSR) to develop the models, using 112 samples with the equatorial spectra, and identical values with the sum of the base region and equator, descending to 77 samples, with the base region spectra. Likewise, derivative treatment combinations and scatter corrections were practiced on the spectroscopy signal. It was concluded that the spectra on the base region were not adequate to predict the thiabendazole levels evaluated. On the other hand, that ones obtained with spectra on the equator, or sum of equator and base were high-quality. Calibration errors were SEC=0,3- 0,36ppm with R 2 =0,85-0,73 respectively. So that, NIRS technology is an accurate tool to quantify the thiabendazole levels lower than MRL on intact orange. INTRODUCCIÓN En la última década, se ha producido un incremento en la demanda con respecto a la calidad y la seguridad alimentaria. Esta demanda se ha generado de forma paralela a un crecimiento en la conciencia medioambiental por parte de los consumidores, provocando mayores niveles de exigencias a los productores alimentarios en cuanto a evaluaciones de calidad de sus productos. En este sentido, juega un papel importante el control sobre los plaguicidas comúnmente aplicados en la agricultura mundial. Estos productos, por un lado han contribuido a la obtención de niveles de producción adecuados, para satisfacer la demanda mundial de alimentos, pero por otro, han creado resistencias en los cultivos ante los mismos, causando en algunos casos situaciones de sobre-aplicación, que generan situaciones de riesgo sobre la salud humana y animal. Así, los países desarrollados están siendo cada vez más exigentes con la aplicación de este tipo de productos en la agricultura. En la Unión Europea (UE), los alimentos destinados a consumo humano o animal están sujetos a un Límite Máximo de Residuos de plaguicidas (LMR), para garantizar que la presencia de estos compuestos no constituya un riesgo para la salud de los consumidores. El Reglamento (CE) nº 396/2005 regula los límites máximos de residuos de plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal. De este modo, se aprecia la necesidad de implantación de tecnologías que permitan un control de residuos de plaguicidas postcosecha de forma rápida y eficiente. En este sentido, la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) se plantea como herramienta para el establecimiento de sistemas de alerta on-line, en la detección de tiabendazol (plaguicida comúnmente aplicado en centrales hortofrutícolas, básicamente para control fúngico), siendo las naranjas el producto empleado para este estudio. En bibliografía, se conocen numerosas aplicaciones de esta tecnología para el control de calidad sobre fruta intacta en postcosecha. Investigadores han demostrado el potencial de la espectroscopia NIR para la determinación de azúcar en melocotones y mandarinas intactas desarrollando una instrumentación para clasificar fruto según el contenido de azúcar (Kawano V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 250 et al., 1992, 1993). Del mismo modo, Hernández Sánchez et al. (2003) determinaron el contenido de azúcar en manzanas, estudiando los factores que afectaban a la robustez de los modelos. Lammerty et al. (2000), compararon dos configuraciones ópticas de un espectrofotómetro y estudiaron la penetración de la radiación en manzanas. Otros trabajos sobre manzanas intactas, se han llevado a cabo para determinar daños en su interior, analizando en transmisión (Clark et al., 2003, McGlone et al., 2005). Asimismo, Mehinagic at al. (2004) desarrollaron un trabajo donde correlacionaban atributos sensoriales con espectros NIR. Analizando kiwis de forma intacta, Clark et al. (2004), estudiaron la madurez del fruto y obtuvieron predicciones de daños en almacenamiento mediante NIRS. Con la misma fruta, McGlone et al. (2002) determinaron predicciones de humedad y sólidos solubles. Con mango también se han predicho daños internos (Teerachaichayut et al., 2007), o su estado de madurez (Saranwong et al., 2004). A pesar de los trabajos descritos sobre la aplicación de la tecnología NIRS en fruta intacta, no se encuentra mucha información relacionada con residuos de plaguicidas. Saranwong y Kawano (2005) obtuvieron predicciones NIR de funguicidas en superficie de tomates, pero no se analizó sobre fruta intacta, ya que se empleó para su determinación una técnica donde se obtenían los espectros sobre un extracto seco (DESIR, Dry-Extract System for Infrared). Por lo tanto, es palpable la necesidad de desarrollar trabajos sobre determinaciones de plaguicidas en fruta intacta mediante NIRS. Así, el objetivo del presente trabajo se ha centrado en la obtención de modelos predictivos de tiabendazol sobre naranja intacta. Para obtener mayor fiabilidad con respecto a la aplicación de la tecnología, el rango predictivo se ha encontrado por debajo del LMR establecido por la Unión Europea (<0,5ppm). MATERIAL Y MÉTODOS Muestras. Aplicación de Tiabendazol El colectivo experimental inicial lo constituían aproximadamente 35kg de naranjas de la variedad Valencia Late, procedentes de una finca perteneciente al término municipal de Palma del Río (Córdoba). Las muestras se recibieron en las instalaciones del IFAPA-Centro de Palma del Río, el mismo día de su recolección, donde se efectuaron los diferentes tratamientos. En primer lugar, en el agua de lavado de la línea de procesado se añadió tiabendazol hasta llegar a una concentración del 0,5% p/v. Dado que en la industria citrícola la aplicación de ceras a las naranjas se efectúa según si se producen específicamente para zumo (no aplicación) y/o para su consumo en fresco, las naranjas fueron divididas en dos grupos, según se aplicase ceras o no. De este modo se representaba la variabilidad encontrada en la industria, permitiendo estudiar la sensibilidad de los modelos predictivos a la presencia de este producto, y analizando la influencia del mismo sobre los espectros NIR. Una vez lavadas y tratadas con tiabendazol el primer grupo, se procedió a una primera etapa de secado. A continuación, se retiraban de la línea de procesado, y se procedió a la inmersión en una emulsión de aceite-agua, a base de cera de polietileno y goma laca al 18% p/v, (Citrosol A, abrillantador para cítricos, tratamientos post recolección). Finalmente, se llevó a cabo otra etapa de secado. El segundo grupo se trató de forma idéntica, pero sin la aplicación de ceras, efectuándose las dos etapas de secado consecutivamente. La figura 1 esquematiza el proceso. Una vez efectuados los tratamientos, se conservaron en cámaras frigoríficas (4ºC, 80% HR), hasta ser transportadas al IFAPA-Centro “Alameda del Obispo” (Córdoba) para realizar el correspondiente análisis espectral NIR. V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 251 Análisis NIR Preparación de muestras. En primer lugar, las muestras fueron pesadas, calibradas e identificadas individualmente, para posteriormente efectuar una selección de las mismas. Esta selección se hizo para minimizar el efecto que pudiera producir la heterogeneidad de la piel, debido a malformaciones o daños causados por diversas patologías. De este modo, se asegura que la información espectral obtenida, sea realmente representativa de la piel de las naranjas analizadas. La figura 2 ejemplifica una serie de muestras que fueron eliminadas, principalmente por presentar síntomas destacados de decoloración de las células epidérmicas alrededor de glándulas de aceite (oleocelosis). El colectivo final seleccionado para el desarrollo de los modelos predictivos lo constituyeron 112 naranjas (57 con aplicación de ceras), que fueron almacenadas en refrigeración (4ºC) hasta la realización del análisis NIR, y posterior análisis de referencia. Adquisición de información espectral. El espectrofotómetro empleado para el análisis fue un monocromador modelo 6500 de FOSS NIRS Systems, trabajando en modo de reflectancia, con un recorrido de longitudes de onda de 400 a 2500nm, efectuando una lectura de absorbancia [log(1/R)] cada 2nm. Este equipo presenta una disposición modular, empleando para la realización del presente trabajo el módulo DCA (Direct Contanct of Food Analyzer), que permite analizar producto intacto, disponiendo el equipo de forma horizontal. Presenta una superficie de ventana circular regulable mediante un diafragma, que, en este caso fue de 2.5cm de diámetro. De cada naranja se obtuvieron 8 espectros, de los cuales 6 estaban distribuidos sobre puntos equidistantes en el ecuador, perteneciendo los dos últimos a la región de la base de la naranja (extremo distal). Con esta información, se llevaron a cabo tres estrategias de tratamiento de datos, esto es, se trataron todos los datos en conjunto (8 espectros/muestra), los obtenidos de la región ecuatorial (6 espectros/muestra), y los de la base (2 espectros/muestra). El programa empleado para la gestión y adquisición de espectros fue ISIscan v2.81. La figura 3 muestra la disposición de las naranjas en el equipo para la obtención espectral del ecuador (A), y del extremo distal (B). Análisis de referencia Una vez analizadas las muestras en el espectrofotómetro, se enviaban al Laboratorio Agroalimentario de Córdoba, para llevar a cabo las determinaciones analíticas de tiabendazol. La técnica analítica empleada fue cromatografía líquido-masas (CL-EM), con un límite de detección en la medida de 0,02mg/kg. Quimiometría Todos los cálculos descritos fueron desarrollados con el programa WinISI III (v1.50e, Infrasoft International, Port Matilda, PA, USA). Selección de espectros. Para la obtención de un espectro representativo por muestra, se efectuó el mediado de los mismos. Previamente se aplicó el valor límite del estadístico RMS (Root Mean Squared) de naranja intacta a cada forma de análisis (Ortiz et al., 2006), mediante el cual se asegura la calidad del dato espectral obtenido. Este estadístico calcula la similitud entre espectros de una misma muestra, eliminando los que se distancian de la media para una forma de análisis determinada y un producto concreto, y minimizando fuentes de error, para obtener espectros representativos. En la determinación de estos valores se emplearon las siguientes expresiones: V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 252 N D RMS n i ij j ∑ = = 1 2 1− = N N MEANSTD 2 1 2 lim 036.1036.1 STDmSTDSTD mK K Kit ×=×= ∑ = = Donde: N: Número de submuestras de una misma muestra. n: Número de lecturas de log (1/R) desde 400 a 2500nm (1050 datos). D ij : Diferencia entre el valor de log (1/R) de la submuestra “j” para la longitud de onda “i”, y el valor del log (1/R) para el espectro medio de N submuestras de una muestra para la longitud de onda “i”. m: Número de muestras Una vez aplicado el valor límite, todos los espectros que lo superen son eliminados del conjunto inicial. Posteriormente se vuelve a recalcular, y nuevamente se eliminan todos aquellos que superen el límite. El proceso continúa hasta que ningún espectro posee un valor RMS superior al límite. En ese momento, es cuando se procede al mediado de los espectros que queden de cada muestra. Análisis de Componentes Principales (ACP). Sobre los tres conjuntos de datos espectrales (espectros de la base, del ecuador, y suma de ambos), se efectuó una reducción de información mediante un Análisis de Componentes Principales. Por lo tanto, se obtuvieron nuevas variables (Componentes Principales), combinación lineal de las antiguas (valores de absorbancia en las diferentes longitudes de onda), linealmente independientes, que explican la mayor cantidad de información con respecto a la inicial. Mediante esta herramienta, se consigue sintetizar gran cantidad de información, a la vez que se elimina información redundante. Posteriormente se efectuó un centrado de cada población y se representaron en tres dimensiones (CP1, CP2 y CP3) los nuevos valores obtenidos en el espacio vectorial generado por las tres primeras Componentes Principales. Estos cálculos se desarrollaron para observar si las poblaciones describían alguna pauta concreta mediante diversos agrupamientos, como por ejemplo la afectación en cuanto a la aplicación de la cera. Modelos predictivos. Los algoritmos empleados para la obtención de los modelos predictivos de tiabendazol fueron ecuaciones multivariantes de regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS), utilizando validación cruzada. La capacidad predictiva está comprendida en un rango entre 0,2-3,9ppm de tiabendazol en naranja intacta. Se seleccionó un número máximo de 9 términos PLS en cada ecuación obtenida, así como 5 pases o grupos de validación cruzada. El colectivo experimental final seleccionado para la elaboración de los modelos fue dividido en aproximadamente un 90% para el desarrollo de los mismos, y un 10% para evaluar su comportamiento mediante validación externa. Esta división fue efectuada totalmente al azar, para simular el comportamiento de los modelos trabajando en análisis de rutina. Para optimizar la precisión y exactitud de las calibraciones, se ensayaron diferentes combinaciones de tratamientos matemáticos de derivada sobre los espectros (1ª derivada con 5nm y 10nm de segmento de derivación, 2ª derivada con 5nm y 8nm de segmento de derivación, y 3ª derivada, con 10nm de segmento de derivación), así como con técnicas de V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 253 corrección de radiación dispersa (“Scatter”): corrección MSC (Multiplicative Scatter Correction) y corrección SNVDT (Standadard Normal Variate and Detrending). De esta forma, la combinación de cada tratamiento de derivada (5 tratamientos) con cada tratamiento de corrección de radiación dispersa (2 tratamientos) permitía la obtención de 10 modelos predictivos. Además de los tratamientos descritos, se obtuvo otro empleando los espectros brutos, es decir, sin derivar y sin aplicar ningún tipo de corrección de radiación dispersa. Finalmente, los 11 modelos se calcularon empleando toda la región espectral analizada (400-2500nm), y excluyendo la región visible del espectro (1100-2500nm). Por lo que 22 modelos predictivos se obtuvieron en total. Los estadísticos empleados para la evaluación de las ecuaciones fueron los Coeficientes de Determinación y los Errores Típicos (ET), tanto en calibración (R 2 y ETC) como en Validación Cruzada (r 2 y ETVC). Los mismos estadísticos se emplearon para evaluar el comportamiento del colectivo de validación externa (ETP y R 2 VE ), junto con la pendiente de sus predicciones. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Valores RMS Cuando se determinaron los valores del estadístico RMS con todos los espectros analizados por muestra (6 del ecuador más 2 de la base), se obtuvo un valor límite de RMS lím =30000. Aplicando este valor, se efectuaron tres pases de eliminación de espectros, descartando finalmente el 29% de toda la información inicial. Sin embargo, ninguna muestra fue eliminada por completo, es decir, ninguna muestra mostró valores del estadístico RMS superiores el límite en sus 8 espectros. Posteriormente, se mediaron los espectros, obteniendo un colectivo conformado por 112 muestras. El mismo límite se obtuvo cuando se analizaron por separado los espectros del ecuador de las naranjas (6 espectros/muestra), y en este caso, tampoco se eliminó ninguna muestra cuando se aplicó este valor para esta forma de presentación de muestras, aunque también hubo tres pases de eliminación de espectros, descartando el 19% de los iniciales. En cambio, con los espectros obtenidos del extremo distal de la naranja (2 espectros/muestra), el valor RMS lím descendió a 9500. Este descenso se debe a que la región a partir de la cual se tomaban ambos espectros era prácticamente la misma, ya que la naranja se disponía para que la información espectral se obtuviera de la región de la base (extremo distal), y, una vez obtenido el primer espectro, se hacía un pequeño giro, sin modificar apenas la disposición inicial. Por lo tanto, la similitud de estos espectros fue mayor que en las otras formas de presentación de muestras, en donde se tomaba un espectro de la región del ecuador para posteriormente efectuar un giro de aproximadamente 60º entre cada lectura. Esta estrategia de análisis se traduce en un mayor valor del estadístico RMS. En los espectros obtenidos de la base, se eliminaron 35 muestras del colectivo inicial, quedando una población para el desarrollo de las calibraciones de N=77. Este porcentaje de muestras eliminadas se debe a que con esta forma de presentación tan solo se obtenían dos espectros, aportando un valor de RMS para cada muestra. De este modo, toda muestra que superase su valor límite (9500), era eliminada del colectivo inicial. Análisis de Componentes Principales Una vez efectuado este cálculo quimiométrico, se procedió a la representación gráfica de cada estrategia de análisis, en función de las tres primeras componentes principales en cada caso (figura 4). V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 254 Como se puede observar, no se aprecia una distinción clara entre muestras a las que se les aplicó el tratamiento de cera. Si bien, el grupo B (espectros obtenidos de la zona del ecuador) presenta un escaso agrupamiento. Según estos comentarios, el diseño de modelos con ambos tipos de espectros (naranjas analizadas indistintamente con la aplicación del tratamiento de ceras) no se verá afectada en su capacidad predictiva, ya que no se aprecia una distinción clara entre ambos grupos, por lo que no sería necesario calibrar de forma independiente. Por lo que la distribución de las muestras en función de las tres primeras Componentes Principales se lleva a cabo en función de otras características inherentes a las muestras, como puede ser el estado de maduración, humedad retenida en la epidermis, o contenido en tiabendazol. Modelos Predictivos En todos los modelos desarrollados se partió de un colectivo inicial de calibración constituido por 102 muestras cuando se trató de los espectros obtenidos a partir de la zona del ecuador, y de la suma del ecuador más del extremo distal. Cuando se emplearon los espectros obtenidos únicamente de la zona del extremo distal, el número inicial del colectivo de calibración descendió a 70 muestras. Los colectivos empleados para validación externa estuvieron constituidos por 10 y 7 muestras respectivamente. Todo el colectivo empleado para cada grupo (calibración-validación), abarcaba un rango en cuanto a la concentración de tiabendazol entre 0,2-3,9ppm. La distribución del mismo se puede observar en la figura 5. A pesar de que ambas poblaciones difieren en el número que las constituyen (112-77), se distribuyen de igual forma, encontrando la mayor concentración de muestras, con niveles inferiores a 0,7ppm de tiabendazol. Por lo tanto, para reforzar e incrementar la robustez de los modelos obtenidos, sería necesario reforzar con muestras que presenten concentraciones superiores a 0,7ppm. Cuando se obtuvieron los modelos predictivos mediante la aplicación de las combinaciones de tratamientos de derivadas y corrección de radiación dispersa sobre los espectros, se seleccionaron en función de los coeficientes de determinación más elevados, y menores errores de predicción. Así, en la tabla 1, se exponen los modelos seleccionados para cada estrategia de análisis. Como se aprecia, el mejor modelo se obtuvo empleando tan solo los espectros del ecuador para su cálculo, aunque se obtuvieron estadísticos similares con los espectros suma del ecuador y extremo distal. Estas ecuaciones se obtuvieron aplicando tercera derivada sobre los espectros, con un segmento de derivación de 10nm. La corrección de radiación dispersa fue SNVDT con el modelo seleccionado a partir de los espectros del ecuador, y MSC en el caso de la suma del ecuador y la base. De la misma forma se empleó toda la región espectral analizada en el primer modelo (VIS+NIR), y tan solo la región NIR en el segundo. El tratamiento empleado para el modelo seleccionado a partir de la información espectral obtenida del extremo distal fue primera derivada con 10nm de segmento de derivación, y corrección de radiación dispersa MSC. En este caso también se empleó toda la región espectral para su cálculo. Shenk y Wesrwehaus (1996) afirman que una ecuación posee buena precisión si su coeficiente de determinación se encuentre entre R 2 =0,7-0,89. De este modo, las ecuaciones seleccionadas a partir de los espectros del ecuador y suma del ecuador con el extremo distal cumplen este requisito. En cambio, según estos autores, la ecuación seleccionada a partir de los espectros obtenidos del extremo distal, tiene tan solo aptitud para diferenciar entre valores bajos, medios y altos. V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 255 Los resultados obtenidos cuando se evaluaron estos modelos externamente, se muestran en la tabla 2. Estos valores corroboran los comentarios efectuados con respecto a la tabla 1, arrojando los mejores resultados el modelo seleccionado a partir de los espectros obtenidos del ecuador. En esta ocasión, las predicciones del colectivo de validación externa del modelo obtenido a partir de espectros del extremo distal son buenas, según el valor obtenido de SEP=0,33. En cambio, representan tan solo un 10% de su variabilidad (R 2 =0,1), con una recta que aporta tan solo una pendiente de 0,31, por lo que este modelo no sería válido para trabajar con garantía en proceso. Altieri et al. (2005), emplearon la tecnología NIRS para la determinación de fungicida (imazalil) en control on-line postcosecha de cítricos. Obtuvieron buenas correlaciones entre el fungicida y los modelos de predicción, con un ETC=0,6, y ETP=3.7. Estos errores son superiores a los obtenidos en el presente trabajo, aunque su rango predictivo era bastante superior (0,5 – 250ppm). Por otro lado, es importante resaltar que el trabajo de Altieri et al. se efectuó para monitorizar la concentración de fungicida en tuberías de lavado, por lo que no se analizaba fruta, sino solución. Saranwong y Kawano (2005), determinaron fungicidas en superficies de tomates mediante NIRS, aunque tampoco fue sobre fruta intacta, ya que empleaban una técnica de extracción del fungicida, para posteriormente analizar sobre un extracto seco. En este caso, el rango de predicción estuvo entre 0-107ppm, obteniendo un error en validación SEP=7.89ppm. Apreciando el rango empleado en el presente estudio (0,2-3,9ppm), la capacidad predictiva obtenida por Saranwong y Kawano fue ligaramente superior, aunque se debe tener en cuenta que este rango se encuentra en concentraciones muy bajas, con otro factor importante, es decir, el análisis se llevó a cabo sobre fruta intacta. CONCLUSIONES La aplicación de ceras sobre las naranjas no ha producido diferencias entre espectros que se traduzcan en la formación de grupos definidos. Por lo que las predicciones de tiabendazol obtenidas son válidas independientemente de la aplicación de este tipo de producto. Según los resultados obtenidos en los modelos predictivos, se demuestra la viabilidad de la tecnología NIRS para predecir contenidos de tiabendazol sobre naranja intacta en concentraciones inferiores al Límite Máximo de Residuos, cuando la información espectral se obtiene sobre la región del ecuador de la naranja, o sumándole a estos espectros los obtenidos sobre la región de la base del extremo distal. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado con los fondos del proyecto INIA, RTA 2005-00043-00-00. BIBLIOGRAFÍA Altieri, G.; Di Renzo, G.C.; Lanza, G. 2005. Imazalil on-line control in post-harvest treatments of citrus fruit. Acta Hort. (ISHS) 682, p.1773-1780 Clark, C.J.; McGlone, V.A.; De Silva, H.N.; Manning, M.A.; Burdon, J.; Mowat, A.D. Prediction of storage disorders of kiwifruit (Actinidia chinensis) based on visible-NIR spectral characteristics at harvest. Postharvest Biology and Technology, 32, p.147-158, 2004. V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 256 Clark, C.J.; McGlone, V.A.; Jordan, R.B. Detection of Brownheart in ‘Braeburn’ apple by transmission NIR spectroscopy. Postharvest Biology and Technology, 28, p.87-96, 2003. Hernández Sánchez, N.; Lurol, S; Roger, J.M.; Bellon-Maurel, V. Robustness of models based on NIR spectra for sugar content prediction in apples. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 11, p.97-107, 2003. Kawano, S.; Fijiwara, T; Iwamoto, M. Nondestructive determination of sugar content in Satsuma Mandarin using Near Infrared (NIT) Transmittance. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 62, p.465-470, 1993. Kawano, S.; Watanabe, H.; Iwamoto, M. Determination of sugar content in intact peaches by near infrared spectroscopy with fiber-optics in interactance probe. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 61, p.445-451, 1992. Lammertyn, J.; Peirs, A.; De Baerdemaeker, J.; Nicolaï, B. 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Validación externa de los modelos seleccionados según el Error Típico de Predicción (ETP), Pendiente y Coeficiente de Determinación (R 2 ) Análisis espectral N SEP Pendiente R 2 Ecuador 10 0,33 1,21 0,85 Extremo distal 7 0,33 0,31 0,1 Ecuador + Extremo distal 10 0,36 0,98 0,73 Lavado ( Tiabendazol 0,5%p/V) Secado I Secado II Encerado GRUPO II GRUPO I Figura 1. Esquema del proceso llevado a cabo sobre las naranjas para la aplicación de tiabendazol Figura 2. Muestras eliminadas del colectivo experimental por a causa de la presencia de defectos V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y AGROEXPORTACIONES 2007 258 A B Figura 3. Disposición de las naranjas en el espectrofotómetro Foss NIRSystems 6500 con módulo DCA, para la obtención de espectros del ecuador (A) y del extremo distal (B). A B C Grupo I, naranjas sin aplicación de ceras Grupo II, naranjas con aplicación de ceras Figura 4. Representación de CP1, CP2 y CP3 de los espectros obtenidos a partir de las zonas base-ecuador (A), del ecuador (B), y base (C) 0 5 10 15 20 25 30 35 0,3 0,7 1,1 1,5 1,9 2,3 2,7 3,1 3,5 3,9 Tiabendazol (ppm) F r ecu en ci a 0 5 10 15 20 25 0,3 0,7 1,1 1,5 1,9 2,3 2,7 3,1 3,5 3,9 Tiabendazol (ppm) F r ecu en cia Figura 5. Distribución del contenido de tiabendazol (ppm) de la población espectral constituida por los espectros obtenidos a partir de las zonas base-ecuador y ecuador (color negro), y de la zona del extremo distal (color gris). Estudio sobre la respuesta espectroscópica en el infrarrojo cercano a niveles de Tiabendazol inferiores al límite máximo de residuos sobre naranja intacta Peña, F.1; Pérez, J.2; Gaitán, A.J.1; Ortiz, V.1,* 1IFAPA Centro Alameda del Obispo Avda. Menéndez Pidal, s/n; 3092, 14.080 CÓRDOBA (España) 2IFAPA Centro de Palma del Río Avda. Rodríguez de la Fuente, s/n; 14.700 Palma del Río CÓRDOBA (España) *victor.ortiz@juntadeandalucia.es Telf./Fax +34 957 016 000 / +34 957 016 043 INTRODUCCIÓN APLICACIÓN PLAGUICIDAS Niveles Producción Adecuados  Riesgo Ambiental  Riesgo Salud humana  Riesgo Salud Animal  CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA LA UNIÓN EUROPEA ESTABLECE LMRs* LMRs*: LÍMITE MÁXIMO DE RESIDUOS. Concentraciones límite de residuos de plaguicidas establecidas para un producto determinado OBJETIVO: Estudiar la viabilidad de la tecnología NIRS (Near Infrared Spectroscopy) como herramienta de Control de Calidad en naranja intacta mediante el desarrollo de modelos predictivos de Tiabendazol (fungicida comúnmente aplicado en centrales hortofrutícolas) MATERIAL Y MÉTODOS TRATAMIENTOS Lavado (Tiabendazol 0,5% p/v) (LTBZ) Encerado (C) Grupo LTBZ N=55 Grupo LTBZ + C N=57 ANÁLISIS NIRS Tres Estrategias de Análisis de Datos: - Espectros región ecuador (6/muestra) - Espectros extremo distal (2/muestra) - Espectros suma (6+2/muestra) QUIMIOMETRÍA 1) Selección Espectral 2) Análisis Componentes Principales 3) Modelos Predictivos (se ensayan pretratamientos de derivada y corrección de radiación dispersa) Errores Típicos (ETs): Calibración, Validación Cruzada y Externa Coef. Determinación (R2): Calibración, Validación Cruzada y Externa Selección Modelos: RESULTADOS SELECCIÓN ESPECTRAL ESPECTROS ECUADOR + EXTREMO DISTAL ESPECTROS ECUADOR N=112 (102 Calibración; 10 Validación) ESPECTROS EXTREMO DISTAL N=77 (70 Calibración; 7 Validación) ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES Ecuador + Extremo Distal Ecuador Extremo Distal No se aprecia clara separación entre naranjas a las que se les aplicó ceras (grupo LTBZ+C) de las que no (grupo LTBZ) Es viable la aplicación de la Tecnología NIRS para predecir contenidos de Tiabendazol en naranja intacta con contracciones inferiores al LMR (0,2-3,9 ppm) cuando la información espectral se obtuvo sobre la región del ecuador, o suma de ésta con la región del extremo distal CALIBRACIÓN N Fact. PLS ETC R2 VAL. CRUZADA ETVC r2 VAL. EXTERNA N SEP Pte R2Análisis Espectral Ecuador Extremo Distal Ec. + Ext. Distal 94 6 0,3 0,83 67 3 0,52 0,56 92 6 0,32 0,79 0,37 0,83 0,59 0,45 0,39 0,7 10 0,33 1,21 0,85 7 0,33 0,31 0,1 10 0,36 0,98 0,73 MODELOS PREDICTIVOS Trabajo financiado por el proyecto INIA, RTA 2005-00043-00-00 130V Congreso Iberoamericano de Tecnología Postcosecha y Agroexportaciones. 29 mayo - 1 junio 2007. Cartagena, Murcia, España. Anexos 371