Integrated "omics" approaches to study non-orthodox seed germination: the case of holm oak (Quercus ilex. ballota [Desf.] Samp)

Abstract

La presente Tesis Doctoral está centrada en el estudio de la encina (Quercus ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.), una especie dominante en los sistemas silvopastorales mediterráneos. El mantenimiento y la sostenibilidad de los bosques de encina se enfrenta actualmente con problemas y retos mayormente relacionados con la conservación de semillas viables, ya que se trata de una semilla recalcitrante, y con la alta tasa de mortalidad de los individuos adultos y plantones luego de ser trasplantados a campo, resultado de las adversas condiciones ambientales. En el presente trabajo se llevó a cabo el estudio de la germinación de semillas de encina, así como de plántulas en estadio temprano mediante una aproximación multidisciplinar que combina las técnicas clásicas de biología molecular con las “ómicas”. Con este objetivo general fueron propuestos los siguientes objetivos específicos 1. Realizar un análisis transcripcional de un grupo de genes candidatos implicados en tolerancia a la de desecación, regulación de la señalización de ABA, metabolismo y defensa contra el estrés oxidativo, a lo largo del proceso de germinación. 2. Identificar genes de expresión diferencial en semilla germinada y de plántulas muy jóvenes de Q. ilex mediante el uso de hibridación sustractiva por supresión (SSH). 3. Identificar proteínas cuya abundancia se ve alterada durante la germinación y desarrollo de plántulas en estadios tempranos, determinando los perfiles proteómicos mediante aproximaciones basadas y libres de gel. 4. Identificar el phosphoproteoma y los cambios que ocurren durante la germinación de semillas Los resultados del análisis transcripcional del grupo de genes candidatos revelaron que las semillas maduras de Q. ilex presentan algunas características fisiológicas intracelulares propias de las semillas ortodoxas que incluyen (i) acumulación de azúcares (sacarosa) y proteínas protectoras (DHN3) y (ii) acumulación de transcriptos implicados en la síntesis de oligosacáridos osmorreguladores de rafinosa (GolS) y en la defensa contra el estrés oxidativo (Sod1, Gst). Sin embargo, las semillas maduras de Q. ilex, como otras semillas recalcitrantes se dispersan con un alto contenido de agua y mantienen el metabolismo parcialmente activo. Los resultados de este análisis transcripcional fueron verificados y complementados con la determinación de (i) niveles de fitohormonas (ABA, GA3, GA4, IAA, iP and iPR), (ii) acumulación de azúcares (Sac, Glc, Fru) y (iii) determinación de proteínas mediante inmunodetección (DHN3, GAPDH, RBCL) y actividad enzimática (SOD); estos resultados mostraron una buena correlación con los transcriptos analizados. El análisis de expresión diferencial de genes mediante SSH permitió identificar por primera vez en Q. ilex un grupo de ESTs correspondiente a genes diferencialmente expresados en semillas germinadas y plántulas en desarrollo temprano. En las semillas germinadas se identificaron 31 genes sobre-expresados, entre los que se incluyen genes que codifican para proteínas implicadas en la respuesta a estreses, transporte, defensa contra estrés oxidativo, modificación de la pared celular, ciclo celular, metabolismo de proteínas y transducción. Por otro lado, 39 transcriptos no redundantes se encontraron sobre-expresados en estadio temprano de plántulas. Las proteínas codificadas por estos transcritos fueron agrupadas en siete categorías funcionales que incluyen fotosíntesis, metabolismo secundario, transporte, señalización, respuesta a diversos estreses, expresión génica y organización de componentes...

This work is focused on holm oak (Quercus ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.) a dominant tree species in natural forest ecosystems over large areas of the Western Mediterranean Basin. Q. ilex forest maintenance and sustainability are facing important problems and challenges related to seed viability/conservation, and plant mortality in both adult trees and young oneyear- old plants after field transplantation resulting from adverse environmental conditions such as drought and the so-called decline syndrome. In the present Doctoral Thesis, the germination and seedling growth of Q. ilex was studied applying a multidisciplinary “omics” approach combined with classical biochemical approaches, according to the actual trends in biosciences research. Within this general aim, specific objectives pursued in this thesis were: 1. Determine the expression profile of a selected group of protein coding genes involved in desiccation tolerance, regulation of ABA-signalling, metabolism and antioxidative defence. 2. Identify differentially expressed genes between germinated seeds and seedlings of Q. ilex by using a suppression subtractive hybridization (SSH). 3. Analyse changes in the proteomic profiles during germination and seedling growth through gel based and gel free approaches. 4. Analyse the dynamic protein phosphorylation changes during seed germination and seedling development. The transcriptional analysis revealed that mature Q. ilex seeds show some of the intracellular physiological characteristics of orthodox seed that included (i) accumulation of non-reducing carbohydrates (sucrose) and protective proteins (DHN3) and (ii) accumulation of transcripts involved in the synthesis of certain osmoregulator of raffinose series oligosaccharides (GolS), the anti-oxidative defence (Sod1, Gst). But the holm oak mature acorns, like other recalcitrant seeds, have the ability to maintain a partially active metabolism. The transcriptional analysis results were verified and complemented with the determination of (i) plant hormones levels (ABA; the gibberellins GA3 y GA4; the auxin IAA and the cytokinins iP and iPR,) (ii) sugars accumulation (Suc, Glc, Fru) and (iii) proteins amounts determined by immunoblotting (DHN3, GAPDH, RBCL) and/or enzymatic activity (SOD) and good correlation was found whit transcript levels. The analysis of differentially expressed genes by SSH allowed the identification for the first time a large number of putative differentially expressed ESTs from the embryo axis in germinated seeds and from shoot seedlings of Q. ilex during the postgermination and seedling establishment. Thirty-one over-expressed genes were identified in germinated seeds at the germination stage. Proteins encoded by these genes are representative of eight functional categories: stress responses, transport, oxidation-reduction, cell wall modification, cell division cycle, protein metabolism, cellular component organization and translation. On the other hand, 39 non-redundant transcripts over-represented in Q. ilex shoots seedlings were grouped in seven functional categories: photosynthesis, secondary metabolism, transport, signalling, stress response, gene expression and cellular component organization. These data constitute an important genomics resource that should clearly benefit further germination and other biological process research on Q. ilex...