Sistemas hidrolíticos de componentes vegetales en el patógeno de tomate Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici: lipasas y poligalaturonasas

Abstract

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici es un hongo patógeno que infecta plantas de tomate a través de su raíz. En este trabajo se ha investigado las bases moleculares que determinan la patogenicidad de este hongo sobre plantas de tomate, estudiando la importancia de enzimas hidrolíticas, particularmente lipasas y poligalacturonasas, debido a su particular capacidad para degradar la cutina y la pectina, presentes en la pared celular de plantas. El perfil lipolítico de F. oxysporum f.sp lycopersici ha sido analizado mediante estudios in silico y ensayos bioquímicos de actividad. Se han identificado vienticinco lipasas estructurales que presentan el pentapéptido -Gly-X-Ser-X-Gly-, característico de lipasas fúngicas, y la secuencia señal de secreción. Además, se han identificado dos reguladores de lipasas, ctf1 y ctf2. El perfil transcripcional de trece genes lipasas durante la colonización de plantas de tomate ha revelado que lip1, lip3 y lip22 están altamente inducidas entre las 21-96 horas post-infección. Para estudiar su participación en patogénesis, se ha llevado a cabo la interrupción génica de cinco genes lipasas (lip1, lip2, lip3, lip5 y lip22) y dos genes reguladores (ctf1 y ctf2), así como un doble mutante Δctf1Δctf2. Los análisis de expresión llevados a cabo por qRT-PCR de las lipasas estructurales en los mutantes Δctf1, Δctf2 y Δctf1Δctf2 ha revelado la existencia de una regulación compleja de las lipasas de F. oxysporum. La reducción de la actividad lipasa total, así como la reducción de la virulencia en los mutantes Δctf1, Δctf2, y Δctf1Δctf2 son una evidencia del papel relevante que juega el sistema lipolítico en la virulencia de este hongo. El estudio in silico de las poligalacturonasas presentes en Fusarium oxysporum f.sp lycopersici ha tenido como resultado la identificación de seis endo-poligalacturonasas y cuatro exo-poligalacturonasas, que presentan los dominios conservados característicos de poligalacturonasas fúngicas. Los análisis de expresión llevados a cabo mediante qRT-PCR han revelado que tan solo dos endo-poligalacturonasas (pg1 y pg5) y dos exo-poligalacturonasas (pgx4 y pgx6) se expresan a nivel significativo en presencia de pectina y durante la colonización de plantas de tomate, mostrando su implicación durante el proceso de infección. El intento de interrupción génica de los dos genes poligalacturonasas principales (pg1 y pgx6), no ha resultado exitoso hasta el momento.

Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici is a fungal pathogen that infects tomato plants through their roots. In this work we have investigated the molecular basis determining the pathogenicity of this fungus on tomato plants, by considering the importance of hydrolytic enzymes, particularly lipases and polygalacturonases, due to its unique ability to degrade cutin and pectin both important polymer constituyents of the plant cell wall. The lipolytic profile of Fusarium oxysporum f.sp lycopersici has been studied by in silico search and biochemical enzyme activity analyses. Twentyfive structural secreted lipases were predicted based on the conserved pentapeptide -Gly-X-Ser-X-Gly-, characteristic of fungal lipases, and secretion signal sequences. Moreover, a predicted lipase regulatory gene has been identified in addition to the previously characterized ctf1. The transcription profile of thirteen lipase genes during tomato plant colonization has revealed that lip1, lip3, and lip22 are highly induced between 21 and 96 h after inoculation. Deletion mutants in five lipase genes (lip1, lip2, lip3, lip5 and lip22) and in the regulatory genes ctf1 and ctf2, as well as a Δctf1Δctf2 double mutant, have been generated. qRT-PCR expression analyses of structural lipase genes in the Δctf1, Δctf2 and Δctf1Δctf2 mutants has indicated the existence of a complex lipase regulation network in F. oxysporum. The reduction of total lipase activity, as well as the severely reduced virulence of the Δctf1, Δctf2, and Δctf1Δctf2 mutants provides evidence for an important role of the lipolytic system of this fungus in pathogenicity. In silico study polygalacturonases present in F. oxysporum f.sp. lycopersici has resulted in the identification of six endo-polygalacturonase and four exo-polygalacturonase, presenting conserved domains characteristic of fungal polygalacturonases. Expression analysis performed by qRT-PCR has revealed that only two endo-polygalacturonase (pg1 and pg5) and two exopolygalacturonase (pgx4 and pgx6) were expressed at significant levels and in the presence of pectin during tomato plant colonization, showing their involvement during the infection process. Gene disruption attempts on the two main polygalacturonase genes (pg1 and pgx6) have not yet resulted successful