EFECTOS DEL ACEITE DE OLIVA VIRGENEXTRA CON ALTO CONTENIDO ENCOMPUESTOS FENÓLICOS SOBRE LAEXPRESIÓN GÉNICA Y LA FUNCIÓNENDOTELIAL EN PACIENTES CON ALTORIESGO CARDIOVASCULARAna Isabel Jiménez MoralesCórdoba, 1 de marzo de 2012 TÍTULO: Efectos del aceite de oliva virgen extra con alto contenido en compuestos fenólicos sobre la expresión génica y la función endotelial en pacientes con alto riesgo cardiovascular AUTOR: Ana Isabel Jiménez Morales © Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2012 Campus de Rabanales Ctra. Nacional IV, Km. 396 A 14071 Córdoba www.uco.es/publicaciones publicaciones@uco.es DON FRANCISCO PÉREZ JIMÉNEZ, CATEDRÁTICO DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD CÓRDOBA Y DIRECTOR CIENTÍFICO DEL IMI- BIC. DON JUAN ALBERTO RUANO RUIZ, DOCTOR EN MEDICINA POR LA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA Hacemos constar: Que el trabajo titulado ?Efectos del aceite de oliva virgen extra con alto con- tenido en compuestos fenólicos sobre la expresión génica y la función endotelial en pacientes con alto riesgo cardiovascular? ha sido realizado por Doña Ana Isabel Jiménez Morales, bajo nuestra dirección, en la Unidad de Investigación de Lípidos y Arteriosclerosis del Hospital Universitario Reina Sofía/ Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC). A nuestro juicio reúne los meritos suficientes para ser defendido ante el tri- bunal correspondiente y poder optar al grado de Doctor. Córdoba, 1 de marzo de 2012 Fdo.: Prof. Dr. Francisco Pérez Jiménez Fdo.: Dr. Juan Alberto Ruano Ruiz Gracias a la vida, que me ha dado tanto... A Juan 7 Me gustaría dar las gracias a todas aquellas personas que de alguna manera han contribuido a que este trabajo sea una realidad: A Francisco Pérez Jiménez, por confiar en mí sin apenas conocerme, abrirme las puertas de la investigación, enseñarme los valores de la excelencia en el trabajo y por alentarme a continuar. Con cada una de sus críticas y correcciones, simpre acertadas, ha contribuido a mi crecimiento personal y profesional. Una referencia a seguir. A Juan Ruano Ruiz, sin duda la persona más brillante que jamás he conocido. Ejemplo de trabajo, abnegación, honestidad, inteligencia y un sinfín más de virtudes. Me ha proporcionado las herramientas necesarias para caminar por un mundo nuevo y tener inquietudes, pero ante todo gracias por ser mi amigo. A mis compañeros del laboratorio, por hacer más livianas las horas de tra- bajo, y en especial a Antonio Camargo, quien me enseñó todos los trucos del ?cacharreo? y a Juan Fernandez por los buenos ratos durante las intervenciones. A mis compañeros de Medicina Interna, adjuntos y residentes, que son los que hacen que disfrute de mi trabajo y de los que aprendo constantemente. A Nieves y a Cristina, con quien he compartido risas y llantos y con las que siempre he podido contar. A Beatriz y Álvaro, por todas las horas robadas. A mi familia, por moldearme como soy, por inculcarme el afán de superación y el inconformismo, por no dudar nunca de mí y por apoyar incondicionalmente mis decisiones. Gracias papá, mamá, hermanito y abu. 8 A Juan, el motor de mi existencia, el mejor compañero del mundo para esta fantástica aventura que es la vida. Por tirar de mí cuando yo frenaba, calmarme cuando me lanzaba, por levantarme cuando me caía y por cuidarme mucho y muy bien. Sin tí nada tendría sentido. A todos vosotros Gracias Índice Índice general 1. Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii 2. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.1. Alimentación y salud cardiovascular. . . . . . . . . . . . . 5 2.1.1. La Dieta mediterránea como modelo de alimen- tación cardiosaludable. . . . . . . . . . . . . . . 5 2.1.2. Beneficios para la salud cardiovascular del aceite de oliva virgen: efectos biológicos y mecanismos de acción molecular. . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.2. El Síndrome Metabólico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.2.1. Concepto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.2.2. El estilo de vida como causa del inicio y el man- tenimiento del SMet. . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.2.3. El tejido adiposo disfuncionante como origen del estado inflamatorio persistente del SMet. . . . . 29 2.2.4. Genética poblacional, epigenética y biología de sistemas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.2.5. Disfunción endotelial como marcador precoz de la enfermedad cardiovascular en el SMet. . . . . 40 2.3. Función endotelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.3.1. Estructura y funciones del endotelio arterial. . . 43 2.3.2. Técnicas para medir la vasodilatación mediada por el endotelio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 ii ÍNDICE GENERAL 2.3.3. Óxido nítrico y función endotelial. . . . . . . . . 54 2.3.4. Influencia de la alimentación sobre la función en- dotelial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 2.3.5. Influencia de la variabilidad genética sobre la función endotelial: análisis de polimorfismos ge- néticos de NOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 2.4. Análisis de alto rendimiento y métodos computacionales en Nutrigenómica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 2.4.1. Microarrays de expresión génica. . . . . . . . . . 65 2.4.2. Microarrays de expresión génica en investigación nutricional. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 2.4.3. Métodos predictivos en el estudio de la regula- ción génica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 3. Hipótesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 4. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 5. Diseño y metodología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 5.1. Criterios de inclusión y exclusión. . . . . . . . . . . . . . . 93 5.2. Intervención alimentaria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 5.3. Concentración postprandial de marcadores inflamatorios, del metabolismo glucídico y lipídico. . . . . . . . . . . . . 100 5.4. Análisis del genotipo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) sobre la vasodilatación mediada por el endotelio. . . . . . . . . 101 5.5. Análisis de la expresión génica en células mononucleares de sangre periférica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 5.6. Predicción de dianas y análisis de enriquecimiento para sitios de unión de Factores de Tanscripción y microRNAs. 111 5.7. Aspectos éticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 5.8. Procesamiento general de los datos y análisis estadístico. . 114 6. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 6.1. Características de la población estudiada. . . . . . . . . . 119 ÍNDICE GENERAL iii 6.1.1. Características demográficas y clínicas . . . . . . 119 6.2. Intervención alimentaria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 6.3. Efecto del aceite de oliva virgen con diferente contenido en fenoles sobre la respuesta inflamatoria y metabolismo energético postprandial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 6.4. Efecto del polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) so- bre la respuesta vasodilatadora mediada por el endotelio tras la ingesta de aceite de oliva virgen con diferente con- tenido en fenoles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 6.5. Análisis de expresión génica en células mononucleares de sangre periférica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 6.6. Predicción de dianas y análisis de enriquecimiento para sitios de unión para TF y miRNAs . . . . . . . . . . . . . 145 7. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 8. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 9. Nomenclatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 10. Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 11. Anexos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235 Resumen 1. Resumen Introducción: Los pacientes con SMet presentan mayor riesgo de enferme- dad cardiovascular que la población general. El estado de inflamación crónica de bajo grado condiciona la aparición precoz de disfunción endotelial. La ingesta aceite de oliva virgen podría mejorar esa alteración gracias a los efectos antioxi- dante, antitrombótico y antiinflamatorio que han demostrado sus componentes minoritarios, especialmente los compuestos fenólicos. Además de la capacidad antioxidante de dichos micronutrientes, no se conoce bien si esos beneficios po- drían estar sujetos a mecanismos más específicos a nivel celular. Hipótesis de trabajo: Determinados genes podrían estar implicados en la mejoría de la función endotelial observada al consumir aceite de oliva virgen, considerando que dicha relación, entre genes y aceite de oliva podría tener natu- raleza bidireccional. Así, determinados polimórfismos genéticos condicionarían cierta variabilidad en el beneficio observado y, a su vez, dichos compuestos po- drían ejercer su acción a través de la modificación de expresión de genes cuyas proteínas participan en la disfunción del endotelio. Objetivos: 1.- Principal: Analizar si el polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) condiciona diferencias en la respuesta vasodilatadora tras la ingesta de aceite de oliva con diferente concentración de compuestos fenólicos. 2.- Se- cundarios: 2.1.-Evaluar si los cambios existentes en la respuesta vasodilatadora endotelial se asocian a cambios en la concentración de eNOS y de NO(x), la riqueza en compuestos fenólicos del aceite o las variantes polimórficas de NOS3 Glu298Asp (rs1799983). 2.2.-Determinar si existen diferencias en la expresión génica tras la ingesta de aceite con diferente contenido en compuestos fenólicos. 2.3.-Investigar, mediante herramientas computacionales, elementos reguladores potencialmente involucrados en los cambios de expresión génica observados. Población, diseño y metodología: 57 pacientes con SMet recibieron tres desayunos basados en aceite de oliva con diferente contenido en compuestos fe- nólicos. Se midieron varios parámetros de la función endotelial [iABC, pico y máximo de la hiperemia reactiva post isquemia (PORH)] mediante láser Dop- pler, así como las concentraciones plasmáticas de NO(x) y eNOS en ayunas y durante el periodo postprandial. En 20 de esos pacientes, se llevaron a cabo experimentos con microarrays de expresión génica a partir de células mononu- cleares de sangre periférica, tras la ingesta de aceite con alto y bajo contenido en compuestos fenólicos. Posteriormente se realizó un análisis de predicción de sitios de unión a factores de transcripción (TFBS) y potenciales dianas de mi- croRNAs (miRNAs) en la serie de genes diferencialmente expresados. Resultados: 1.-Descubrimos una interacción gen-dieta para la respuesta postprandial de la PORHmax (p=0,039) y NO(x) (p=0,043). Las personas con viii 1 Resumen genotipo TT mostraron valores menores de eNOS, NO(x) y PORHmax, en com- paración con los sujetos con genotipo GG y GT, especialmente en las medidas postprandiales (todas p<0,05). Estas diferencias se atenuaban cuando se consu- mía el aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. 2.-Encontramos 98 genes diferencialmente expresados al comparar la ingesta de aceites con di- ferente concentración en compuestos fenólicos. Muchos de estos genes, relacio- nados con la obesidad, hipertensión, alteraciones en el metabolismo lipídico, DM tipo 2 y enfermedad coronaria, codifican proteínas que participan en rutas metabólicas como factor de transcripción NF-kB, complejo del factor de trans- cripción activador de proteina 1 (AP-1), citoquinas o protein quinasas activadas por mitógenos (MAPKs). 3.-Observamos una mayor frecuencia de potenciales sitios de unión para los factores de transcripción NF-kB, FOXQ1 y SRF, y me- nor frecuencia para las secuencias reguladoras predichas para PPARG-RXRa y NHLH1 en aquellos genes cuya expresión se reprimía tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. Conclusiones: Nuestro trabajo describe, por primera vez, un efecto de in- teracción entre el aceite de oliva virgen con alto contenido en compuestos fenóli- cos y un polimorfismo del gen que codifica una de las enzimas más importantes de la homeostasis del endotelio. Los pacientes con genotipo TT del polimorfis- mo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) muestran una respuesta vascular disminuida en comparación con los que tienen los genotipos GT o GG, hecho que es par- cialmente compensado tras la ingesta de aceite de oliva virgen extra con alto contenido en compuestos fenólicos. Parte de estos efectos podrían estar mediados por modificaciones en la expresión de genes relacionados con rutas metabólicas vinculadas con la inflamación y la regulación del ciclo celular y regulados de forma compleja por un conjunto de factores de transcripción y miRNAs, si bien esta última conclusión no deja de ser una hipótesis que tendrá que ser sometida a prueba en futuros experimentos. Este trabajo ha sido financiado con fondos AGR 922 de la Consejería de Eco- nomía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía (a Francisco Pérez Jimenez); Ayuda 06/0129 (a Francisco Pérez Jimenez) y 0040/07 (a Juan Ruano) de la Consejería de Salud, Junta de Andalucía; Ayuda REF 200500253 del Centro de Excelencia en Investigación sobre Aceite de Oliva y Salud (a Francisco Pérez Ji- menez); y la Diputación Provincial de Córdoba, Agencia para el Aceite de Oliva y la Universidad de Córdoba. El trabajo ha sido financiado también en parte pr fondos de investigación del Minsterio de Sanidad (Beca CB06/03/0047), Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición, Instituto de Salud Carlos III, (a Francisco Pérez Jimenez) y a la Fundación Biomédica de Córdoba. Este trabajo carece de conflicto de intereses. Introducción 2 Introducción 5 2. Introducción2.1. Alimentación y salud cardiovascular. 2.1.1. La Dieta mediterránea como modelo de alimentación cardio- saludable. Diversos estudios ecológicos llevados a cabo entre 1950 y 1960, tales como el Seven Countries Study , el Rockefeller Foundation Study y el trabajo de la European Atomic Energy Comission, mostraron que existía relación entre cier- tos patrones de alimentación y una mayor esperanza de vida, así como menor tasa de enfermedad cardiovascular y ciertos tipos de cáncer. Desde entonces, la investigación acerca de la repercusión que sobre la salud humana pueden ejercer los diferentes hábitos de alimentación ha sido muy fructífera. Se han obteni- do abundantes datos científicos que confirman que existe un efecto beneficioso cuando las personas siguen un modelo de alimentación similar al de la Dieta me- diterránea (DMed), en contraposición al modelo tradicional existente en países de Norteamérica y el norte de Europa, rico en grasas saturadas. El modelo de DMed no es el único con efectos beneficiosos para la salud, sino que comparte esta característica con otros patrones de alimentación existentes en el mundo como el modelo Indú o el modelo vegetariano , teniendo todos ellos en común un consumo alto de cereales, frutos secos, verduras y frutas, moderado de hue- vos, leche y derivados así como una menor o nula ingesta de grasas saturadas y carne. En nuestro entorno, el modelo de DMed ha constituído durante décadas el paradigma de estilo de alimentación saludable. El término se definió en 1995 en la Conferencia Internacional de Dietas del Mediterráneo como ?el patrón dietético hallado en los países mediterráneos de zonas de crecimiento de olivos caracterizado por un elevado consumo de aceite de oliva, elevado consumo de legumbres, cereales no refinados, frutas, vegetales, moderado consumo de pro- ductos diarios la mayoría en forma de queso y yogur y moderado a elevado consumo de pescado junto con un bajo consumo de carne y productos cárnicos 6 2 Introducción y moderado de vino? [1]. En el transcurso de las últimas décadas se han ob- tenido numerosos resultados científicos que lo avalan como saludable. De este modo, en varios estudios observacionales se ha comprobado que un alto grado de adherencia a dicho patrón se asocia a mayor longevidad [2], a menor mor- bilidad y mortalidad global [3] así como a una menor incidencia de factores de riesgo cardiovascular (RCV) [4], enfermedad cardiovascular [5] y menor estrés oxidativo postprandial[6]. Además, las poblaciones que siguen dicho patrón de alimentación tienen menor incidencia de diabetes mellitus (DM) [7], de algunos tipos de cáncer [8] y de deterioro cognitivo asociado a la edad [9, 10], en com- paración con otros modelos [11]. Estos resultados han sido respaldados por un reciente metaanálisis que mostró cómo la modificación a largo plazo de factores de riesgo cardiovascular y de marcadores de inflamación es mayor cuando se si- gue un modelo de alimentación tipo DMed en comparación con modelos pobres en grasa y ricos en hidratos de carbono [12]. En las décadas de los 60-70, los investigadores se centraron en explorar, a través de estudios ecológicos y observacionales, qué factores clínicos o analí- ticos podían estar implicados en la aparición de dichos efectos saludables. El principal resultado fue comprobar que existía una correlación positiva entre la concentración plasmática de colesterol y la mortalidad cardiovascular, de modo que un menor consumo de grasas saturadas junto a una mayor ingesta de áci- dos grasos monoinsaturados (AGM), principalmente procedentes del aceite de oliva, o poliinsaturados (AGP) se asociaba a menores concentraciones plasmáti- cas de colesterol total (CT) y colesterol LDL (LDLc), junto a concentraciones de colesterol HDL (HDLc) estables o ligeramente elevadas, y ésto, a su vez, iba acompañado de 2 a 4 veces menos mortalidad por enfermedad cardiovas- cular con respecto al modelo occidental. De este modo, quedó establecida la importancia de la relación entre un alto consumo de grasas saturadas y eleva- das concentraciones de colesterol en sangre con la enfermedad cardiovascular. Posteriormente, los resultados del Seven Countries Study y el WHO-MONICA mostraron la asociación de concentraciones altas de colesterol en plasma con 2 Introducción 7 otros factores como el consumo de tabaco, la obesidad, la hipertensión arterial y un bajo aporte de antioxidantes en la dieta [13]. Desde entonces se han llevado a cabo diferentes estudios prospectivos con el objetivo de definir mejor qué alimentos, nutrientes y micronutrientes serían responsables de dichos efectos saludables. En el estudio AIRGENE, las personas que siguieron un patrón de alimentación tipo DMed redujeron las concentracio- nes plasmáticas de diversos marcadores inflamatorios que se elevan tras sufrir un infarto de miocardio [14]. Por otra parte, en los estudios PREDIMED y SUN se ha constatado que se produce una reducción del riesgo de DM tipo 2 [15] y de las concentraciones plasmáticas de marcadores inflamatorios [16], mejoría en la calidad de vida [17] y reducción de los trastornos depresivos [18] en las personas que siguen estos hábitos de alimentación. Sin embargo, son escasos los estudios de intervención aleatorizados que investigan los efectos sobre la salud a largo plazo de la DMed. En prevención secundaria tan sólo el Lyon Heart Diet ha demostrado que seguir un patrón de alimentación tipo DMed conduce a una re- ducción del riesgo de cardiopatía isquémica (CI) [19], si bien hay que considerar que en este trabajo se utilizó mantequilla de canola como fuente de ácidos gra- sos monoinsaturados además del aceite de oliva típico de este patrón dietético. En la actualidad nuestro grupo está llevando a cabo el estudio de intervención CordioPrev 1 , en el que se evaluará de forma aleatorizada y controlada, la capa- cidad del modelo de DMed de prevenir la aparición tanto de nuevos episodios coronarios como de muerte y otras formas de manifestación de la enfermedad cardiovascular en pacientes que ya han presentado un evento coronario. 2.1.2. Beneficios para la salud cardiovascular del aceite de oliva vir- gen: efectos biológicos y mecanismos de acción molecular. Composición del aceite de oliva virgen. El aceite de oliva virgen extra (EVOO) constituye el componente graso mayoritario y uno de los tres pilares distintivos, junto con el pan y el vino, del modelo de DMed. Está compuesto 1ClinicalTrials.govIdentifier:NCT00924937 8 2 Introducción           !"" "# $"$ %  &&'( )%*  +,%* -,,./       "( !" "(010"(  ' !  1$ Figura 1. Micronutrientes del aceite de oliva. de dos grandes fracciones. La fracción saponificable comprende el 98-99% del peso y de la que forman parte triglicéridos (TG), fosfolípidos y ácidos grasos libres, especialmente ácido oleico, seguido de ácido palmítico y ácido linoléico, además de otros ácidos grasos en concentración de trazas, como el margárico o el esteárico. El aceite de oliva es único, si consideramos su elevada cantidad de ácido oleico, ya que la mayoría de aceites de semillas están compuestos funda- mentalmente por AGP incluyendo el ácido linoleico, ácido graso esencial n-6. Comparado con éstos, el ácido oleico, al ser monoinsaturado, es menos suscepti- ble a la oxidación, lo que repercute en una mayor estabilidad del aceite durante su conservación [20]. A pesar de que la fracción insaponificable representa tan sólo el 1-2% del peso del aceite, este hecho diferencia al aceite de oliva virgen de otros tipos de aceite, tanto los refinados como aquellos que son obtenidos a partir de semillas (soja, girasol, colza). Esta fracción contiene una gran variedad de moléculas de naturaleza orgánica y de pequeño peso molecular, conocidas como componen- tes minoritarios del aceite de oliva o micronutrientes. Entre ellos destacamos, por existir mayor documentación sobre su función biológica en el ser humano, el grupo de hidrocarburos constituído por escualeno, carotenoides y clorofila, el de los tocoferoles (alfa, beta y gamma tocoferol), así como los grupos de aromatizantes, estanoles/esteroles, terpenos y compuestos fenólicos. 2 Introducción 9 Los compuestos fenólicos presentan en la estructura molecular un grupo fe- nol, un anillo aromático y, al menos, un grupo funcional hidroxilo. Dentro de este grupo se conocen, a su vez, los fenoles simples [hidroxitirosol (HT), tirosol (T) y los ácidos cafeico, cumárico, gálico y vanílico], secoiroides (oleuropeina, oleocantal y ligstrósido), flavonoides (apegenina, luteolina) y lignanos (pinoresi- nol y acetopinoresinol) [21](Figura 2). La principal característica de este grupo de micronutrientes es la gran capacidad antioxidante que han demostrado tanto in vitro como in vivo [21, 22]. La oleuropeina es precursora de HT y T, dos de los compuestos fenólicos biológicamente más activos y sobre los que se han descrito más efectos beneficiosos, tanto en ayunas como en el periodo postprandial tras el consumo de aceite de oliva virgen, ya sea de forma puntual o a largo plazo [23, 24]. Sin embargo, la concentración y proporción de los diferentes compuestos fe- nólicos en el aceite de oliva virgen no es constante. Depende de múltiples factores como la variedad de aceituna, las características del terreno donde crece el olivo, la forma de extracción del aceite, la forma de conservación y almacenamiento del mismo [25, 26]. Estos factores modifican las condiciones del estado redox de la aceituna en el olivo, poniendo en marcha los mecanismos que ésta tiene para defenderse de factores prooxidantes habituales como la alta temperatura o la radiación ultravioleta propios del clima mediterráneo. Estos compuestos, que se deterioran con la luz y la exposición al aire, aceleran su autooxidación tras la caída del árbol y en el proceso de producción de los aceites. Tan sólo el EVOO, que es el que procede de la primera prensa de la aceituna, es el que tiene la máxima concentración de dichos compuestos minoritarios, en comparación con otros aceites como el aceite virgen y el aceite refinado, para cuya obtención se siguen procesos que utilizan fuentes de calor o disolventes que los eliminan del producto final. Efectos biológicos del aceite de oliva virgen. Efectos antioxidantes. 10 2 Introducción                                                      Figura 2. Compuestos fenólicos En situación de ayunas. En muchos trabajos, los efectos beneficiosos del aceite de oliva se evalúan en situación de ayunas tras un periodo de ingesta diaria continuada que oscila entre semanas a meses. En 1999 se publicó en España el primer estudio de intervención que evaluó, siguiendo un diseño aleatorizado, secuencial y cruzado, en pacientes con enfermedad arterial periférica, el efecto sobre la oxidabilidad de las LDL y su captación por macrófagos después del consumo durante 3 meses aceite de oliva virgen en comparación con aceite refinado. Se observó un mayor tiempo de latencia y una menor captación de LDL por los macrófagos tras la ingesta del aceite de oliva virgen [28]. Dos años más tarde, en un estudio de intervención aleatorizado, controlado y cruzado realizado en Holanda con voluntarios sanos, no se observaron diferencias en la oxidabilidad de las partículas de LDL (lag time y la formación de dienos), lipoperóxidos, carbonilos proteicos ni en la capacidad antioxidante del plasma tras la ingesta durante 3 semanas de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos (HPOO) en comparación con otro aceite de oliva con bajo contenido (LPOO) en dichas sustancias [29]. Un resultado similar fue obtenido en Grecia por Moschandreas y cols. quienes llevaron a cabo un estudio de intervención aleatorizado, controlado, cruzado y simple ciego, en este caso en voluntarios sanos fumadores [30]. Sin embargo, estos desalentadores intentos de demostrar los efectos antioxi- dantes de la fracción fenólica del aceite de oliva dieron paso a otros estudios 2 Introducción 11 F ig ur a 3. E f e c t o s d e l o s c o m p u e s t o s f e n ó l i c o s . A d a p t a c i ó n d e B a d i m ó n y c o l s . [ 2 7 ] 12 2 Introducción como el realizado en Italia por Visioli y cols. quienes, en pacientes dislipémicos y siguiendo un diseño aleatorizado, controlado y cruzado, evaluaron el efecto a largo plazo, sobre diferentes marcadores de estrés oxidativo, de la ingesta duran- te 7 semanas, con un periodo de lavado de 4 semanas, de aceite de oliva virgen y aceite refinado con una composición en ácidos grasos prácticamente igual. Se observó un incremento en la capacidad antioxidante del plasma tras la ingesta del aceite virgen comparado con el aceite refinado [31]. Ese mismo año, Ma- rrugat y cols. publicaron otro estudio de intervención, aleatorizado, controlado, cruzado y doble ciego, realizado en 30 voluntarios sanos residentes en España, que tomaron durante 3 semanas, con un periodo de lavado de 2 semanas, tres aceites de oliva con diferente concentración en compuestos fenólicos. Observa- ron un decenso en la concentración plasmática de LDL oxidadas (LDLox) y un incremento en la resistencia a la oxidación de las LDL tras las ingesta de los aceite de oliva con mayor contenido en compuestos fenólicos comparado con el aceite sin estas sustancias [32]. Con el mismo diseño y participantes del trabajo anterior, Covas y cols. evaluaron el efecto del tipo de aceite consumido sobre las concentraciones de LDLox, lipoperóxidos (LPO), F2-isoprostanos (F2IP), dienos conjugados, balance de glutation y la actividad de superóxido dismuta- sa (EC 1.15.1.1) (SOD), glutation peroxidasa (EC 1.11.1.9) (GPx), glutation reductasa (EC 1.6.4.2) (GR) y paraoxonasa (EC 3.1.1.2) (PON). En este caso sí observaron que estos marcadores de estrés oxidativo descendían de forma li- neal y opuesta al incremento en las concentraciones de los compuestos fenólicos (T, HT, metil-O-hidroxitirosol) contenidos en las partículas plasmáticas de LDL [33]. Otros dos trabajos analizaron el efecto protector que sobre el ADN mito- condrial y nuclear pueden tener los micronutrientes del aceite de oliva. Así, un estudio de intervención multicéntrico (España, Dinamarca, Finlandia, Ita- lia, Alemania), aleatorizado, cruzado y doble ciego, evaluó en hombres sanos el efecto que podría tener el consumo de tres tipos de aceite oliva con diferente con- centración en compuestos fenólicos durante 3 semanas con un periodo de lavado 2 Introducción 13 de 2 semanas entre ellos, sobre la eliminación urinaria de formas 8-hidroxiladas de guanosina (8-OHdG), desoxiguanosina y sus formas monóxidas (8OHGua), como marcadores de daño del ADN mitocondrial por estrés oxidativo [34]. Se observó una menor eliminación de estas sustancias al acabar cada periodo de intervención con respecto a los valores basales, pero no se encontraron diferen- cias de efecto al comparar los tres aceites entre sí. Sin embargo, Salvini y cols. llevaron a cabo un trabajo de intervención alimentaria en mujeres postmenopau- sicas que consumieron dos tipos de aceite de oliva con diferente concentración de compuestos fenólicos, siguiendo un diseño aleatorizado y cruzado. El daño oxidativo fue un 30% menor durante el periodo en el que se consumió el HPOO comparado con el LPOO [35]. En resumen, de estos ocho estudios, con participación de 292 personas (250 hombres y 42 mujeres), cinco (n=128) muestran que la ingesta diaria durante más de 3 semanas de aceite de oliva virgen modifica los marcadores de estrés oxidativo en situación de ayunas (Covas y cols., 2006; Visioli y cols., 2004; Marrugat y cols., 2004; Ramirez-Tortosa y cols., 1999; Salvini 2006). En dos estudios (n=64), en los que se incluyeron fumadores y mujeres, no observaron dichos efectos beneficiosos. En situación postprandial. Se considera que un incremento o una mayor duración de la lipemia postprandial es un factor de riesgo de desarrollo de arteriosclerosis debido a que se asocia a un estado de estrés oxidativo [36]. Varios estudios en humanos han evaluado el efecto del aceite de oliva virgen, concrétamente el papel de los compuestos fenólicos que contiene, sobre esta situación de riesgo. Los cuatro que destacan por su mayor calidad en cuanto a diseño aleatorizado, secuencial, cruzado y controlado son los que se comentan seguidamente. En 2004, Weinbrenner y cols. publicaron un estudio llevado a cabo en España con voluntarios sanos a los que se indicó que consumieran durante 4 días 25 mL de tres tipos de aceite de oliva con diferente concentración en compuestos 14 2 Introducción fenólicos siguiendo un diseño aleatorizado, cruzado y doble ciego, con periodos de lavado de 10 días entre los aceites. En el periodo postprandial, observaron que se reducían la concentración de LDLox y de 8-OHdG tras la ingesta de HPOO y MPOO (contenido medio en compuestos fenólicos) y la actividad de GPx tras el consumo de LPOO [23]. En otro estudio de intervención aleatorizado, cruzado y doble ciego reali- zado por nuestro grupo en el que participaron 15 mujeres postmenopáusicas y 6 hombres, todos diagnosticados de hipercolesterolemia poligénica y con eda- des entre 53-68 años, se evaluó el efecto de la ingesta aguda de 40 mL de dos aceites de oliva con diferente concentración en compuestos fenólicos sobre las concentraciones plasmáticas de LPO y F2IP. Los participantes siguieron una dieta baja en compuestos antioxidantes 24 horas antes de cada ingesta de aceite de oliva. Se observó una disminución significativa en el periodo postprandial de ambos marcadores tras la ingesta del aceite de oliva con alto contenido en feno- les comparado con el aceite de oliva con bajo contenido en dichos compuestos [37]. Covas y cols. llevaron a cabo un estudio de intervención aleatorizado, cruza- do, doble ciego, en el que se evaluó en 12 hombres sanos, residentes en España y con edades de 20-22 años, el efecto de la ingesta aguda de 40 mL de tres aceite de oliva con diferente concentración en compuestos fenólicos, sobre la oxidabilidad de las partículas de LDL colesterol. Los tres aceites se administraron de forma aleatorizada y cruzada, con un periodo de lavado de 10 días, durante el cuál los participantes siguieron estrictamente una dieta baja en sustancias antioxi- dantes. Estos autores encontraron que la concentración de partículas de LDLox guardaba una relación inversa con la concentración de compuestos fenólicos en los aceites administrados y directa con la concentración que alcanzaban algunas de estas sustancias (T, HT y 3-O-metil-hidroxitirosol) en el interior de dichas partículas de colesterol [24]. Bogani y cols. evaluaron los cambios en marcadores inflamatorios, [trombo- xano B2 (TXB2) y leucotrieno B4 (LTB4)] y marcadores de estrés oxidativo 2 Introducción 15 [niveles de peróxido de hidrógeno urinario (H2O2) y capacidad antioxidante to- tal del plasma] tras una comida grasa administrada a 12 sujetos sanos. Mediante un diseño de cuadrados latinos y divididos en tres grupos, los sujetos recibieron EVOO, aceite de oliva y aceite de girasol, con dos semanas de lavado en cada periodo. Se detectó un descenso significativo de TXB2 y LTB4 tras 2 y 6 horas de la ingesta de EVOO, pero no tras la ingesta de aceite de oliva y aceite de girasol, así como un incremento de la capacidad antioxidante total del plasma [38]. En resumen, los cuatro estudios citados previamente, con 69 participantes, 54 hombres y 15 mujeres, muestran que la ingesta aguda de aceite de oliva vir- gen modifica los marcadores de estrés oxidativo durante el periodo postprandial. Los autores tuvieron en cuenta los potenciales efectos antioxidantes de diversos alimentos en las dietas habituales de los participantes y los posibles errores en la interpretación de los resultados, por lo que fueron sometidos a un periodo de wash-in durante 1-10 días con dietas pobres en micronutrientes con capacidad antioxidante. En todos los estudios se observa que dichos efectos son dosis de- pendiente en relación a las concentraciones de los compuestos fenólicos en los aceites suministrados (Covas y col., 2006; Ruano y colsl., 2005; Weinbrenner y cols., 2004 y Bogani 2007) y a la biodisponibilidad de los mismos, representada por las concentraciones alcanzadas por éstos tanto en plasma como las partículas de LDLc (Covas y cols., 2006). Recientemente, la EFSA(European Food Safety Authority) ha publicado un documento en el que se destacan, en base a evidencias científicas, los beneficios para la salud de los compuestos fenólicos en la protección de las LDL del daño oxidativo 2 . Efectos antiinflamatorios. También se han atribuído efectos antiinfla- matorios a los micronutrientes del aceite virgen, tal y como diferentes trabajos realizados in vitro apuntaban hace un par de décadas. Los primeros indicios 2www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/2033.htm 16 2 Introducción fueron encontrados en modelos animales en los que se vio que tanto la produc- ción de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) como la citoxicidad mediada por macrófagos se reducían tras alimentar ratas con aceite de oliva [39]. Poste- riormente, Carluccio y cols. llevaron a cabo un estudio en células endoteliales procedentes de vena umbilical humana (HUVECs) activadas con lipopolsisacá- ridos (LPS) y citoquinas. Comprobaron que, tras ser cultivadas en un medio que contenía oleuropeína, HT o resveratrol a concentraciones nutricionales, se producía la inhibición de la expresión de moléculas de adhesión celular vascular (VCAM-1)[40]. Posteriormente se verificó que la oleuropeína, el HT y el ácido homovalínico reducían la concentración de moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1) y VCAM-1, tanto de la expresión de la proteína en la superficie de la HUVECs como de los respectivos niveles de mRNA, siendo mayor el efecto para oleuropeína e HT [41]. Estos resultados experimentales han servido de estímulo para el desarrollo posterior de estudios de intervención con el fin de comprobar si los resultados observados in vitro eran replicados al administrar aceite de oliva virgen a poblaciones sanas y con enfermedad cardiovascular. En situación de ayunas. Salas-Salvadó y cols. encontraron, en una cohorte de personas asintomáticas con elevado RCV, que unos hábitos de alimentación próximos al patrón de DMed, con fuente de grasa tanto nueces como aceite de oliva virgen, se asociaba a meno- res concentraciones plasmáticas en ayunas de VCAM-1, ICAM-1, interleucina 6 (IL-6) y proteína C reactiva (PCR) en comparación a un patrón de alimentación caracterizado por un consumo probre en grasas y elevado en frutas o cereales [42]. En 2009 Mena y cols. llevaron a cabo un estudio de intervención en 106 personas con elevado RCV, a las que se les administraron durante 3 meses y de manera paralela una dieta tipo DMed enriquecida con aceite de oliva, otra tipo DMed enriquecida con nueces y una control rica en hidratos de carbono (HCO) y baja en grasas. Al cabo de los tres meses, las personas que habían consumido las dos dietas tipo DMed presentaron un descenso de la expresión en monoci- 2 Introducción 17 tos de CD49d (quimitoaxis leucocitaria) y CD40 (ligando proinflamatorio), así como una disminución de las concentraciones plasmáticas de IL-6 e ICAM-1. Además, los participantes que sigueron una DMed enriquecida con aceite de oliva mostraron una reducción de VCAM-1 y PCR [43]. Para aclarar si estos efectos se debían al contenido en compuestos minorita- rios del aceite de oliva, Fitó y cols. diseñaron un estudio de intervención en el que participaron 28 pacientes con enfermedad coronaria a los que administra- ron dos tipos de aceite de oliva que solo se diferenciaban en la concentración de compuestos fenólicos, siguiendo un diseño aleatorizado, secuencial y cruza- do. Después de la administración diaria, durante 3 semanas, de 50 mL de cada aceite con 2 semanas de lavado entre ambos, comprobaron que las concentra- ciones plasmáticas de IL-6 y PCR fueron menores tras la ingesta de HPOO en comparación con el LPOO[44]. En situación postprandial. Durante estos años, nuestro grupo de investigación ha estado muy interesado en dilucidar si el efecto antiinflamatorio observado en situación de ayunas se producía también en el periodo postprandial. De este modo, diseñamos un es- tudio de intervención con personas sanas a las que se les administró durante 4 semanas, de forma secuencial y cruzada, tres tipos de dieta, que tenían como fuente de grasa principal aceite de oliva, mantequilla y nueces respectivamente. Además, al principio y al final de cada periodo, se les administró un desayuno rico en la fuente grasa en la que se había basado dicha intervención. Tanto en situación de ayunas como durante el periodo postprandial, cuando la dieta fue rica en aceite de oliva, no se produjo la activación de NFkB observada tras las otras dos intervenciones [45, 46]. Esta respuesta se vio acompañada de un incre- mento de la concentración de NO(x) y de una reducción de VCAM-1 durante el periodo postprandial [47]. Estos resultados han sido parcialmente reproducidos en un estudio griego de diseño paralelo en 67 voluntarios sanos, en el que se compararon los efectos 18 2 Introducción de diferentes tipos de aceite sobre marcadores solubles de inflamación. Estos autores demostraron que el consumo agudo de aceite de oliva, de soja, de hígado de bacalao y de girasol disminuía de manera significativa los niveles de ICAM-1 y además el aceite de oliva los niveles de TNFa [48]. Efectos antitrombóticos. El aceite de oliva virgen con alto contenido en compuestos fenólicos también ha demostrado ejercer un efecto beneficioso sobre los factores de coagulación y la agregabilidad plaquetaria. Inicialmente se realizaron estudios en animales de experimentación. Así, Pe- troni y cols. ya en el año 1995 investigaron los efectos in vitro de un compuesto fenólico obtenido del aceite de oliva, el 2-(3,4-di-hidroxifenil)-etanol (DHPE), encontrando que era capaz de inhibir la agregación plaquetaria y la producción de eicosanoides [49]. González-Correa y cols. postularon que este efecto estaría mediado por la inhibición que sobre la ciclooxigenasa (EC 1.14.99.1) (COX) tendrían compuestos como el HT, presente en la fracción minoritaria del aceite de oliva, lo que conduciría, en un segundo paso, a la reducción de la síntesis de tromboxano A2 (TXA2) [50]. En este tiempo varios estudios de intervención en humanos han intentando aclarar esta cuestión. López Segura y cols. demostraron que el consumo de una dieta rica en aceite de oliva durante 24 días reducía los niveles plasmáticos del inhibidor del activador tisular del plasminógeno (PAI-1) en comparación con una dieta NCEP-1 (rica en HCO y pobre en grasas)[51]. Oubina y cols. compararon el efecto del consumo diario de aceite de oliva virgen y de aceite de girasol alto en ácido oléico en 14 mujeres sanas. Tras un mes, comprobaron que se reducían las concentraciones de TXB2 en ayunas cuando las participantes tomaban aceite de oliva virgen. En la discusión, los autores atribuyen este efecto a la fracción fenólica del aceite de oliva, ya que el aceite de girasol alto en oleico posee más cantidad de dicho ácido que el propio aceite de oliva [52]. En este trabajo también se observó un descenso significativo de TXB2 y LTB4 en el periodo postprandial tras 2 y 6 horas de la ingesta de aceite de oliva virgen en comparación con el 2 Introducción 19 aceite de oliva refinado y el aceite de girasol [38]. Fueron Leger y cols. los que demostraron la reducción de TXB2 en plasma tras administrar diariamente 25 mg de HT a personas sanas durante tres días [53], hecho que se corresponde con un hallazgo similar de Visioli y cols. tras administrar HPOO a pacientes hiperlipémicos [31]. Aparte del efecto que el aceite de oliva tendría sobre la producción de leu- cotrienos y tromboxanos, se han publicado varios trabajos que demuestran la acción beneficiosa de sus micronutrientes sobre los mecanismos de la trombosis y coagulación, especialmente FVII y PAI-1, adoptando un perfil menos deletéreo. En uno de ellos se compararon los efectos que tendría la administración durante 3 semanas de tres dietas basadas en aceites de girasol, colza y aceite de oliva vir- gen sobre las concentraciones de FVII coagulante, tanto en ayunas como durante el periodo postprandial, en personas sanas, resultando menores tras la ingesta de aceite de oliva en comparación con los otros tipos de aceites [54]. Posteriormente se ha visto que el consumo de aceite de oliva también reduce otros factores de la coagulación, como VII, XII, XIIa y X, cuando se compara con el aceite de colza y el de girasol [54]. Un efecto de similar naturaleza se ha encontrado también sobre el PAI-1, el activador tisular del plasminógeno (t-PA) , el factor tisular [-Tissue factor- (TF)] o el fibrinógeno, al comparar aceite de oliva virgen con otros aceites como el de soja, el aceite refinado o grasas saturadas [55]. Estos cambios parecen estar relacionados con el contenido en compuestos fenólicos del aceite de oliva, tanto en ayunas [56] como en el periodo postprandial [57]. Acción vasodilatadora arterial. El aceite de oliva ha demostrado tam- bién mejorar la función vasodilatadora arterial mediada por el endotelio. Una limitación para poder interpretar los resultados de estos estudios es que la meto- dología utilizada es muy heterogénea, especialmente en relación a los parámetros medidos y las poblaciones objeto de estudio. Nuestro grupo ha evaluado la función endotelial tras la ingesta aguda de aceite de oliva y después de su consumo mantenido. Fuentes y cols. analizaron 20 2 Introducción el efecto que tenía en pacientes hipercolesterolémicos una alimentación de ti- po DMed rica en aceite de oliva, en comparación con una dieta rica en grasas saturadas, sobre la función endotelial medida con ecografía bidimensional. La dilatación mediada por flujo dependiente del endotelio (FMD) postisquémia me- joró tras la administración de la dieta tipo DMed, pero no tras la asegunda[58]. Esposito y cols. realizaron en Italia un estudio de intervención con 180 pacien- tes diagnosticados de Síndrome Metabólico (SMet) a los que, de forma paralela y simple ciego, se les indicó que consumieran una dieta de tipo DMed rica en aceite de oliva frente o una dieta baja en grasas y rica en HCO. Después de dos años de seguimiento, la función endotelial (medida como una escala de puntua- ción basada en las diferencias de presión arterial tras infusión de L Arginina) mejoró en el grupo de la intervención mientras que permaneció estable en el grupo control [59]. En estos años también se ha estudiado el efecto del aceite de oliva virgen y el vino sobre la función endotelial en sujetos sanos. En un trabajo de Karatzi y cols. los participantes recibieron diariamente una comida estándar junto a 50 g de aceite de oliva y 250 ml de vino. Se administraron dos tipos de aceite (aceite de oliva virgen y refinado) y dos tipos de vino (tinto y blanco) en un diseño 2 x 2. La FMD se midió con ecografía, tanto en ayunas como en el periodo postprandial. El consumo combinado de vino tinto con aceite de oliva virgen, ambos ricos en micronutrientes con capacidad antioxidante, mejoró la FMD tras una y dos horas de su ingesta en comparación con la FMD en ayunas [60]. Años más tarde, nuestro grupo, llevó cabo un estudio de intervención en pacientes hipercolesterolémicos quienes, con un diseño aleatorizado, secuencial y cruzado, recibieron desayunos basados en dos tipos de aceite de oliva virgen cuya única diferencia era la concentración en compuestos fenólicos [37]. La hiperemia reactiva postisquémia (PORH) medida con láser Doppler, mejoró durante el periodo postprandial tras la ingesta de HPOO en comparación con el LPOO. 2 Introducción 21 Mecanismos de acción del aceite de oliva. De la mayoría de los beneficios del aceite de oliva que han sido expuestos hasta ahora serían responsables tanto el ácido oleico como muchos de los compuestos minoritarios que hemos visto que contiene. Se ha demostrado que estos compuestos modifican algunos de los mecanismos biológicos implicados en la patogénesis de diferentes factores de RCV gracias a sus efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antitrombóticos [54, 9, 21]. Los trabajos más recientes apuntan a que sería el efecto sinérgico obtenido de la interacción de los distintos micronutrientes, más que la simple suma de actividad de cada uno por separado, el responsable del efecto beneficioso observado a nivel poblacional [61]. Este hecho reforzaría la idea de que es la suma de efectos obtenidos del conjunto de alimentos y no de los alimentos o nutrientes aislados, la responsable de los beneficios para la salud atribuídos al modelo de DMed. Además, algunos compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen como el escualeno, HT o triterpenos como el eritrodiol, uvaol, ácido maslínico y ácido oleanólico actuarían en múltiples niveles celulares mediando efectos antiproliferativos, citotóxicos, inductores de la apoptosis, reductores de radicales libres o preventivos del daño oxidativo del ADN [62, 63] 1.- Modificación del microambiente prooxidante. Como se ha co- mentado con anterioridad, la capacidad antioxidante es una característica co- mún a la mayoría de micronutrientes del aceite de oliva. El estrés oxidativo está implicado en el desarrollo del envejecimiento, inflamación, infecciones, cáncer y enfermedades cardiovasculares. Se define como el desequilibrio entre la produc- ción de especies radicales reactivas de oxígeno (EROs) y de nitrógeno (ERNs) y las defensas antioxidantes, en favor de los primeros. El oxígeno es esencial como aceptor terminal de electrones en las cadenas respiratorias de los orga- nismos aerobios. Estas moléculas interaccionan con lípidos, CHO, proteínas y aminoácidos, ADN y otros radicales libres y antioxidantes. Ésto pone en marcha sistemas enzimáticos antioxidantes como la catalasa (EC 1.11.1.6) (CAT), SOD y GR así como otras enzimas relacionadas con la reparación del ADN como la 22 2 Introducción Figura 4. Sistemas enzimáticos involucrados en la generación e inactivación de ROS. Tomado de Förstermann U (2008). [64] poli-ADP-ribosa polimerasa (PARP-1), Ref-1, ADN-PK y p53. Del equilibrio entre ambos sistemas, oxidante y antioxidante, depende el mantenimiento de la función biológica celular normal y cuando falla se origina un estado denominado estrés oxidativo (Figura 4). Existen muchas fuentes de EROs que pueden favorecer un ambiente prooxi- dante en la proximidad del endotelio como el tabaco, ciertos medicamentos, moléculas contenidas en los alimentos (ácidos grasos oxidados, trazas metálicas, aditivos alimentarios, alcohol, trazas de pesticidas), el metabolismo citosólico y mitocondrial de las células circulantes en el plasma y de la pared vascular, y los perixisomas de los macrófagos activados. Los compuestos fenólicos han mostrado in vitro ejercer un efecto antioxidan- te sobre las LDLox [65] y disminuir la producción de F2IP, marcador también de oxidación lipídica [21]. En un estudio reciente, al incubar células mononucleares de sangre periférica con TCDD, una potente dioxina, se comprobó que dismi- nuía significativamente la viabilidad de dichas células y la actividad de CAT y GP, aumentando las concentraciones de SOD, GR y otros marcadores de estrés oxidativo como LPO, proteinas carboniladas (PC) y EROs. Sin embargo, al in- cubar las células conjuntamente con TCDD y un compuesto fenólico del aceite de oliva como es el HT, todos estos marcadores de estrés oxidativo se normali- 2 Introducción 23 zaron, aumentó la supervivencia de la célula y disminuyeron las concentraciones de LPO, PC, SOD y GR [66]. In vivo, aumenta la capacidad antioxidante del plasma, [38] protege frente al daño oxidativo en el ADN mitocondrial y aumen- ta la actividad GP [23]. Otros compuestos fenólicos también han demostrado poseer actividad antioxidante, como la oleuropeína, que inhibe la oxidación de las LDL inducida por sulfato de cobre , la formación de LPO y actuan como scavenger de aniones superóxido generados por las células polimorfonucleares [21]. Por último, uno de los mecanismos de acción conocidos del escualeno, otro componente minoritario del aceite de oliva, sería su papel como scavenger de ra- dicales libres [67]. Otras sustancias antioxidantes como la coenzima Q, añadidas a una DMed, han demostrado disminuir el estres oxidativo postprandial[6]. 2.- Interacción con proteínas transportadoras y enzimas. El oleo- cantal, secoiroide responsable del sabor picante del aceite de oliva virgen, ha demostrado tener efectos antiinflamatorios al inhibir COX-1 y COX-2 de una manera análoga al ibuprofeno [68]. Además, se ha comprobado que las modifi- caciones de la actividad enzimática que median la capacidad antiproliferativa del escualeno son la inhibición de la farnesilación de la oncoproteina ras y de la HMG-CoA reductasa, lo que reduciría la producción de mevalonato, nece- sario para la síntesis de DNA durante la proliferación celular. También se ha demostrado que el escualeno tiene capacidad de modular la función de enzimas implicadas en la activación de ciertos carcinógenos [69]. Por otro lado, los si- tosteroles del aceite de oliva virgen podrían disminuir de manera significativa las concentraciones de LDLs, CT y TG a través del bloqueo competitivo de la familia de receptores intestinales ABCG5/8 [70]. Estos compuestos interaccio- narían también a nivel del sistema nervioso con la proteina Tau impidiendo su cambio a conformación fibrilar, uno de los principales fenómenos implicados en el proceso neurodegenerativo de la enfermedad de Alzheimer [71]. 3.-Regulación de la expresión génica. Se ha sugerido que uno de los mecanismos implicados en los efectos biológicos beneficiosos observados en las 24 2 Introducción personas que siguen una DMed sería la modulación de la expresión de aquellos genes involucrados en los fenómenos de inflamación vascular, de la generación de macrófagos espumosos y en la trombogénesis [72]. Recientemente se ha descrito cómo la adición de coenzima Q a una DMed es capaz de reducir la expresión postprandial de genes antioxidantes así como de modular la respuesta inflama- toria postprandial y el estrés del retículo endoplásmico[73, 74]. Aunque existe ya información sobre el efecto que a nivel génico ejercerían algunos de los mi- cronutrientes contenidos en la DMed, como resveratrol [75], flavonoides [76] o alfatocoferol [77], aún falta mucho por conocer referente al mecanismo de ac- ción por el que los compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen ejercerían dichos cambios de expresión génica. Con el fin de aclarar esta cuestión se han realizado estudios preliminares tanto in vitro como en modelos animales usando plataformas de microarrays de expresion génica [78]. Éstos han sugerido que el aceite de oliva podría modificar la expresión de genes que codifican proteí- nas involucradas en los mecanismos celulares que median la resistencia al estrés oxidativo [79], el metabolismo lipídico [80] y otras rutas relacionadas con la pa- togenia de la arteriosclerosis [81]. A pesar de que estos resultados han abierto una interesante línea de investigación, queda aun por dilucidar si estos cambios en la expresión génica están mediados por el propio ácido oleico o se deben a la presencia de los compenentes minoritarios, como consecuencia de su actividad antioxidante o por la interacción directa con receptores, enzimas o factores de transcripción. 2 Introducción 252.2. El Síndrome Metabólico. 2.2.1. Concepto. El SMet representa un estado crónico inflamatorio sistémico desencadenado por el desequilibrio energético ocasionado por un estilo de vida en el que predo- mina el hábito sedentario y una excesiva alimentación, cuya fuente de energía está constituída principalmente por grasas saturadas. La importancia de dicho estado radica en que, si se mantiene en el tiempo y el sustrato genético es el adecuado, las personas que lo padecen desarrollan alteraciones celulares de ca- rácter deletéreo a nivel del tejido adiposo, el músculo, el hígado o el endotelio arterial. Estos cambios, en último término, condicionan la aparición de obesi- dad, resistencia periférica a la acción de la insulina, hipertensión arterial o de enfermedad coronaria arteriosclerótica. El síndrome no es sino un conjunto de características fenotípicas que aparecen tardíamente en la historia natural de la enfermedad. De hecho, hasta hace pocos años, han existido discrepancias en la forma de abordar su estudio por parte de los grupos de investigadores clíni- cos y de los investigadores básicos. Los primeros, centrados en definir mejor los criterios diagnósticos del síndrome, tan sólo consideraban los aspectos clínicos que eran reflejo de la alteración de los órganos implicados. Los segundos han intentado dilucidar tanto la patogenia del síndrome como su historia natural a nivel celular y de tejidos. A la luz de los trabajos experimentales realizados en este campo en los últimos 10 años, ha sido necesario corregir en varias ocasiones los criterios del SMet, de tal modo que se han bajado los umbrales definitorios para algunos de los parámetros utilizados, con la intención de identificar más precozmente muchos de los pacientes con SMet [82]. Ha sido necesario conocer mejor la naturaleza de esta alteración inflamatoria para introducir en el área clínica el concepto evolutivo del SMet, desbancando así la concepción estática que había hasta la fecha. Este nuevo paradigma, que centra el origen del pro- blema en la inflamación sistémica iniciada en el tejido adiposo, permite explicar cómo pueden existir poblaciones que, con un estado inflamatorio crónico similar 26 2 Introducción al de SMet, pero sin cumplir todos los criterios clínicos definitorios del SMet, presenten mayor riesgo de enfermedad cardiovascular que la población normal. Ejemplos son aquellas personas con normopeso, con lipodistrofia o incluso en- fermos obesos sin resistencia a la acción de la insulina [83, 84]. Tanto los estudios genéticos como el abordaje mediante biología de siste- mas han sido dos estrategias que han facilitado esta labor investigadora y cuya mayor aportación es la de identificar poblaciones en riesgo de desarrollar la en- fermedad cuando se exponen a estilos de vida similares a los que condicionan la aparición del SMet [85]. Esto permitiría diseñar de forma personalizada estrate- gias preventivas encaminadas tanto a evitar la aparición del estado inflamatorio en personas genéticamente predispuestas como a seleccionar qué cambios en el estilo de vida y qué modalidades de tratamiento serían más coste-eficientes para modificar su riesgo antes de que aparezca la enfermedad cardiovascular [7]. El convencimiento de que la obesidad es un problema de salud mundial y la percepción de que el tejido adiposo es algo más que un mero depósito de grasa han llevado a centrar su atención como órgano endocrino. Este aspecto es importante, ya que probablemente el factor necesario para iniciar la cascada de eventos patogénicos no sea el incremento en la masa grasa corporal sino de la capacidad que ésta tenga para adaptarse a modificaciones en el equilibrio energético y de la sensibilidad del mismo a responder a dichas modificaciones activando un fenotipo pro-inflamatorio. De hecho, aunque la obesidad central se ha considerado siempre un rasgo característico del síndrome, en los últimos años se han encontrado evidencias que apoyan la anterior hipótesis. En este sentido, diferentes trabajos han demostrado que, por un lado, existen personas delgadas que sí presentan el resto de los criterios definitorios del SMet y, por otro, pacientes obesos que no desarrollan en el tiempo ninguno de los rasgos ca- racterísticos de SMet [83]. Por este motivo, en 2009 se publicó un documento de consenso internacional elaborado conjuntamente por varias sociedades científi- cas entre las que se encontraban International Diabetes Federation (IDF), Task Force on Epidemiology and Prevention, National Heart, Lung and Blood Ins- 2 Introducción 27 titute (NHLBI), American Heart Association (AHA), World Heart Federation (WHF), International Atherosclerosis Society (IAS) e International Association for the Study of Obesity (IASO). Revisando los criterios del ATP III, en el docu- mento elaborado no se consideraba la obesidad abdominal como un componente necesario para la definición de SMet [86]. Esta declaración aglutina la principal conclusión de los investigadores básicos, quienes sostienen que realmente nos encontramos ante un problema de inflamación crónica sistémica, originado por una alteración en el equilibrio energético corporal, en el que la obesidad, al igual que la resistencia a la insulina, no es sino un fenotipo intermedio muy frecuente, pero no imprescindible, que conecta el inicio de la enfermedad, el desarrollo de la arteriosclerosis y la aparición de eventos cardiovasculares. 2.2.2. El estilo de vida como causa del inicio y el mantenimiento del SMet. Como se ha comentado anteriormente, existen ciertos estilos de vida que favorecen el inicio del SMet. De este modo, tener hábitos de alimentación inade- cuados o la escasez de ejercicio físico regular condicionan su desarrollo. La po- blación occidental se encuentra en situación postprandial la mayor parte del día. La hiperlipemia postprandial ejerce efectos negativos sobre la integridad vascular, los fenómenos inflamatorios y el metabolismo de los ácidos grasos, pe- ro también puede ser influida de manera positiva por la dieta y por estilos de vida saludables. La hiperlipemia postprandial es la respuesta fisiológica ante una comida grasa y esta respuesta puede ser diferente según el tipo y canti- dad de grasa ingerida [54, 87]. Se ha comprobado que en diferentes poblaciones con modelos de alimentación ricos en grasa saturada, especialmente en países industrializados, existe una mayor frecuencia de SMet [88] y, de forma inversa, cómo la dieta rica en monoinsaturados ejercería un efecto protector [89]. La inactividad física también se ha relacionado en diversos estudios con una mayor incidencia de SMet [90]. En un reciente trabajo conducido en adolescentes, con un seguimiento medio de 22 años, encontraron que el hábito sedentario durante 28 2 Introducción este periodo interaccionaba con factores genéticos sobre los cambios observados en el índice de masa corporal (IMC) en el paso de la adolescencia a la edad adulta [91]. Como es de suponer, cambios en el estilo de vida de aquellas personas en riesgo de SMet, tanto en lo referente a sus patrones de alimentación como en la actividad física, son objetivo principal en el diseño de estrategias de prevención de las alteraciones metabólicas-inflamatorias o del control de las complicaciones asociadas al SMet [92]. Con respecto a los estilos de alimentación, existen sufi- cientes pruebas que sugieren que los patrones de alimentación ricos en frutas y verduras, fibra no absorbible, aceite de oliva virgen y diversas fuentes de ácidos grasos w-3 reducen algunos de los rasgos clínicos [93, 94, 95, 96, 97] y paráme- tros de alteración tisular e inflamación sistémica [98, 99] en estas personas. Por ejemplo, un estudio reciente ha demostrado, en pacientes con SMet y sobrepe- so, que el consumo durante 18 semanas de una dieta rica en fibra de cereales mejora la sensibilidad a la insulina [93] o que una dieta baja en grasas y rica en carbohidratos suplementada con w-3 de cadena larga pueden mejorar el perfil lipoproteico postprandial en pacientes con SMet, en el sentido de producir una reducción de TG en comparación con otras dietas [96]. Con respecto a esta úl- tima dieta, recientemente se ha publicado, en el marco del proyecto LIPGENE, un estudio que concluye que además es capaz disminuir la incidencia de SMet o de revertirlo en casos ya diagnosticados [100]. La DMed, constituye uno de los patrones de alimentación más saludables en la actualidad, habiendo mostrado sus beneficios en cuanto a la prevención y la modificación del curso evolutivo del SMet y de enfermedades cardiovasculares relacionados con éste [101, 42, 102]. La adherencia a una DMed también se ha relacionado con efectos beneficiosos sobre cada uno de los componentes clínicos definitorios del SMet. Con respecto al perímetro abdominal, una alta adherencia a la DMed se ha asociado a cifras menores de este parámetro en varias pobla- ciones . En lo que se refiere al perfil lipídico, un metaanálisis reciente analizó 50 estudios, algunos prospectivos, otros ensayos clinicos y otros transversales, 2 Introducción 29 determinando que la DMed se asocia a una reducción en la concentración de TG y a un aumento de HDL-c [103]. En ese mismo trabajo se evaluó la rela- ción existente entre la presión arterial y la DMed. Una gran adherencia a la DMed se relacionaba con un descenso en cifras de PA en comparación con una adherencia menor [104] y, si se comparaba la DMed con otra dieta control, la reducción de la presión arterial resultaba mayor tras el consumo de la primera [103]. El patrón de DMed también ha demostrado tener un efecto beneficioso sobre el metabolismo hidrocarbonado, disminuyendo tanto las cifras de glucosa plasmática en ayunas como el valor del índice HOMA-IR [105]. 2.2.3. El tejido adiposo disfuncionante como origen del estado infla- matorio persistente del SMet. Algunas paradojas, como el hecho de que la disminución del riesgo cardio- vascular sea limitada, incluso alcanzando en la clínica un control intensivo de la homeostasis de la glucosa en la DM tipo 2, o que existan rasgos propios del SMet en pacientes con atrofia de tejido adiposo, como ocurre en algunas lipo- distrofias, han llevado a cambiar el papel principal que tenía el fenómeno de resistencia periférica a la insulina en la fisiopatología del SMet por el del tejido adiposo como el primer órgano que falla [106]. El tejido adiposo, además de las funciones clásicas de aislamiento térmico, protección mecánica y almacenamiento de grasa en forma TG, se comporta como un órgano metabólicamente activo donde, coordinado con el hígado, el músculo esquelético y el sistema nervioso, se inician todas las alteraciones que aparecen en el desarrollo del SMet [107]. Una de sus funciones principales es almacenar los lípidos absorbidos en el tubo digestivo durante el periodo postprandial. Un exceso en la cantidad de grasa ingerida asociado al sedentarismo puede alterar el balance energético, tal y como ocurre en algunos modelos de alimentación frecuentemente seguidos en los países industrializados. Esta situación inesta- ble puede ser adecuadamente manejada por el tejido graso o precipitar el fallo de la homeostasis lipídica, dando lugar a cambios en el sistema de transporte 30 2 Introducción energético del adipocito, la alteración del metabolismo de la glucosa y la acti- vación de mecanismos autorreguladores que extienden el desequilibrio al resto del organismo. La respuesta adecuada ante un exceso de grasa postprandial es el almacenamiento de los TG en adipocitos pequeños y periféricos, localizados en la grasa subcutánea de las extremidades. Cuando se sobrepasa su capaci- dad, dichos TG se acumularían en otras regiones donde existen poblaciones de adipocitos inicialmente no preparados para dicha función. De este modo, su acú- mulo mantenido, tanto intraabdominal como en el tejido muscular, facilitará la aparición de resistencia a la insulina allí donde se depositen [108]. La composición corporal de masa grasa también depende del número y del tamaño de dichos adipocitos. El número de adipocitos está limitado en la edad adulta, por lo que los cambios que experimente la persona en esta etapa de la vida en la masa grasa se atribuyen a cambios en el tamaño de los mismos. Ade- más, el tejido graso puede sufrir dos tipos de transformaciones, ante condiciones de balance energético positivo: a) si el tejido sufre hiperplasia y es capaz de ex- pandirse, las personas no desarrollaran características del SMet; b) si las células sufren hipertrofia y el tejido tiene escasa capacidad de expandirse, se hace re- sistente a la insulina, contribuyendo así al conjunto de alteraciones metabólicas de este síndrome. Es lo que se conoce con el término de obesidad hipertrófica [109]. Parece ser que en la obesidad que acompaña al SMet hay una correlación negativa entre el IMC y el número de preadipocitos, lo que ha hecho pensar que se produce un deterioro de la diferenciación de preadipocito a adipocito, aunque este fenomeno aún no es bien conocido. Ciertos mediadores, como el TNFa, in- ducen una transdiferenciación del preadipocito hacia un fenotipo macrófago-like. Este hecho explicaría la disminución del número de adipocitos y la perpetuación del estado inflamatorio. Sin embargo basados en que este efecto es reversible, otros autores postulan que lo realmente existe es una incapacidad intrínseca del preadipocito para diferenciarse a adipocito en los pacientes predispuestos a desarrollar SMet, en los que el tejido adiposo circundante se ha expandido e 2 Introducción 31 hipertrofiado[110]. Estos adipocitos hipertrofiados, grandes, más insulín resis- tentes y lipolíticos, secretarían más mediadores inflamatorios. En resumen, no sólo el aumento de la masa grasa por hipertrofia de adipocitos, sino su loca- lización en el cuerpo también tendrá un papel importante en el desarrollo de obesidad y SMet. La grasa visceral es más activa en cuanto a la incorporación y liberación de ácidos grasos libres, mientras que el almacenamiento masivo de energia tiene lugar de forma más eficiente en el tejido adiposo subcutaneo. La capacidad de amortiguación del pico de absorción postprandial de TG por parte del tejido adiposo visceral es limitada cuando la capacidad del tejido adiposo periférico es superada [106]. Existen varios mecanismos que dirigen el paso de la simple obesidad central al desarrollo de SMet. En primer lugar, el estado lipolítico de la grasa omental muestra resistencia a la insulina, lo que contribuye a la exposición del hígado, a través de la circulación portal, a grandes cantidades de ácidos grasos libres, facilitando así los cambios metabólicos hepáticos que conducen a la hiperinsuli- nemia (por disminución del aclaramiento hepático de insulina), la intolerancia a la glucosa (por aumento de producción hepática de glucosa) y la hipertrigliceri- demia [por aumento de secreción de apolipoproteína B (APO B) y VLDL][111]. En el caso de los depósitos grasos periféricos no ocurre esta situación, pues los ácidos grasos liberados evitan la circulación portal y sus consecuencias. El segun- do mecanismo se fundamenta en la capacidad secretora del tejido adiposo, como órgano endocrino, de liberar adipoquinas como la adiponectina y, bajo determi- nadas condiciones, citoquinas proinflamatorias como la proteina quimiotáctica de monocitos tipo 1 (MCP-1), IL-6 o TNFa, promoviendo tanto la inflamación como la disminución de la sensibilidad a la insulina y contribuyendo de ésta manera al perfil inflamatorio y protrombótico que tiene lugar en el SMet [112]. Una inflamación crónica de bajo grado en el tejido adiposo puede ser el factor central en el desarrollo de muchas patologías que caracterizan el SMet. Las adipoquinas son citoquinas que funcionarían como moduladores de dicha inflamación, en primera instancia a nivel local y, posteriormente, con repercu- 32 2 Introducción sión sistémica [113]. Este estado, junto a la resistencia periférica a la acción de la insulina y la disfunción del endotelio arterial, son los principales fenómenos biológicos que dirigen el desarrollo de la arteriosclerosis en estos pacientes [114]. En un estudio reciente se evaluó la presencia de SMet en pacientes obesos con y sin grasa ?inflamada?, de acuerdo con la presencia o no de crown like structures (CLS), figuras histológicas resultado de la disposición de los macrófagos alre- dedor de un adipocito muerto en una estructura similar a una corona, y cuya presencia sugiere actividad inflamatoria, comparándolos con personas delgadas. Observaron que aquellos pacientes obesos en cuyo tejido adiposo no aparecían estas estructuras, presentaban un fenotipo clínico con menos resistencia insulí- nica y menos expresión de genes proaterogénicos junto a una función vascular preservada, situación más parecido a la de las personas delgadas que a la de los obesos con tejido adiposo inflamado [115]. La presencia de las CLS en el teji- do adiposo periférico se ha relacionado recientemente con la cantidad de tejido adiposo visceral, un incremento de producción de TNFa, mayor secreción de insulina en ayunas y concentración elevada de glucosa junto a la sobreexpresión de metalopeptidasa de matriz 9 (MMP-9), CD 14 y de otros genes relacionados con la ruta de NF-kB[116]. A diferencia de la IL-6, el TNFa no es secretado mayoritariamente por adipo- citos, sino por macrófagos activados que infiltran dicho tejido. Ambas citoquinas promueven la lipolisis y la secreción de ácidos grasos libres que, una vez liberados a través del sistema portal, contribuyen al aumento de glucogénesis hepática, induciendo resistencia periférica a la acción de la insulina [117]. Además, la IL-6 promueve la inflamación no solo en el propio tejido adiposo, donde es primaria- mente producida, sino también en el endotelio arterial y en el hígado. De hecho, se ha comprobado que la concentración portal de IL-6 presenta una correlación positiva con la concentración de PCR en dicho sistema, lo que explicaría cómo cambios metabólicos e inflamatorios iniciados localmente en la grasa visceral re- percuten en el estado de inflamación sistémica crónica de bajo grado observada en los pacientes con SMet [118]. 2 Introducción 33 Ambas citoquinas participan también en el fenómeno de resistencia a la ac- ción de la insulina que ocurre en los tejidos periféricos. Un mecanismo implicado es la inhibición de la fosforilacion de IRS-1, molécula clave en las vías de se- ñalización de la insulina [119]. La activación de los receptores de TNFa e IL-6 induce la activación de importantes activadores de la inflamación como la kinasa IKKb y la kinasa N-terminal c-Jun (JNK). JNK también se activaría por los AGL y por las proteínas de respuesta ante el ?estrés en el retículo endoplásmico?, factores que se han relacionado con la actividad asociada a la obesidad [120]. La activación de IKKb no causaría resistencia insulínica mediante la fosforilación de IRS-1, sino a través de la activación del factor de transcripción NF-kB, que mediaría la expresión de diferentes genes responsables de la respuesta proinfla- matoria [119]. Por último, hay que mencionar el papel que desempeña la infiltración de monocitos-macrófagos en el tejido adiposo, probablemente desencadenada como respuesta al aumento del tamaño de los adipocitos que se observa al incio del SMet. Este incremento se asocia a mayor estrés de las células del tejido adi- poso, lo que origina especies radicálicas de oxígeno y libera AGL y citoquinas proinflamatorias. De éstas, MCP-1 parece ser la más importante para iniciar el reclutamiento de monocitos, pues se ha visto que aparece en el tejido graso de forma precoz, mucho antes que otros marcadores inflamatorios. La transmigra- ción de monocitos desde el endotelio capilar que atraviesa los lobulillos de tejido graso se realiza mediante la expresión secuencial de moleculas de adhesión por ambas partes, tanto de las células endoteliales como de los propios monocitos (Figura 5). Tras su salida al tejido adiposo, los monocitos se diferencian en macrófagos activados con capacidad de liberar citoquinas proinflamatorias. Los macrófagos activados constituyen la fuente principal TNFa en el tejido adiposo y es posible que actúen de manera sinérgica con los adipocitos, amplificando así el fenó- meno inflamatorio a nivel local. Los monocitos residentes en el tejido adiposo tienen una producción escasa de citoquinas proinflamatorias, pero pueden ser 34 2 Introducción Figura 5. Migración transendotelial. Tomado de Ley K y cols. Nature Rev (2007). [121] también activados a a partir de las citoquinas producidas por macrófagos pro- cedentes del torrente circulatorio, obteniendo así un efecto multiplicador [112]. Hay autores que argumentan que más que representar una simple enfermedad inflamatoria, el SMet constituiría un trastorno específico de activación macro- fágica con la consecuente pérdida de coordinación metabólica. Como tal, las secuelas de la obesidad serían más producto de la pérdida de influencia positiva de los macrófagos y no solo del perjuicio de la inflamación. Las implicaciones de estas conclusiones podrían ser importantes, ya que supondrían una nueva diana terapéutica para esta pandemia: la activación macrofágica [122]. 2.2.4. Genética poblacional, epigenética y biología de sistemas. La fisiopatología del SMet es un problema complejo de abordar ya que no obedece a un único mecanismo, sino que es consecuencia de una serie de al- teraciones mantenidas en el tiempo en personas que, con un sustrato genético predisponente, se exponen a una serie de estímulos medioambientales poco sa- ludables. Saber en qué proporción es responsable cada uno de los factores es difícil de discernir ya que carecemos de estudios que sean capaces de cuantificar la carga genética, y en ocasiones nos vemos obligados a confiar en informaciones separadas de los componentes fenotípicos o rasgos metabólicos que conforman 2 Introducción 35 dicho síndrome como la dislipemia, la resistencia insulínica, la obesidad o la hipertensión arterial [2]. Dichos rasgos podrían estar condicionados entre un 40 y un 70% de ocasiones por el componente hereditario [85]. La naturaleza fa- miliar del SMet y la marcada diferencia en la prevalencia entre varios grupos raciales son claramente consistentes con la existencia de un componente gené- tico de susceptibilidad para la enfermedad. Pero no es suficiente sólo con el sustrato genético, pues la expresividad fenotípica está también modulada por factores ambientales relacionados con los hábitos de vida como el exceso de la ingesta calórica, baja actividad física, exceso de grasas saturadas, dieta con bajo contenido en fibra, el excesivo consumo de alcohol o el tabaquismo. El interés por dilucidar los aspectos genéticos en el desarrollo del SMet ha dado lugar a nuevas área de investigación. Una de ellas sería la Nutrigenómi- ca, que analiza el papel que diferentes variaciones genéticas [polimorfismos de nucleótido único (SNPs) o variaciones en el número de copias (CNVs)], seleccio- nadas en el proceso evolutivo, que actuarían como moduladoras del desarrollo del SMet en presencia de ciertos hábitos alimentarios. En la era paleolítica, el hombre se veía obligado a realizar una enorme tarea física diaria para conseguir sus alimentos. De dicha necesidad y de la interacción con el medio, se postula que se favoreció la selección de un ?genotipo ahorrador?, es decir, determinadas variaciones genéticas asociadas a una maquinaria enzimática capaz de facilitar el almacenamiento eficiente del exceso de energía en forma de glucógeno muscular y de TG en el tejido adiposo con la finalidad de almacenarlos en los perio- dos de abundancia y utilizarlos en momentos de escasez [123]. Esta capacidad ahorradora programada genéticamente desde hace miles de años ha tenido que enfrentarse a cambios en el estilo de vida del ser humano, sobre todo en los paí- ses industrializados del primer mundo. En éstos, existen hábitos de vida donde son frecuentes el consumo abundante de alimentos de alto contenido calórico y una menor actividad física. La selección de ?polimorfismos genéticos ahorrado- res? unidos a una elevada ingesta calórica podrían explicar el aumento de peso que se observa en estos países y que ha conducido al incremento de magnitud 36 2 Introducción epidémica de SMet y de DM tipo 2 en las últimas décadas. La Epigenética es otro área de investigación cuya aplicación al estudio del SMet ha cobrado interés en los últimos años [124]. Su objetivo es analizar qué factores podrían regular la transcripción génica mediante la programación de patrones de metilación de las zonas promotoras durante la etapa de vida intra- uterina y cómo dicha regulación influiría en el desarrollo de SMet tanto en la infancia como en la etapa adulta [125](Figura 6). Existen evidencias epidemio- lógicas que relacionan el peso al nacer con el desarrollo en la edad adulta de SMet y de enfermedad cardiovascular [126]. Uno de los modelos que se ha creado para explicar este fenómeno ha sido el del ?genotipo ahorrador?. De manera similar a lo que ocurrió en la era paleolítica, según esta hipótesis, un microambiente fetal deficitario en nutrientes conduciría a la reprogramación del patrón de metilación de aquellos genes cuyas proteínas faciliten una respuesta metabólica adaptativa que permita asegurar la supervivencia hasta el nacimiento. En este caso, si tras el nacimiento el ambiente fuese rico en nutrientes, la anterior programación epi- genética ?ahorradora? facilitaría el desarrollo de SMet en la edad adulta [127]. Esto sucedió en una población femenina holandesa en un periodo de hambruna tras la segunda guerra mundial. Sin embargo, estas conclusiones son difíciles de extrapolar al estado actual de los países del primer mundo. Una situación de privación de nutrientes de tal magnitud durante el embarazo tan solo se encon- traría a día de hoy en países del tercer mundo o en situaciones muy concretas como la hiperémesis gravídica o bien en el caso de trastornos de la conducta alimentaria durante el embarazo. Además de la hipótesis anterior de desnutrición prenatal, existe otro modelo que considera que el patrón de metilación también puede ser alterado en el caso de que exista sobrenutrición de la madre durante el periodo de gestación. Cada vez hay más resultados que apuntan a que la ingesta abundante de grasas duran- te el embarazo y la lactancia puede condicionar que el recién nacido desarrolle SMet en la edad adulta [128]. De este modo, se ha observado en animales de experimentación que la alimentación materna con elevada cantidad de grasas 2 Introducción 37 !"#$%&'()*')&+'(,%) #"&*+%-"(#./"&) 0+%1"&#"*%&'() !"#$%&$'(') *+,-./"0-() 1$"2&() 3$'02(&,0$"4$) !506$"2&() !"#$%&$'(') -(%'027(*-+.(%) Figura 6. Relaciones entre genética, epigenética y enfermedad cardiovascular. origina en las crías un aumento de la adiposidad y la expresión modificada de proteínas clave implicadas en la señalización hepática de la insulina, lo que ori- gina a su vez una disminución de la sensibilidad hepática a dicha hormona [129]. Estos animales desarrollan posteriormente disfunción endotelial, hipertensión y enfermedad cardiovascular [130]. De todos modos, parece ser que la realidad es más compleja, ya que un reciente metaanálisis encuentra que la relación entre el peso al nacimiento y la masa grasa adulta adopta la morfología de una curva en ?U?, de manera que, pesos extremos al nacimiento, tanto muy bajos como muy altos, pueden predisponer a la aparición de DM tipo 2 en la edad adulta [131]. La genética del SMet es por tanto muy compleja y depende de muchos facto- res. Estudios recientes sugieren que los mecanismos epigenéticos de programa- ción involucrados son cambios en el patrón de metilación de islas CpG (tanto hiper como hipometilación de las regiones promotoras), la modificacion median- te metilación y acetilación de histonas y la expresión de determinados miRNAs. 38 2 Introducción Todos estos mecanismos actuarían tanto en el periodo prenatal como durante el resto de la vida regulando la expresión génica sin alterar la secuencia del ADN. De cualquier manera, las evidencias indican que el epigenoma se puede ver afec- tado por factores medioambientales durante periodos críticos del desarrollo [132] y durante el inicio de la obesidad y el SMet [133]. En el seno del SMet se ven afectadas multitud de rutas metabólicas e infini- dad de genes involucrados en ellas describiéndose SNPs relacionados con rasgos y componentes de SMet como la dislipemia, la obesidad o la resistencia insu- línica. Así Povel y cols. demostraron que los polimorfismos CETP Ile405Val y APOE Cys112Arg se asociaban a concentraciones bajas de HDLc y a obesidad abdominal, siendo el efecto de uno independiente del otro y viceversa [134]. Fre- deriksen y cols demostraron que los pacientes homocigotos para el alelo Ala del polimorfismo Pro12Ala de PPAR-gamma 2 presentaban una reducción de ries- go de resistencia insulínica en una poblacion danesa de pacientes no diabéticos [135]. También se han realizado estudios explorando las interacciones de otros polimorfismos con factores dietéticos como el de Pérez-Martinez y cols. que de- mostraron en el proyecto LIPGENE, cómo el polimorfismo P446L de GCKR interaccionaba con los ácidos grasos w-3, modulando así la resistencia insulínica y la concentración plasmática de ciertos marcadores de inflamación en pacientes con SMet [136]. Deram y cols., analizando las variantes polimórficas del gen que codifica la perilipina, encontraron que el alelo minoritario de PLIN4 se asociaba a un mayor riesgo de padecer SMet, mientras que el PLIN6 se asoció a mayor pérdida ponderal en una población de adolescentes obesos a los que se sometió durante 20 semanas a terapia conductual y nutricional para perder peso [137]. También se ha estudiado el papel que juegan los miRNAs en el desarrollo y mantenimeinto del SMet. Así se ha visto que determinados miRNAs se re- lacionan con la adipogénesis a través de la via WNT (miR-8, -210, -21) o con el funcionamiento de adipocitos maduros (miRs-10b, -15, -26a) [138, 139, 140]. Otros miRNAs actúan como mediadores de vias de señalización de inflamación en el tejido adiposo como el miR-132, que promueve la producción de factores 2 Introducción 39 proinflamatorios en respuesta al estrés nutricional [141]. Otros miRNAs se han asociado al metabolismo hidrocarbonado (miRs-20b, -21, -24, -15a, -126, -191, -197, -223, -320, -486, -28-3p) encontrandose expresados de manera diferencial en diabéticos, lo que podría constituir en el futuro un posible marcador biológico de DM [142]. Un aspecto también estudiado es el efecto que podrían tener sobre rasgos del SMet otras variaciones en la secuencia de ADN como son las microinserciones y microdelecciones agrupadas genericamente bajo el nombre CNV. Se han en- contrado delecciones en genes relacionados con la adiponectina (ADIPOQ)[143], CNVs relacionados con el metabolismo lipídico (LDLR, LPA) [144] y obesidad (LEP) [145]. En los últimos años existe una tendencia al cambio de modelo de abordaje del SMet desde un punto de vista genético (Figura 7). Figura 7. De la genética tradicional a la biología de sistemas. Los métodos tradicionales incluían la identificación de variantes genéticas y mutaciones subyacentes a una altera- ción de un solo gen con grandes efec- tos en rasgos metabólicos, describien- do genes estadísticamente relaciona- dos con rasgos clínicos de interés en una gran cohorte [85]. La biología de sistemas por el contrario identifica la contribución de pequeños efectos en las variaciones genéticas en muchos genes en la aparición de un rasgo determinado. Permite la generación de un modelo en red de interacciones funcionales entre genes. Además en los últimos años nos ha sobrevenido una avalancha de estudios genéticos poblacionales a gran escala que vienen a cubrir las carencias metodológicas que los clásicos es- tudios de ligamiento basados en estructuras familiares, especialmente la falta de potencia estadística, para identificar el grado de contribución en el fenotipo 40 2 Introducción de polimorfismos genéticos de baja frecuencia poblacional [146]. Así, diferentes estudios denominados GWAS (Genome-Wide Association Studies) relacionan variaciones genéticas comunes con la obesidad y otros rasgos relacionados con el SMet [147, 148, 149]. Un reciente estudio GWAS analizó si las variantes gené- ticas más comunes con efectos pleiotrópicos podían explicar los distintos rasgos del SMet. Compararon los rasgos metabólicos pareados utilizando un panel de 2,5 millones de SNPs en 22.161 pacientes con SMet, encontrando 29 variantes genéticas asociadas a SMet. Los efectos de los 16 SNPs más importantes en los rasgos de SMet, desde el punto de vista cuantitativo, fueron relativamente pequeños, explicando tan solo el 9% de las variaciones en TG, el 5,8% de las va- riaciones en el HDLc, el 3,6% de las variaciones en glucemia basal y el 1,4% de la presión arterial sistólica. Estos resultados resaltan el carácter de enfermedad genéticamente compleja que tiene el SMet y acentúan la necesidad de abordar su conocimiento desde estrategias holísticas e integradoras [150]. Para concluir, podríamos resumir que el SMet se ve condicionado por un sustrato genético hereditario, en el que factores medioambientales, modificacio- nes epigenéticas y de regulación de la expresión génica a nivel trascripcional y postranscripcional influyen en su desarrollo y su expresión clínica [151, 152, 153](Figura 8). 2.2.5. Disfunción endotelial como marcador precoz de la enfermedad cardiovascular en el SMet. Como ya hemos apuntado, uno de los principales motivos por los que es importante la existencia de SMet es que constituye una situación de alto ries- go de desarrollar enfermedad cardiovascular, siendo la disfunción endotelial el marcador más precoz de daño del vaso. La existencia de SMet como predictor de RCV ha sido un tema controvertido en los últimos tiempos. En el año 2005 la ADA (American Diabetes Association) subrayó la necesidad de establecer el RCV asociado al SMet. A partir de enton- ces, se han llevado a cabo más de 70 estudios observacionales para investigar 2 Introducción 41 F ig ur a 8. F i s i o p a t o l o g í a d e l S M e t . A d a p t a d o d e R e i l l y y c o l s . [ 1 5 4 ] . 42 2 Introducción dicha relación. Mottillo y cols. publicaron los resultados de un metaanálisis con 83 estudios prospectivos, observacionales, estratificados en función de la presen- cia o no de SMet con el fin de estimar el RCV asociado al SMet en 10 años, concluyendo que los pacientes con SMet tienen un riesgo dos veces mayor de padecer enfermedad cardiovascular y muerte por causa cardiovascular e ictus comparado con las personas que no lo padecen. Además presentan una morta- lidad global 1,5 veces superior y dos veces más riesgo de sufrir un infarto de miocardio [155]. 2 Introducción 432.3. Función endotelial 2.3.1. Estructura y funciones del endotelio arterial. El endotelio vascular constituye el mayor órgano del cuerpo humano en ex- tensión, al representar una superficie de 150 m 2 . Está formado por una mo- nocapa de células planas alineadas en la misma dirección del flujo sanguíneo (Figura 9). Junto al papel de barrera semipermeable al paso de sustancias des- de la sangre, constituye el regulador primordial del tono vascular, asegurando una vasodilatación adecuada que permita mantener la presión arterial en el ran- go de valores normales y, de este modo, posibilitar la perfusión de los tejidos. Además es el encargado de mantener la homeostasis vascular mediante la se- creción endocrina, autocrina y paracrina de sustancias vasoactivas moduladoras del crecimiento, adhesión celular, fibrinolisis o adhesión de plaquetas activadas, entre otras funciones [157](Figura 10). La disminución en la biodisponibilidad de alguna de las moléculas vasodilatadoras y antiaterogénicas, principalmente el óxido nítrico (NO), es lo que caracteriza la disfunción endotelial. El NO regula la fluidez de la sangre, al controlar la vasorreactividad y per- meabilidad de la pared en respuesta inmediata a los cambios hemodinámicos provocados por factores físicos, como son la presión tangencial sobre la pared de la arteria o por fuerzas de cizallamiento del flujo de la circulación sanguínea. Tanto en la enfermedad cardiovascular como en presencia de factores de riesgo asociados, las alteraciones hemostáticas y el estado proinflamatorio conducen a una alteración funcional de la células endoteliales denominada disfunción endo- telial. Este fenómeno aparece de forma temprana en el curso evolutivo de dichas enfermedades, de ahí que su detección precoz permitiría conocer el estado de salud del árbol vascular antes del desarrollo de una placa aterosclerótica angio- gráficamente significativa, estratificando el riesgo de estos pacientes para iniciar intervenciones de carácter preventivo. El endotelio, como veremos a continua- ción, también es un órgano diana del estado inflamatorio crónico que se observa en los pacientes con SMet. 44 2 Introducción F igura 9. E s t r u c t u r a y f u n c i ó n d e l e n d o t e l i o . T o m a d o d e A r r e b o l a y c o l s . [ 1 5 6 ] . 2 Introducción 45                                                     !" #$"%& $"%&      ' (    )  *                      '    (      *  %           %      +  %&,       +      ,   (     Figura 10. Sustancias liberadas por el endotelio. 2.3.2. Técnicas para medir la vasodilatación mediada por el endote- lio. Se conoce como ?vasodilatación dependiente del endotelio? aquella media- da por el NO generado por la oxido nítrico sintasa endotelial (EC:1.14.13.39) (eNOS). La disminución de su biodisponibilidad constituye el primer fenómeno de disfunción endotelial [158]. La liberación constitutiva de NO por el endote- lio tiene como principal función el mantenimiento del tono del músculo liso de la pareddel vaso, que puede provocarse experimentalmente mediante estímulos físicos o fenómenos químicos. Aunque uno de los fármacos con dicho efecto es la acetilcolina (Ach), dado que requiere administración parenteral intraarterial, su uso en investigación clínica hoy en día es escaso. Como estímulo físico se ha utilizado la variación en la tensión de cizallamiento provocada por el incremento transitorio del flujo sanguineo, generalmente tras un perido de isquemia local controlada y que da lugar a la hiperemia reactiva postisquemia (PORH). En es- te fenómeno, descrito por primera vez en 1933 por Schretzenmayr, se ha basado el desarrollo de técnicas no invasivas para medir la reactividad vascular depen- diente del endotelio tras la aplicación de un periodo de isquemia. Celermayer fue pionero en proponer la medición de la dilatación mediada por flujo para evaluar 46 2 Introducción de forma no invasiva la función endotelial [159]. Otro de los estimulos físicos que se han utilizado ha sido la generación de cambios controlados de temperatura en la superficie cutánea. Técnicas para medir la capacidad vasodilatadora coronaria. Aunque la medición de la función endotelial coronaria continua constituyendo el patrón de referencia, su complejidad y requerimientos técnicos hacen que su uso extensivo no sea posible. La primera evidencia de la existencia de disfunción endotelial en los vasos ateroscleróticos se obtuvo a mediados de los años 80, cuando se utilizó la infusión intracoronaria de Ach para inducir la vasodilatación de las arterias coronarias [160]. Sin embargo, al poco tiempo se desarrollaron técnicas menos invasivas para evaluar la disfunción endotelial arterias periféricas. Dichos métodos difieren según el vaso seleccionado para evaluar la función endotelial, la técnica mediante la cual se mide la vasodilatación y el estímulo que provoca dicha vasodilatación. A continuación pasaremos a describir algunas de las más utilizadas. Coronariografía. La función endotelial coronaria se puede medir median- te cateterismo cardíaco. Tras la introducción de un catéter arterial bien femoral o radial, se administra contraste intravenoso. Si se aplica adecuadamente puede proporcionar información muy valiosa del lecho vascular coronario. En la mayo- ría de los protocolos se incluye la infusión intraarterial de Ach y nitroglicerina para evaluar la función endotelial dependiente e independiente del endotelio respectivamente. Las arterias coronarias con endotelio intacto responden a la infusión de Ach con una dilatación de los vasos epicárdicos y de la microcircu- lación, resultando en un incremento del flujo sanguíneo coronario. No obstante si la superficie endotelial está dañada o incluso interrumpida, la Ach producirá una vasoconstricción paradójica secundaria a la estimulación de los receptores muscarínicos de las células musculares lisas vasculares, con el consiguiente des- censo en el flujo coronario [160]. De manera similar a otras técnicas, la respuesta a la administración intraarterial de Ach proporciona información pronóstica im- 2 Introducción 47 portante. Sin embargo, dada la naturaleza invasiva y el alto coste de la técnica, hace que no se pueda utilizar de manera extensiva en la práctica clínica ni en estudios de investigación. Ecocardiografía de estrés con dipiridamol. La microcirculación coro- naria se puede medir también de manera indirecta mediante ecocardiografía de estrés con administración de dipiridamol. La disfunción coronaria microvascular observada se puede clasificar en cuatro tipos. Tipo A: Disfunción microvascular coronaria en ausencia de enfermedad arterial coronaria y enfermedad miocár- dica; tipo B: disfunción microvascular coronaria en el contexto de miocardio- patía; tipo C: disfunción microvascular coronaria en presencia de enfermedad obstructiva de arterias epicardicas; tipo D: disfunción microvascular coronaria yatrogénica [161]. Recientemente se ha descrito que la reserva de flujo coronario evaluada con esta técnica (definida como el cociente entre la velocidad de flujo diastólico pico durante la hiperemia y dicho pico en situación normal) es una medida sensi- ble que permite detectar estenosis epicárdica y deterioro de la microcirculación coronaria. Es más, diversos estudios han mostrado que los pacientes con hiper- tensión arterial pueden tener la reserva de flujo coronario disminuida a pesar de tener coronarias angiográficamente normales [162]. Aun así, esta técnica tam- poco es la más adecuada para la valoración de la función endotelial en ensayos clínicos, dada la destreza en el manejo de la ecocardiografía cardiaca que se requiere. Técnicas para medir la capacidad vasodilatadora periférica. Dilatación mediada por flujo medida por ecografía de la arteria braquial. Este método mide el diámetro de la arteria braquial, en reposo y tras el incremento en la presión de cizallamiento arterial inducida por la isquemia que provoca el inflado de un manguito de presión, ocasionando una hiperemia reactiva y la vasodilatación de la arteria braquial, fundamentalmente debido a 48 2 Introducción la liberación de NO del endotelio [163]. La dilatación mediada por flujo (FMD) se expresa en porcentaje de cambio del diámetro de la arteria con respecto al diámetro arterial basal. Celermajer y cols. fueron los primeros en medir esta respuesta in vivo en la arteria braquial o radial [159]. Posteriormente Joannides y cols. demostraron que se trataba de un fenómeno dependiente del NO, abrien- do por tanto una puerta al estudio de la función endotelial [164]. Además ha sido validada, al comprobar que los valores de vasodilatación arterial obtenidos mediante este procedimiento guardan relación con la capacidad vasodilatadora de la circulación coronaria medida a través de la infusión intraraterial de Ach [165]. En los últimos años se ha comprobado que valores reducidos de FMD guar- dan relación con la presencia de factores de riesgo cardiovascular tradicionales, reflejando el grado de respuesta terapéutica y el riesgo de desarrollar eventos cardiovasculares futuros [166]. Por estos motivos, desde principio de los años 90, la ecografía doppler se considera la técnica no invasiva de referencia para la evaluar la vasoreactividad arterial periférica. Sin embargo, el alto grado de especialización del evaluador y el coste de los equipos han sido dos limitaciones que han dificultado su implementación en la práctica clínica. Pletismografía de oclusión venosa (VOP). En estos años se han he- cho esfuerzos para desarrollar técnicas más sencillas y rápidas para medir la capacidad vasodilatadora del endotelio [167]. La pletismografía mide cambios de volumen en respuesta a variaciones del flujo sanguíneo. La VOP es el método más antiguo de investigación del flujo sanguíneo en humanos [168]. El principio fundamental de la VOP es la medida del flujo sanguineo de un tejido, general- mente músculo, a través del cambio en el volumen tisular derivado del inflado y desinflado de un manguito de presión proximal al mismo tejido. El manguito se infla a una presión que ocluya el retorno venoso pero permita el flujo arte- rial. La tasa de cambio de volumen será, por tanto, proporcional a la tasa de flujo aterial. El método más usado para medir la VOP fue diseñado en 1975 por Hokanson, si bien posteriormente se han ido introduciendo modificaciones. 2 Introducción 49 Requiere de un medidor automático calibrado de mercurio en silastic que se coloca a modo de anillas a lo largo de la extremidad explorada. A medida que el diámetro de la extremidad en estudio se expande y contrae, se produce un cambio en la longitud de la columna de mercurio. Existe una modificación de esta técnica que permite el estudio de la función endotelial en el brazo. A pesar de que está limitada por su naturaleza semi inva- siva, la pletismografía venosa del brazo ofrece la ventaja de poder administrar de manera intraarterial moléculas, hormonas o fármacos como Ach o nitroglicerina, para cuantificar la vasodilatación dependiente e independiente del endotelio res- pectivamente [169]. El brazo contralateral generalmente se utiliza como control, para comprobar que la sustancia administrada no ejerce ningún efecto sistémico. También es posible administrar otras sustancias agonistas y antagonistas, e in- cluso nuevos fármacos en dosis muy pequeñas con escasa repercusión sistémica, en la arteria braquial [164]. El flujo sanguineo antebraquial (FBF) se calcula co- mo la tasa de incremento en la circunferencia del antebrazo y se expresa en mL. min 1 100mL 1 de volumen del antebrazo. La administración de Ach induce un incremento del FBF cuya magnitud proporciona un índice de la función vaso- motora endotelial de la resistencia de arteriolas musculares periféricas, mientras que la administración de L-NMMA ,un inhibidor de NO sintasa, disminuye el FBF poniendo en evidencia la liberación basal de NO en este nivel. Tonometría arterial periférica (PAT). La medida de la respuesta va- sodilatadora periférica mediante la tonometría arterial periférica (PAT) digital está adquiriendo importancia para evaluar la función vascular, debido a su sen- cillez. A pesar de que la señal de la PAT es modulada por factores medioam- bientales, locales y sistémicos, también se afecta por la biodisponibilidad del NO y, por tanto, depende del estado funcional del endotelio. Tras provocar una hiperemia en el vaso explorado, se incrementa la amplitud del pulso digital y, así, la amplitud de la señal de la PAT, respuesta que depende en parte de la sintesis del NO [170]. La pletismografía digital detecta cambios pulsátiles en el 50 2 Introducción volumen arterial. Un descenso en el volumen sanguineo arterial en el pulpejo del dedo causa un descenso en la columna pulsátil arterial, disminuyendo la señal de medida y viceversa. De forma similar a como se medía la FMD, un manguito de presión arterial se coloca en un brazo, mientras que el otro brazo sirve de control interno. Tras medir los cambios del volumen sanguineo basal, se infla el manguito a una presión por encima de la sistólica y se desinfla tras 5 minutos para inducir una hiperemia reactiva en el brazo. El índice calculado entre el brazo con la hiperemia reactiva y el brazo control representa una medida de la función endotelial. No obstante el aumento de la amplitud del pulso tras la hiperemia reactiva es una respuesta compleja a la isquemia. Puede reflejar cam- bios en el flujo, así como en la dilatación microvascular y solo depende en parte del NO [170]. Existen estudios que demuestran que el detrerioro de la función endotelial periférica evaluada en el dedo se correlaciona con la microcirculación coronaria en pacientes con aterosclerosis temprana [171]. En un estudio trans- versal de 1957 pacientes de la cohorte de Framingham se asoció la disfunción vascular digital con factores de RCV tradicionales [172]. Análisis de la onda de pulso (PWA). La morfología de la onda de pre- sión arterial contiene información importante, acerca de la rigidez de las grandes arterias y la cantidad de onda reflejada dentro del sistema arterial [173]. La re- flexión de la onda tiene lugar en sitios donde la impedancia cambia, como en las ramificaciones arteriales. Se cuantifica determinanado el índice de aumento (AIx), que representa la diferencia entre el primer y el segundo pico sistólico [174]. A pesar de que la impedancia de las arterias largas y elásticas es relativa- mente constante, la impedancia de las pequeñas arterias y arteriolas es mucho más dinámica y depende en gran parte del tono del músculo liso y del tamaño del vaso. Por tanto, cambios en el tono de pequeñas arterias afectan al refle- jo de la onda, de modo que la vasodilatación reduce el AIx, mientras que la vasoconstricción lo aumenta [174]. Como se ha venido reiterando, uno de los principales factores que regulan 2 Introducción 51 el tono vascular es el NO derivado del endotelio. Se sabe que el NO influye en le reflejo de la onda y por tanto en la morfología de la onda arterial. El gliceril trinitrato (GTN), un donante de NO exógeno, reduce el reflejo de la onda a dosis bajas, antes que cualquier otro efecto medible, en la resistencia o presión media, sugiriendo que las pequeñas arterias son mas sensibles al GTN que los vasos con mayor resistencia. De forma contraria, la inhibición de la producción endógena de NO con LG monometil-L-Arginina, aumenta el reflejo de la onda [175]. Es importante destacar que la rigidez de la aorta, expresada como velocidad de onda de pulso arterial aórtica, es un firme predictor de eventos cardiovascu- lares futuros y de mortalidad, especialmente en los pacientes con mayor riesgo basal, hechos demostrados recientemente en un metaanálisis con 15000 sujetos [176]. Hiperemia térmica local. La hiperemia térmica local mide el incremen- to sostenido del flujo sanguíneo cutáneo, cuando se provoca un aumento de la temperatura cutánea [177], llegando a valores máximos cuando se alcanzan 42-44 ºC [178]. La vasodilatación térmica máxima refleja la máxima capacidad vasodilatadora de los vasos [178], con un pico inicial de flujo sanguineo cutáneo durante los primeros 10 minutos seguido de un periodo de plateau tras 20-30 minutos del calentamiento. La fase inicial rápida, mediada por la inervación sen- sitiva local [179], está modulada por un reflejo axonal dependiente del CGRP (calcitonin gene related peptide o péptido relacionado con el gen de la calcito- nina) y la sustancia P [178]. En contraposición, la fase de plateau está mediada en gran parte por el NO [179]. Iontoforesis con acetilcolina. La iontoforesis se basa en la capacidad de un fármaco ionizado disuelto para migrar a través de la piel cuando se le aplica una corriente de baja intensidad [180]. La cantidad del fármaco depo- sitado dependerá de la magnitud y la duración de la corriente aplicada y de la permeabilidad de la barrera cutánea. Cuando se combina con la flujometría 52 2 Introducción doppler, este método permite la detección de alteraciones en el flujo cutáneo en respuesta a la administración controlada de un fármaco vasoactivo aplicado en la superficiede la piel [181]. La iontoforesis con Ach origina una respuesta va- sodilatadora caracterizada por un pico precoz seguido de un periodo de menor intensidad pero de mayor duración. Se utiliza también nitroprusiato sódico para generar una vasodilatación independiente del endotelio [182]. Flujometría Laser Doppler (LDF). Se basa en el fenómeno Doppler descrito por el matemático austriaco Johann Christian Doppler (1803?1853). Cuando se dirige un haz de luz láser sobre la superficie cutánea, una fracción penetra a través de ella e interacciona con las células en movimiento, princi- palmente eritrocitos, que circulan por las arteriolas terminales, asas capilares y vénulas postcapilares, en un volumen tisular aproximado de 1-1,5 mL. Debido al efecto Doppler, los fotones de la luz láser reflejados en esas células sufren un pequeño cambio en su frecuencia que será proporcional a la velocidad de movimiento de las mismas. La luz reflejada, mezcla de frecuencias cambiadas y no cambiadas, se transmite mediante una fibra óptica flexible a un fotodiodo del láser Doppler. Posteriormente es amplificada, analizada para determinar la cantidad de cambio en la frecuencia y transformada en una señal analógica. La utilización del láser Doppler permite una medición continua, no invasiva y en tiempo real del flujo sanguineo en la piel de una determinada región. El registro de la señal se realiza mediante el acoplamiento de un ordenador equipado con un sotfware de adquisición específico [183] y los valores obtenidos se expresan como unidades de perfusión arbitrarias. Se pueden grabar varias señales dife- rentes pero las que más se utilizan son la perfusión microvascular (flux), que representa el producto entre el número de células sanguineas en el volumen del tejido muestra y, la velocidad media de las mismas. El registro de dicho medida en un periodo de tiempo y en diferentes circunstancias permite identificar varios parámetros como son la PORH max, la PORH pico o el PORH% de cambio. La reproducibilidad de estos parámetros inter e intra sujetos es buena, ya que 2 Introducción 53 presenta un coeficiente de variación menor del 10% [184]. Como hemos apuntado previamente, la flujometría Doppler permite la eva- luación del flujo sanguíneo cutáneo microvascular a lo largo del tiempo y las alteraciones que ocasiona un determinado estímulo. La disfunción endotelial es un proceso sistémico qué puede ser medido en vasos de diferentes localizacio- nes [165]. Dado que el lecho vascular periférico representa un acceso fácil, ha sido elegido por múltiples autores para la evaluación de la función endotelial en personas con diferentes factores de RCV como DM tipo 2 [185], hipercolesterole- mia [186] obesidad [187] y otros parámetros, como la presión arterial sistólica, la presión de pulso o la glucemia plasmática [188]. De igual manera, se ha demos- trado que los resultados obtenidos al medir la función endotelial microvascular reflejan el estado de arterias de mayor calibre y por tanto los resultados son extrapolables [189] a lo que está ocurriendo en otras arterias como por ejemplo las coronarias [190]. La mayor ventaja que ofrece el láser Doppler es que presenta una alta sen- sibilidad para la detección y cuantificación de los cambios en el flujo cutáneo en respuesta a un determinado estímulo. El mecanismo exacto implicado en la respuesta postoclusiva no ha sido dilucidado por completo pero se conoce que el NO juega un papel fundamental en la vasodilatación postisquémica y ante el au- mento de tensión de la pared, de forma que la medición de la función endotelial también supone un reflejo de los procesos in vivo que influyen en la biodispo- nibilidad del NO. Además, se ha propuesto su uso para la monitorización de la eficacia terapéutica en la práctica clínica [191]. Sin embargo, presenta varias fuentes de variabilidad que creemos importante señalar. Por un lado, en los trabajos publicados se aprecian diferencias metodo- lógicas en relación a los tiempos de isquemia, que oscilan entre 1 y 5 minutos, obteniendo por tanto respuestas diferentes y difíciles de comparar [192]. Por otro lado, existen discrepancias en los puntos elegidos para las mediciones. Sin embargo, se ha visto, que cuando se estandariza el punto de registro, la repro- ducibilidad interensayo medida por laser es similar a otras técnicas no invasivas 54 2 Introducción como con hiperemia térmica e iontoforesis con Ach, presentando un mínimo coe- ficiente de variación comparada con la FMD de la arteria braquial [190, 193]. En resumen, la facilidad de uso al ser un método sencillo, no técnico depen- diente, no invasivo y con buena reproducibilidad de los registros obtenidos, han convertido al láser Doppler en la técnica más usada en los estudios clínicos de microcirculación. Otros métodos para medir la función endotelial: marcadores solubles. También se puede evaluar la función endotelial cuantificando marcadores bio- lógicos solubles en plasma. Estos marcadores pueden ser moléculas de adhesión como ICAM-1, VCAM-1 o E-selectina, productos que aumentan durante la dis- función endotelial, como PCR, factor de von Willebrand o trombomodulina, y derivados o precursores de la células endoteliales circulantes (progenitores y micropartículas) [194]. Las moléculas de adhesión son muy importantes en la respuesta inmune innata y adaptativa, jugando un papel fundamental en la mi- gración transendotelial de leucocitos en la zona de inflamación, que da lugar al inicio del daño macroscópicamente evaluable [195]. Se ha observado que durante el periodo postprandial se produce un deterioro de la función endotelial normal [36, 196, 197]. El aumento en las moléculas de adhesión endotelial, debido al incremento del estrés oxidativo, terminará provo- cando la disfunción del endotelio que lleva al desarrollo de arteriosclerosis. Estos fenómenos que se observan especialmente tras la ingesta de grasas saturadas, pueden limitarse parcialmente con la ingesta concomitante de diversas fuentes de antioxidantes naturales [198] (Figura 11). 2.3.3. Óxido nítrico y función endotelial. La acción vasodilatadora del NO está mediada intracelularmente por el au- mento de la concentración de cGMP y de reducción de calcio, que sigue a la estimulación de la guanilato ciclasa [199]. El NO es un radical libre del nitró- geno tremendamente inestable. Poseer un número impar de electrones, le con- 2 Introducción 55 Figura 11. Producción de NO en la célula endotelial en condiciones normales (izquierda) y en el estado de lipemia postprandial que conduce a la disfunción endotelial (derecha). Tomado de Wallace y cols. (2010) [198]. Figura 12. Formación y mecanismos de acción del NO. Tomado de Pathvardhan [200]. fiere una extraordinaria reactividad química tras ser producido por la eNOS. Se sintetiza en las propias células endoteliales en respuesta a estímulos fisiológicos como la hipoxia o la tensión de cizallamiento de la pared del vaso a partir de un átomo de nitrógeno del grupo guanidin-terminal de L-arginina en presencia de determinados cofactores [200](Figura 12). Al tratarse de un gas muy reactivo, su vida media es corta, con una duración de entre 5 y 40 segundos. Rápidamente se transforma, al ponerse en contacto con agua y oxígeno, en nitratos y nitritos, [NO(x)], que constituyen los productos finales estables de la liberación de óxido nítrico en el organismo (Figura 13). 56 2 Introducción ONOO- Síntesis prostaciclina Disminución de producción de PGI2 COX2 Aumento producción PGs Nitración de proteinas Pérdida de NO activo Efectos directos citotóxicos Oxidación de ADN, proteinas, enzimas y lípidos SOD Aumento producción ROS Inactivación de canales iónicos Figura 13. Efectos de los peroxinitri- tos. Dado que la proporción relativa de cada uno de ellos es difícil de deter- minar en una muestra, es la suma de la concentración de estos productos de degradación, más estables que el propio NO, la que se considera como marcador indirecto de la biodisponi- bilidad de NO. Éste además de trans- formarse en NO(x), puede reaccionar con el anión superóxido (O2·) en condiciones de elevado estrés oxidativo, origi- nando peroxinitritos (NOO·), que han demostrado tener un efecto tóxico sobre las células y se han relacionado con procesos inflamatorios y ateroscleróticos [201]. Por tanto la biodisponibiliad del NO dependerá tanto de su cinética de formación por la NOS como de la degradación del mismo por las EROs del microambiente vascular [202]. El NO tiene efectos beneficiosos para la salud al ser antimitótico, antiiflama- torio, antitrombótico y antioxidante. Inhibe además la agregación plaquetaria impidiendo la progresión del fenómeno aterosclerótico [203]. La hipercolesterolemia, la DM tipo 2, la hipertensión arterial o el tabaquismo se han asociado a una menor producción de NO o a un aumento de la degrada- ción de NO [204]. Cualquier estrategia encaminada a incrementar la biodispo- nibilidad del NO en estos pacientes podría ser beneficiosa para contrarrestar el alto RCV que presentan. 2.3.4. Influencia de la alimentación sobre la función endotelial. La relación entre dieta y función endotelial se ha evaluado en diversos es- tudios epidemiológicos. En un trabajo prospectivo del año 2004 llevado a cabo con 732 enfermeras que siguieron dos patrones dietéticos diferentes, uno de ellos caracterizado por una alta ingesta de vegetales, frutas, cereales enteros, pesca- 2 Introducción 57 do y pollo, y el otro, de tipo occidental, caracterizado por un elevado consumo de carne roja, cereales refinados y patatas fritas, observaron que las partici- pantes que siguieron la primera dieta mostraron concentraciones más bajas de E-selectina en comparación con aquellas que consumieron la dieta de tipo oc- cidental [205]. La dieta rica en vegetales se caracterizaba por un bajo consumo de grasas saturadas y ácidos grasos trans, acompañado de un alto consumo de frutas y vegetales, alimentos ricos en sustancias antioxidantes. Posteriormente se ha observado que el consumo de frutas y vegetales en pacientes hipertensos conlleva una mejoría de la función endotelial [206]. La mayoría de los trabajos realizados posteriormente se han centrado en analizar los efectos que podrían tener el contenido graso de la dieta sobre la función endotelial. La sobrecarga grasa ejerce un efecto deletéreo sobre la presión arterial y la función endote- lial [207] y que la reducción intensiva de los niveles de lípidos plasmáticos se relaciona con una mejoría de dichos parámetros [208]. Algunos de dichos estu- dios relacionan la ingesta de ciertos tipos de grasas con la disfunción endotelial (Figura 14). En estos últimos años se ha prestado especial atención al efecto que determi- nados patrones de alimentación podrían ejercer sobre la función endotelial. Las pruebas científicas existentes hasta ahora señalan ciertos alimentos y nutrientes que ejercen un importante papel modulador, tanto en la inflamación, como en el estrés oxidativo que ocasionan disfunción endotelial [209]. De este modo, se ha visto que el consumo de alimentos que contienen acidos grasos w-3,[210, 211] ácido fólico [212, 213], vitamina C y E [214, 215], compuestos fenólicos [58, 37] y L-arginina [216, 217] podrían ejercer efectos beneficiosos sobre la reactividad vascular, bien por disminución de la activación endotelial, bien mejorando la dilatación mediada por el flujo, tanto en individuos sanos como en personas con alto RCV [218]. La DMed, de la que se ha hablado extensamente en el apartado anterior, también ha demostrado ejercer efectos beneficiosos sobre la función endotelial [219]. Por otro lado, las dietas ricas en grasas y azúcares producen un deterioro de la misma [205]. En personas sanas, la ingesta de grasas saturadas 58 2 Introducción                                                                          ! " # # $              %      ! " #                  #            #          &                  &                    ! " # '        $      ! 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El aceite de oliva ha demostrado poseer efectos beneficiosos sobre la función endotelial, tanto en la dilatación mediada por endotelio [58] como en las moleculas de adhesión endotelial [48]. Probablemente parte de este efecto beneficioso se deba a la acción que ejercen sobre el endotelio los compuestos fe- nólicos contenidos en el aceite de oliva virgen, ya que la mejoría de la respuesta vasodilatadora postisquémica es tanto mejor cuanto mayor es la concentración de estas sustancias en el aceite [37]. 2.3.5. Influencia de la variabilidad genética sobre la función endote- lial: análisis de polimorfismos genéticos de NOS. La NOS tiene un papel crucial en mantener una adecuada biodisponibilidad de NO, lo que facilita la homeostasis del tono vascular cuando se producen cambios en las necesidades de flujo sanguíneo local. Esta enzima forma parte de un grupo complejo de proteínas que catalizan la conversión de L-arginina en NO y L-citrulina (Figura 15). Existen al menos tres isoformas de la NOS con funciones y localizaciones diferentes. Con un 50?60% de homología en la secuencia de aminoácidos (figura 60 2 Introducción                                                     !               "  !       #     $  % &  ' ( " ) ' (         $!( &*       #        + !   ,         $-     "   Figura 16. Isoformas de la NOS. 16) comparten en su estructura dominio N-terminal, un dominio oxigenasa con dominios heme, L-arginina y tetrahidrobiopterina (BH4), una región central de unión a calmodulina y un dominio reductasa terminal con sitios de unión para nicotinamida adenin dinucleótido fosfato reducido (NADPH), flavin adenina dinucleótido (FAD) y flavina mononucleótido (FMN). Para su acción enzimática requieren la presencia de varios cofactores como NADPH, FAD, FMN y BH4. Tanto eNOS como nNOS son isoformas cons- titutivas calcio-dependientes que generan pequeñas cantidades de NO para el mantenimiento de las funciones biológicas. iNOS, por el contrario, es una isofor- ma calcio independiente implicada en la producción de grandes cantidades de NO durante periodos prolongados. eNOS se localiza en las caveolas, estructuras funcionales, dinámicas y es- pecializadas que se aprecian como invaginaciones de la membrana plasmática, aunque también como vesículas, racimos citoplasmáticos o estructuras trans- celulares. Por lo general tienen forma de letra omega invertida, presentando un diámetro de 50-100nm. Se caracterizan por la presencia de caveolina, una 2 Introducción 61 proteína palmitoilada integrada a la membrana mediante uniones a colesterol y glicoesfingolípidos, cuya oligomerización da lugar a la formación de caveolas [223]. Están presentes en diferentes tipos celulares, sobre todo en células endote- liales. Sirven como plataforma de señalización celular y regulación de la cinética de transporte de vesículas a través de la membrana plasmática. Juegan un pa- pel fundamental en la regulación de la función endotelial, ya que múltiples rutas de señalización relevantes, relacionadas con la patogenia de diferentes factores de RCV, convergen en las caveolas, regulando así la actividad de la eNOS. Se sabe que la interacción directa entre eNOS y Cav-1 (la caveolina mayoritaria en las caveolas endoteliales), más concretamente con su dominio SD, inhibe la actividad de la enzima [224, 225]. En modelos de ratón deficientes en APO-E y knock-out para el gen que codifica la proteína Cav-1 (CAV1) se ha comproba- do que la pérdida de Cav-1 disminuye ciertas moléculas proaterogénicas como CD36 y VCAM-1 [226]. Por tanto, las alteraciones en las caveolas endoteliales podrían contribuir al deterioro de la función endotelial [227]. Por otro lado, también se ha comprobado que animales de experimentación deficientes en eNOS desarrollan hipertensión arterial y disfunción endotelial [228] reversibles al transferir dicho gen al animal, quedando de manifiesto el importante papel de la eNOS en el mantenimiento de la homeostasis endotelial [229]. La activación de eNOS como respuesta a la presión de cizallamiento puede estar mediada por dos mecanismos diferentes. Un mecanismo se activa vía calcio dependiente, como respuesta rápida a estímulos sobre el endotelio y otra, a largo plazo, mediada por la fosforilación de un residuo de tirosina, menos influída por las fluctuaciones de concentración de calcio intracelular [230, 231]. El otro mecanismo de activación de la eNOS depende de la fosforilación de un residuo de serina. Cuando la célula endotelial se expone al estrés de cizallamiento, se produce la fosforilación del residuo S1177 de eNOS mediado por AKT1 [232] y otras kinasas como protein kinasa A (PKA) y AMPK [233]. El gen que codifica la eNOS se encuentra en el brazo largo del cromosoma 7 (35-36). Son varios los polimorfismos que se han identificado asociados a esta 62 2 Introducción región. De ellos, el más estudiado es el Glu298Asp (G894T, rs1799983) caracte- rizado por un cambio en la posición 894 de una guanina por una timina en el exon 7, que se traduce en un cambio del aminoacido glutámico a aspartato en el codón 298. Éste es el único polimorfismo del gen que conlleva un cambio en la secuencia aminoacídica, que si bien no supone alteración de su conformación, sí parece influir en su función al facilitar que ciertas proteasas ocasionen un cleavage intracelular de la proteína [234]. La sustitución crea una unión débil Asp-Pro que la hace especialmente susceptible en este punto a la fragmentación proteica mediante hidólisis ácida. Estos resultados no se han podido replicar en posteriores estudios y algunos autores consideran que dicho fenómeno se trata de un artefacto de laboratorio y no de una realidad biológica [235]. La presencia de este polimorfismo se ha relacionado con el desarrollo de enfermedad coronaria, infarto de miocardio, resistencia insulínica, lípidos plas- máticos [236, 237] y DM tipo 2 [238]. Un metaanálisis reciente también lo ha asociado con el desarrollo de hipertensión arterial esencial [239] (Figura 17). 2 Introducción 63                                                                    !    "         #     $         "                                          %  &      ' ( )             !    "         #                * & +          $            "                         )      ,  *       #       !                -                 #                % .     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F ig ur a 17 .E s t u d i o s q u e h a n r e l a c i o n a d o l a p r e s e n c i a d e l p o l i m o r fi s m o N O S 3 G l u 2 9 8 A s p ( r s 1 7 9 9 9 8 3 ) c o n l a e n f e r m e d a d c a r d i o v a s c u l a r . 2 Introducción 652.4. Análisis de alto rendimiento y métodos computacio-nales en Nutrigenómica Clásicamente, en biología molecular se ha utilizado la estrategia de reduccir la complejidad de los sistemas biológicos analizando de forma aislada alguna de sus partes y viendo qué factores modifican su estado cuando un número limitado de variables son alteradas de forma controlada en el laboratorio. Este método ha sido válido para dar respuesta a enfermedades monogénicas, por lo general poco frecuentes, ocasionadas por la ausencia o disfunción de una proteína derivada de una mutación en el gen que la codifica. Sin embargo, esta aproximación, que tantos descubrimientos ha permitido en el área de la genética clásica, no ha sido suficientemente útil para abordar el estudio de enfermedades como el cáncer, la DM o el Alzheimer, cuyo desarrollo está condicionado por la alteración de múltiples genes que codifican proteínas que interaccionan en redes y cuya regulación resulta más compleja. Esta nueva visión ha venido favorecida por el mejor conocimiento que se tiene de los mecanismos de regulación de la expresión génica y el enorme desarrollo que han tenido las plataformas tecnológicas de alto rendimiento desde finales de los años 90, conocidas como microarrays, y que permiten el análisis simultáneo de cientos de miles de reacciones con una sóla muestra biológica. Estas plataformas, utilizadas en el campo de investigación de la genética hacen posible, por ejemplo, el análisis masivo de polimorfismos (SNPs y CNVs), la cuantificación de la expresión génica, el estudio de la expresión diferencial de isoformas de ARNm en diferentes tejidos o el análisis del grado de metilación de las zonas reguladoras génicas. 2.4.1. Microarrays de expresión génica. En 1995 Schena publica en la revista Science el primer estudio en el que se utiliza una plataforma de microarray para monitorizar la expresión de varios genes en paralelo de Arabidopsis Thaliana [240]. Posteriormente fueron apare- ciendo más publicaciones que utilizaban microarrays para medir de forma global 66 2 Introducción aquellos cambios de expresión génica bajo diversas condiciones celulares, iden- tificando genes expresados anormalmente en muestras de cáncer en humanos [241]. Desde entonces, el uso de microarrays se ha ido extendiendo progresiva- mente, de forma que en la actualidad son múltiples las aplicaciones que se dan a este tipo de plataformas. De este modo, se pueden utilizar para predecir el pronóstico de determinadas enfermedades [242], clasificar muestras en grupos basándose en sus patrones de expresión [243], detectar variaciones de secuencias entre individuos de la misma especie [244] o estudiar cómo los genes se expresan en diferentes condiciones [245]. La enorme cantidad de información y la rapidez en obtenerla facilitarían el proceso de traslación de resultados a la práctica clínica, permitiendo desarro- llar, en menor plazo de tiempo, tanto estrategias preventivas y de diagnóstico precoz en subgrupos de población de alto riesgo, como el diseño de esquemas terapéuticos de forma individualizada [246]. De hecho, su uso en el campo de la Farmacogenómica ha facilitado el descubrimiento de nuevos fármacos y dia- nas terapéuticas, así como la identificación, de forma precoz, de posibles efectos secundarios derivados de los mismos. A continuación describiremos los aspectos metodológicos más relevantes re- lacionados con el uso de microarrays de expresión génica. Diseño y metodología. Un microarray de expresión génica se puede definir como una superficie inerte de varios milímetros de área sobre la que se han fijado de forma matricial miles de sondas que están identificadas con aquellos genes cuya expresión se quiere cuantificar mediante la hibridación con el ARN de la muestra biológica en cuestión. El grado de hibridación por complementariedad entre la sonda y el ARN se pone de manifiesto mediante una señal de fluores- cencia que se mide por análisis de imagen, indicando el nivel de expresión del gen correspondiente a la sonda en la muestra problema. Tipos de microarrays de expresión génica: Existen fundamentalmen- te dos tipos de microarrays de expresión génica: los microarrays de dos colores 2 Introducción 67 (spotted microarrays) y los arrays de oligonucleótidos. Los primeros se fabrican mediante una técnica llamada fotolitografía en la que una secuencia nucleotídica de cadena sencilla se sintetiza directamente in situ sobre placas de vidrio. Las secuencias de oligonucleótidos generalmente tienen 25-60 pares de bases. Los más frecuentes de este tipo son los arrays de A#metryx GeneChips®, en los que cada gen está representado por un conjunto de secuencias cortas que lo ca- racterizan. El segundo tipo son los microarrays de cADN, que usan secuencias de ácidos nucleicos largas, de cientos a miles de pares de bases, a modo de sonda. Los ácidos nucleicos se producen mediante la clonación de sus secuencias a partir de bases de datos y se amplifican mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos arrays son los más utilizados para comparar la diferencia en la expresión de genes de dos muestras diferentes de ARN. Procesamiento de la muestra biológica: Un paso crucial es el aisla- miento de ARN de las células o tejidos que queremos estudiar. Dado que los patrones de expresión pueden cambiar, en función de la temperatura o de de- terminados reactivos de conservación, es fundamental que el material sea rápi- damente congelado y que las siguientes etapas de la extracción de ARN sean llevadas a cabo de forma cuidadosa y rápida [247]. En la mayoría de los pro- tocolos se requieren entre 25 y 100 mg de ARN total, que no es tan fácil de conseguir si hacemos experimentos con células o tejidos humanos, por lo que se han desarrollado métodos para aumentar la sensibilidad y reducir la cantidad de ARN necesarios. Una de estas estrategias es la amplificación por transcripción in vitro, con la que de 1 mg de ARN se obtienen 50 mg de cARN marcado. Si ésta estrategia se combina con la síntesis de cADN, se aumenta la amplifica- ción aún más. Tras obtener las muestras de cADN, se marcan con un colorante fluorescente generalmente con tintas Cy-3/Cy-5 para cada miembro del par de muestras que se va a hibridar en cada array. El uso de diferentes tintas permite que la hibridación del ARN de dos poblaciones celulares diferentes emita luz con diferentes longitud de onda, haciendo posible que dos muestras se puedan 68 2 Introducción mezclar e hibridar a la vez (Figura 18). Una vez marcadas, se dejan hibridar, en un proceso que dura varias horas, en unas condiciones específicas de temperatura y movimiento. La hibridación es la reacción de afinidad en la que se unen las muestras de cADN marcadas con sus complemetarias inmovilizadas en la superficie del array. A continuación se lleva a cabo el lavado de los arrays para eliminar las interacciones inespecíficas de la muestra con el material inmovilizado y la superficie del mismo. Finalmente, se realiza la lectura mediante un escáner que capta la señal emitida por cada muestra, permitiendo identificar la razón de intensidades en cada punto entre ambos canales de fluorescencia. Con un software de adquisición, la imagen se captura en un formato de 16 bits y los datos de intensidad bruta, ruido de fondo y relación de señales son transformados a un formato numérico que sea posible tratar estadísticamente. Análisis de los resultados. Los experimentos con microarrays producen datos de expresión génica de miles de genes. Se obtienen largas listas de medi- das de intensidad de puntos y cocientes de intesidad al comparar las muestras problema. El desafío consiste por tanto, en tamizar esa ingente cantidad de información para encontrar resultados significativos. Se necesitan herramientas de computación y técnicas estadísticas robustas para analizar e interpretar los datos, diferenciando la señal real del ruido de fondo encontrado en ellos. Los tipos de análisis que se pueden realizar y la calidad de los resultados vendrán determinados por el diseño experimental del estudio, por lo que es necesario que el planteamiento del mismo sea meditado antes de comenzar a recoger las muestras biológicas de los pacientes. El uso de estas plataformas supone un elevado coste, por lo que el diseño debe tener en cuenta la manera de minimizarlo, controlando los posibles sesgos biológicos y técnicos y definiendo con claridad el objetivo principal del estudio. Se sabe que diferentes cADNs incorporan el marcador fluorescente con una eficiencia distinta durante la preparación de las muestras y que además se hibri- 2 Introducción 69 F ig ur a 18 .P r o c e s a m i e n t o d e l a s m u e s t r a s p a r a l a u t i l i z a c i ó n d e microarrays. 70 2 Introducción dan con sus sondas complementarias de la placa con diferentes tasas. Además, en los arrays de cADN no se sabe exactamente qué cantidad de ADN hay in- movilizado en cada punto. Por ello, muchos autores recomiendan el marcado recíproco con intercambio de tintas (dye swap) para minimizar estos posibles errores técnicos. La realización de réplicas es otro método para intentar disminuir estos errores que ha reducido de forma importante los falsos positivos, pero que puede resultar limitado por el elevado coste que supone aumentar el número de placas y por la disponibilidad de muestras. Las réplicas pueden ser bien biológicas, es decir, el número de muestras obtenidas para el experimento, o bien técnicas, que son ca- da una de las copias que se hacen de las muestras biológicas. Lo ideal es trabajar maximizando el número de réplicas biológicas, pero como se comentó previamen- te, a veces no se dispone de material suficiente y hay que recurrir a las réplicas técnicas, o mejor, a la combinación de ambas. La variabilidad, como vemos, será de naturaleza biológica, intrínseca a todos los organismos e influida por factores tanto genéticos como ambientales, y técnica, que debemos evitar en la medida de lo posible. !"#$%&%'%()*"+*"!,-&* )-./!0%1!'%()*2*3.+3.-'+&!/%+),-* !)40%&%&* 0%&,!*"+*5+)+&*&%5)%6%'!,%7-&* !)-,!'%()*6$)'%-)!0* '89:;<=>?@* +AB=<:>C?*D>E<=G8* H8IJ9<:*D<*@FF>C?* %?@<=KG*= 88cm (mujeres) ó >102 cm (hombres). ? Glucemia plasmática en ayunas > 100 mg.dL1 ? Concentraciones plasmáticas en ayunas de colesterol HDL < 40 mg.dL1 (hombres) ó < 50 mg.dL 1 (mujeres). ? Concentraciones plasmáticas de TG > 150 mg.dL1mg/dL. ? Cifras de presión arterial sistólica y/o diástólica mayores a 130 y 85 mmHg respectivamente. 5 Diseño y metodología 95 Criterios de exclusión: Embarazo o periodo de lactancia. Consumo habitual de tabaco, complejos vitamínicos o más de 30 gramos de alcohol al día. Antecedentes o diagnóstico actual de DM tipo 2. Antecedente en los últimos 12 meses de cáncer. Diagnóstico de enfermedad crónica de tipo inflamatoria (hepática, renal o tiroidea) y/o toma continuada de fármacos inmunosupresores, antiagre- gantes, antihipertensivos o antinflamatorios. Antecedente personal de enfermedad cardiovascular (infarto de miocardio, ángor, arteriopatía periférica) o cerebrovascular (infarto cerebral, acciden- te isquémico transitorio). Antecedente de enfermedad psiquiátrica grave (depresión mayor o esqui- zofrenia). Haber participado en los últimos 6 meses en algún programa de reducción de peso.5.2. Intervención alimentaria. Tipos de aceites. A partir de un aceite de oliva virgen extra (CANOLIVA ® Antonio Cano e Hijos ? , Córdoba, España) se obtuvieron tres tipos de aceite con diferente con- centración en compuestos fenólicos pero similares en el resto de componentes químicos, HPOO, MPOO, LPOO. Para obtener un aceite con baja concentración de compuestos fenólicos se procedió a la extracción física de dichos compuestos a partir del aceite de oliva virgen extra mediante lavado con agua bidestilada en diferentes embudos. La mezcla del agua con el aceite se agitó durante 3 minutos y se dejó reposar para facilitar el proceso de separación. Se deshechó la fase acuosa 96 5 Diseño y metodología y se repitió el proceso 7 veces a temperatura ambiente y con protección para la luz a fin de evitar la oxidación de éstos compuestos. Se obtuvo así un aceite con bajo contenido en compuestos fenólicos (70 ppm) ya que mediante este método de extracción es la mínima cantidad residual que puede permanecer en el aceite. El aceite con contenido medio de compuestos fenólicos se obtuvo al mezclar a partes iguales los dos aceites previos (HPOO y LPOO). Se determinaron las concentraciones de micronutrientes más importantes, tales como tocoferoles y ácidos grasos. Para cuantificar la concentración de tocoferol en los aceites de oliva se llevó a cabo la separación de sus distintos isómeros mediante croma- tografia liquida de alta resolución (HPLC) con el cromátografo Perkin-Elmer (Perkin Elmer, SGE Scientific, Australia) y su detección por fluorescencia con el detector de diodos de batería Beckman modelo 186 (Beckman ? , Palo Alto, CA, USA) utilizando el método IUPAC 2432 (IUPAC, 1992). La composición en ácidos grasos se determinó mediante cromatrografía de gas en un sistema au- tomático Perkin-Elmer (SGE Scientific, Australia) de acuerdo con la regulación europea 2568/91 (CE, 1991), utilizando el ácido cafeico como control interno. La concentración de polifenoles presente en cada aceite se cuantificó mediante HPLC (Varian ® ProStar, Palo Alto, CA, USA). Diseño del estudio. Estudio que compara tres intervenciones alimentarias en humanos, utilizando un diseño aleatorizado, secuencial y cruzado. Las intervenciones consistieron en la administración de tres desayunos preparados con tres tipos de aceite de oliva cuya composición química sólo difería en el contenido de compuestos fenólicos (un aceite con alto, otro con medio y otro con bajo contenido). Los desayunos se administraron en tres días diferentes, separados por una semana de lavado. Los participantes fueron asignados de forma aleatoria a recibir un desayuno cada día de la intervención que consistió en 40 mL de cada uno de los tres tipos de aceite de oliva virgen junto a 60 gramos de pan de harina blanca de forma secuencial y cruzada siguiendo el esquema que se detalla en la Figura 23. 5 Diseño y metodología 97 !" #$% &% '( %) %* "+ $,- .$/ +' !" #$% &% '$+ 0" #1 "+ .$/ +' 2'3 ") -+ -3 ' 45 -6 ' 45 -7 ' 45 -8 ' 9- 1- &% ' 9- 1- &% ' 6'3 ") -+ -' 6'3 ") -+ -' :! ;; ' < !; ;' 9! ;; ' =# >? %' @' =# >? %' A' =# >? %' B' F ig ur a 23 .D i s e ñ o d e l a i n t e r v e n c i ó n . 98 5 Diseño y metodología Durante la realización del estudio se indicó a los participantes que siguieran una dieta de homogeneización rica en hidratos de carbono (CHO) basada en 20 menús, y la indicación de no tomar complementos vitamínicos ni potenciales fuentes de compuestos fenólicos (soja, chocolate, aceite de oliva virgen extra, té, café, vino, etc). De esta manera se pretendía controlar la variabilidad atribuible a las diferencias existentes entre los participantes debidas a los patrones de alimentación que tuvieran antes de entrar en el estudio. Este tipo de dieta CHO fue consumida desde 4 semanas antes del primer desayuno hasta finalizar el estudio. 24 horas antes de acudir al hospital para recibir cada desayuno, se les indicó que evitasen realizar ejercicio físico intenso. En la mañana de la intervención sólo se les permitió la ingesta de agua ad libitum. Con el fin de conocer el grado de adherencia a las dietas CHO y al resto de recomendaciones alimentarias, se realizaron encuestas alimentarias semicuan- titativas al inicio del estudio y los días de intervención, así como recordatorios de 24 horas de forma telefónica a las 2 y 4 semanas. Se realizaron extracciones de sangre venosa a los 0, 30, 60, 120 y 240 minutos de la ingesta de cada desayuno. Se midió la función endotelial microvascular mediante láser Doppler antes y 120 y 240 minutos tras cada desayuno (Figura 22). Obtención de muestras biológicas. Se obtuvieron en cada tiempo 20 mL de sangre venosa, empleando agujas Venoject® (Terumo?), tubos conteniendo 1 mg.dL1 de EDTA y tubos con citrato sódico al 3,8% (Vacutainer ? ). A continuación se depositaron en un re- cipiente con hielo y protegidos de la luz intentando evitar así su exposición a la luz, aire y temperatura ambiente. El plasma se obtuvo mediante centrifugación a baja velocidad a 1500 G durante 15 min a 4ºC de temperatura dentro de la primera hora tras la extracción sanguínea. Las muestras de sangre se almacena- ron posteriormente alicuotadas en un congelador a -80ºC hasta su análisis. Se procedió de la misma manera en cada uno de los tiempos de extracción. 5 Diseño y metodología 99 !"# $% &' &# " (! ") *+ &# " ,* -- .$+ " #& '/ +$ " 0"% 1' " 2( 0"% 1' " 30 "% 1' " 40 "% 1' " (! 0"% 1' " 5* "67 +% &8 *# ") 1- *. 1- $% 1&' 9$ #" 5* "#: -. $% $' 9* #"' :9 +18 1* '& .$# " '1 ";1 9& % 1' &# " 5* "#* <&" 5* "6+ :9 &# "' 1"= :% *# " 5* "% *# 9* #"' 1"; 1' *# " 5* "#* <&" 5* "&8 $19 $", $"* .1; &" 5* "8& 6> ?"9 >"* "8) *8 *. &9 $" 5* "$< $+ 818 1* "@ #18 *" 1' 9$ '# *" !" #$ %& '( ) AB C D# " F ig ur a 24 .E s q u e m a d e t r a b a j o d e l d í a d e l a i n t e r v e n c i ó n . 100 5 Diseño y metodología5.3. Concentración postprandial de marcadores inflama-torios, del metabolismo glucídico y lipídico. Parámetros inflamatorios. Se determinó la concentración de PCR de alta sensibilidad en plasma, por muestra y por duplicado, mediante turbidimetría con un analizador DDPP- 800 Hitachi® (Roche?, Basilea, Suiza) así como la IL6, cuyas concentracio- nes plasmáticas se determinaron en ayunas y 240 minutos tras el desayuno, por muestra y por duplicado, mediante ELISA utilizando el Kit cometrcial Quantiki- ne Human IL-6 Immunoassay (R&D Systems GMBH, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania). Marcadores del metabolismo lipídico. Lipemia postprandial: Al finalizar el estudio se analizaron las concentracio- nes de CT, HDL-c, TG y apolipoproteína A-I (APO A-I) y B (APO B) en un autoanalizador modular DDPPII Hitachi® (Roche?, Basilea, Suiza), utilizan- do reactivos de la casa comercial Boehringer-Mannhein (Mannheim, Alemania), por muestra y por duplicado. Las determinaciones de CT y TG se realizaron mediante test enzimáticos colorimétricos, con los métodos CHOP-PAP [279] y GPO-PAP [280], utilizando un calibrador universal (Roche ? , Basilea, Suiza) y controles ciegos (Vitro ? ). Para la determinación de HDL-c se utilizó un método enzimático colorimétrico tras precipitación con polietilenglicol 6000 (Peg-6000 ) [281]. La cuantificación de APO A-I y APO B se realizó por inmunoturbidi- metría automatizada en el equipo Array-Beckman ® (Barcelona, España), con controles y calibradores de la misma casa comercial [282]. El valor del colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LDL-c) fue calculado mediante la fórmula de Friedewald usando los valores de CT, HDL-c y TG [283]. Ácidos grasos libres no esterificados (NEFAs): Se realizó la determina- ción de la concentración plasmática de ácidos grasos no esterificados en ayunas 5 Diseño y metodología 101 y tras 30, 60, 120 y 240 minutos de la ingesta de los diferentes tipos de aceite, por muestra y por duplicado, mediante ensayo colorimétrico enzimático (Roche Diagnostics ? , Penzberg, Alemania). Parámetros del metabolismo glucídico. Glucosa: Se analizaron las concentraciones plasmáticas de glucosa en ayunas y tras 30, 60, 120 y 240 minutos de la ingesta de los diferentes tipos de aceite de oliva, por muestra y por duplicado mediante el analizador Hitachi 917 por el método de la glucosa oxidasa (GOD-PAP; Boerhinger ? , Mannheim, Alemania). Insulina: Se determinaron las concentraciones plasmáticas de insulina en ayu- nas y tras 30, 60, 120 y 240 minutos de la ingesta de los diferentes tipos de aceite de oliva, también por muestra y por duplicado, mediante inmunoensayo de mi- cropartículas (Abbott Diagnostics ? , Matsudo-shi, Japón).5.4. Análisis del genotipo NOS3 Glu298Asp (rs1799983)sobre la vasodilatación mediada por el endotelio. Parámetros de función endotelial. Para el estudio de la función endotelial se utilizó el Láser Doppler lineal Pe- riflux 5000 ® (Perimed S.A. ? , Stokholm Sweden). El protocolo para la medición del flujo sanguineo capilar comenzó por colocar al sujeto en posición de decúbito supino, relajado en una habitación a temperatura estable de entre 20-25ºC. Se situó la sonda del láser en la cara palmar de la segunda falange del segundo dedo de la mano derecha y un manguito compresor (HG Erkameter 300 ? , Erka, Bad Tolz, Germany) colocado 5 centímetros por encima del codo derecho. Se esperó 1 minuto para relajar al participante y a continuación se realizó una lectura basal del flujo sanguíneo durante 1 minuto (t0). Seguidamente se insufló el es- figmomanómetro hasta alcanzar una presión de 200-220 mm Hg, comprobando que se mantenía estable en el cero, la linea de registro. Se mantuvo en este modo 102 5 Diseño y metodología durante 4 minutos tras los cuales se deshinchó el manguito y se registró el flujo postisquemia durante 1 minuto más (td). De cada registro se analizaron varios parámetros: porcentaje de cambio del área bajo la curva (iABC), hiperemia reactiva post isquemia (PORH) pico, PORH basal y PORH máxima (Figura 23). Se obtuvieron tres registros por paciente y día; uno en situación basal antes de la intervención, a los 120 minutos del desayuno y finalmente a las 4 horas. Los registros obtenidos fueron transmi- tidos y almacenados en el programa informático PeriSoft® para Windows. Los parámetros que se calcularon fueron: el incremento del area bajo la curva (iABC) del flujo tras la isquemia mediante la siguiente fórmula: iABC = [(ABCtd ABCt0) ? 100/ABCt0] y la PORH pico según la siguiente fórmula: PORHPico = PORHBasal + PORHMa?ximo Además se consideraron para el análisis la PORH maxima y PORH pico. Concentración plasmática de eNOS. La concentración plasmática de eNOS se determinó mediante ensayo colori- métrico conforme a las instrucciones del fabricante con el Nitric Oxide Synthase Assay Kit, Colorimetric (Calbiochem®, La Jolla, California, EE.UU). Concentración plasmática de NO(x). La concentración de NO(x) en plasma es un indicador indirecto de la bio- disponibilidad de óxido nítrico. Para su determinacion fue necesario purificar las muestras con filtros Microcon YM-10® (Micon Bioseparations, Millipore?, Billerica, MA, USA). Tras equilibrar cada filtro con agua ultrapura, se cargaron con 200 µL de plasma EDTA de cada muestra y se centrifugaron a 12.000 rpm 5 Diseño y metodología 103 Figura 25. Esquema del registro láser Doppler de flujometría. 104 5 Diseño y metodología durante 20 min con la centrífuga Microfugue 11® (Beckman?, Palo Alto, CA, USA). Posteriormente se ensayaron, por muestra y por duplicado, 80 µL de es- te filtrado con el kit comercial Nitrate/nitrite Colorimetric Assay LDH method Kit®(Cayman Chemicals?, Ann Arbor, USA). Genotipado del polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983). Aislamiento del ADN: El ADN se extrajo a partir de 10 mL de sangre re- cogida en tubos de EDTA (1mg.dL -1 ) como anticoagulante. Posteriormente se centrifugaron (2500 rpm, 20ºC, 15 min) en una centrífuga Beckmam modelo J-6 (Beckmam ? Coulter España S.A, España) para separar la capa de leucocitos. Todo el proceso se realizó en condiciones de esterilidad para evitar la conta- minación. La extracción de ADN genómico se hizo a través del kit QiAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen?, Hilden, Alemania). Se obtuvo un rendimiento de 3-6µg de DNA/200µL de sangre total con una pureza aproximada de 1,8 en la relación de absorbancia 260nm/280nm. La cuantificación se realizó mediante espectrofotometria UV/V con NanoDrop 1000 (Termo TM Scientific?, Boston, EEUU). Además se realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% para verificar la calidad del DNA. Genotipado del polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) mediante PCR-RFLP: De cada paciente se obtuvo el genotipo del polimorfismo NOS3 Glu298Asp mediante RFLP utilizando para la PCR 300ng de ADN genómico, 0,5 µL de Taq polimerasa BIOTAQ? 5 U. µL-1 (Bioline, London, Reino Uni- do), 2 µL de PCR Bu"er 10X sin Mg2+ (Bioline, London, Reino Unido), 1,6 µL de MgCl2 25 mM (Bioline, London, Reino Unido), 1,6 µL de dNTPs 2 mM (Bioline, London, Reino Unido) y 1 µL (15 pmol.µL-1) de cada cebador (Fw : 5?- CCC TGT CCT GCT CCC T -3? y Rev : 5?- CTC AAA CGC TAC AGG G-3?) todo ello en un volumen final de 20 µL de H2O. La PCR se realizó con el termociclador Stratagene Mx3005 (Agilent?, Stratagene Products Division, La Jolla, CA, USA) de modo que, con cada muestra, el ADN fue desnaturalizado a 5 Diseño y metodología 105 94ºC durante 5 min, seguido de 40 ciclos consistentes cada uno de una primera fase de desnaturalización (94ºC, 35 sg), otra de alineamiento (59ºC, 35 sg) y finalmente una de elongación (72ºC, 40 sg), con una extensión final de 7 min a 72ºC. A continuación, 10 mL del producto obtenido de la PCR fueron sometidos a digestión con 5U de la enzima de restricción Mbo I (Fermentas?, Madison, WI, EEUU) en un volumen final de 30 mL, durante 16h a 37ºC. Los produc- tos obtenidos fueron separados mediante electroforesis no desnaturalizante de agarosa al 2,5%. Se visualizaron en el transiluminador ultravioleta Gel Printer Plus (Tecnología para Diagnóstico e Investigación S.A.?, Madrid, España). Las bandas observadas correspondían a los genotipos GG (206 pb), GT ( 119 pb ) y TT (87 pb).5.5. Análisis de la expresión génica en células mononu-cleares de sangre periférica. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) a par- tir de muestras de 30 mL de sangre periférica recogidas en tubos con EDTA (1 mg.dL -1 .) como anticoagulante, extraídas 4 horas después de la ingesta del desayuno basado en aceite de oliva (alto y bajo contenido). Posteriormente se centrifugaron (2500 rpm, 20ºC, 15 min) en una centrífuga Beckmam modelo J-6 (Beckmam ? , Coulter España S.A, España). La capa leucocitaria se diluyó en proporción 1:2 en PBS y las células se separaron en 5 mL de gradiente de Ficoll (solución de aislamiento de linfocitos, Rafer, Zaragoza, España) mediante centrifugación a 2000 x g durante 30 min. Las PBMCs se recogieron y se lavaron por duplicado con PBS frío. Extracción de ARN, cuantificación y calidad del ARN total. Se extrajo el ácido ribonucléico (ARN) total de las células mononucleares utilizando el reactivo TRI (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) y posteriormen- 106 5 Diseño y metodología te se limpió mediante el kit de limpieza RNeasy Mini Elute (Qiagen?, Hilden, Germany). El ARN total obtenido se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 v3.5.2 (Nanodrop Technology®, Cambridge, UK). La in- tegridad de dicho ARN se evaluó mediante migración en gel de agarosa 1,6% TBE 1x, considerandose apto para la hibridación de los arrays si las muestras presentaban bandas intactas correspondientes a las subunidades 18S y 28S del ARN ribosómico. Obtención, amplificación y marcado del ADNc. Las muestras de ARN se marcaron usando el kit comercial de amplificación de ARN SuperScript Indirect RNA Amplification System? (Invitrogen?, Carls- bad, CA, USA) conforme a las instrucciones del fabricante. De manera resumida, se retrotranscribió 1 mg del ARN total con la SuperScript? III Reverse Trans- criptase para posteriormente sintetizar una segunda cadena complemetaria con el uso de ADN polimerasa I y de ADN ligasa. Se llevó a cabo un solo paso la am- plificación y el marcaje mediante ARN polimerasa T7 con los flouróforos Alexa Fluor® 555 y Alexa Fluor® 647 (Invitrogen?, Carlsbad, CA, USA). La tasa de incorporación del marcador se evaluó con el espectrofotómetro Nanodrop® ND-1000 v3.5.2 (Nanodrop Technology®, Cambridge, UK) considerando un marcaje adecuado si dicha incorporación se encontraba entre 8 y 12 pmol.µL-1. Diseño del estudio. Se generaron perfiles de expresión génica utilizando la plataforma de ADNc microarray Whole Human Genome Oligo Microarray G4112A (Agilent Techno- logies Inc., Santa Clara, CA, USA). Cada microarray contiene 45.220 sondas o pruebas para explorar 30.886 transcritos humanos. Se utilizaron dos réplicas técnicas con sus correpondientes intercambio de tintas (dye-swap) resultando, de este modo, cuatro réplicas por cada muestra biológica. En cada uno de los arrays se compararó el ARN de PBMCs obtenido tras la toma de aceite de oliva virgen con alto contenido en compuestos fenólicos con el ARN de PBMCs 5 Diseño y metodología 107 obtenido después de la ingesta de aceite de oliva virgen con bajo contenido en dichos micronutrientes tal y como se detalla en el siguiente esquema (Figura 24). Hibridación y lectura de la señal de los arrays. La hibridación se realizó utilizando el kit Gene Expression Hybridization Kit (Agilent ? , Santa Clara, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para ello se mezclaron 825 ng de cada muestra de ARN amplificado y marcado con reactivo bloqueante y tampón de fragmentación, siendo todo incubado 30 minutos a 60ºC. El proceso de hibridación se llevó a cabo a 65ºC durante 17 h en un sistema de rotación continua dentro de la cámara de hibridación de acuerdo con el manual de Agilent. Posteriormente los arrays se desmontaron para ser lavados con las soluciones I y II según las instrucciones del fabricante, para posteriormente ser secados con una pistola de nitrogeno antes de su lectura con un escáner GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, USA). Los datos crudos de lectura se obtuvieron con el software Agilent Feature Extraction Software (v9.5) (Agilent?, Santa Clara, CA, USA) Normalización y análisis de expresión diferencial. Las señales ajustadas de fondo (BGSubSignal) se calcularon con el programa Agilent Feature Extraction Software (v9.5) y se filtraron con el Flag IsWellA- boveBG. El cociente del Log2 de la señal centrada (rojo/verde) se normalizó dentro del array y entre los arrays mediante el uso del ajuste tipo lowess de los modelos lineales creados para cada gen con el uso del paquete Limma9 del entorno de programación y análisis estadístico R (GNU), teniendo en cuenta que se trata de un diseño que tiene dos réplicas técnicas con sus respectivas réplicas con intercambios de tinta. Se analizó la expresión diferencial de los genes contenidos en cada array comparando el aceite con bajo contenido en compuestos fenólicos con el de 9http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html 108 5 Diseño y metodología Figura 26. Diseño del experimento con microarrays. 5 Diseño y metodología 109 alto contenido en dichos compuestos a las 4 horas de la ingesta del mismo. Se utilizó para dicho análisis el paquete MARRAY, 10 del entorno de programación y análisis estadístico R (GNU). Para considerar un gen como diferencialmente expresado, se utilizaron criterios de filtrado combinando el valor de M (log2ratio de la señal) mayor de 0,5 (sobreexpresado) o menor de -0,5 (reprimido) (fold change 1,4 y -1,4 respectivamente) y la significación estadística (p) de ?0,01 del modelo lineal ajustado para cada gen. Los resultados se ajustaron por el efecto del cruce de tintas y por la FDR utilizando el método de Benjamini y Hochberg [284]. Validación de los resultados mediante qRT-PCR. Se procedió a la amplificación mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) de los ARN de los genes expresados diferencialmente. Para ello se se- leccionaron los 4 genes con mayor valor absoluto de Fc. Las reacciones de PCR se realizaron con el termociclador Stratagene Mx3005 (Agilent Technologies?Stratagene Products Division, La Jolla, CA, USA) usando el kit comercial iQ SYBR Green Supermix (Bio Rad?Laboratories, Hercules, CA, USA) en un volumen final de 20 mL con 10 pmol de cada cebador. Cada reacción se llevó a cabo con 1 mL de una dilución 1:5 (v/v) de la primera hebra de ADNc, sintetizada usando 1mg de ARN total con el kit commercial iScript cDNA Synthesis Kit (Bio Rad? La- boratories, Hercules, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reación se sometió a incubación a 96ºC durante 3 min, seguida de 40 ciclos de 30 sg a 96ºC, 30 sg a 62ºC, 20 sg a 72ºC y 10 sg a 80ºC, momento en el que la intensidad de fluorescencia se midió para evitar señales de ruido de fondo y de formación de homodímeros de cebadores. Los cebadores utilizados fueron: ERG1-Up: (5?-CTACGAGCACCTGACCGCAGAG-3?) ERG1-Low: (5?-CCAGGGAAAAGCGGCCAGTATAG-3?) JUN-Up: (5?- GACCTTCTATGACGATGCCCTCAA-3?) JUN-Low: (5?-ACGTCGGGCGAGGTGAGGAGGTC-3?) 10http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/marray.html 110 5 Diseño y metodología IL1B-Up: (5?-GGGACAGGATATGGAGCAACAAGT-3?) IL1B- Low: (5?-GCTTATCATCTTTCAACACGCAGGA-3?) PTGS2-Up: (5?-ATGAGTTATGTCTTGACATCCAGATCAC-3?) PTGS2-Low: (5?-CAAACATCATGTTTGAGCCCTGG-3?) RPL13-Up: (5?-CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3?) RPL13- Low: (5?-TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA-3?) La especificidad de las amplificaciones mediante PCR se evaluó mediante creación de una curva de hibridación (60-95ºC con una velocidad de calenta- miento de 0,5ºC.sg1 y la medición continua de intensidad de fluorescencia) y mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 1,6% TBE 1X. Los datos se expresaron como valores relativos respecto a las concentraciones de ARNm del gen constitutivo RPL13a. Las eficiencias de los cebadores fueron: EGR1, 98%; PTGS2, 101%; IL1B, 96%; JUN, 108%; RPL13a, 95%. Análisis funcional de los genes expresados diferencialmente. Con el fin de investigar relaciones funcionales en el conjunto de genes diferen- cialmente expresados utilizamos el Software de análisis the Ingenuity Pathway (Ingenuity Systems, Redwood City, CA USA) que utiliza una base de datos predefinida que contiene información funcional de más de 10.000 genes huma- nos. Las relaciones funcionales obtenidas del análisis pevio se verificaron con una segunda herramienta, g:Profiler, que analiza enriquecimiento en términos de ontología genética, rutas metabólicas y sitios de unión a factores de trans- cripción de una determinada lista de genes. Además utilizamos la aplicación PathJam con el fin de obtener rutas metabólicas en las que se vieran los genes diferencialmente expresados en nuestro experimento [285]. 5 Diseño y metodología 1115.6. Predicción de dianas y análisis de enriquecimientopara sitios de unión de Factores de Tanscripción ymicroRNAs. Listas de genes. Se analizaron las regiones reguladoras de genes procedentes de dos listas con un tamaño similar, una con los genes cuyos transcritos mostraron variación en el análisis de expresión diferencial al comparar el aceite de oliva rico en compuestos fenólicos con el de bajo contenido en dichos compuestos y otra obtenida al azar mediante el comando sample (DB, 100 ) ejecutado en R (GPL) sobre el archivo que contenía las 45.220 pruebas representadas en la plataforma empleada previamente. La información adicional sobre cada uno de los genes se obtuvo con el servicio web BioMart 11 . Predicción de sitios de unión de factores de transcripción (TF). Con modelos ocultos de Markov obtenidos con HMMER3 12 a partir de las bases de datos TRANSFAC ® 13 y JASPAR 14 , se utilizó la aplicación MAPPER [278] para predecir TFBS, anotando en cada caso: el modelo identificado, la posición y región genómica, el valor score y el E-value. El valor score es una puntuación asignada por HMMER para cada comparación y representa el grado de ajuste del la región explorada con el modelo evaluado. El E-value es un valor estadístico obtenido de cada análisis con HMMER y corresponde a la probabilidad de que la predicción se deba al azar. Valores altos de score y bajos de E-value se relacionan con predicciones de mayor grado de verosimilitud. Las regiones genómicas exploradas en la identificación de TFBS comprendían (Figura 25): la zona desde -5000 pb hasta el sitio de inicio de la transcripción (+1); la región 5?-UTR, cuando existía; el primer intrón y el resto de intrones. 11http://www.biomart.org/ 12http://hmmer.janelia.org/ 13http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html 14http://jaspar.cgb.ki.se/ 112 5 Diseño y metodología Predecir lugares de unión para miRNAs 5?-UTR +1 1º intrón Exones -5000 pb Predecir lugares de unión de TF +1 1º intrón Exones -5000 pb !"#$%& !"#$%& '"#$%& Figura 27. Regiones genómicas exploradas. Los TFBS se exploraron en la zona desde -5000 pb hasta el sitio de inicio de la transcripción (+1), la región 5?-UTR, cuando existía, el primer intrón y el resto de intrones. Los sitios de unión de miRNAs se exploraron en la región 3?-UTR. Predicción de microRNAs. Se utilizó el algoritmo TargetScan 15 para la predicción de sitios de unión de miRNAs en la región genómica 3?-UTR (Figura 25). Asociados a cada resulta- do, TargetScan ofrece una puntuación contextualizada del sitio (Total Context Score) que considera características de vecindad como son el contenido en AU de las regiones exploradas y la posición de la misma dentro de la secuencia de ARNm [286]. También genera el valor agregado de (PCT ) que es un estimador bayesiano de la probabilidad de que dicho sitio esté conservado evolutivamente debido a una presión selectiva. Como las puntuaciones contextuales se calculan en base a información completamente ortogonal al grado de conservación evolu- tiva del sitio de unión, los valores de Total Context Score y (PCT ) proporcionan información complementaria sobre la calidad de las predicciones realizadas. Va- lores de (PCT ) agregado >1 y de Total Context Score >0 se relacionan con predicciones de mayor grado de verosimilitud. Para aumentar el grado de sig- 15http://www.targetscan.org/ 5 Diseño y metodología 113 nificación biológica de los miRNAs filtrados con este criterio, se seleccionaron para el análisis de enriquecimiento sólo aquellos para los que se habían predicho sitios de unión en más de 6 genes para cada grupo. Análisis de enriquecimiento. Una vez obtenida la relación de predicciones de TFBS y dianas para miRNAs en cada listado de genes, un análisis exacto de Fischer identificó diferencias en las frecuencias de dichas dianas al comparar ambos listados de genes, lo que se interpretaría como mayor o menor frecuencia de aparición de la que se esperaría encontrar por azar. Los factores de transcripción y los miRNAs se clasificaron según la nomenclatura de consenso. Análisis de coaparición. Se contabilizaron las ocasiones en que dos o más TFBS diferentes aparecían en una misma secuencia génica, obteniendo los patrones más frecuentes en los que dichos factores se combinaban en el listado ?EVOO list?. Por otro lado, se identificaron las frecuencias con las que uno o más de los miRNAs predichos coaparecían en un mismo resumen bibliográfico junto a términos relacionados con enfermedad cardiovascular, recuperando los términos que aparecían con más frecuencia en el listado ?EVOO? en comparación con la lista random. Red de interacción. Con Cytoscape 2.8.0 16 se construyó una red de interacción teniendo en cuen- ta la relación entre los genes y los TF y miRNAs para los que existía un enri- quecimiento de sitios de unión en el listado ?EVOO? en comparación con la lista random. 16http://www.cytoscape.org/ 114 5 Diseño y metodología5.7. Aspectos éticos. El estudio se ha realizado respetando los principios fundamentales estableci- dos en la Declaración de Helsinki (1964), en el Convenio del Consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina (1997), en la Declaración Uni- versal de la UNESCO sobre el genoma humano y los derechos humanos (1997), así como cumpliendo los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter per- sonal y la bioética. El proyecto fue sometido a evaluación por el Comité de Ética e Investigación Clínica del Hospital Universitario Reina Sofía. Todos los pacientes fueron informados acerca del estudio y se les solicitó el consentimiento informado escrito antes de entrar en el mismo (Anexo).5.8. Procesamiento general de los datos y análisis estadís-tico. Para analizar diferencias estadísticamente significativas entre dos ó más gru- pos de variables categóricas se utilizó el test de q2 y para las variables cuantita- tivas se realizó el análisis de la varianza (ANOVA) de uno o más factores seguido del test HSD de Tukey para comparaciones múltiples. Previamente se realiza- ron análisis para ver si dichas variables cumplían las hipótesis de normalidad (mediante gráficas QQ y el Test de normalidad de Shapiro-Wilk), de semejanza de las varianzas u homocedasticidad (mediante el test de Barlett) y de inde- pendencia o no colinealidad. Cuando no cumplían estos criterios, se realizó la transformación logarítmica de los datos de la variable. Se calculó el coeficinte de correlación lineal r de Pearson para relacionar las diferentes variables. Para comprobar si las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo estaban en equilibrio de Hardy-Weinberg se realizó un análisis de bondad de ajuste me- diante un test de q2 con el paquete HardyWeinberg implementado para R17. Los contrastes de hipótesis se realizaron asumiendo un error tipo II de 0,8. Se 17[http://pbil.univ-lyon1.fr/library/genetics/html/HWE.test.html] 5 Diseño y metodología 115 consideraron diferencias estadísticamente significativas, permitiendo rechazar la hipótesis de trabajo, si el valor de p era igual o menor de 0,05 (error tipo I). Los valores de las diferentes variables se procesaron y analizaron con diver- sos paquetes de CRAN 18 para R (GNU, Free Software Foundation, Inc., Boston, MA, USA), un lenguaje y entorno de software libre para el análisis estadísti- co y gráfico 19 . Para las búsqueda bibliográfica en MEDLINE se utilizó Entrez de PubMed, los gestores bibliográficos Mendeley, Zotero y Bibdesk v. 1.5.4 20 (GNU, Free Software Foundation, Inc., Boston, MA, USA), para la informa- ción relativa a diferentes genes se utilizó BioMart 21 y el editor de texto LYX 2.0.0 22 (GNU, Free Software Foundation, Inc., Boston, MA, USA). Se utiliza- ron además modelos ocultos de Markov obtenidos con HMMER3 23 a partir de las bases de datos TRANSFAC ® 24 y JASPAR 25 , la aplicación MAPPER 26 para predecir los sitios de unión de los factores de transcripción. Se utilizó el programa TargetScan 27 para la predicción de sitios de unión de miRNAs en la región genómica 3?-UTR. Utilizando la información existente en Biomolecular Interaction Network Da- tabase (BIND)28 se confeccionó una red de interacción proteína-proteína (PPI) de 2 niveles, que tenía como núcleo los genes diferencialmente expresados en el análisis previo. Se utilizó Information Hyperlinked over Proteins (iHOP)29, en base a referencias bibliográficas, para la extracción automática de nuevas inter- acciones y de asociación de otras proteínas con nuestra red inicial de PPI. Se utilizó el plugin NetworkAnalyzer de la aplicación Cytoscape 2.8.0 30 para ana- lizar la topología de dicha red e identificar las principales proteínas conectoras 18[http://cran.es.r-project.org/] 19http://www.r-project.org/index.html 20http://bibdesk.sourceforge.net/ 21Http://www.biomart.org/B 22ftp.lyx.org 23http://hmmer.janelia.org 24http://www.gene-regulation.com/pub/databases 25http://jaspar.cgb.ki.se/ 26http://genome.ufl.edu/mapper/ 27http://www.targetscan.org/ 28http: // www. bind. ca/ 29http: // www. ihop-net. org/ UniPub/ iHOP/ 30http: // www. cytoscape. org/ 116 5 Diseño y metodología (hubs). Se utlizó la herramienta gProfiler para el analisis de enriquecimiento de términos GO. 31 31http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/ Resultados 6 Resultados 119 Figura 28. Población de estudio. 6. Resultados6.1. Características de la población estudiada. 6.1.1. Características demográficas y clínicas Partiendo de una población de 480 candidatos, 108 individuos cumplían los criterios de inclusión y ninguno de exclusión. De éstos, 79 aceptaron participar, firmando el consentimiento escrito antes de comenzar el estudio. Diez lo abando- naron durante el periodo de homogeneización. De los 69 que iniciaron la fase de intervención, tan sólo 65 la completaronen su totalidad. Tras evaluar la calidad de los datos obtenidos para el total de parámetros analizados (valores extremos, pérdidas de información), se consideraron para los sucesivos análisis un total de 57 pacientes (Figura 26), todos ellos de origen caucásico (22 hombres y 35 mujeres) y una edad media de 56±9 años (36-70). En el momento de la inclusión el peso medio fue de 99±15 Kg y el IMC de 38,7±4,4 Kg.m-2 (Figura 27).6.2. Intervención alimentaria. El análisis de la concentración de macro y micronutrientes, antes y después del lavado, mostró que los aceites utilizados tan solo diferían en la concentración de compuestos fenólicos (Figura 28). 120 6 Resultados                      !"# $%  %   & '()  %     &   %  %%  %  (*) ( (*( +  %   %   (*) ( (*( +   % %   , -.( / %  %  !)() -.( 0/    #  /%   %  # /1/ % %   # +1/    %  %  2((3( /  % -  /  %    - 4 /     &) # (5 6/%   %  Figura 29. Características basales de la población estudiada.                                     !   """"  ! #!  ""  $%    $%&    '(#!     )  *   +,-.     *  *  +,-.    '   *  +,-. " /  *  +,-.    *!   +.  Figura 30. Composición de micronutrientes de los aceites. 6 Resultados 121 CT tiempo (minutos) C T (m g. dL -1 ) 150 170 190 210 230 250 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 31. Concentraciones plasmáticas de CT tras la ingesta de aceite con di- ferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) = 0,204; p2(tiempo) = 0,027; p3(aceite*tiempo) = 0,082.6.3. Efecto del aceite de oliva virgen con diferente con-tenido en fenoles sobre la respuesta inflamatoria ymetabolismo energético postprandial. Al analizar las concentraciones de PCR, IL-6, HDLc y APO B no se encon- traron diferencias significativas en función de la concentración de compuestos fenólicos de los aceites (resultados no mostrados). Las concentraciones del res- to de parámetros del metabolismo lipídico se modificaron en el periodo post- prandial sin que existieran diferencias según el tipo de aceite consumido (CT, p=0,027; LDLc, p<0,001; TG, p<0,001; APO A-1, p=0,032; NEFAs, p<0,001) (Figuras 29, 30, 31, 32 y 33). De modo similar, se observaron cambios en las concentraciones de glucosa e insulina, existiendo, para esta última, un efecto de interacción entre el tiempo y el tipo de aceite consumido (p= 0,039) (Figuras 34 y 35). 122 6 Resultados LDL tiempo (minutos) LD L (m g. dL -1 ) 80 100 120 140 160 180 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 32. Concentraciones plasmáticas de LDLc tras la ingesta de aceite con di- ferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) =0,824; p2(tiempo) <0,001; p3(aceite*tiempo) = 0,241. TG tiempo (minutos) TG (m g. dL -1 ) 100 120 140 160 180 200 220 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 33. Concentraciones plasmáticas de TG tras la ingesta de aceite con di- ferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) =0,700; p2(tiempo) <0,001; p3(aceite*tiempo) = 0,724. 6 Resultados 123 APOA1 tiempo (minutos) AP O A 1 (m g. dL -1 ) 90 110 130 150 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 34. Concentraciones plasmáticas de APO A-1 tras la ingesta de aceite con diferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) = 0,345; p2(tiempo) = 0,032; p3(aceite*tiempo) = 0,142. NEFAs tiempo (minutos) N EF As (m g. dL -1 ) 0 10 20 30 40 50 60 70 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 35. Concentraciones plasmáticas de NEFAs tras la ingesta de aceite con diferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) = 0,202; p2(tiempo) <0,001; p3(aceite*tiempo) = 0,165. 124 6 Resultados Glucosa tiempo (minutos) gl uc os a (m g. dL -1 ) 60 80 100 120 140 160 180 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 36. Concentraciones plasmáticas de glucosa tras la ingesta de aceite con diferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) = 0,126; p2(tiempo) <0,001; p3(aceite*tiempo) = 0,383. Insulina tiempo (minutos) In su lin a (U .L -1 ) 0 10 20 30 40 50 60 0 30 60 120 240 aceite HPOO MPOO LPOO Figura 37. Concentraciones plasmáticas de insulina tras la ingesta de aceite con diferente contenido en compuestos fenólicos (HPOO: alto; MPOO: medio y LPOO: bajo). ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) = 0,195; p2(tiempo) <0,001; p3(aceite*tiempo) = 0, 039. 6 Resultados 1256.4. Efecto del polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983)sobre la respuesta vasodilatadora mediada por el en-dotelio tras la ingesta de aceite de oliva virgen condiferente contenido en fenoles. Análisis de la distribución genotípica. Las frecuencias alélicas (G=0,560; T=0,440) y genotípicas (GG=0,335; GT=0,45; TT=0,215) fueron similares a las encontradas en otras poblaciones caucásicas (HapMap 32 y PERGELEN). Estas distribuciones además se hallaban en equili- biro de Hardy-Weinberg (q2=0,196, p= 0,657, D= 0,826). Caracteristicas basales de los sujetos en función del polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983). Al analizar las características basales de los pacientes agrupados en virtud del grado de portador del alelo T del polimorfismo Glu298Asp de la NOS3 (rs1799983), no se observaron diferencias significativas para los parámetros es- tudiados (Figura 36). Respuesta vasodilatadora mediada por el endotelio. A continuación se detalla el efecto observado del aceite y el polimorfismo sobre cada uno de los parámetros de la respuesta vasodilatadora medida por láser Doppler que fueron analizados. 1.-iABC Los pacientes con genotipos TT o GT mostraron un menor valor de iABC tras la ingesta de los diferentes aceites (p=0,002). Además, el valor de iABC resultó ser mayor cuanto más elevada fue la concentración de compuestos fenó- licos en los aceites consumidos (p=0,004). Sin embargo, no se apreció interacción entre aceite y genotipo para este parámetro de la respuesta vasodilatadora (Fi- gura 37). 32www.hapmap.org/ 126 6 Resultados                          !"#$ % &    '()        * # + ," % &      * #  % %   !-  .    !/  .    "$%  "     '$",  0 1       )"2 "   1/1%  "  & ./1%  "   & 2  " &  !3!  "   &   !34  "   & )5  1   Figura 38. Características basales en función de los distintos alelos del polimor- fismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983). Los valores representados corresponden a las medias ± desviación estandard; los valores de la p resultan del análisis ANOVA para analizar las diferencias entre gupos de genotipos. * Las diferencias de género se analizaron con el test 2 . 2.-PORH max: Se observó cómo una interacción entre el efecto del genotipo de NOS3 Glu298Asp (rs1799983) y el tipo de aceite consumido explicaba las diferencias observadas en los valores de PORH max (p=0,039). Éstos resultaron ser menores en aquellos pacientes con genotipo TT que en los que tenían genotipos GT o GG, siempre que el aceite ingerido tuviera una concentración media o baja en compuestos. Sin embargo, estas diferencias desaparecían cuando el aceite tenía alta concen- tración en dichas sustancias (p= 0,002) (Figura 38). 3.-PORH pico: Tras la ingesta del aceite con alto contenido en compuestos fenólicos la res- puesta pico fue mayor en comparación con los otros dos aceites (p=0,026), sin observar efecto alguno del genotipo de NOS3 Glu298Asp (rs1799983) sobre dicha respuesta (Figura 39). 6 Resultados 127 HPOO tiempo (minutos) iAB C 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 0 120 240 genotipo GG GT TT MPOO tiempo (minutos) iAB C 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 ** 0 120 240 genotipo GG GT TT LPOO tiempo (minutos) iAB C 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 ** 0 120 240 genotipo GG GT TT Figura 39. Análisis del iABC tras la ingesta de aceites con diferente contenido fenólico según cada genotipo. ANOVA para medidas repetidas; p1(aceite) = 0,004; p2(genotipo) = 0,002; p3(aceite*genotipo) = 0, 051. Análisis post hoc (Tuckey) por genotipo * p< 0,05; ** p<0,001. 128 6 Resultados HPOO tiempo (minutos) lo g(P O R H m ax ) 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 0 120 240 genotipo GG GT TT MPOO tiempo (minutos) lo g(P O R H m ax ) 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 * 0 120 240 genotipo GG GT TT LPOO tiempo (minutos) lo g(P O R H m ax ) 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 * ** 0 120 240 genotipo GG GT TT Figura 40. Análisis de la respuesta PORHmáxima tras la ingesta de aceites con diferente contenido fenólico según cada genotipo. ANOVA para medidas re- petidas; p1(aceite) = 0,414; p2(genotipo) = 0,002; p3(aceite*genotipo) = 0.039. Análisis post hoc (Tuckey) por genotipo * p< 0,05; ** p<0,001. 6 Resultados 129 HPOO tiempo (minutos) lo g(P O R H pi co ) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 ** 0 120 240 genotipo GG GT TT MPOO tiempo (minutos) lo g(P O R H pi co ) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 0 120 240 genotipo GG GT TT LPOO tiempo (minutos) lo g(P O R H pi co ) 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 0 120 240 genotipo GG GT TT Figura 41. Análisis de la respuesta PORH pico tras la ingesta de aceites con di- ferente contenido fenólico según cada genotipo. ANOVA para medidas repetidas; p1(aceite) = 0,026; p2(genotipo) = 0,073; p3(aceite*genotipo) = 0,878. Análisispost hoc (Tuckey) para el genotipo ** p<0,001 130 6 Resultados Respuesta vasodilatadora, biodisponibilidad de NO y polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983). 1.-Concentración de eNOS: Observamos que los pacientes con genotipo TT tenían concentraciones menores de eNOS que los que tenían genotipo GT o GG (p= 0,032), sin embargo no encontramos interacción alguna entre el genotipo y los tipos de aceite consumidos (Figura 40). 2.-Concentración de NO(x): La concentración basal de NO(x) fue significa- tivamente menor en aquellos enfermos con genotipos TT o GT en comparación con aquellos que presentaban genotipo GG (p=0,039). Tras la ingesta de aceite con bajo contenido en compuestos fenólicos se producía una marcada disminu- ción en la concentración de NO(x) en el periodo postprandial, hecho que no sucedía cuando el aceite ingerido tenía una concentración media o alta de es- tos compuestos (p=0,015). Además, observamos una interacción gen-dieta que resultó estadísticamente significativa (p=0,042) (Figura 41). 3.-Análisis de correlación: Encontramos una correlación positiva entre la concentración de NO(x) y la PORH máxima tras la ingesta de aceite de oliva con alto (r=0,379; p=0,001) y medio (r=0,378; p=0,0001) contenido en com- puestos fenólicos, pero no tras la ingesta de aceite con bajo contenido en dichas sustancias (r=0,060; p= 0,587) (Figura 42). Al analizar el efecto que el po- limorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) podía tener sobre estas asociaciones, encontramos una correlación positiva entre NO(x) y la PORH máxima en los pacientes con genotipo GG (r=0,778; p<0,001) y GT (r=0,318; p<0,001), pero no en aquellos con genotipo TT (r=0,170; p=0,128) (Figura 43). 6 Resultados 131 HPOO tiempo (minutos) lo g( [e N O S ]) 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.5 3.7 * 0 120 240 genotipo GG GT TT MPOO tiempo (minutos) lo g( [e N O S ]) 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.5 3.7 * 0 120 240 genotipo GG GT TT LPOO tiempo (minutos) lo g( [e N O S ]) 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.5 3.7 * * 0 120 240 genotipo GG GT TT Figura 42. Concentraciones plasmáticas de eNOS tras la ingesta de aceites con diferente concentración en compuestos fenólicos. ANOVA para medidas repetidas; p1(aceite) = 0,932; p2(genotipo) = 0,032; p3(aceite*genotipo) = 0,242. Análisispost hoc (Tuckey) para el genotipo * p<0,005. 132 6 Resultados HPOO tiempo (minutos) lo g( [N O (x) ]) 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 0 120 240 genotipo GG GT TT MPOO tiempo (minutos) lo g( [N O (x) ]) 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 0 120 240 genotipo GG GT TT LPOO tiempo (minutos) lo g( [N O (x) ]) 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 ** 0 120 240 genotipo GG GT TT Figura 43. Concentraciones plasmáticas de NO(x) tras la ingesta de aceites con diferente concentración en compuestos fenólicos. ANOVA para medidas repetidas. p1(aceite) = 0,015; p2(genotipo) = 0,039; p3(aceite*genotipo) = 0,042. Análisispost hoc (Tuckey) para el genotipo * p<0,005. 6 Resultados 133 log(NO(x)) lo g(P O R H m ax ) 2 3 4 5 6 7 8 LPOO 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 MPOO 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 HPOO 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 aceites LPOO MPOO HPOO Figura 44. Correlación entre PORH máxima y NO(x)en función del aceite de oliva consumido. LPOO; R: 0,006 / p= 0,587; MPOO; R: 0,378 / p= 0,001; HPOO; R: 0,379 /p= 0,0001. log(NO(x)) lo g(P O R H m ax ) 2 3 4 5 6 7 8 GG 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 GT 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 TT 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 genotipo GG GT TT Figura 45. Correlación entre PORH máxima y NO(x)en función del genotipo NOS3. GG; R: 0,778 / p<0,0001; GT; R: 0, 318 / p= 0,001; TT; R: 0,170/ p= 0,128 134 6 Resultados6.5. Análisis de expresión génica en células mononuclearesde sangre periférica. Genes expresados diferencialmente El análisis con microarrays mostró un índice de correlación de >90% de la señal del logaritmo de la intensidad cruda entre las réplicas inter-array en todos los casos. El coeficiente medio de variación de los valores del logaritmo de la señal de cada prueba fue menor de 0,1 para las replicas intra-array. Los cambios en la expresión génica se determinaron como log2 del ratio de los valores de la intensidad de la señal correspondiente a los transcritos presentes cuatro horas después de la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en polifenoles dividido entre los valores de intensidad de señal correspondiente a los transcritos presentes 4 horas tras la ingesta de aceite con bajo contenido en compuestos fenólicos. Se seleccionaron 15.308 sondas o pruebas de alta calidad con log2 ratios entre 1,89 y -1,79. Entre éstas, encontramos 98 genes diferencialmente expresados en PBMCs humanas. Seleccionando el ratio del log2 mayor que 0,4 (mayor expresión tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en fenoles, es decir, al menos 1,32 veces más cambio) y log2 del ratio menor de -0,4 (menor expresión tras la ingesta de aceite con bajo contenido en fenoles, es decir al menos 1,32 menos cambio) observamos que 19 genes estaban sobreexpresados (Figura 43) y 79 genes estaban reprimidos (Figuras 44,45, 46 y 47) con una significación estadística para el modelo lineal ajustado por FDR de p=0,001. Los resultados se ajustaron por el efecto del dye-swap y por FDR. Los genes más reprimidos en pacientes con SMet durante el periodo postprandial tras ingerir aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos fueron: G0S2, EGR2, EGR1, FOSB, IL1B, NR4A2, EGR3, RASGEF1B, CXCL1 y PTGS2 (1,95 a 2,74 veces de cambio) y los más sobreexpresados fueron: CA1, RAP1GAP, GYPB, FN1 and SELENBP1 (1,46 a 1,57 veces de cambio). 6 Resultados 135                                     !  !"  "  #  #$       !  !"  % $#%  & '( "  ) !! !"    %  #      '  *     $% # +,    )   -(  $% $     (( ! !  % %  +.(& )  &   $ %  /0  12  !1 ) !    " #  $## #  1  ! "3  ,%  $ ##   (/4 * ! 5  !1 ) !  !6  % $ %#    (7 "8 !  5)9  %%        ::;&( !  "  )  %%  %$#     ' !    # $%% # <; "    %% #% ##       (+( 5    ( +'( ! #%#  %%# !       ;4/    *  % % $% #  " #  ! $  %  &    # ! #    "      %# #  ,<,'         #  $%   '   Figura 46. Genes sobreexpresados tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. El valor M representa el logaritmo del ratio de la expresión diferencial entre el canal rojo y verde (M = log2(R/G). El valor B representa el logaritmo de la odds de la expresión génica diferencial y la proba- bilidad B se obtiene conviertiendo el logaritmo de la odds ratio; probabiliad B= ( B 1+B ). (M) mujeres (H) 136 6 Resultados                                   !!"#"      ! ## # # $%&    &"#   !  '(  )  #   " # *'(  )      "# # +,+ )   -   .+,+ /   !# " ++## )   -   .++ / #  # # "  " " ++# )   -   .++ / # !!  " ## +,+! )   -   .+,+ / ! "  "!  +,+# )   -   .+,+ / #   " !  +,+'"    -   .+,+ / "  " #!     %+*# "! '0*"  #!#  +1 +1 !   ! " 2*%!'     )   !    ""  !  3+04!        4   ! " # " '(% )   5 6     ( # #!" "                                   Figura 47. Tabla 1.1 Genes reprimidos tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. El valor M representa el logaritmo del ratio de la expresión diferencial entre el canal rojo y verde (M = log2(R/G). El valor B representa el logaritmo de la odds de la expresión génica diferencial y la probabilidad B se obtiene conviertiendo el logaritmo de la odds ratio; probabiliad B= ( B 1+B ). 6 Resultados 137                              !" #     !$!  ##%         &' ()        '" *) #*  #       +, -        .$! */#    ##%        0 %1 22     & 3 // (* 23     4 )       5' 60#  #        7' // *       ., #,  +2       7' // 8/       ,  // *%* 0%       '&+ - (*         ,23 %% 0#(            9 3 :%*#      2!' 2! 6   (- #                          Figura 48. Tabla 1.2 Genes reprimidos tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. El valor M representa el logaritmo del ratio de la expresión diferencial entre el canal rojo y verde (M = log2(R/G). El valor B representa el logaritmo de la odds de la expresión génica diferencial y la probabilidad B se obtiene conviertiendo el logaritmo de la odds ratio; probabiliad B= ( B 1+B ). 138 6 Resultados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igura 49. Tabla 1.3 Genes reprimidos tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. El valor M representa el logaritmo del ratio de la expresión diferencial entre el canal rojo y verde (M = log2(R/G). El valor B representa el logaritmo de la odds de la expresión génica diferencial y la probabilidad B se obtiene conviertiendo el logaritmo de la odds ratio; probabiliad B= ( B 1+B ). 6 Resultados 139                              !"# $ % !&#  $   %      '  $  "# '    ()* & &  % &+$  &&     ,-. +$   & ,#    /.0  & 1&$ +&   & 23    *45  & 6 6&%&1$&7 *84     *-4)0-  & 6 & $$&7 $  *-4    394'  % : ; '    -92 5 8$ 5,./5    .- 5 8$< .- +& $  3=)    -92  & > &$  6  8,    )     &%6&     8? 3#%& @3 A %& $ 6& =  8    )     &%6&     -2 5 8$ .- +& $  ?88    8.  % 8    2 + $ %  %  +     8(4 -  ;&  &     ,)88 ,)88  & % 8      , $ %  %  +     2 + $ %  %  +               Figura 50. Tabla 1.4 Genes reprimidos tras la ingesta de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. El valor M representa el logaritmo del ratio de la expresión diferencial entre el canal rojo y verde (M = log2(R/G). El valor B representa el logaritmo de la odds de la expresión génica diferencial y la probabilidad B se obtiene conviertiendo el logaritmo de la odds ratio; probabiliad B= ( B 1+B ). 140 6 Resultados gen lo gF C -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 EGR1 IL1B JUN PTGS2 plataforma microarray RT-PCR Figura 51. Comparación de los valores de Fold Change (FC), obtenidos conmicroarrays y con RT-PCR, tras el consumo de aceite de oliva con alto y bajo contenido en polifenoles. Los valores de la expresión génica se transformaron logarítmicamente antes del análisis estadístico. Validación de los genes expresados diferencialemente Las variaciones en la expresión génica, fueron similares al comparar ambos métodos, microarray y RT-PCR, existiendo un valor para el coeficientes r de Spearman entre 0,901 y 0,968 con una significación de p < 0,001 (Figura 49). Analisis funcional Con el fin de investigar las relaciones funcionales del conjunto de genes expre- sados diferencialmente, utilizamos el software de análisis Ingenuity Pathway. De los 98 genes diferencialmente expresados en los pacientes con Síndrome Metabó- lico, dos transcritos (LOC284454 y AF351612) no mostraron ninguna entrada en la base de datos del software y sólo 81 genes se eligieron finalmente para la red de interacción. ?Trastorno inflamatorio? fue la característica más representada (39 genes, p=2.11E-19). De éstos, 35 genes (PTGS2, IL1B, IL6, OSM, CCL3, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCR4, NAMPT, DUSP1, DUSP2, EGR1, EGR2, EGR3, EREG, FOSB, G0S2, JUN, JUNB, NFKBIA, NFKBIZ, NR4A1, NR4A2, PER1, SOCS3, SOD2, TAGAP, TNFAIP3, ZFP36, AREG, CA2, CD69, CD83, 6 Resultados 141 ratio de log2(MA) normalizados ra tio d e lo g2 d e qR T .P C R -6 -4 -2 0 2 EGR1 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 IL1B -5 -4 -3 -2 -1 0 1 JUN -5 -4 -3 -2 -1 0 1 PTGS2 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Figura 52. Análisis de correlación entre el log2 del ratio de los valores de expre- sión génica de los microarrays y los experimentos con qRT-PCR. El ratio de los valores de expresión génica corresponde a la expresión génica tras el consumo de aceite con alto contenido en polifenoles, dividido entre la expresión génica tras el consumo de aceite con bajo contenido de dichas sustancias. Se muestran los valores de la r de Spearman. CDKN2A) estaban reprimidos tras la ingesta de aceite de oliva con alto conte- nido en compuestos fenólicos y 4 genes estaban sobreexpresados (CCR2, CA1, CPVL, FN1). Las gene ontologies (GO) de ?función celular? más fuertemen- te asociadas con los genes diferencialmente expresados fueron: ?muerte celular? (41 genes, p= 7.53E-11); ?migración celular? (24 genes, p= 3.88E-8); ?división celular? (23 genes, p=6.29E-8); ?proliferación celular? (32 genes, p=9,90E-7) y ?transcripción? (25 genes, p=3,55E-05). La red de análisis arrojó otras 14 su- bredes diferentes, de las cuales, una se identificó como fundamentalmente enri- quecida en genes diferencialmente expresados tras el consumo de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos. Esta subred incluía 26 genes cu- yas funciones principales estaban relacionadas con enfermedades inflamatorias con un valor de probabilidad de entre 10 y 54 (Test exacto de Fisher) de in- terrelación génica al azar. Todas las subredes se fusionaron para obtener una red general (Figura 51). Las proteínas interactantes se añadieron utilizando la base de datos del Ingenuity Pathways. Finalmente los genes no conectados o aquellos conectados por dos o más aristas se retiraron excepto los que se habían 142 6 Resultados expresado de manera diferencial en nuestro estudio. Realizamos asímismo un analisis funcional con la aplicación PathJam obte- niendo diversas rutas metabólicas anotadas en las bases de datos REACTOME 33 , KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)34 y NCI 35 y en las que se encontraban involucrados los genes que encontramos diferencialmente expresados tras la ingesta de HPOO (Figura 52). 33www.reactome.org/ 34http: // www. genome. jp/ kegg/ 35http://pid.nci.nih.gov/ 6 Resultados 143 Figura 53. Red de Ingenuity Pathway Analysis. Red de genes modulados por el aceite con alto contenido en polifenoles. 144 6 Resultados                                                                 !  "  #   #  #      $  #   $ #    $ #  $   % & ' ' (  )  (        *    !   +         ! !  " $  #   #       $      #  #   , #  -  .    $  #    $  #   , #  % / ,  *0   1  )  2 1 0 *  / 3  )      *          !    ! !  +  !  " '  '    '   4 5/  4 5/ - 6  ' .  % & ' '/ 7)0      2  *0  2  *  8 * (   + +  +        " $  #   $ #   , #  -  , #  / 3 & - ,  / 3  ,6  % & ' '    2  *0  2  *  8 * ( +   +         +  ! "  #   #  #      $  #   $ #    $ #   $   / 3 & - ,  %       6    0 2 * )   2             !    !    "  #   #  #      $  #   $ #    $ #  $   % & ' '  00)0      2  * 0  2  *  8 * (    ! +     +      "  #   , #  -  , #   4 5/ / 3 & - ,   #  % & ' '  *2 *    *     !     ! +  + +   "  #   #  #   , #  -  , #   4 5/ / 3 & - ,  % / , ' 0 1           2 1 0 *  (  8    ! +    !  ! !  " '   , #   4 5/ /     .' &  % / ,   -   8    *  2  * 0  2    +   ! !  ! !  " 7 , 6 9   7 5 .6  '    4 5/ : 36   % / , , #  )  *   2  * 0  2 ;           !  ! !  " $  #   , #  -  , #   . .  % / ,  3)    *       < *     8         !  !   " 7 5 .6   , #   4 5/  . .  % / ,  *    * 0 / 3) * * -  *  8 * (   !  !  ! ! !  !   "/ 3 & - ,  / 3  ,6  %        0 *     =     ) 0      >    +      !  !   "  #   #  #      $  #   $ #    $ #  $   % / ,  7  !  7  ! #  2  *0  2         !  !   " 4 5/ / 3 & - ,  / 3  ,6  % & ' '  6 &  2  * 0  2  *  8 * (    +    !  !  !   " 7 5 .6   7 5 .6   , #  -  4 5/ /     6 #   '  - % / , , # )  *   2  * 0  2 ;       !    !  !   " , #   4 5 / -  . .  % & ' ' 6 *  8 * (    *           +  !  !   " 7 &/    ?  .  , #   4 5/ / 3 & - ,  6 ' .  % F igura 54. R u t a s m e t a b ó l i c a s q u e c o n t i e n e n g e n e s e x p r e s a d o s d i f e r e n c i a l m e n t e t r a s l a i n g e s t a d e H P O O . 6 Resultados 1456.6. Predicción de dianas y análisis de enriquecimientopara sitios de unión para TF y miRNAs TFBS Se obtuvieron predicciones de 94.830 sitios de unión a TF en las regiones exploradas de los 98 genes que habían mostrado variación en su expresión tras la ingesta de los aceites de oliva. Estableciendo como filtro un valor de score >1 y de E-value <1, se seleccionaron como de mayor verosimilitud 834 posiciones de elementos reguladores que correspondían a 89 factores de transcripción. La mayoría de TFs estaban representados en menos de un 30% de los genes analiza- dos. Tan sólo CAAT-BOX, bZIP911, HFH-1, HMG-IY, LUN-1, MTF-1, MEF-2 y NF-kB mostraron algún sitio de unión en la región reguladora del 30-90% de los genes. El análisis de enriquecimiento utilizando como referencia la lista de genes obtenida al azar a partir de los genes representados en la plataforma del microarray, mostró que había más sitios de unión para NF-kB, FOXQ1 y SRF y menos para PPARG-RXRa y NHLH1 de lo que cabría esperar por azar (Figuras 53, 54 y 55). Con el fin de identificar si las diferencias encontradas dependían de la locali- zación de los elementos reguladores, se analizaron las distribuciones de frecuen- cias de dichos elementos en función de su posición génica. Se aprecia una clara influencia de la posición en la distribución de frecuencias para FOXQ1, SRF y NF-kB HFH-1. Por ejemplo, FOXQ1 mostró más diferencias en los sitios de unión predichos en las posiciones de 1 a 3 kbp del sitio de inicio de la transcrip- ción y en intrones, comparado con regiones similares de la lista random. SRF mostró las diferencias más grandes en la región de +1 kbp del sitio de inicio de la transcripción y en el primer intrón. Por último los sitios de unión predichos para NF-kB se localizaban mayoritariamente en una región que iba de +1 kbp upstream del sitio de inicio de la transcripción hasta la posición 5?-UTR y el intrón 1, así como en otros intrones comparado con regiones similares de los genes de la lista random (Figura 56). 146 6 Resultados                                                                                                 !                                                                    !  " # !  " #  $            $            %  !  " #      !  " #    &  '                  ( ) *      +       "                         #  #              ,    , -          +  ,     .  /      0         1   %  2      3  &    %        $    #              % &                    #  #   !    $          1   %  2        %       4   4   4  5      "         '            '      ( ) *     '   ( "      +       '            , -     &   (                 %  2 & %      %  2         "                     %    %  % 2 & %     %  2  ! 6 7   ,  *  ! 6 7   ,  *  +       &      $           8     &          9  0     ! ! * + .  + / +    0 " $      +    $ (    :       6    &         6    &  :      8   (    ; <  . 0    "  "     1    , -     &   (                 %   9  ,  9  ,         "  $         , " #  "     &   (    $              %   (    =     ,  * * *  = 3  3  '  /    > >       Figura 55. Tabla 1.1. Frecuencias para TFBS humanos predichos en las lista de genes EVOO y en la random list . 6 Resultados 147                                                                                                                       !       "        "  "         "      #    "                                     $ %   !       !    &  ' (         )                " !  ! %   !    !   "         " * +          #               #                "            $%             ,  & , -            #    ,. / 0                   !   ! %   !      ! (  ! 1 2 $        2$      3    #        &   %%             '    (   )  #     * * +* $    $   *  , #          $ 4  -  !    - &&  5  $  3     -     .  / 0      &    )      &          #             . 6         !    7    .    8    9     .       #      "  #          &   &    #      Figura 56. Tabla 1.2. Frecuencias para TFBS humanos predichos en las lista de genes EVOO y en la random list. 148 6 Resultados                                                                                                              !      "     !           !            !# $  $  ! ! %  ! &'    ! ( )               !              ! ) *+ ( ) , ) $ &      !  ) , '    -   !      .      /  0    ' ( ) ) 1  /  0  2 , .   -   !         "  #      $   -          ' $ ! 3 '  $    ""   4 "   4 5 * + .   6   !  % & '  1 +   .   !  7  2 8 .      !  5  * +      !   * +*      !   * + 0      !  7 6       !  ( ! )! * %  +      8/ + .     !  4*1* ) .  .    !  7 / .     !   4       !   8       !  7 9 & 6   .   !  7   8   .   !  1  & 6     !  1 :7 * +  6 -   !   5        !  )#;      !  <7    .      !  < 5 4 5 6     !  Figura 57. Tabla 1.3. Frecuencias para TFBS humanos predichos en las lista de genes EVOO y en la random list. 6 Resultados 149 posición de los TFBS posicion co un t 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 -5 .0 a -4 .0 -3 .9 a -3 .0 -2 .9 a -2 .0 -1 .9 a -1 .0 -0 .9 a SS T 5' -U TR 1e r in tr ón re st o de in tr on es FO X Q 1 N F-k B N H LH 1 PPA R G -R XR alfa SR F grupo EVOO random Figura 58. Frecuencias de aparición de TFBS en función de su posición genómica comparando la lista de genes EVOO y la random list. 150 6 Resultados microRNAs Se predijeron 532 sitios de unión para 81 miRNAs diferentes en las regiones 3?-UTR exploradas de los 98 genes que habían mostrado variación en su expre- sión tras la ingesta de los aceites de oliva. En la lista random se identificaron 446 potenciales dianas correspondientes a 77 miRNAs. El grupo de genes cuya expresión se ve modificada por el efecto de los fenoles del aceite de oliva presen- taba un enriquecimiento de miRNAs relacionados con fenómenos de inflamación (miR-9, miR-23ab, miR-27ab, miR-223, miR-146), biología vascular (miR-146, miR-214), metabolismo de la glucosa y/o lipídico (miR-9, miR-103, miR-104), DM tipo 2 (miR-29abc) y enfermedad coronaria (miR-1, miR-221, miR-222) respecto a la frecuencia que cabría esperar por azar (q2=72.321; p=0,002). En la figura 57 están representados los miRNA que coaparecen con términos re- lacionados con enfermedad cardiovascular en la literatura y en la figura 58 los miRNAs para los que no se han encontrado dicha relación al realizar el análisis de text mining. En la figura 59 se representa la red de aquellos genes cuyas proteínas interaccionan y que pueden tener, a través de miRNAs, una regula- ción común a nivel traduccional. En dicha red se identifican cuatro factores de transcripción (FOSB, JUNB, EGR1 y ZFP36), así como 8 proteínas citosólicas, 1 mitocondrial y 12 miRNAs. 6 Resultados 151                                                                                                                                                                                                                                          ! " # "     "  $  % &        '      "  "      "       "   "  $    ( )      (   '  "  "   *  ) $   + & (        "      )   '  "  "   *      ,   '  "  "   *        "    '  "  "   *      %  ( -   '      "  "      "       "   "      % "    '  "  "   *       "      ! " # "     "       ) "   .  "        -          '  "  "   *       +    '  "  "   *       ( .  "        -       +     "            !     /   - !               ! " # "     "  0       "      + %    "            !     /   - !         ( +      ! " # "     "      ,      ! " # "     "  0   '  "  "   *  0    &   - !         1       "            ! " # "     "          '      "  "      "       "   "          '      "  "      "       "   "          '  "  "   *  Figura 59. Análisis de enriquecimiento de términos de PubMed relacionados con los miRNAs predichos y la enfermedada cardiovascular. 152 6 Resultados                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  Figura 60. MiRNAs predichos en cada lista de genes que no coaparecen con términos relacionados con enfermedad cardiovascular en la literatura. 6 Resultados 153 F ig ur a 61 .R e d d e i n t e r a c c i ó n d e p r o t e i n a s ( c u a d r a d o a z u l ) , f a c t o r e s d e t r a n s c r i p c i ó n ( t r i a n g u l o v e r d e ) y m i R N A s ( c í r c u l o r o j o ) . Discusión 7 Discusión 157 7. DiscusiónCaracterísticas de la población estudiada y de la interven-ción alimentaria. Al analizar las características basales de los participantes en el estudio en relación al polimorfismo Glu298Asp de la NOS3 no encontramos diferencias es- tadísticamente significativas, por lo que consideramos válidos los resultados para su posterior análisis sin necesidad de ajustar por factores de confusión. Se reali- zó un ajuste de los aceites consumidos como factor el orden de la intervención, sin que existieran diferencias significativas.Análisis de la respuesta de marcadores de inflamación, li-pídicos y glucídicos. No encontramos efectos significativos ni del tiempo ni de los diferentes ti- pos de aceite en cuanto a los marcadores inflamatorios. Los parámetros del metabolismo lipídico se vieron afectados por el tiempo en nuestro estudio en concordancia con su efecto biológico, alcanzando los picos postprandiales, tal y como cabía esperar para cada marcador. El metabolismo hidrocarbonado también se modificó a lo largo del tiempo alcanzando su pico postprandial a los 60 minutos aproximadamente. Este hecho nos parece de especial importancia ya que nos permite supo- ner que los cambios que apreciamos en el trabajo se deben a la diferencia de concentración en compuestos fenólicos del aceite.Análisis de la vasodilatación mediada por endotelio, de lasvariaciones en la concentración de NO(x) y eNOS y corre-laciones. Nuestros hallazgos demuestran que los pacientes con SMet que tienen ge- notipo TT para el polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983) presentan una 158 7 Discusión función endotelial postprandial menos eficiente, como se evidencia al desarro- llar una menor PORHmax, mucho más evidente cuando el aceite utilizado en la preparación del desayuno contenía baja concentración en compuestos fenó- licos. En nuestro estudio hemos constatado que existe una interacción entre el genotipo y la concentración de compuestos fenólicos del aceite, ya que una alta concentración de dichas sustancias es capaz de amortiguar el deterioro de la función endotelial que experimentan dichos pacientes. En un intento de aclarar cuáles podían ser los mecanismos biológicos subyacentes a dicha interacción, encontramos que las personas con genotipo TT tenían además, una concentra- ción menor de eNOS y una menor biodisponibilidad de NO. Es posible que este grupo de pacientes presente una respuesta vasodilatadora insuficiente cuando, en condiciones de estrés, sea necesario aumentar la producción de NO mediante el incremento de la actividad de eNOS, pues en su caso la enzima sería dis- funcionante. Sin embargo, como hemos visto, podría compensarse esa menor producción de NO con una mayor estabilidad del mismo, al existir en el medio moléculas con alta capacidad antioxidante, como es el caso de los compuestos fenólicos del aceite de oliva que usamos en nuestro estudio. El periodo postprandial se ha convertido en un activo campo de investigación en torno a la enfermedad cardiovascular. En la cultura occidental el hombre pasa la mayor parte de su tiempo en situación postprandial, estado que influye de manera directa en el riesgo cardiovascular [287]. En este periodo del día se produce una disfunción endotelial transitoria, fundamentalmente tras la ingesta de comidas con contenido graso. No obstante este fenómeno no es uniforme y puede estar condicionado por variables intrínsecas y extrínsecas, entre las que se encuentran ciertos polimorfismos genéticos y algunas actividades de la vida contidiana como el ejercicio, el consumo de tabaco o el patrón de alimentación. Nuestro grupo ha publicado previamente que la ingesta de EVOO es capaz de modular la función endotelial postprandial en pacientes hipercolesterolémicos [37]. Hay varios posibles mecanismos subyacentes a este hecho, pero parece ser 7 Discusión 159 que la biodisponibilidad del NO constitutiva es uno de los principales factores determinantes de la respuesta vasodilatadora endotelial. La biodisponibilidad del NO puede verse alterada tanto por una disminución en su producción como por su rápida degradación en un entorno celular de gran estrés oxidativo. Los efectos antioxidantes in vivo de los compuestos fenólicos son de sobra conoci- dos, tal y como hemos venido reiterando hasta ahora [37, 24, 288, 65, 289]. En concordancia con esas evidencias, recientemente se ha publicado, que la admi- nistración a ratones de una dieta rica en aceite de oliva incrementa tanto la expresión génica de eNOS en eritrocitos de ratón, como su actividad, por medio de la activación del transporte de L-arginina [290]. Además, ciertas variaciones genéticas de la NOS se han implicado en la función endotelial postprandial. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que voluntarios sanos portadores del alelo T del polimorfismo NOS3 Glu298Asp (rs1799983), a los que se les administra una comida rica en AG saturados, mues- tran una función endotelial postprandial menos eficiente comparada con los vo- luntarios homocigotos para el alelo G [291]. Otros estudios han relacionado el alelo T con un incremento en el riesgo de vasoespasmo coronario en pacientes con cardiopatía isquémica, lo que puede indicar que parte de ese riesgo aumentado esté mediado por alteraciones en la respuesta vasodilatadora fisiológica [292], en linea con nuestros resultados. Sin embargo, son pocos los trabajos relativos a la disfunción endotelial que han investigado los fenómenos biológicos, a través de los que dicho polimorfismo se relaciona con enfermedades cardiovasculares (CI, ictus e hipertensión). Nuestros datos apuntan que algunas de estas diferencias en la función endotelial podrían estar mediadas por la vía del NO, a su vez condicionada por variantes genéticas del polimorfismo NOS3 Glu298Asp. Para intentar demostrar nuestras hipótesis, realizamos determinaciones plasmáticas de eNOS y NO(x), siendo ambas concentraciones menores en el grupo de pa- cientes con genotipo TT en comparación con aquéllos que mostraban genotipos GT o GG para dicho polimorfismo. Pensamos que podría deberse a una menor concentración constitutiva de eNOS en el grupo de pacientes con el genotipo 160 7 Discusión TT, hecho que explicaría la menor biodisponibilidad de NO observada tanto en periodo de ayunas como en la fase postprandial. Se sabe que la biodisponibilidad del NO permite mantener tanto el tono basal como la respuesta vasodilatadora dependiente del endotelio, y que su alteración promueve el estrés oxidativo y un ambiente inflamatorio local [293]. En este sentido, al analizar la relación entre las concentraciones de NO(x) y la respuesta vasodilatadora endotelial (medida como PORH max), encontramos una excelente correlación tras la ingesta de aceites con alto y medio contenido en fenoles, que se perdía cuando la concen- tración de dichas sustancias era baja y los pacientes tenían genotipo TT para el polimorfismo NOS3 Glu298Asp. Por lo que consideramos como hipótesis que, en un ambiente con baja concentración de NO y escasos antioxidantes, otros mecanismos adicionales deben contribuir a la vasodilatación arterial (neuronal, AMPc, calcio o vía de las quinasas). El mecanismo exacto por el que un simple cambio en un nucleótido puede ocasionar un efecto tan importante sobre la función endotelial está comenzando a desvelarse. Se ha observado en estudios experimentales que la presencia del alelo T condiciona una menor actividad de la eNOS. Al existir T en lugar de G en la posición nucleotídica 894, el gen codifica una proteína que contiene aspartato en lugar de glutamato, lo que conduce a una mayor susceptibilidad a que un fragmento de 100 kDa sea escindido de la proteina, disminuyendo así su actividad enzimática [234]. Intentando buscar otros mecanismos adicionales, que nos ayuden a entender cómo este polimorfismo puede influir en la regulación de la actividad de la eNOS y por tanto, la producción de NO, hay que tener en cuenta el papel que juega la localización intracelular de la eNOS en las caveolas. Se ha descubierto recientemente que los portadores del alelo T tienen un menor enriquecimiento de eNOS acoplada a Cav-1, proteina principal de las caveolas endoteliales y donde se almacena la eNOS inactiva. En situación de estrés, esta enzima se disocia de Cav-1 aproximadamente un 40% menos cuando son portadores del alelo T en comparación con el genotipo GG [294]. De este modo los portadores del alelo T, no solo tendrían una menor reserva de masa 7 Discusión 161 enzimática, sino que además ocurriría una disrupción funcional en momentos determinantes de estrés. En nuestro estudio hemos combinado dos posibles factores estresantes para el endotelio de los pacientes con SMet: el estado postprandial y la isquemia transi- toria. Primero utilizamos aceite de oliva virgen con alto contenido en compuestos fenólicos, como fuente de grasa, creando así un ambiente menos proinflamatorio y prooxidante. Luego testamos esa situación con varias concentraciones de di- chos antioxidantes naturales. De acuerdo con nuestra hipótesis, los portadores del alelo T mostraron que una respuesta vasodilatadora endotelial menos eficien- te, con menor respuesta PORHmax y menores concentraciones plasmáticas de eNOS y NO(x). Pero el hallazgo más interesante ha sido comprobar la existencia una interacción gen-dieta, tanto en la PORH max como en los otros marcado- res plasmáticos de función endotelial, con menores diferencias entre genotipos cuanto mayor es la concentración de compuestos fenólicos del aceite consumido. En otras palabras, cuanto mayor concentración de compuestos fenólicos hay en el medio, más se reduce el efecto propio que confiere el ser portador del alelo T del polimorfismo NOS3 Glu298Asp. Estos resultados pueden estar mediados por el efecto antioxidante y antiinflamatorio del aceite de oliva virgen en general y de los compuestos fenólicos en particular [37, 288, 289, 65]. Es importante recalcar que nuestro trabajo ha analizado el efecto biológico del aceite de oliva tras una única comida y que además estos resultados debe- rían ser replicados en diferentes poblaciones y tras una ingesta sostenida de los diferentes aceites incluida en población no caucásica. Se sabe que las diferencias étnicas pueden ser muy relevantes cuando de estudios genéticos se trata. De hecho las frecuencias alélicas del polimorfismo Glu289Asp de la NOS3 pueden variar considerablemente entre poblaciones caucásicas, africanas y asiáticas. Los beneficios de un consumo mantenido de aceite de oliva son bien conocidos y no solo debido a su contenido en AG monoinsaturados sino también debido a su contenido en compuestos minoritarios, que como se ha venido reiterando poseen multiples efectos biologicos beneficiosos. Nuestro trabajo ha permitido conocer 162 7 Discusión un nuevo beneficio: la mejoría de la función endotelial, especialmente en una po- blación que constitutivamente tienen una respuesta vasodilatadora deteriorada, por el genotipo que portan. Este beneficio se puede alcanzar tras la toma de una dosis única de aceite de oliva con alto contenido en fenoles, un hecho importante en la práctica clínica diaria a fin de aconsejar mejor a nuestros pacientes acerca de sus hábitos de vida saludables.Análisis de la expresión génica diferencial. Nuestro trabajo demuestra que la fracción fenólica del aceite de oliva virgen es capaz de reprimir in vivo la expresión de varios genes relacionados con rutas de la inflamación en pacientes con SMet durante el periodo postprandial. Estos resultados nos parecen de especial relevancia, ya que, como comentamos al inicio, el SMet se considera un estado de inflamación crónica de bajo grado y cualquier medida que ayude a corregir esta situación, limitará tanto el desarrollo como la perpetuación de la disfunción endotelial, la placa aterosclerótica y la enfermedad cardiovascular [295, 296]. Uno de los genes cuya expresión se ve reducida tras la ingesta de aceite de oliva es PTGS2. Este gen codifica la prostaglandin-endoperóxido sintasa 2 (COX-2), una isoenzima inducible involucrada en la biosíntesis de prostaglandi- nas, que utiliza como sustrato el ácido araquidónico. En macrófagos, la actividad de la COX-2 se incrementa rápidamente en respuesta a ciertos estímulos como la citoquina proinflamatoria IL1b. Existen pruebas suficientes que indican que la sobreexpresión de PTGS2 y la síntesis de prostaglandinas influyen en el estado inflamatorio crónico [297]. De la Puerta y cols. observaron una reducción de la producción de IL1b y de la actividad de la COX-2 en macrófagos de ratón tras la ingesta de una dieta enriquecida con aceite de oliva [298]. Por otro lado, se ha comprobado que el consumo sostenido de una DMed enriquecida con aceite de oliva revierte la sobreexpresión de COX-2 que presentan los pacientes con elevado RCV [72]. Recientemente se ha señalado la capacidad del hidroxitirosol, uno de los compuestos fenólicos más importante y más biológicamente activos 7 Discusión 163 del aceite de oliva, de disminuir in vitro la expresión de PTGS2 inducida por LPS [299], probablemente mediante la reducción de la activación del factor de transcripción nuclear NFkB [300]. Nuestro estudio ha mostrado que la ingesta de aceite de oliva rico en compuestos fenólicos en humanos se ha asociado a una disminución de la expresión de ambos genes, IL1b y PTGS2, comparado con la ingesta de aceite de oliva con baja concentración de dichos compuestos. Estos efectos podrían contribuir a la disminución del estado inflamatorio postpran- dial que se atribuye a la DMed rica en aceite de oliva, en consonancia con los resultados obtenidos en otros trabajos en este sentido [42, 45, 46]. La ruta de interacción citokina-citokina contiene una red de proteínas (qui- miocinas y sus receptores) involucrada en el reclutamiento y activación de leu- cocitos durante la respuesta inflamatoria. En nuestro trabajo hemos visto que la expresión de algunos genes que codifican proteínas de dicha ruta, como CCL3, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCR4, IL1B, IL6 y OSM, es reprimida tras la in- gesta de aceite de oliva rico en compuestos fenólicos. El gen CCL3, que codifica la proteina inflamatoria 1 (MIP-1A), se ha relacionado con el fenómeno de in- filtración de monocitos en el tejido adiposo, efecto clave en el desarrollo del SMet [301]. CXCL1, CXCL2 (MIP2A) y CXCL3 (MIP2B) codifican quimioci- nas pequeñas y estructuralmente relacionadas que regulan el tráfico celular de varios tipos de leucocitos, mediante interacciones con un subgrupo de receptores acoplados a proteina G. Elgazar-Carmon y cols. han demostrado que la infil- tración precoz de neutrófilos en el tejido adiposo de ratón puede estar mediada por CXCL1, un proceso que podría preceder a la infiltración macrofágica tras el consumo a largo plazo de una dieta rica en grasas [302]. El gen IL6 codifica una citoquina con el mismo nombre, que está involucrada en una gran variedad de condiciones relacionadas con fenómenos inflamatorios, como SMet, la DM tipo 2 o la artritis reumatoide [112, 303, 304]. Por otro la- do se ha propuesto que IL6 y OSM (que codifica oncostatina M), un regulador de crecimiento y miembro del grupo de citokinas de la IL 6, pueden contri- buir al incremento del riesgo cardiovascular en pacientes obesos por medio de 164 7 Discusión sobreexpresión de PAI-1 en el tejido adiposo [305]. Además se ha encontrado sobreexpresada en lesiones arterioscleróticas, pudiendo contribuir a la progre- sión de la arteriosclerosis promoviendo la proliferación de células musculares lisas [306] y mediante la expresión de factor tisular que a su vez es activado por NF-kB [307]. La activación de las rutas del factor de transcripción NF-kB y la proteína MAPK dan lugar a una cascada de fosforilaciones que inducen a su vez, la acti- vación de otros factores de transcripción como CREB y AP-1, que actuarían en las regiones promotoras de diversos genes relacionados con la respuesta inflama- toria como IL-6 y TNFa [308]. La represión de todas las quimiocinas anteriores podría ser consecuencia de la interacción entre los compuestos fenólicos del acei- te de oliva y la via de señalización NF-kB/MAPK/AP-1. NF-kB representa una familia de factores de transcripción esenciales para la regulación de la respuesta inmune tanto innata como adaptativa, al ser activada por citoquinas inflama- torias y otros mediadores de estrés oxidativo [308, 309]. Se ha demostrado que la activación del NF-kB juega un papel importante en la disfunción endotelial en obesos [310]. Este factor también se ha relacionado con la adipogénesis y el desarrollo de resistencia insulínica que aparece en el SMet [119, 311]. El pro- ducto del gen SGK1 es una kinasa regulada por glucocorticoides, con un papel fundamental en la respuesta al estrés. Al ser una proteína diana de la cascada de señalización PI3K, su activación incrementa la actividad de NF-kB mediante la fosforilación de su kinasa inhibitoria IKKa [312]. De este modo, la disminución de la expresión del gen SGK1 por los compuestos fenólicos del aceite de oliva disminuiría la activación del NF-kB. El incremento de actividad de SGK1 desen- cadenaría funciones glucocorticiodeas sobre la presión sanguinea y la ganancia ponderal, sin que existiesen concentraciones elevadas de dichas sustancias en el plasma sanguíneo [313]. Además, el gen NFkBIA, que codifica IkBa, miembro de la familia IkB encargada de evitar la traslocación del NFkB, se reprime tras la ingesta de HPOO. Ghanim y cols. describieron un incremento de IkBa en cé- lulas mononucleares de sujetos obesos al compararlas con sujetos delgados. Este 7 Discusión 165 incremento paradójico se debe probablemente al hecho de que NF-kB se une al promotor del gen de IkBa a fin de activar su transcripción, y por este motivo su expresión estaría aumentada. IkBa es un inhibidor rápido de la actividad NF- kB. De este modo se alternarían ciclos de inducción y de unión de IkBa a NF-kB que reducirían rápidamente su actividad transcripcional y la expresión de IkBa, seguido de ciclos rápidos de inhibición y estimulación de la actividad de NF-kB a nivel transcripcional de forma concordante con la reducción de NFkBIA que se muestra en nuestros resultados [314]. La hipótesis de que la activación de NF-kB disminuye con los compuestos fenólicos del aceite de oliva se sustenta también en otros dos estudios in vivo que demostraron una reducción en la activación de NF-kB tras el consumo de aceite de oliva [45, 46]. En otros estudios in vitro se ha observado una disminución en la activación de dicho factor mediada por resveratrol, considerando como hipótesis que esta vía utilizaría un mecanismo común a este compuesto, por el cual los compuestos fenólicos reducirían la expresión de genes que codifican citoquinas inflamatorias y moléculas de adhesión [315]. Tras la ingesta de HPOO encontramos un descenso en la expresión de DUSP1 y DUSP2. Estos genes codifican serina-treonina fosfatasas encargadas de dismi- nuir tres efectores finales de la vía de las MAP kinasas: p38, MAPK/ERK y SAPK/JNK [308]. Además, TRIB1, otro de los genes reprimidos tras la inges- ta de HPOO, está involucrado en la señalización de MAPK, participando en la activación de proteinas ERK [316] sobreexpresado en placas ateroscleróticas humanas [317]. Así, la reducción en la expresión de TRIB1 por los compues- tos fenólicos del aceite de oliva podría promover el descenso de la activación de ERK. Esta observación concuerda con estudios in vitro que que demuestran que los compuestos fenólicos del té verde reprimen la expresión de PTGS2 me- diante la disminución de ERK y la activación de p38 MAPK [318]. Además, recientemente García-Rios y cols han estudiado el efecto que ejerce el polimor- fismo rs17321515 del gen TRIB1, en pacientes con hipercolesterolemia familar, encontrado que el polimorfismo modularía el efecto del tabaco sobrelos niveles 166 7 Discusión de lípidos plasmáticos y la relación entre la presencia de arco corneal y dichos niveles [319]. Nuestros resultados permiten establecer como hipótesis que los compuestos fenólicos del aceite de oliva influirían en la activación de AP-1, con- junto de heterodímeros de JUN, FOS y familias de factores de transcripción activados [320], a través de dos mecanismos diferentes. Por un lado a través de la represión de JUN, JUNB y FOSB, tal y como se ha observado tras la ingesta de HPOO y por otro lado de manera indirecta, a través de la vía de las MAPK donde la intensidad relativa y la duración de la activación determinan el tipo de respuesta. Recientement Chen y cols han descrito una red de genes con enrique- cimiento de macrófagos (MEGN) de unos 1237 genes que presentan relaciones causales con enfermedades complejas asociadas al SMet [321]. De entre estos 1237 genes, 13 de ellos están incluidos en nuestro conjunto de genes expresados de manera diferencial en PMBCs tras la ingesta aguda de HPOO: JUN, RGS1, CXCL2, ANXA3, RASGEF1B, CD83, CA2, EGR2, DIAPH3, CCL3 y TLR7, PSAP e IFIT3. De Mello y cols evaluaron en individuos con deterioro del meta- bolismo hidrocarbonado y SMet, cómo la pérdida de peso a largo plazo se asoció a un descenso de la expresión de IL1B [322]. Kaizer y cols mostraron mediante análisis de microarrays en PBMCs un conjunto de 22 genes sobreexpresados en pacientes con DM tipo 1 y 2 en comparación con un grupo de sujetos sanos [323]. 8 de esos 22 genes sobreexpresados en los pacientes con diabetes tipo 2, se reprimieron en nuestro estudio tras el consumo de HPOO (IL1B, EGR2, EGR3, PTGS2, FOSB, CXCL1, SGK y TRIB1). Además la expresión de PBEF1, otro gen involucrado en la patogénesis de la DM tipo 2 [324], se redujo tras el con- sumo de aceite de oliva rico en compuestos fenólicos. 7 Discusión 167Análisis predictivo de elementos reguladores comunes. Nuestros resultados apuntan a la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión de genes en el que uno o más factores de transcripción y/o miRNAs actuarían de manera coordinada en respuesta al contenido fenólico del aceite de oliva. Los estudios realizados hasta ahora, concernientes al mecanismo de acción de los compuestos fenólicos, muestran que sus efectos se deberían no solo a su naturaleza antioxidante sino también al efecto modulador de rutas de señalización celular o actuando por sí mismos como moléculas de señalización sobre receptores aún desconocidos [325]. En nuestro caso, las regiones regula- doras de la transcripción situadas upstream de aquellos genes cuya expresión está modulada por el contenido fenólico del aceite de oliva presentan un enri- quecimiento de sitios de unión para el factor de transcripción nuclear NF-kB. NF-kB es un eje central regulador de múltiples procesos inflamatorios crónicos [326] y su activación durante el postprandio disminuye en respuesta a la DMed enriquecida en aceite de oliva [46, 327, 41, 328, 329, 94, 330]. FOXQ1 codifica un factor de transcripción de la familia FOX [331] involucrado en la regulación transcripcional de genes relacionados con el desarrollo embrionario, el ciclo ce- lular específica de tejidos y el crecimiento tumoral [332]. Por otro lado, el gen CSF codifica un TF miembro de la superfamilia MADS (MCM1, Agamous, De- ficiens, SRF) que regula algunos genes que actuan como mediadores celulares, como FOS, que participan en el ciclo celular, apoptosis, desarrollo y diferencia- ción celular. De cualquier manera la información referente a los otros TF que obtuvimos en este estudio y sus efectos asociados al consumo de aceite de oliva rico en compuestos fenólicos es escasa. Por medio de un abordaje bioinformático, NF-kB se identificó como una dia- na potencial para miR-9. Estudios in vitro han mostrado que la sobreexpresión de miR-9 reduce NF-kB a nivel proteico [333] y de ARNm [334]. Nuestro estu- dio ha revelado que algunos de los miRNAs obtenidos están relacionados con la inflamación y con la diferenciación macrofágica. En este sentido, el hecho de que la expresión de miR-9 en monocitos se induzca por factores proinflamatorios 168 7 Discusión como LPS, agonistas TLR2 y TLR7/8 o TNFa/IL1 sugiere que el papel prin- cipal del miR-9 es el de contrarregular la respuesta inflamatoria y proliferativa desencadenada por dichos estímulos mediante la represión de NF-kB. En el pro- ceso de diferenciación de monocitos a macrófagos, se produce una diminución de miR-223, lo que conlleva un incremento concomitante de la expresión de IKKa y un descenso de la expresión de genes proinflamatorios inducidos por NF-kB [94]. MiR-223 se comportaría, de esta manera, como otro contrarregulador de la inflamación impidiendo la activación masiva de macrófagos. De hecho, la ac- tivación de la inhibición de NF-kB por SC-514 (un inhibidor de IKK2) bloquea la expresión de algunos de los miRNAs inducidos por LPS, como miR-23ab y miR-27ab [335]. Se postula que es la acción de la subunidad p65 de NF-kB, la que regula transcripcionalmente la expresión de dichos miRNAs. Se ha identificado SLC2A4 (GLUT4), un transportador de la glucosa, como otra diana de miR-223 lo que podría involucrar a esta molécula en la regulación de la captación de glucosa y el desarrollo de resistencia a la acción de la insulina [336]. Tanto miR-9, miR-103 como miR-104 se han visto involucrados en el me- tabolismo de la glucosa y de las grasas. MiR-9 regularía la secreción de insulina, al aumentar los niveles de granufilina (SYTL4) en la célula beta pancreática por medio de la expresión del factor de transcripción ONECUT2 [337]. Sin embargo, la sobreexpresión de miR-29a, miR-29b y miR-29c en modelos exprerimentales con ratones reduce la captación de glucosa mediada por insulina en los adipo- citos [338]. Por su parte, cambios en los niveles de miR-103 y miR-107 se han relacionado con la expresión de diversos genes que codifican proteínas implica- das en el metabolismo de los ácidos grasos dentro del adipocitos en respuesta a una dieta enriquecida en ácido linoleico [339]. MiR-27A alternativamente utiliza como dianas PPARG y CEBPA que inhiben la formación de adipocitos y se reprimen durante la adipogénesis [340]. Resulta interesante comprobar cómo algunos aspectos biológicos relativos a la enfermedad coronaria están modulados por algunos miRNAs cuyas potencia- les dianas encontramos en el grupo de genes diferencialmente expresados tras la 7 Discusión 169 ingesta de aceite con alto contenido fenólico. Se ha encontrado una alteración en la expresión de miR-146 y miR-214 en arterias humanas dañadas [341] mien- tras que la expresión del primero en grasa subcutánea se correlaciona de una manera positiva con las concentraciones de triglicéridos en ayunas [342]. Los niveles de expresión de miR-221 y miR-222 se asocian de forma positiva con la concentración de precursores de células endoteliales, menores en pacientes con enfermedad coronaria y que aumentan tras el tratamiento con atorvastatina [343]. Por otra parte la sobreexpresión de miR-1 parece reducir la conducción cardiaca y el automatismo mediante la represión post-transcripcional de KCNJ2 y GJA1, lo que reduce el potencial arritmogénico tras un infarto de miocardio [344]. MiR-29 por su parte, inhibe la respuesta fibrótica tras sufrir un infarto de miocardio con lo que esto supone en la recuperación funcional del que lo padece [345]. Recientemente Rantalainen y cols. han investigado las diferencias de expresión de miRNAs en tejido adiposo visceral y glúteo de sujetos con y sin SMet, encontrando diferencias significativas en el perfil fenotípico molecu- lar de miRNAs entre ambos tejidos. Al comparar los miRNAs de dicho estudio que estaban significativamente relacionados con sus correspondientes dianas de ARNm, con los miRNAs obtenidos en nuestro trabajo, observamos que había varios en común como miR-128, miR-137, miR-142, miR-144, miR-182, miR- 183, miR-217, miR-223, miR-410 ó miR-488 [346], abriendo así una posibilidad a futuros abordajes para investigar el efecto modulador que sobre dichos miR- NAs y sus dianas, podría tener la fracción fenólica del aceite de oliva en el tejido adiposo. En la red de interacción que construímos, fue incluído un grupo de miR- NAs involucrados en la biología del vaso arterial, los mecanismos inflamatorios que acompañan a su estado disfuncionante y al desarrollo de la enfermedad co- ronaria: (miR-1, miR-23ab, miR-27ab, miR-30b, miR-146, miR-214, miR-221, miR-222, miR-223) [94, 336, 339, 340, 347, 348, 343, 349, 338]. Todos los TF incluidos en dicha red, FOSB, JUNB, EGR1 y ZFP36, mostraron cambios en su expresión tras el consumo de compuestos fenólicos contenidos en el aceite 170 7 Discusión de oliva. En esta red, FOSB, JUNB y EGRF 1 tienen un papel fundamental conectando otros miRNAs y genes que codifican varias proteinas relacionadas con procesos inflamatorios Recientemente, Gomard y cols. han observado que la inducción transcripcional de NF-kB mediada por JUNB se correlaciona con la inducción de TNF-a e IL-6 [350], dos citoquinas estrechamente relacionadas con el desarrollo de SMet. Podríamos establecer, de esta manera, la hipótesis de una mecanismo por el que los compuestos fenólicos del aceite de oliva modularían, a través de miRNAS y TFs, la expresión de genes que codifican proteinas de las rutas de respuesta inflamatoria. En este sentido, Milenkovic y cols. han publicado un trabajo en los últimos meses en el que estudian el efecto de diferentes compuestos fenólicos sobre la expresión de miRNAs y ARNm en hepatocitos de ratones Apo E -/-. Observaron que aquellos genes que comparten la peculiaridad de que tanto su expresion como la expresión de ciertos miRNAs, para los que poseen elementos reguladores en sus regiones no codificantes, se ven modificadas por la acción de los compuesto fenolicos, están involucrados en cerca de 30 rutas biológicas (KEGG), entre las que destacan la ruta de las MAPK quinasas, receptor de células T, adipoquinas, insulina o señalización Wnt. Sugiriendo así dianas celu- lares que pueden regularse por la acción de los compuestos fenólicos en ambos niveles: miRNA y RNAm[351]. Nuestros resultados están basados en predicciones computacionales, que con- llevan sus tasas de falsos positivos y negativos. Durante varios años, la busqueda mediante predicciones de dianas de miRNAs y TFBSs en las regiones 3UTR se ha considerado bastante problemática [352]. Sin embargo existen estrategias en- caminadas a minimizar estas tasas de falsos positivos a través del uso de análisis filogenético en paralelo para identificar las regiones con mayor preservación evo- lutiva y el análisis conformacional y energético de las estructuras miRNA-ARNm [353]. En el análisis que llevamos a cabo, limitamos el número de predicciones iniciales estableciendo un filtro que incrementara el número de verdaderos po- sitivos en la selección final de resultados, de ambas clases de predicciones. Esta 7 Discusión 171 estrategia conservadora y el hecho de que el listado de genes fue obtenido de un estudio de intervención alimentaria con un diseño controlado y aleatorizado, nos hacen confiar en la validez de nuestros resultados. No obstante estos resultados no dejan de ser preliminares hasta que un diseño experimental de interacción de proteinas (basado en un sistema de doble híbrido por ejemplo) o comprobando la acción del mRNA después de una transfección de dicho miRNA, pongan a prueba nuestras hipótesis. Conclusiones 8 Conclusiones 175 8. ConclusionesConclusión principal La mejoría en la función endotelial que experimentarían los pacientes con SMet al consumir aceite de oliva virgen estaría modulada por la interacción exis- tente entre la concentración en compuestos fenólicos y polimorfismo Glu298Asp NOS3 (rs1799983).Conclusiones secundarias 1. Las concentraciones de eNOS y de NO(x), cuya variabilidad determina di- ferencias en la respuesta vasodilatadora mediada por el endotelio durante el periodo postprandial, dependen tanto de la composición en compues- tos fenólicos del aceite de oliva como del genotipo de NOS3 Glu298Asp (rs1799983), de tal modo que aquellos pacientes con genotipo TT serían los que más se beneficiarían del consumo de aceite de oliva con alto contenido en dichas sustancias. 2. Gran parte de los efectos beneficiosos observados tras ingerir de aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos estaría mediado por modificaciones en la expresión de diversos genes relacionados con rutas metabólicas implicadas en el desarrollo de fenómenos inflamatorios o de la regulación del ciclo celular como son la ruta de NFkB/AP-1, la interacción de citoquinas y sus receptores, el metabolismo del ácido araquidónico o la cascada de MAP quinasas. 3. Es probable que exista un complejo sistema regulador de los cambios en la expresión génica tras la ingesta de aceite de oliva en el que participen factores de transcripción y miRNAs, aunque creemos necesario diseñar futuros experimentos tanto en cultivos celulares como en modelos de ex- perimentación animal que permitan poner a prueba dicha hipótesis. 4. Nuestros resultados proporcionan una base molecular que podría ayudar a 176 8 Conclusiones entender el reducido riesgo de enfermedad cardiovascular observado en el área Mediterránea, donde el aceite de oliva representa la principal fuente de grasa de la dieta. Estos hallazgos refuerzan la relación existente entre la alimentación y el síndrome metabólico, aportando nuevas evidencias del efecto beneficioso que el consumo de aceite de oliva virgen en el marco de un estilo de vida saludable puede tener. 9. Nomenclatura Nomenclatura 8-OHdG 8 hidroxideoxiguanosina 8OHGua 8 hidroxiguanina ABC Área bajo la curva Ach Acetilcolina ADA American Diabetes Association ADN Ácido desoxirribonucleico AGM Ácidos grasos monoinsaturados AGP Ácidos grasospoliinsaturados AHA American Heart Association APO A-1 Apolipoproteína A-I APO B Apolipoproteína B ARN Ácido ribonucléico ATP Adult Treatment Panel CAT Catalasa Cav-1 Caveolina 1 CGRP Péptido relacionado con el gen de la calcitonina 180 9 Nomenclatura CHO Hidratos de carbono CI Cardiopatia isquemica CNV Variaciones en el número de copias COX Ciclooxigenasa CT Colesterol total DHPE 2-(3,4-di-hidroxifenil)-etanol DM tipo 2 Diabetes mellitus tipo 2 DMed Dieta Mediterránea EFSA European Food Safety Authority ELISA Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay eNOS Oxido nítrico sintasa endotelial ERNs Especies radicales reactivas de nitrógeno EROs Especies radicales reactivas de oxígeno EVOO Extra virgin olive oil: aceite de oliva virgen F2IP F2-isoprostanos FMD Dilatación mediada por flujo FVII Factor VII de la coagulación GO Gene Ontology GPx Glutation peroxidasa GR Glutation reductasa GTN Gliceril trinitrato GWAS Genome-Wide Association Studies 9 Nomenclatura 181 H2O2 Peróxido de hidrógeno HDLc Colesterol vehiculizado en lipoprotei?nas de alta densidad HMG-CoA reductasa Hidroximetilglutarilcoenzima A reductasa HOMA Homeostasis Model Assessment HPLC Cromatografia liquida de alta resolución HPOO Aceite de oliva con alto contenido en compuestos fenólicos HT Hidroxitirosol HUVECs Células endoteliales procedentes de vena umbilical huma- na IAS International Atherosclerosis Society IASO International Association for the Study of Obesity ICAM-1 Molecula de adhesión intercelular IDF International Diabetes Federation IL-6 Interleucina 6 IMC Índice de masa corporal JNK JUN kinasa KEGG Kyoto Enciclopedia of Genes and Genome LDF Flujometría Laser Doppler LDL-c Colesterol vehiculizado en lipoproteínas de baja densidad LDLox LDL oxidada Lowess Locally weighted linear regression LPO Lipoperóxidos 182 9 Nomenclatura LPOO Aceite de oliva con bajo contenido en compuestos fenóli- cos LPS Lipopolisacáridos LTB4 Leucotrieno B4 MCP-1 Proteina quimiotáctica de monocitos tipo 1 miRNAs Micro ARN MMP-9 Metalopeptidasa de matriz 9 MPOO Aceite de oliva con medio contenido en compuestos fenó- licos NCEP National Cholesterol Education Program NEFAs Ácidos grasos libres no esterificados NHLBI National Heart, Lung and Blood Institute NO Oxido nítrico NOO· Peroxinitritos PAI-1 Inhibidor del activador tisular del plasminógeno PAT Tonometría arterial periférica PBMCs Células mononucleares de sangre periférica PCR Proteína C reactiva PCR Reacción en cadena de la polimerasa PLIN Gen que codifica perilipina PON Paraoxonasa PORH Hiperemia reactiva postisquemia 9 Nomenclatura 183 PWA Análisis de la onda de pulso RCV Riesgo cardiovascular RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real SNP Polimorfismo de nucleótido unico SOD Superóxido dismutasa T Tirosol t-PA Activador tisular del plasminógeno TF Factor tisular TG Triglicéridos TNFa Factor de necrosis tumoral alfa TXA2 Tromboxano A2 TXB2 Tromboxano B2 VCAM-1 Molécula de adhesión celular vascular VOP Pletismografía de oclusión venosa WHF World Heart Federation 10 Bibliografía 185 10. 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Fernandez, Antonio Camargo, Fernando Lo?pez-Segura, Javier Caballero Villarraso, Francisco Fuentes-Jime?nez, Jose Lo?pez-Miranda, and Francisco Pe?rez-Jime?nez Lipids and Atherosclerosis Unit (A.I.J.-M., J.R., J.D.-L., J.M.F., A.C., F.L.-S., F.F.-J., J.L.-M., F.P.-J.), Instituto Maimo?nides de Investigacio?n Biome?dica de Co?rdoba/Reina Sofia University Hospital/University of Cordoba, and Centro de Investigacio?n Biome?dica en Red Fisiopatología de la Obesidad y Nutricio?n, Instituto de Salud Carlos III, and Biochemical Laboratory (J.C.V.), Reina Sofia University Hospital, 14004 Cordoba, Spain Background: Glu298Asp polymorphism of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene (NOS3) has been characterized as a risk factor of hypertension and coronary artery disease. Previous studies suggest that the higher risk observed in T allele carriers is due to endothelial dysfunction associated with a lower eNOS activity and that acute consumption of phenol-rich olive oil ame- liorates postprandial endothelial dysfunction by reducing oxidative stress and increasing nitric oxide bioavailability. Nevertheless, how these facts may interact in a population with altered endothelial function such as metabolic syndrome patients remains unknown. Objective: The objective of the study was to evaluate whether the presence of NOS3 Glu298Asp polymorphism interacts with the phenol content of virgin olive oil (VOO) to influence postprandial endothelial function. Design: Fifty-seven subjects with metabolic syndrome received three breakfasts based on VOO with different phenolic content. Baseline, incremental area under the curve, peak, and maximum pa- rameters of postocclusive skin reactive hyperemia (PORH) were evaluated by laser Doppler, and the nitrate/nitrite [NO(x)] and eNOS concentrations were obtained during fasting and postprandially. Results:A gene-diet interaction was found on maximum PORH and NO(x) (P! 0.039 and P! 0.043, respectively). TT subjects showed lower values of eNOS, NO(x), and maximum PORH as compared with GG and GT subjects, especially in the postprandial measurements (allP" 0.05). However, most of these differences were attenuated when high-phenol VOO was consumed. Conclusion: In a population with a compromised endothelial function, concentrations of phenols in dietary VOO interact with NOS3 Glu298Asp to ameliorate the endothelial dysfunction associated to the TT genotype. (J Clin Endocrinol Metab 96: E1694?E1702, 2011) Endothelial dysfunction is an early event in the devel-opmentof atherosclerosis anda subclinical condition found in most patients with hypercholesterolemia, hyper- tension, type 2 diabetes mellitus, metabolic syndrome (MetS; as a cluster of conditions that predispose patients to cardiovascular disease and diabetes), and coronary ar- ISSN Print 0021-972X ISSN Online 1945-7197 Printed in U.S.A. Copyright © 2011 by The Endocrine Society doi: 10.1210/jc.2011-1056 Received March 22, 2011. Accepted July 8, 2011. First Published Online August 3, 2011 * A.I.J.-M. and J.R. contributed equally to this work. Abbreviations:AUC,Areaunderthecurve;CAD,coronaryarterydisease;eNOS,endothelialNO synthase; HDLc, high-density lipoprotein cholesterol; MetS, metabolic syndrome; n-3 FA, n-3 fatty acid; NO, nitric oxide; NO(x), nitrate/nitrite; PORH, postocclusive skin reactive hyperemia; PORHmax, PORHpeak referred to baseline value; PORHpeak,maximum value achieved after 4 min of flow occlusion; t0, capillary flow measured for 1 min; Tchol, total cholesterol; td, flow recorded for 1 min after cuff was deflated; TG, triglyceride. J C E M O N L I N E A d v a n c e s i n G e n e t i c s ? E n d o c r i n e R e s e a r c h E1694 jcem.endojournals.org J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 tery disease (CAD) (1, 2). The main biological feature of endothelial dysfunction is an impaired nitric oxide (NO) bioavailability as a consequence of either a reduced pro- duction by endothelial nitric oxide synthase (eNOS) or, more frequently, of its increased breakdown by inflam- matory molecules and reactive oxygen species (3). eNOS, encoded by theNOS3 gene, is a dually acylated peripheral membrane protein that, targeted to the Golgi region and caveolae of endothelial cells, catalyzes the generation of NO (4). Some studies have focused on the role of genetic vari- ants in theNOS3 gene on cardiovascular risk factors (5, 6) and the development of coronary artery disease (7, 8).One of the most studied polymorphisms to date is NOS3 Glu298Asp (rs1799983), which has been reported as an independent risk factor for CAD (8?10), myocardial in- farction (11), hypertension (12), MetS (6, 13, 14), and type 2 diabetes mellitus (15). Furthermore, this gene vari- ant is related to a significant increase in reintervention and recurrent symptoms after coronary artery bypass grafting (11), to accelerated carotid atherosclerosis (16), and in- creased blood pressure responses to !1-adrenoceptor ac- tivation (17). Although it is well known that endothelial function can be modulated by nutrients, studies of the effect of inter- action betweenNOS3Glu298Asppolymorphismand diet on endothelial function are scarce, mainly exploring the effect of fatty acids and foods with antioxidant capacity (18). In a descriptive study, Leeson et al. (19) analyzed the effect of the presence of NOS3 Glu298Asp polymorphism onplasman-3 fatty acid (n-3FA) concentrations andflow- mediated brachial artery dilatation. Vascular function was positively related to plasma n-3 FA concentration in T allele carriers but not in G homozygotes (19). Interest- ingly, Ferguson et al. (20) showed from the LIPGENE dietary intervention study how in T allele carriers with MetS plasma triacylglycerol concentrations were consid- erably more responsive to changes after an n-3 FA-sup- plemented diet than G allele homozygotes. [Lipgene (?Diet, genomics, and the metabolic syndrome: an inte- grated nutrition, agro-food, social, and economic analy- sis?) was a European Union Sixth Framework Integrated Program conducted by 25 research centers across Europe] (20). Recently Delgado-Lista et al. (21) observed that healthy T allele carriers of the NOS3 Glu298Asp poly- morphism have an impaired postprandial reactive hyper- emia response after a saturated fatty meal. Phenolic compounds are soluble minor components of virgin olive oil whose concentration in olive oil depends on some factors such as the cultivar, climate, ripeness of the olives at harvesting, etc. In vitro and ex vivo models have shown different properties like antioxidant, DNA oxida- tion prevention, endothelial dysfunction prevention by quenching free radicals, inhibition of platelet aggregation, and antiinflammatory activity (22). Some of these prop- erties as antioxidant, antithrombotic, and capacity of im- prove endothelial function are reproduced in human as well and revised elsewhere (23, 24). As our group has previously shown, the beneficial effect of a breakfast based in high phenol virgin olive oil on postocclusive skin reactive hyperemia (PORH) by increasing NO bioavail- ability during the postprandial period in a hypercholes- terolemic population (25), the main purpose of this study was to investigate whether there is any interaction be- tween this vascular response and the presence of theNOS3 Glu298Asp polymorphism variants in a MetS population. Subjects and Methods Subjects and design Fifty-seven subjects (22 men, 35 women) from the Lipids and Atherosclerosis Unit at Hospital Universitario Reina Sofía (Co?r- doba, Spain) participated in this study. All subjects fulfilled three or more of the criteria proposed by the Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on De- tection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults Panel III for MetS: 1) central obesity (waist circumference !102 cm in men or!88 cm in women); 2) high blood pressure of 130/85 mm Hg or greater or documented use of antihyper- tensive therapy; 3) high fasting glucose ("100 mg/dl"1); 4) hy- pertriglyceridemia ("150 mg/dl"1), and 5) low high-density li- poprotein cholesterol (HDLc) (#40 mg/dl"1 for males or 50 mg/dl"1 for females) (26). None of the participants showed ev- idence of chronic disease such as hepatic, renal, thyroid, or car- diac; high alcohol consumption; or a family history of early- onset cardiovascular disease nor were taking drugs. None of them were active smokers. Baseline characteristics of all subjects are described in Table 1. All subjects gave written informed con- sent to participate, which was previously approved by the Re- view Committee at the Reina Sofía University Hospital in ac- cordance with the Helsinki Declaration. Participants followed a 6-wk washout period in which they were instructed to avoid consuming soy supplements, vitamins, or drugs. During this period and through the end of the study, all subjects followed a low-fat, carbohydrate-rich diet based on 20 different menus whose adherence was assessed after 2 and 4 wk usinga3-drecordandafoodfrequencyquestionnaire. In the24h before the study intervention, participants were instructed to avoid consuming phenol-rich foods such as fruit or juices, wine, grapes, chocolate, coffee, tea, olive oil, or soy supplements and to refrain from intense physical exercise. After a 12-h fasting period and following a randomized sequential crossover design with a 1-wk washout period, subjects received in the hospital three fat meals (breakfast in this case) consisting of 60 g of white bread, 40 ml of virgin olive oil with three different amount of phenolic content each day (398, 149, and 70 ppm), and 60,000 IU of vitamin A per square meter of body surface. Throughout the 4-h duration of each intervention day, they performed no physical activity nor consumed anything but water ad libitum. J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 jcem.endojournals.org E1695 Sample collection Blood samples were drawn after an overnight (12 h) fast, before the breakfast, and120and240min after its consumption. Samples from the fasting and postprandial states were collected in tubes containing 1 g EDTA per liter or 3.8% citrate and were stored in containers with ice and kept in the dark. Plasma was separated from whole blood by low-speed centrifugation at 1500 $ g for 15 min at 4 C within 1 h of extraction. Endothelial function Laser-Doppler linear Periflux 5000 (Perimed AB; Ja?rfa?lla, Stockholm, Sweden) was used to measurePORH. Laser Doppler uses the Doppler shift principle in which laser light is scattered by moving blood cells to produce a shift on the reflected light, which is detected by a photodetector and processed to determine the amount of the frequency shift. The resulting signal is the product of the number of blood cells moving and the mean velocity of them in a sample, usually expressed in arbitrary units of flux. With the patient lying in the supine position in a roomwith stable temperature (20?22C), the blood pressure cuff (HG Erkameter 300; Erka, Bad Tolz, Germany) was placed5 cmabove the elbow while the laser probe was attached to the palmar surface of the second finger of the same dominant hand. After a 5-min rest- ing period, basal capillary flow was measured for 1 min (t0). Thereafter, 4-min distal ischemia was induced by inflating the cuff to suprasystolic pressure (200?220mmHg). The cuff was then deflated and, after 30 sec, the flowwas recorded for 1min (td). The data obtained were recorded and stored using the software PeriSoft forWindows 2.5 (PerimedAB; Ja?rfa?lla). The values of the area under the curve (AUC) of the t0 and td times were analyzed. These data were used to calculate the increase in postischemic flow by means of this formula: incremental area under the curve% [(AUCtd"AUCt0)$ 100/AUCt0]. The values of skin flux at baseline (baseline) and the maximum value achieved after 4 min of flow occlusion (PORHpeak) were also analyzed. PORHmax was defined as PORHpeak referred to baseline value and was calculated: PORHmax % [(PORHpeak) " baseline skin flux]. These measurements were carried out three times: before and 120 and 240min after the consumption of every breakfast. Analytical methods Lipid parameters were measured with a modular autoana- lyzer DDPPII Hitachi (Roche, Basel, Switzerland) using spe- cific reagents (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Determinations of total cholesterol (Tchol) and triglyceride (TG) levels were made by colorimetric enzymatic methods (27, 28);HDLcby colorimetric assay after precipitating the lipoproteins containing apolipoprotein B with polyethylene- glycol (29); low-density lipoprotein cholesterol by the Friede- wald formula based on Tchol, TG, and HDLc values (30). Apolipoprotein A1 and apolipoprotein B levels were mea- sured by inmunoturbidimetry (31). Plasma glucose concentra- tions were measured with a Hitachi 917 analyzer (Roche Mo- lecular Biochemicals) by the glucose oxidase method. Plasma insulin concentrations were measured by microparticle en- zyme immunoassay (Abbott Diagnostics, Matsudo-shi, Japan). Plasma NO concentration was estimated by measuring nitrate and nitrite [NO(x)] levels as a marker of NO bioavailability by colorimetric method using a nitrate/nitrite colorimetric assay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). eNOS plasma concentra- tion was determined by a colorimetric assay kit (Calbiochem, La Jolla, CA). Blood draws were performed after an overnight (12 h) fast, before the breakfast, and120and240min after its consumption. NOS3 Glu298Asp polymorphism genotypes Genomic DNA was extracted from peripheral blood mono- nuclear cells using a Quiamp DNA blood mini kit (QIAGEN Iberia, Madrid, Spain). Genotype for the NOS3 Glu298Asp polymorphism was determined by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis using specific oligonucleotide primers (forward, 5&-CCC TGT CCT GCT CCC T-3& and re- verse, 5&-CTC AAA CGC TAC AGG G-3&). PCR products were digested by MobI and were separated by a 2.5% agarose gel. The resulting 206-bp PCR product was cleaved into two smaller fragments of 119 and 87 bp in the presence of a T nucleotide at 894 (corresponding to Asp 298) but not in its absence. The fragments were visualized after ethidium bro- mide staining under UV light. Statistical analysis The normality of data was assessed using the Shaphiro- Wilk test, and log transformation of datawas performedwhen those variables were not normally distributed. In genotype TABLE 1. Baseline characteristics of the study participants according to NOS3 Glu298Asp T allelic distribution GG GT/TT P value Gender (men/women) 08/13 14/22 0.085 Age (yr) 54 ' 8 57 ' 9 0.23 Weight (kg) 101.8 ' 19.8 97.3 ' 11.1 0.28 Height (cm) 159 ' 9 160 ' 8 0.83 BMI (mass (kg)/(height (m))2) 39.7 ' 4.8 38.1 ' 4.2 0.18 Waist circumference (cm) 116 ' 11 113 ' 10 0.12 Hip circumference (cm) 127 ' 14 127 ' 11 0.31 SBP (mm Hg) 149 ' 20 144 ' 20 0.44 DBP (mm Hg) 93 ' 12 88 ' 11 0.13 MBP (mm Hg) 112 ' 14 107 ' 11 0.17 Glucose (mg/dl) 105 ' 19 104 ' 22 0.93 Insulin (mU/liter) 13.4 ' 8.4 12.3 ' 9.9 0.49 Tchol (mg/dl) 211 ' 37 199 ' 25 0.11 LDLc (mg/dl) 127 ' 33 119 ' 23 0.26 HDLc (mg/dl) 53 ' 12 48 ' 13 0.16 TG (mg/dl) 145 ' 49 174 ' 96 0.19 APOA1 (mg/dl) 148 ' 21 136 ' 24 0.98 APOB (mg/dl) 99 ' 24 98 ' 17 0.56 Lp(a) (mg/dl) 52 ' 45 33 ' 34 0.78 CRP (mg/liter) 3.5 ' 4.3 2.5 ' 2.9 0.28 Values are presented as mean ' SD. P values are from one-way ANOVA analysis testing differences between genotype groups. Gender differences were tested with #2 test. BMI, Body mass index; SBP, systolic blood pressure; DBP, diastolic blood pressure; MBP, mean blood pressure; LDLc, low-density lipoprotein-cholesterol; APO, apolipoprotein; Lp(a), lipoprotein a; CRP, C-reactive protein. E1696 Jime?nez-Morales et al. Glu298Asp Olive Oil and Endothelium J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 analysis, the Hardy Weinberg equilibrium was tested using a robust #2-based test. We performed two-factor ANOVA for repeated measures with Tukey post hoc analysis. In this anal- ysis we studied the statistical effects of the type of the olive oil ingested independent of genotype, the effect of genotype, and the interaction of both factors, indicative of the degree of the postprandial response in each subjects with each breakfast by genotype and the effect of the genotype in NO(x) and eNOS concentrations. For correlation analysis Pearson?s test was used. All data presented in the text and tables are expressed as mean' SD unless otherwise specified. A value of P# 0.05 was considered statistically significant. All statistical tests were performed using R programming and statistical environment software (General Public License). Results Baseline characteristics of study participants The age of participants ranged from 36 to 70 yr (mean 56 yr). The subjects had a mean body mass index [mass (kilograms)/[height (meters)]2] of 38.7 ' 4.4 kg/m2 (27.9?49.4 kg/m2). The general characteristics of the sub- jects, according to the NOS3 Glu298Asp genotype sub- groups, are described in Table 1. There were no baseline characteristic differences between both groups. Genotype analysis Allelic frequencies (G % 0.560; T % 0.440) and geno- typic frequencies (GG% 0.335; GT% 0.45; TT% 0.215) for NOS3 Glu298Asp were in line with the reference data for Caucasian populations in HapMap and PERLEGEN. These distributions were in the Hardy-Weinberg equilib- rium (#2 % 0.196, P % 0.657, D % 0.826). Doppler, genotype, and olive oil There were no significant differences according to geno- type for incremental area under the curve values (Table 2). For the rest of the laser-Doppler parameters, the effect of olive oil on the endothelial function by NOS3 Glu298Asp genotypes is shown in Table 2 and Fig. 1. The grade of olive oil influenced the PORHpeak response (P % 0.026). In the post hoc analysis, the PORHpeak after the intake of olive oil with high ormediumphenolic contentwas higher than after low-phenol olive oil (data not shown). In the other variable measured,PORHmax,wefoundagene-diet interaction(P% 0.039). The postprandial vascular responsewas lower inTT subjects comparedwith thosewith the TGorGG genotypes after intake of olive oil with low and medium phenol con- centration but notwhen phenol-rich olive oil was consumed (P% 0.002) (Fig. 1). eNOS/NO(X) concentrations, genotype, and olive oil Homozygous subjects for the T allele had significantly lowerbasal plasmaconcentrationsof eNOS(P%0.032) and NO(x) (P%0.039)comparedwithGGandGTsubjects (Figs. 2 and 3). A marked reduction in NO(x) was observed in ho- mozygous subjects for the T allele after the intake of low- phenol olive oil but not when olive oil with medium or high content in phenolic compoundswas consumed (P% 0.015). Correlation between PORHmax and NO(x) A positive correlation between NO(x) concentration andPORHmaxwas found after the intake of olive oil with high (r% 0.379; P% 0.001) and medium (r% 0.378; P% TABLE 2. Postprandial changes PORH evaluated by laser Doppler flowmetry after the acute intake of virgin olive oil with high (398 ppm), medium (189 ppm), or low (70 ppm) concentrations of phenolic compounds at time points 0, 120, and 240 min Genotype Log(PORHpeak) Time (min) Log(PORHiAUC) Time (min) 0 120 240 0 120 240 HPOO GG 5.35 ' 1.10 5.24 ' 1.15 6.23 ' 1.20 3.29 ' 0.39 3.18 ' 0.21 3.18 ' 0.35 GT 5.86 ' 1.08 5.43 ' 1.10 5.24 ' 1.16 3.46 ' 0.55 3.20 ' 0.49 3.14 ' 0.53 TT 5.70 ' 1.14 5.23 ' 1.11 5.23 ' 1.26 2.96 ' 0.47 2.91 ' 0.55 3.06 ' 0.48 MPOO GG 5.58 ' 1.10 5.21 ' 1.13 5.21 ' 1.11 3.32 ' 0.65 3.83 ' 0.53 3.10 ' 0.44 GT 5.62 ' 1.13 5.39 ' 1.16 5.13 ' 1.15 3.32 ' 0.41 3.19 ' 0.49 3.22 ' 0.56 TT 5.62 ' 1.10 5.06 ' 1.11 5.03 ' 1.16 2.98 ' 0.74 3.12 ' 0.45 3.25 ' 0.60 LPOO GG 5.46 ' 1.12 5.06 ' 1.15 5.06 ' 1.09 3.18 ' 0.5 3.23 ' 0.41 3.02 ' 0.61 GT 5.62 ' 1.11 5.13 ' 1.16 4.96 ' 1.18 3.28 ' 0.48 3.16 ' 0.59 3.25 ' 0.56 TT 5.61 ' 1.20 4.82 ' 1.25 4.79 ' 1.09 2.95 ' 0.18 2.87 ' 0.35 2.23 ' 0.45 p1 % 0.026 p1 % 0.004 p2 % 0.073 p2 % 0.002 p3 % 0.878 p3 % 0.051 Values are presented as mean ' SD. Two-way ANOVA analysis for repeated measures was used: p1, olive oil effect; p2, genotype effect; p3, olive oil*genotype effect. iAUC, Incremental AUC; HPOO, high phenol olive oil; MPOO, medium phenol olive oil; LPOO, low phenol olive oil. J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 jcem.endojournals.org E1697 FIG. 2. Evaluation of the influence of NOS3 Glu298Asp genotypes on postprandial plasma eNOS concentration after the intake of olive oil with different contents of phenolic compounds at time points 0, 120, and 240 min. A, High phenol olive oil. B, Medium phenol olive oil. C, Low phenol olive oil. HPOO, High phenol olive oil; MPOO, medium phenol olive oil; LPOO, low phenol olive oil. Two-way ANOVA analysis for repeated measures was used: olive oil effect: P % 0.932; genotype effect: P % 0.032; olive oil*genotype effect: P % 0.242. Tukey post hoc analysis by genotype: *, P # 0.05; **, P # 0.001. FIG. 1. Evaluation of the influence of NOS3 Glu298Asp genotypes PORHmax after the intake of olive oil with different content of phenolic compounds at time points 0, 120, and 240 min. A, High phenol olive oil. B, Medium phenol olive oil. C, Low phenol olive oil. HPOO, High phenol olive oil; MPOO, medium phenol olive oil; LPOO, low phenol olive oil. Two-way ANOVA analysis for repeated measures was used: olive oil effect: P% 0.414; genotype effect: P% 0.002; olive oil*genotype effect: P% 0.039. Tukey post hoc analysis by genotype: *, P# 0.05. E1698 Jime?nez-Morales et al. Glu298Asp Olive Oil and Endothelium J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 0.0001) content in phenolic compounds but not when low-phenol olive oil was consumed (r % 0.060, P % 0.587). When an analysis was carried out for the NOS3 Glu298Asp genotype, a positive correlation between NO(X) concentration and PORHmaxwas observed in G al- lele carriers (GG: r%0.778;P#0.0001;TG: r%0.318;P% 0.0001) but not in subjectswith theTTgenotype (r%0.170; P% 0.128). Figures are given as supplemental material. Discussion Our findings demonstrate that patients with MetS who have the TT genotype for NOS3 Glu298Asp polymor- phism display a less efficient postprandial endothelial function, as evidenced by a lower PORHmax. Interest- ingly, this loss of function is more evident when the olive oil used in preparing the meal is low in phenolic content, showing an interaction between genotype and the concen- tration in phenolic compounds of the olive oil consumed. Looking for underlying mechanisms, we found that these subjects have a lower eNOS concentration and NO bio- availability. This group of patients could have an insuffi- cient response when, in stress conditions, an increase of activity is required of a dysfunctional eNOS, unless mol- ecules with a high antioxidant capacity, such as those pro- vided by meals rich in high-phenol virgin olive oil, are present. The postprandial state is an active field of research in cardiovascular disease due to the evidence indicating that it influences cardiovascular risk (32). During this period, there is a transient endothelial dysfunction, mainly after fatty meals. However, this phenomenon is not uniform and may be regulated by extrinsic and intrinsic variables. Wepreviously published that the intakeof a virgin olive oil with a high content of phenolic compounds modulates the postprandial endothelial function in hypercholester- olemic patients (25). There are several possible mecha- nisms underlying this fact, but the main route seems to be the NO pathway. For this, there is a lot of evidence about the antioxidant in vivo effects of phenols (25, 33?36). In line with this evidence, it has been recently published that giving mice a diet rich in olive oil increases the activity of NOS, as well as its genetic expression, via an activation of L-arginine transport (37). In addition, NO synthase gene variations have been implicated in postprandial endothe- lial function. We have recently shown that healthy male T carriers for the NOS3 Glu298Asp who are submitted to a saturated fatty acid-rich meal have a less efficient post- prandial endothelial function compared with GG ho- mozygous (21). Interestingly, some studies have linked the T allele with an increased risk of coronary vasospasm in patients with CAD, which can indicate that part of its augmented risk may be due to alterations in normal vessel vasodilatation (38, 39), which agrees with our results. Nevertheless, few FIG. 3. Evaluation of the influence of NOS3 Glu298Asp genotypes on postprandial plasma NO(x) concentration after the intake of olive oil with different content of phenolic compounds at time points 0, 120, and 240 min. A, High phenol olive oil. B, Medium phenol olive oil. C, Low phenol olive oil. HPOO, High phenol olive oil; MPOO, medium phenol olive oil; LPOO, low phenol olive oil. Two-way ANOVA analysis for repeated measures was used: olive oil effect: P% 0.015; genotype effect: P% 0.039; olive oil*genotype effect: P% 0.042. Tukey post hoc analysis by genotype: **, P# 0.001. J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 jcem.endojournals.org E1699 studies have focused on the endothelial function when looking the underlying biological processes that link this polymorphism to cardiovascular disease (CAD, stroke, hypertension, etc.). Our data suggest that the NO pathway may mediate differences in the endothelial function due to NOS3 Glu298Asp genotypes. To show this, we determined the eNOS plasma concentration andNO(x), and these param- eters were lower among the TT genotype of the NOS3 Glu298Asp polymorphism compared with GT and GG subjects. We suggest that a lower constitutive concentra- tionofeNOS in the groupof patients with theTTgenotype could be the cause of the lower bioavailability of NO dur- ing the fasting and postprandial states. It is known that NO bioavailability is crucial for the maintenance of basal tone and endothelium-dependent vasodilatory response, and its alteration leads to oxidative stress and local in- flammatory environment (40). A lack of positive correla- tion between PORHmax and NO(x) concentration was observed in TT subjects after intake of olive oil with low phenolic content. In a deleterious environment, with a lower NO concentration, some other additional mecha- nisms of vasodilatation (neuronal, cAMP, calcium, or the kinases pathway) probably contribute to PORH. How a single nucleotide change can perform such an important effect on the endothelial function is still to be discovered, but it has been shown in experimental studies that the presence of the T allele is correlated with lower eNOS activity. When a T is present instead of a G at nu- cleotide position 894, the NOS3 gene encodes a protein product containing aspartate, instead of glutamate, which leads to a higher susceptibility to cleavage into a 100-kDa fragment, thus decreasingeNOS activity (41). Looking for additional hypothesis to help us to understand how this single-nucleotide polymorphism could influence the NO pathway, it has recently been discovered that the T allele carriers have less eNOS associated with caveolin-1, the main protein in endothelial caveolae, and the main storage of inactive NOS3 in a static condition and a functional disruption after acute stress, leading to a dysfunctional enzyme (42). In our model, we combined two potential endothelial stress factors for MetS patients: the postprandial state and transient ischemia. First, we used virgin olive oil, high in phenolic compounds, as the source of fat, thus creating a less proinflammatory and prooxidant environment, and second, we tested this situation after several concentra- tions of those natural antioxidants. According to our hy- pothesis, the T carriers showed a less efficient endothelial function via NO pathway activation, as evidenced by a lower PORHmax parameter and lower NO(X) and eNOS plasma concentrations. But, more interestingly, there was a gene-diet interaction, both in PORHmax parameters and plasma surrogate markers, with lower differences be- tween genotypes when increasing concentrations of phe- nols. In other words, a higher concentration of phenols seemed to reduce, at least in part, the deleterious effect of the T allele carrier?s condition. These results may be me- diated by the antioxidant and antiinflammatory effects of virgin olive oil in general and phenols in particular (25, 33, 35, 36). It has to be underlined that we have analyzed the bio- logical effect of olive oil after only one isolated meal, and these results have to be replicated in different populations and after a long-term consumption of virgin olive oils, including a non-Caucasian population. As is well known, ethnic differences can be of considerable relevance in genetic studies. In fact, the allelic frequencies of the Glu289AsppolymorphismvaryconsiderablyamongCau- casian, African, and Asiatic groups, so it certainly would not be right to generalize our results to those populations. The benefits of sustained olive oil consumption are known worldwide and not only due to its monounsatu- rated fatty acids but also to its minor components as phe- nolic compounds. After this studywe knowonemore ben- efit of this nutrient: improving the endothelial function, especially in a population who constitutively has a worse vasodilatory response. This benefit is achieved after a sin- gle dose of olive oil with high phenolic content, an impor- tant fact in the diary clinical practice to give advice to our patients. Summarizing, we describe for the first time a gene-diet interaction between virgin olive oil with high concentra- tion of phenolic compounds and the Glu298Asp polymor- phism of the eNOS, one of the most relevant enzymes involved in endothelial function regulation. The patients with the TT genotype display a lower vascular response compared with the TG and GG genotypes, and this re- sponse is ameliorated after intake of phenol rich EVOO. Acknowledgments Wethank the patientswho participated in this study. The Centro de Investigacio?nBiome?dica enRedFisiopatologíade laObesidad y Nutricio?n is an initiative of the Instituto de Salud Carlos III (Madrid, Spain). We also extend our thanks to Marino Uceda, who prepared the olive oil, and to Jose? Carlos Isla Tejera for the technical support with the artworks. A.I.J.-M., J.R., and F.P.-J. designed research; A.I.J.-M., J.R., J.M.F., A.C., F.L.-S., J.C.V., and F.F.-J. conducted research; A.I.J.-M. and J.R. analyzed data; A.I.J.-M., J.R., and J.D.-L. wrote the paper; and J.L.-M. and F.P.-J. had primary responsibility for final content. All authors read and approved the final manuscript. E1700 Jime?nez-Morales et al. Glu298Asp Olive Oil and Endothelium J Clin Endocrinol Metab, October 2011, 96(10):E1694?E1702 Address all correspondence and requests for reprints to: Francisco Pe?rez-Jime?nez, Servicio de Medicina Interna, Hospital Universitario Reina Sofia, Avendua Mene?ndez Pidal s/n, Co?r- doba 14004, Spain. E-mail: fperezjimenez@uco.es. This work was supported by Grant AGR 922 from the Con- sejería de Economía, Innovacio?n y Ciencia, Junta de Andalucía (to F.P.-J.); Grants 06/0129 (to F.P.-J.) and 0040/07 (to J.R.) from the Consejería de Salud, Junta de Andalucía; Grant REF 200500253 from the Centro de Excelencia en Investigacio?n so- bre Aceite de Oliva y Salud (to F.P.-J.); and the Diputacio?n Pro- vincial de Cordoba, Agencia para el Aceite de Oliva and the University of Cordoba. The work was also supported in part by research grants from the Spanish Ministry of Health (Grant CB06/03/0047, Centro de Investigacio?n Biome?dica en Red Fi- siopatología de la Obesidad y Nutricio?n, Instituto de Salud Car- los III, to F.P.-J.) and the Fundacio?n Biome?dica de Co?rdoba. Disclosure Summary: The authors have nothing to disclose. References 1. Versari D, Daghini E, Virdis A, Ghiadoni L, Taddei S 2009 Endo- thelial dysfunction as a target for prevention of cardiovascular dis- ease. Diabetes Care 32(Suppl 2):S314?S321 2. 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BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Open AccessR E S E A R C H A R T I C L E BioMed Central © 2010 Camargo et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Research articleGene expression changes in mononuclear cells in patients with metabolic syndrome after acute intake of phenol-rich virgin olive oil Antonio Camargo?1, Juan Ruano?1, Juan M Fernandez1, Laurence D Parnell2, Anabel Jimenez1, Monica Santos- Gonzalez3, Carmen Marin1, Pablo Perez-Martinez1, Marino Uceda4, Jose Lopez-Miranda1 and Francisco Perez- Jimenez*1 Abstract Background: Previous studies have shown that acute intake of high-phenol virgin olive oil reduces pro-inflammatory, pro-oxidant and pro-thrombotic markers compared with low phenols virgin olive oil, but it still remains unclear whether effects attributed to its phenolic fraction are exerted at transcriptional level in vivo. To achieve this goal, we aimed at identifying expression changes in genes which could be mediated by virgin olive oil phenol compounds in the human. Results: Postprandial gene expression microarray analysis was performed on peripheral blood mononuclear cells during postprandial period. Two virgin olive oil-based breakfasts with high (398 ppm) and low (70 ppm) content of phenolic compounds were administered to 20 patients suffering from metabolic syndrome following a double- blinded, randomized, crossover design. To eliminate the potential effect that might exist in their usual dietary habits, all subjects followed a similar low-fat, carbohydrate rich diet during the study period. Microarray analysis identified 98 differentially expressed genes (79 underexpressed and 19 overexpressed) when comparing the intake of phenol-rich olive oil with low-phenol olive oil. Many of these genes seem linked to obesity, dyslipemia and type 2 diabetes mellitus. Among these, several genes seem involved in inflammatory processes mediated by transcription factor NF-?B, activator protein-1 transcription factor complex AP-1, cytokines, mitogen-activated protein kinases MAPKs or arachidonic acid pathways. Conclusion: This study shows that intake of virgin olive oil based breakfast, which is rich in phenol compounds is able to repress in vivo expression of several pro-inflammatory genes, thereby switching activity of peripheral blood mononuclear cells to a less deleterious inflammatory profile. These results provide at least a partial molecular basis for reduced risk of cardiovascular disease observed in Mediterranean countries, where virgin olive oil represents a main source of dietary fat. Admittedly, other lifestyle factors are also likely to contribute to lowered risk of cardiovascular disease in this region. Background Metabolic syndrome (MetS) is a very common condition that is associated with increased cardiovascular disease (CVD) risk and type 2 diabetes mellitus, itself a risk factor for CVD. Its diverse clinical characteristics illustrate the complexity of the disease, involving several dysregulated metabolic pathways and multiple genetic targets. When caloric intake exceeds caloric expenditure, a positive caloric balance and subsequent storage of fat in adipose tissue appears; this often is cause of adipocyte hypertro- phy and obesity. Depending on interaction of genetic and environmental factors, this hypertrophy can be followed by macrophage accumulation within adipose tissue lead- ing to local hypoxia, inflammation, and oxidative stress. * Correspondence: fperezjimenez@uco.es 1 Lipids and Atherosclerosis Research Unit. IMIBIC (Instituto Maimonides de Investigacion Biomedica de Cordoba), Reina Sofia University Hospital, University of Cordoba, and CIBER Fisiopatologia de la Obesidad y Nutricion, Spain ? Contributed equally Full list of author information is available at the end of the article Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 2 of 11 These deleterious effects favor adipose functional failure resulting in changes in systemic energy delivery; these also impair glucose consumption and activate self-regula- tory mechanisms that extert influence over whole body homeostatic systems and link obesity to numerous health problems associated with MetS [1]. A low-level systemic chronic inflammation, with abnormal cytokine produc- tion in adipose tissue, increased acute-phase reactants, and activation of inflammatory signaling pathways, often acting over a period of many years, appears to constitute a potential link to atherosclerosis development in these patients [2]. In addition, changes in postprandial metabo- lism undergoing every time we have a meal as well as alterations in this state may play an important role in the development of cardiovascular and cardiovascular associ- ated diseases [3]. Moreover, Van Oostromet et al. [4] pro- vides evidence that postprandial triglyceridemia is related to a pro-inflammatory state due to high expression of markers of neutrophilic and monocyte activation. The anti-atherogenic effects associated with Mediterra- nean Diet (MD) rich in Virgin Olive Oil (VOO) consump- tion, could contribute in explaining the low rates of cardiovascular mortality found in Southern European Mediterranean countries, in comparison with other Western populations [5]. It has been demonstrated recently that inhibition of circulating immune cell activa- tion could be a protective mechanism by which MD exerts its healthy effects [6]. Bonani et al. [7] showed that extra VOO consumption reduces inflammatory markers and increase serum antioxidant capacity at postprandial state. Previously, our group has showed how a VOO-rich MD, during postprandial state, reduces inflammatory response of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) mediated by transcription factor NF-?B, when compared to, butter and walnut-enriched diets or Western diets [8,9]. These results have been replicated by others and support the hypothesis that decreasing NF-?B pathway activation is a mechanism involved in the anti-inflamma- tory effect of a VOO-rich MD [10,11]. Nevertheless, it has been proposed that healthy effects of VOO may be due not only to its oleic acid content but also to the anti- oxidant and anti-inflammatory capacity of minor compo- nents, especially the phenol-rich fraction [12,13]. Our group demonstrated that the VOO phenol fraction also improves endothelial dysfunction and haemostatic profile during postprandial state [14,15]. Other studies showed how these compounds ameliorate lipid profiles and decrease oxidative stress in vivo [12]. However, in animal models, it has been showed that hydroxytyrosol, a phenol found in olive oil, administered after being extracted from its original matrix could be not only non beneficial but indeed harmful for health [16]. It has been speculated that potentially beneficial effects could be due to olive oil modulation on genes involved in proliferative, antioxidant and inflammatory pathways. In order to clarify this question, some human, animal mod- els and in vitro studies were undertaken using gene expression microarray platforms [17]. These studies showed that olive oil is able to modify gene expression coding for proteins participating in cellular mechanisms involved in oxidative stress resistance [18], lipid metabo- lism [19] and other atherosclerosis-related traits/path- ways [20,21]. Nonetheless, it is unresolved whether these changes in gene expression are mediated by oleic acid or executed by olive oil polar minor components, maybe as a consequence of their antioxidant capacity, or by interact- ing directly with receptors, enzymes or transcription fac- tors. To date, no intervention studies in humans have thoroughly explored the effects of VOO phenol com- pounds on gene expression. Thus, the main purpose of this study was to identify genes which undergo changes in expression in PBMCs in patients with MetS, after acute intake of breakfast based in phenol-rich virgin olive oil, compared to phenol-poor olive oil breakfast. Results Postprandial metabolic parameters No significant differences were observed in any of the iAUCs of the main metabolic variables (glucose, insulin, non-sterified fatty acids, serum triglycerides and high density lipoprotein cholesterol) after intake of phenol- rich virgin olive oil compared with olive oil with lower content of these compounds (Table 1). Microarray results and selection of candidate genes Two color microarrays experiments were performed by using Agilent platforms; 45,220 probe sets were tested to interrogate the expression of 30,886 unique human genes. Microarray analysis showed a correlation index >90% of the raw log-intensity signal among replicates in the array in all cases. Mean coefficient of variation of the log-signal probe values was lower than 0.1 for intra-array replicates. Changes in gene expression were determined as log2 ratio of signal intensity values corresponding to transcripts present 4 hours after intake of olive oil with high phenol content, divided by the signal intensity values, which cor- respond to transcripts present 4 hours after consumption of low phenol content olive oil. 15,308 high-quality probes were selected ranging from 1.89 to -1.79 log2 ratio. In these, we found 98 genes differentially expressed in human PBMCs (Additional File 1), selecting log2 ratio greater than 0.4 (more expression after intake of olive oil with high phenol content, this is, at least 1.32 fold, in 19 over-expressed genes) or log2 ratio lower than -0.4 (less expressed after consumption of high phenol content olive oil; this is, at least 1.32 fold, in 79 under-expressed genes) with a statistical significance (p) for the fitted linear model of = 0.01. Results were adjusted by dye-swap Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 3 of 11 effects and by False Discovery Rate (FDR) using the Ben- jamini and Hochberg method. The most under-expressed genes in MetS patients during postprandial period after intake of olive oil phenols were G0S2, EGR2, EGR1, FOSB, IL1B, NR4A2, EGR3, RASGEF1B, CXCL1 and PTGS2 (1.95- to 2.74 fold) and the most over-expressed genes were CA1, RAP1GAP, GYPB, FN1 and SELENBP1 (1.46- to 1.57- fold). Additionally, we performed a gender analysis (Additional File 2). From these, we found 32 genes differentially expressed in the analysis for both, men and women. However, 329 genes were differentially expressed only for men (218 genes) and only for women (111 genes). Results validation by qRT-PCR To confirm microarray results using an independent technique, log2 of the normalized microarray ratio values were compared with log2 ratio values for four genes obtained from qRT-PCR experiments (JUN, PTGS2, EGR1 and IL1B). Results showed that features of the changes in both procedures were similar with Spearman r coefficients between 0.901 and 0.968 and p-values less than 0.001 (Figure 1 and 2). Pathway analysis In order to investigate functional relationships in the set of differentially expressed genes, we used the Ingenuity Pathway Analysis Software [22] (Ingenuity Systems, Red- wood City, CA USA) which employs a predefined knowl- edge base containing over 10.000 curated human genes. Of the 98 differentially expressed genes found in patients with MetS during the postprandial period after intake of olive oil phenols, two transcripts (LOC284454, AF351612) showed no entries within the knowledge base and only 81 genes were eligible for network analysis. Inflammatory disorder was the most highly represented disorder (39 genes, p = 2.11E-19). From these, 35 genes (PTGS2, IL1B, IL6, OSM, CCL3, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCR4, NAMPT, DUSP1, DUSP2, EGR1, EGR2, EGR3, EREG, FOSB, G0S2, JUN, JUNB, NFKBIA, NFKBIZ, NR4A1, NR4A2, PER1, SOCS3, SOD2, TAGAP, TNFAIP3, ZFP36, AREG, CA2, CD69, CD83, CDKN2A) were under- expressed and after intake of virgin olive oil with high content in phenolic compounds, 4 genes were over- expressed (CCR2, CA1, CPVL, FN1). Cellular functions most strongly associated with the differentially expressed genes were cell death (41 genes, p = 7.53E-11), cell migra- tion (24 genes, p = 3.88E-8), cell division (23 genes, p = 6.29E-8), cell proliferation (32 genes, p = 9.90E-7) and transcription (25 genes, p = 3.55E-05). Network analysis yielded 14 different sub-networks, from which, one was identified as preferentially enriched by genes found dif- ferentially expressed after high-phenol VOO intake. This top-scoring sub-network included 26 genes whose related top-function was 'inflammatory diseases' with a probabil- ity value of 10-54 (Fisher's exact test) of gene interrelation- ships being by chance. All sub-networks were merged to obtain the overall network shown in Figure 3. Interacting proteins were added using Ingenuity Pathways Knowl- edge Base database. Finally non-connected genes or those connected by two or more edges were removed, except for those genes that were found to be differentially expressed in our microarrays analysis. Discussion In the present study, we have observed that the phenol fraction of VOO in vivo is able to repress the expression of several genes related to inflammation pathways in patients with MetS during postprandial period (Addi- tional File 1). This finding draws interest since pro- inflammatory state remains as one component of MetS [23] and low-grade inflammation is often associated with endothelial dysfunction [24], which by itself is associated to the development of atherosclerosis [25]. The PTGS2 gene encodes prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (COX-2), an inducible isozyme involved in Table 1: Postprandial metabolic parameters. Low-phenol OO breakfast High-phenol OO breakfast p value iAUC Glucose (mg.dL-1. min-1) 1775 ± 5156 1556 ± 2661 0.876 iAUC Insulin (U.L-1.min-1) 3722 ± 2904 4141 ± 2239 0.627 iAUC NEFA (mmol.L-1.min-1) -4257 ± 3321 -4029 ± 2626 0.990 iAUC TG (mg.dL-1. min-1) 4256 ± 3504 4277 ± 6441 0.995 iAUC HDLc (mg.dL-1. min-1) 112 ± 689 135 ± 1036 0.395 Incremental area under the postprandial serum concentration curve (iAUC) of glucose, insulin, NEFA, TG and HDLc after the acute intake of both types of olive oil. OO, olive oil; p values correspond to Wilcoxon-paired test (n = 20); iAUC, incremental area under the concentration curve; NEFA, non-sterified fatty acids; TG, serum triglycerides; HDLc, high density lipoprotein cholesterol. All values are expressed as mean ± SD. Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 4 of 11 prostaglandin biosynthesis using arachidonic acid as sub- strate. In macrophages, and other cells, COX-2 activity is rapidly increased by various stimuli, such as pro-inflam- matory cytokine IL1?. Substantial evidence indicates that up regulated PTGS2 expression and prostaglandin syn- thesis indeed influence chronic inflammatory conditions [26]. De la Puerta et al. observed that murine mac- rophages showed significantly reduced IL1? production and COX-2 activity after olive oil-enriched diet [27]. Recently, it has been demonstrated that hydroxytyrosol, one of the most important phenol compounds found in virgin olive oil, attenuates in vitro LPS-induced transcrip- tion of PTGS2 [28]. Our study showed that in vivo intake of phenol-rich virgin olive oil in humans is associated with a decreased expression of both IL1B and PTGS2, as compared to low-phenol olive oil intake. Those effects could contribute to reduced inflammation during post- prandial state in agreement with anti-inflammatory effects observed after VOO-rich MD consumption [8,9]. The cytokine-cytokine interaction pathway contains a network of proteins (chemokines and their receptors) involved in the recruitment and activation of leukocytes during inflammatory response. Expression of genes such as CCL3, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCR4, IL1B, IL6, and OSM is described under-expressed after acute intake of phenol-rich olive oil in our intervention study on diet. CCL3 gene, which codes for macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1), has been implicated in monocyte infil- tration of adipose tissue, an action that could significantly influence a pro-inflammatory pattern within endothelial cells [29]. CXCL1, CXCL2 (MIP2A), and further, CXCL3 (MIP2B) are genes for small and structurally related chemokines that regulate cell trafficking of various types of leukocytes through interactions with a subset of G pro- tein-coupled receptors. Elgazar-Carmon et al. have dem- onstrated in mice that early neutrophil infiltration of adipose tissue may be mediated by CXCL1, a process that would precede macrophage infiltration after long-term consumption of a high-fat diet [30]. IL6 encodes a cytokine which is secreted to serum and induces a tran- scriptional response involved in a wide variety of inflam- mation-associated conditions, including MetS and type 2 diabetes mellitus (T2DM) [31]. On the other hand, it has been proposed that IL6 and OSM, which encodes Figure 1 Microarrays results validation by qRT-PCR. Mean ( ± S.E.M.) of relative expression values after the consumption of low and high phenol content olive oil. One way ANOVA p value is showed. Gene expression values were log transformed before statistical analyses. 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 R el a tiv e Ex pr e s s io n 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010 0.0012 0.0014 R el a tiv e Ex pr e s s io n 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0.018 R el a tiv e Ex pr e s s io n 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 R el a tiv e Ex pr e s s io n IL1BEGR1 JUN PTGS2p = 0.083 p = 0.118 p = 0.014 p = 0.006 Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 5 of 11 oncostatin M, a growth regulator and member of the IL6 group of cytokines, can contribute to the increased car- diovascular risk in obese patients by up regulating PAI -1 in adipose tissue [32]. Activation of NF-?B and MAPK pathway, a cascade of phosphorilation events that result in the activation of transcription factors like CREB and AP-1, synergize for expression of inflammatory genes through coordinate bindings of transcription factors to ?B and AP-1 sites which have been found together in the promoters of e.g. IL6 and TNF-?, and many other inflammatory genes [33]. Chemokine repression found in our study could be con- sequence of phenols interaction with this inflammation signaling system, since expression of some genes involved in NF-?B/MAPK/AP-1 signaling pathways was also mod- ulated after phenol-rich olive oil based breakfast. NF-?B is a transcription factor activated by pro-inflammatory cytokines [34] and oxidative stress mediators [35]. Recently Pierce et al. have demonstrated that NF-?B acti- vation is important in mediating vascular endothelial dys- function in obese humans [36]. The product of SGK1 gene, encoding a serum/glucocorticoid regulated kinase with a role in stress response and by itself being a down- stream target for PI3K signaling, enhances nuclear NF-?B activity by phosphorylating an inhibitory kinase IKK? [37]; so repression on expression of SGK1 gene by olive oil phenols would decrease the NF-?B activation. In addi- tion, NFKBIA gene, which encodes to I?B?, a member of an inhibitory I?B family that retains NF?B into the cyto- plasm, remained under-expressed after acute intake of phenol-rich olive oil. It has been reported that NF-?B binds to the I?B? promoter in order to activate its tran- scription [38]. Thus, this negative feedback mechanism results in rapid cycles of inhibition and stimulation of NF-?B where a decrease on NF-?B activation is accompa- nied by a reduction on NFKBIA gene expression, as observed in our results. The hypothesis that NF-?B acti- vation is decreased by olive oil phenols is also supported by two in vivo studies which showed reduced NF-?B acti- vation after olive oil consumption [8,9]. Additionally, in vitro studies showing attenuated NF-?B activation by res- veratrol support the hypothesis that this pathway employs a shared mechanism by which polyphenols reduce expression of genes encoding inflammatory cytokines and adhesion molecules [39]. After intake of virgin olive oil with high content in phe- nolic compounds we found a decreased postprandial expression of DUSP1 and DUSP2. Those genes encode dual serine-threonine phosphatases, which down regu- late members of p38, MAPK/ERK and SAPK/JNK, the three final effectors of the MAPK pathway [33]. In addi- tion, TRIB1, another gene repressed by phenol-rich olive oil, is involved in MAPK signaling, participating in the activation of ERK proteins [40] and being up regulated in human atherosclerotic plaques [41]. Thus, reduction of TRIB1 expression by olive oil phenols could promote decreased ERK activation. This observation agrees with in vitro studies demonstrating that phenol compounds of green tea down regulate PTGS2 expression by decreasing ERK and p38 MAPK activation [42]. Our results allow us to hypothesize that olive oil phenols influence activation of AP-1, which consists of a variety of heterodimers of Jun, Fos and activating transcription factor families [43], by means of two different mechanisms: a) one direct, involving repression of JUN, JUNB and FOSB as observed after phenol-rich olive oil intake; and/or b) another one indirect, through MAPK pathway, where the relative intensity and duration of activation determine the type of response. Lastly, biomedical literature and text mining tasks were performed to identify interactions of differentially expressed genes in PBMCs as response to phenol-rich VOO with conditions clustered around MetS such as obesity, hypertension, dyslipemia, hyperglycemia, or T2DM. Recently, Chen et al. have described a mac- rophage-enriched gene network (MEGN) of ~1237 genes referred as having causal relationship with complex-dis- ease traits associated with MetS [44]. Thirteen genes share our set of differentially expressed genes in PBMCs after acute intake of phenol-rich olive oil and MEGN: JUN, RGS1, CXCL2, ANXA3, RASGEF1B, CD83, CA2, EGR2, DIAPH3, CCL3, and TLR7, PSAP and IFIT3. De Mello et al. assessed individuals with both impaired glu- cose metabolism and MetS on how long-term weight loss affects expression of cytokines in PBMCs. Weight reduc- Figure 2 Correlation between microarrays and qRT-PCR results. Correlation analysis between log2 ratio of the gene expression values from microarrays and qRT-PCR experiments. Ratio of the gene expres- sion values correspond to gene expression after consumption of high phenol content olive oil divided by gene expression after the con- sumption of low phenol content olive oil. Spearman r values are shown in the graphs. JUN EGR1 IL1B PTGS2 R = 0.901 P < 0.001 R = 0.922 P < 0.001 R = 0.959 P < 0.001 R = 0.968 P < 0.001 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 -4 -3 -2 -1 0 1 2 Log Ratio Microarrays Lo g R at io q RT - CR -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 Log Ratio Microarrays Lo g R at io q RT -P CR -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Log Ratio Microarrays Lo g R at io q RT -P CR -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 Log Ratio Microarrays Lo g R at io q RT -P CR Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 6 of 11 tion resulted in a decrease in of IL1B expression [45]. Kai- ser et al. showed by microarrays analysis in PBMCs a set of 22 over-expressed genes in T1DM and T2DM com- pared to healthy subjects [46]. Interestingly, 8 of the iden- tified 22 over-expressed genes in T2DM were repressed by olive oil phenols, according to our intervention study (IL1B, EGR2, EGR3, PTGS2, FOSB, CXCL1, SGK, and TRIB1). In addition, PBEF1, another gene involved in the pathogenesis of T2DM [47], was also found repressed after consumption of phenols-rich olive oil. Taken together, this finding could lead to potential therapeutic implications in T2DM. Figure 3 Ingenuity Pathway Analysis Network. Network of phenol-rich VOO modulated genes. Gray symbols denote that the gene was found over-expressed or under-expressed by phenols in microarrays analysis. Extracellular Space Citoplasm Nucleus Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 7 of 11 Conclusions Our study shows that intake of breakfast based in virgin olive oil being rich in phenol compounds is able to repress expression of several pro-inflammatory genes in vivo, thereby switching activity of PBMCs to a less delete- rious inflammatory profile. These results provide at least a partial molecular basis for risk reduction of cardiovas- cular disease observed in Mediterranean countries, where VOO represents a main source of dietary fat. Admittedly, other lifestyle factors are also likely to con- tribute to lowered risk of CVD in this region. Nonethe- less, our data suggest that mechanisms by which these micronutrients in phenol-rich olive oil would exert their anti-inflammatory effect could involve pathways related to NF-?B/AP-1, cytokine-cytokine receptor interaction, arachidonic acid metabolism, and MAPK. These findings strengthen the relationship between inflammation, obe- sity and diet and provide evidence at transcription level of control of healthy effects derived from VOO consump- tion in humans. However, it would be interesting to eval- uate whether these beneficial effects are maintained after prolonged feeding and if these effects are carried out by one or several olive oil phenolic compounds, or if they are consequence of a synergic effect of the total phenolic fraction. Methods Subjects Twenty (56 years old; range, 40-70) subjects (9 men, 11 women) from the Lipids and Atherosclerosis Unit at Hos- pital Universitario Reina Sof ía (Cordoba, Spain) partici- pated in this study. All subjects fulfilled three or more of the proposed cri- teria proposed by the Third Report of the National Cho- lesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) for MetS: a) central obesity (waist circumference > 102 cm in men or > 88 cm in women); b) high blood pressure ? 130/ 85 mmHg or documented use of antihypertensive ther- apy; c) high fasting glucose (? 100 mg.dL-1); d) hypertrig- lyceridemia (? 150 mg.dL-1), and e) low high density lipoprotein cholesterol (HDLc) (< 40 mg.dL-1 for males or 50 mg.dL-1 for females). Subjects had an average body mass index (BMI) of 38.98 (27.95-44.42) kg.m-2, waist perimeter of 132.2 cm (103.0-137.0), systolic blood pres- sure of 146 ± 19 mmHg, diastolic blood pressure of 89 ± 10 mmHg, plasma glucose levels of 102.8 ± 17.0 mg.dL-1, plasma insulin levels of 11.5 ± 6.5 mU.L-1, total choles- terol (TC) plasma levels of 201.7 ± 27.1 mg.dlL-1 triacylg- lyceride (TAG) plasma levels of 185 ± 78 mg.mL-1, low density lipoprotein cholesterol (LDLc) levels of 120.3 ± 19.7 mg.dL-1 and high density lipoprotein cholesterol (HDLc) levels of 50.7 ± 11.8 mg.dL-1. No subjects showed evidence of chronic diseases (hepatic, renal, thyroid, car- diac), smoking, alcohol consumption, or family history of cardiovascular disease of early onset, nor were they tak- ing drugs. The Human Investigation Review Committee at Reina Sofia University Hospital approved this study. All participants gave informed consent before joining the study. Study design and dietary intervention Before the first breakfast intervention, participants fol- lowed a 6-week washout period in which they were instructed to not take vitamins, soy supplements, or any drug. To eliminate the potential effect that might exist in their usual dietary habits, all subjects followed a low-fat, carbohydrate rich (CHO) diet during this period through the end of the study. Compliance with the CHO diet was assessed after two and four weeks using a three-day recording and a food frequency questionnaire. 24 hours prior to each breakfast intervention, participants were instructed to avoid consuming phenol-rich foods such as fruit or juices, wine, grape juice, chocolate, coffee, tea, olive oil, or soy, and to refrain from intense physical exer- cise. After a 12-h fast and following a randomized sequential crossover design with one-week washout period, participants reported to the hospital and received two fat meals consisting of 60 grams of white bread, 40 mL of VOO (CANOLIVA®, Antonio Cano e Hijos?, Cor- doba, Spain) with high (398 ppm) or low (70 ppm) con- tent in phenolic compounds, and 60,000 IU of vitamin A per m2 of body surface. Throughout the 4-hour duration of the study session, subjects performed no physical activity, nor did they consume anything but water. Olive oil characteristics Olive oil with low content in phenolic compounds was obtained by physical extraction of most phenolic com- pounds from the high-phenol olive oil, so that both oils retained a similar composition of the remaining macro- and micro-nutrients with the exception of phenolic con- tent (70 ppm vs 398 ppm) (data not shown). Hydroxyty- rosol content was 0.2 %mol.g-1 and 45.4 %mol.g-1, respectively in low-phenol and high-phenol olive oil. High-phenol olive oil was washed in separating funnels with the same volume of distilled water. This operation was repeated seven times at room temperature under reduced light to avoid oxidation. Fatty acid composition of oils was determined by gas chromatography in a Per- kin-Elmer Autosystem (SGE Scientific, Australia) accord- ing to EU Regulation 2568/91 (CE, 1991). Tocopherol composition was analyzed by HPLC in a Perkin-Elmer HPLC, applying IUPAC method 2432 (IUPAC, 1992). Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 8 of 11 Sample collection Venous blood samples were obtained at 0, 30, 60, 120 and 240 min after consumption of each breakfast. Samples from fasting and postprandial states were collected in tubes containing 1 g EDTA/L and stored in containers with iced water and kept in the dark. Special care was taken to avoid exposure to air, light, and ambient temper- ature. Plasma was separated from whole blood by low- speed centrifugation at 1500 × g for 15 min at 4°C within the hour after extraction. Lipid analysis and biochemical determinations Lipid parameters were assessed with the modular autoan- alyzer DDPPII Hitachi (Roche, Basel, Switzerland), using specific reagents (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany). Determinations of TC and TAG levels were made by colorimetric enzymatic methods [48,49]; of HDLc by colorimetric assay [50]; of LDLc by the Friede- wald formula based on CT, TAG, and HDLc values [51]. Plasma glucose concentrations were measured with a Hitachi 917 analyzer (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) by the glucose oxidase method (GOD-PAP). Plasma insulin concentrations were measured by microparticle enzyme immunoassay (Abbott Diagnostics, Matsudo-shi, Japan). Nonsterified fatty acid concentra- tions were measured by enzymatic colorimetric assay (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany). Isolation of PBMCs PBMCs were isolated within 2 hours after blood draw from 30 mL EDTA anticoagulated blood samples taken 4 hours after consumption of each olive oil-based break- fast. Buffy coats were diluted 1:2 in PBS, and cells were separated in 5 mL Ficoll gradient (lymphocyte isolation solution, Rafer) by centrifugation at 2000 × g for 30 min. PBMCs were collected and washed twice with cold PBS. Harvested PBMCs were preserved in liquid nitrogen and stored at -80°C prior to RNA extraction. RNA extraction and microarray samples preparation Total RNA was extracted from mononuclear cells with TRI Reagent (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) and purified with RNeasy MiniElute Cleanup Kit (Qia- gen, Hilden, Germany). Recovered RNA was quantified using a Nanodrop ND-1000 v3.5.2 spectrophotometer (Nanodrop Technology®, Cambridge, UK). RNA integrity was assessed using 1.6% agarose gel, 1× TBE. RNA was judged suitable for array hybridization only if samples exhibited intact bands corresponding to 18S and 28S ribosomal RNAs. Microarray analysis design Gene expression profiles were generated using the 4x44K glass slide Whole Human Genome Oligo Microarray G4112A (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Each microarray uses 45,220 probes to interrogate 30,886 unique human genes and transcripts. Two sets of dye-swapped experiments were performed to total four replicate hybridizations per subject (totals 80 microarray experiments). Each array compared total RNA from PBMCs obtained 4 hours after intake of virgin olive oil with high phenolic content with RNA obtained 4 hours after low-phenol virgin olive oil consumption. Synthesis and labeling of cDNA RNA samples were labeled using the SuperScript Indirect RNA Amplification System (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. To avoid confounding by extraneous factors, all experi- ments were performed in a single batch and processed by one researcher on the same day for each step. Dye incor- poration rates were assessed with a Nanodrop® ND-1000 v3.5.2 spectrophotometer (Nanodrop Technology®, Cam- bridge, UK) and found to be between 8 and 12 pmol. %L-1. Microarray hybridation and scan protocol Differentially labeled aRNA samples were cohybridized on microarray slides. Hybridization was performed using the Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technol- ogies Inc., Santa Clara, CA, USA) following the manufac- turer's instructions. Microarray images of each slide were obtained with a Gene Pix 4000B scanner (Axon Instru- ments, Union City, CA, USA). Image quantization was performed using Agilent Feature Extraction Software v9.5 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Preprocessing and normalization of the microarray data Background adjusted signals (BGSubSignal) were calcu- lated by the Agilent Feature Extraction Software (v9.5) and filtered on the flag IsWellAboveBG. Log2 dye swapped (red/green) mean-centered signal ratio data were normalized within-array and between-array by Lowess and quantile methods respectively, both imple- mented in the R Limma package (GLP). Differential gene expression analysis Identification of genes whose expression could be regu- lated by virgin olive oil phenols was done by comparing microarray results from PBMCs obtained at 4 hours after high and low phenol olive oil ingestion. Differential gene expression analysis was performed by fitting of gene-wise linear models to microarray data with R Limma package (GLP). For considering a gene as differentially expressed, filtering criteria were used combining M value (signal log2 ratio) greater than 0.4 (over-expressed) or lower than -0.4 (under-expressed) (by 1.32 and -1.32-fold changes, respectively), and statistical significance (p) of the fitted linear model of ? 0.01 for every gene. Results were Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 9 of 11 adjusted by dye-swap effects and by False Discovery Rate (FDR) using Benjamini and Hochberg method. MIAME Gene Expression Omnibus (GEO) database Raw microarray data have been curated and accepted in GEO (a public repository for microarray data, aimed at storing MIAME (Minimum Information About Microar- ray Experiments) compliant data in accordance with MGED (Microarray Gene Expression Data) recommen- dations. Access to data concerning this study may be found under GEO experiment accession number GSE15812 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ acc.cgi?token=pjihtumyoyogmhy&acc=GSE15812. qRT-PCR analysis of differentially expressed genes PCR analyses were performed using Mx3005 Thermocy- cler (Agilent Technologies, La Jolla, CA) and iQ SYBR®Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., Her- cules, CA, USA) commercial kit in a final volume of 20 %l with 10 pmol of each primer. Each reaction was per- formed on 1 %l of 1:5 (v/v) dilution of the first cDNA strand, synthesized using 1 %g of total RNA by the com- mercial kit iScript® cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Labora- tories, Inc., Hercules, CA, USA) according to the manufacturer's instruction. The reaction was incubated at 96°C for 3 min, followed by 40 cycles of 30 s at 96°C, 30 s at 62°C, 20 s at 72°C and 10 s at 80°C where fluorescence was measured to avoid primer-dimer and background signals. Primers used were: ERG1-Up (5'-CTACGAG- CACCTGACCGCAGAG-3'), ERG1-Low (5'-CCAGG- GAAAAGCGGCCAGTATAG-3'), JUN-Up (5'- GACCTTCTATGACGATGCCCTCAA-3'), JUN-Low (5'-ACGTCGGGCGAGGTGAGGAGGTC-3'), IL1B-Up (5'-GGGACAGGATATGGAGCAACAAGT-3'), IL1B- Low (5'-GCTTATCATCTTTCAACACGCAGGA-3'), PTGS2-Up (5'-ATGAGTTATGTCTTGACATCCAGAT- CAC-3'), PTGS2-Low (5'-CAAACATCATGTTTGAGC- CCTGG-3'), RPL13-Up (5'- CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3') and RPL13- Low (5'-TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA-3'). Specificity of PCR amplifications was verified by a melt- ing curve program (60-95°C with a heating rate of 0.5°C/s and a continuous fluorescence measurement) and ana- lyzed by electrophoresis on a 1.6% agarose gel, TBE 1×. Primer efficiencies were: EGR1, 98%; PTGS2, 101%; IL1B, 96%; JUN, 108%; RPL13a, 95%. Expression values were obtained as relative expression of the target gene versus the constitutively expressed RPL13a gene (relative expression = 2-(Ct, Target gene-Ct, Reference gene)). Statistical analysis Several variables were transformed to define the meta- bolic postprandial response after acute intake of both types of olive oil. Incremental area under plasma concen- tration curve (iAUC) was calculated for all measured metabolic variables by the trapezoidal method. The nor- mality of data was assessed using the Saphiro-Wilk test. Log transformation of data was performed when those variables were not normally distributed. Differences between iAUC after intake of high-phenol and low-phe- nol olive oils were analyzed using Wilcoxon-paired test. For data analysis, gene expression data were presented in M-values [log2(ratio)] expressing a fold change after high-phenol olive oil intake compared to low-phenol olive oil consumption. The corresponding p-value, B- value, and B-probability are shown (Additional File 1). The data input for correlation analysis using Spearman's test were the log2(ratio) value for microarrays (M-value) and qRT-PCR in subject individuals. All data presented in the text and tables are expressed as mean ± SD unless otherwise specified. Significance levels were set to p-values less than 0.01 for microarray data and less than 0.05 for all other analyses. All statistical tests were performed using R programming and statisti- cal environment software (GLP). Abbreviations used ppm: part per million; MetS: metabolic syndrome; CVD: cardiovascular disease; VOO: virgin olive oil; MD: Medi- terranean Diet; PBMC: peripheral blood; mononuclear cells; MEGN: macrophage-enriched gene network. Additional material Authors' contributions AC and JR contributed equally to this work. AC, JR, JL-M, and FP-J: designed research; AC, JMF, and MU: provision of study materials and subjects; AC, JR, JMF, AJ, and MS-G: performed research; LDP and MU: contributed new reagents/analytic tools; AC, AJ, and MS-G: collection and assembly of data; AC, JR, JMF, LDP, CM, PP-M, JL-M, and FP-J: analyzed data; CM, PP-M, JL-M, and FP-J: provided statistical expertise; AC: wrote the paper; JR, LDP, MU, JL-M and FP-J: critical review of the manuscript; FP-J: obtained funding. None of the authors had any personal or financial conflicts of interest. Acknowledgements This work has been supported by Consejeria de Innovacion, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucia (AGR 922 to FP-J), Ministerio de innovación, Ciencia y Empresa (SAF 2003-05770 to FP-J), Consejeria de Salud, Junta de Andalucia (06/0129 to FP-J and 0040/07 to JR); Centro de Excelencia en Investigacion sobre Aceite de Oliva y Salud (CEAS), Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Agencia para el Aceite de Oliva. We wish to thank the patients who participated in this study. The CIBEROBN is an initiative of the Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain. We extend our thanks to Canoliva (Antonio Cano e Hijos SA, Luque, Córdoba), who generously donated the olive oil. Additional file 1 Description of differentially expressed genes in microarray analysis. List of the differentially expressed genes identified by microarray analysis when comparing the intake of phenol-rich olive oil with low-phenol olive oil in mononuclear cells in patients with metabolic syn- drome. Additional file 2 Description of differentially expressed genes in gen- der analysis. List of the differentially expressed genes when comparing the intake of phenol-rich olive oil with low-phenol olive oil in mononuclear cells in patients with metabolic syndrome in gender analysis. Camargo et al. BMC Genomics 2010, 11:253 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/253 Page 10 of 11 Author Details 1Lipids and Atherosclerosis Research Unit. IMIBIC (Instituto Maimonides de Investigacion Biomedica de Cordoba), Reina Sofia University Hospital, University of Cordoba, and CIBER Fisiopatologia de la Obesidad y Nutricion, Spain, 2Jean Mayer US Department of Agriculture Human Nutrition Research Center on Aging at Tufts University, Boston, Massachusetts, USA, 3Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, University of Cordoba, 14071 Cordoba, Spain and 4IFAPA Centro Venta del Llano, Junta de Andalucía, P.O. Box 50, Mengibar, Jaen E-23620, Spain References 1. Phillips C, Lopez-Miranda J, Perez-Jimenez F, McManus R, Roche HM: Genetic and nutrient determinants of the metabolic syndrome. Curr Opin Cardiol 2006, 21:185-193. 2. 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Debe decidir si desea tomar parte en él. Tómese el tiempo necesario para decidir. Lea atentamente lo que sigue y formule al médico del estudio todas las dudas que tenga. El estudio es llevado a cabo por miembros de la Unidad de Lípidos y Arteriosclerosis del Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba. ¿Por qué se realiza este estudio? La obesidad, el exceso de peso y la diabetes tipo 2 están aumentando en todas las regiones de Europa. Antes de 2010, casi 31 millones de personas en nuestro continente requerirán tratamiento para la diabetes y sus complicaciones relacionadas. La diabetes y el síndrome metabólico son enfermedades de mayor frecuencia en personas en edad media y avanzada, y en todas los países europeos, la proporción de la población mayor y económico-dependiente está aumentando, con las predicciones de que antes de 2030, cerca del 30% de europeos serán personas de edad mayor a 60 años. El síndrome metabólico es una enfermedad caracterizada por una disminución de la sensibilidad de los tejidos a la acción de la insulina, junto a la existencia de anormalidades de los lípidos de la sangre, obesidad abdominal e hipertensión arterial. El síndrome afecta una proporción substancial de las poblaciones de edad media o avanzada de los países europeos y confiere un riesgo perceptiblemente mayor de enfermedad cardiovascular así como de enfermedades relacionadas. El propósito de este estudio es el de investigar la relación entre la la diferente composición en compuestos fenólicos (unas sustancia antioxidantes que se encuentran de forma natural tanto en la aceituna como en el aceite de oliva virgen) y las alteraciones metabólicas, inflamatorias y de la coagulación que se relacionan con el síndrome metabólico. De este modo, se pretende investigar si la dieta puede mejorar el control de la enfermedad. Objetivos: ? Mejorar nuestro conocimiento acerca de la influencia de la composición en compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen consumido con el síndrome metabólico a nivel clínico, celular y genómico. ? Establecer los determinantes genéticos que regulan la respuesta vascular que llevan a una mejor respuesta a la variación del tipo de aceite de oliva en personas con síndrome metabólico. ¿Por qué se me pide que participe en este estudio? Se le ha pedido que participe en el estudio y que done muestras de su sangre para analizar su ADN, los lípidos y otros componentes de la sangre. La información que se obtenga será utilizada para investigar que relación existe entre los genes y los componentes de la sangre y los compuestos fenólicos con el desarrollo y el tratamiento del síndrome metabólico. Su autorización para donar estas muestras de sangre es opcional y depende por entero de usted. Tanto si decide donarlas como si decide no hacerlo, recibirá el mismo trato médico. Si decide no donar la muestra o sí retira su consentimiento, no perderá ninguno de los beneficios, el tratamiento médico ni los derechos que le correspondan. El investigador no desea identificarle en relación con esta investigación y utilizará procedimientos diseñados para impedir que los resultados de la misma sean relacionados con usted. ¿En qué consistirá mi participación? Tras ser seleccionado, usted recibirá una alimentación control durante seis semanas, para unificar el tipo de alimentación inicial de todos los participantes en el estudio. Después de esto, se le realizará un estudio basal para determinar su situación con respecto a los lípidos y otros factores que influyen en el síndrome metabólico. Para ello, se le extraerán medidas repetidas de sangre durante una jornada, de forma que se sepa como se comporta su organismo a lo largo del día. Así, tras 12 horas de ayunas, le administrará en el tiempo 0 un desayuno y se le realizarán extracciones de 20 mililitros de sangre venosa en ayunas y a los 0, 30, 60, 120, 240 y 360 minutos tras la administración de dicha comida. También se realizará un estudio de función endotelial con un aparato láser Doppler y se le recogerá la orina de esas 24 horas. Este procedimiento se repetirá otros dos días más con otros tipos de aceite. ¿Qué efectos adversos (malos) pueden derivarse de mi donación de las muestras de sangre o de orina? Debe saber que se utilizará una aguja para extraerle sangre y para el test de resistencia a la insulina. La mayoría de los donantes experimenta un ligero dolor en el punto de inserción de la aguja y algunos pueden desarrollar un hematoma. Los procedimientos han sido diseñados para que sea muy difícil relacionarle a usted con los resultados de la investigación genética. No obstante, existe siempre una remota posibilidad de que la información sobre su participación en este estudio sea conocida. CONSENTIMIENTO INFORMADO Yo ( nombre y apellidos) _____________________________ He leído y entendido la hoja de información que se me ha entregado. He podido hacer preguntas sobre el estudio y se han contestado. He recibido suficiente información sobre el estudio. He hablado con ______________________________ Comprendo que mi participación es voluntaria. Comprendo que puedo retirarme del estudio. ? Cuando quiera. ? Sin tener que dar explicaciones. ? Sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio. Fecha: Firma del Participante. (A completar por el paciente) _______________ ________________________________ Fecha: Firma de la persona que llevó la discusión del Consentimiento informado. ____________ ______________________________ Fecha: Firma del investigador* _______________ ________________________ ? En caso de que sea la misma persona que llevó la discusión del consentimiento informado, debe firmar también en este apartado. CONSENTIMIENTO DEL REPRESENTANTE Yo ( nombre y apellidos)_____________________ En calidad de (relación con el participante): ___________________ de ( nombre del participante):________________________ He leído y entendido la hoja de información que se me ha entregado. He podido hacer preguntas sobre el estudio y se han contestado. He recibido respuestas satisfactorias a mis preguntas. He recibido suficiente información sobre el estudio. He hablado con (nombre del Investigador)__________________ Comprendo que la participación es voluntaria, Comprendo que puede retirarse del estudio.: 1º Cuando quiera. 2º Sin tener que dar explicaciones. 3º Sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. En mi presencia se ha dado a _____________________________________ toda la información pertinente adaptada a su nivel de entendimiento y está de acuerdo en participar. Y presto mi conformidad con que _______________________________________ participe en este estudio. Fecha: Firma del representante. (a completar por el representante). Fecha: Firma de la persona que llevó la discusión del Consentimiento informado. Fecha: Firma del Investigador* _________________ _________________________ *En caso de que sea la misma persona que llevó la discusión del consentimiento informado, debe firmar también en este apartado. CONSENTIMIENTO ORAL ANTE TESTIGOS Yo (nombre y apellidos) _____________________________________ Declaro bajo mi responsabilidad que ____________________________________ Ha recibido y entendido la hoja de información sobre el estudio. Ha podido hacer preguntas sobre el estudio y se han contestado, Ha recibido suficiente información sobre el estudio. Ha sido informado por ______________________________________ Comprende que su participación es voluntaria. Comprende que puede retirarse del estudio: 1º Cuando quiera. 2º Sin tener que dar explicaciones. 3º Sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. Y ha expresado libremente su conformidad para participar en el estudio. Fecha: Firma del Testigo Imparcial. (A completar por el Testigo) ____________________ _______________________ Fecha: Firma ( o marca o huella digital) (A completar por el paciente) del paciente: ___________________ _________________ Fecha: Firma de la persona que llevó la discusión del consentimiento informado. __________________ _________________ Fecha: Firma del Investigador* __________________ _________________ ? En caso de que sea la misma persona que llevó la discusión del consentimiento informado, debe firmar también en este apartado.