Efecto de la temperatura, la actividad del agua, y la radiación UV-B sobre la germinación y crecimiento de aislados de Beauveria bassiana (bálsamo) Vuill.procedentes del suelo y filoplano de dos ecosistemas forestales

Abstract

ultravioleta (UV-B) tienen una gran influencia sobre la presencia, distribución y persistencia de los hongos entomopatógenos (HE) en sus hábitats naturales (suelo o filoplano de las plantas). Sin embargo, la protección contra estos factores es mayor en el primer hábitat que en el segundo, por lo que uno de los objetivos del presente trabajo ha sido determinar si el filoplano podría proporcionar aislados fúngicos mejor adaptados a las condiciones extremas de temperatura, humedad y exposición a rayos UV-B que los del suelo. Para ello, 20 aislados del HE Beauveria bassiana obtenidos de suelo y filoplano de dos ecosistemas del sur de España (dehesa y reforestación de encinas) fueron seleccionados para: (1) Ser caracterizados molecularmente con el factor de elongación EF1-α y la región intergénica nuclear Bloc, (2) Estudiar su diversidad utilizando 4 microsatélites (ISSR), (3) Evaluar sus requerimientos térmicos, hídricos y de UV-B. El análisis genético reveló diferencias entre los aislados, y mostró relación entre los microsatelites y EF1-α/Bloc. De los 20 aislados estudiados, se obtuvieron dos haplotipos, uno que contenía los aislados de la secuencia tipo del grupo ST1 y un segundo haplotipo que contenía el resto de aislados agrupados en tres secuencias tipo (ST2, 3 y 4). Las secuencias tipo ST2, 3 y 4 son aparentemente polifiléticas, lo que sugiere heterogeneidad temporal aparecida entre estos tres grupos. Este análisis sugiere que no hay una relación directa entre el origen de los aislados y su diversidad genética. Una vez caracterizados molecularmente, se procedió al estudio de la respuesta de los aislados frente a los principales factores climáticos (temperatura, humedad y radiación UV-B) para dilucidar una posible relación entre la ecología de estos aislados y su origen, secuencia tipo o haplotipo. El efecto de la temperatura sobre la germinación y crecimiento diametral se evaluó sometiendo a los distintos aislados a temperaturas de entre 15 a 35 ºC. Estos presentaron un óptimo de temperatura en el crecimiento micelial que osciló entre de 23.8 y 28.7ºC y un porcentaje de germinación, máximo para todos los aislados a 25ºC, entre 64.6 y 94.3% tras 18 horas de incubación. La actividad del agua (aw) se evaluó en la germinación de los conidios enfrentándolos a distintos valores de aw (1-0.862) obtenidos mediante la adición de glicerol al medio de cultivo. Todos los aislados presentaron valores máximos de germinación entre 1 y 0.996aw, a partir del cual la germinación comenzó a decrecer en la mayoría de ellos. Tan sólo 4 aislados germinaron a 0.928aw. Por debajo del mismo no germinó ningún aislado tras 24 horas de incubación. Finalmente, los conidios de los aislados se expusieron a dos irradiancias (920 y 1200mW m-2) durante 2, 4 y 6 horas. En este caso, se evaluó la germinación, las unidades formadoras de colonias (o culturability) y el crecimiento micelial. En el caso de la germinación, se observó que los conidios perdían capacidad germinativa cuanto mayor era la irradiancia y tiempo de exposición, un hecho que no fue tan evidente en la formación de colonias o el crecimiento micelial. Parece ser que los propágulos se “recuperan” tras la exposición, una recuperación que es menor cuanto mayor es el tiempo de exposición (6h) y la irradiancia (1200 mW m-1). Se podría decir que los hongos entomopatógenos procedentes del filoplano, aparentemente más expuestos a valores extremos de los factores ambientales evaluados, podrían haber evolucionado para resistir las condiciones más desfavorables. Los resultados de este trabajo muestran claramente que el hábitat no siempre origina genotipos con mejor competencia ambiental.

Environmental abiotic factors such temperature, moisture and ultraviolet radiation (UV-B) highly influence presence, distribution and persistence of entomopathogenic fungi (EF) in their natural habitats (soil or plants phylloplane). However, protection against these factors is greater in the soil than in the plant phylloplane. For that, one of the objectives of the present work has been to determine whether the phylloplane could harbour fungal isolates better adapted to extreme conditions of temperature, humidity and UV-B exposure than those from the soil. For that, twenty isolates of the EF Beauveria bassiana obtained from soil and phylloplane of two ecosystems from the south of Spain (holm oak dehesa and reforestation) were selected to: (1) be molecularly characterized with elongation factor 1-α(EF1-α) and the intergenic nuclear region Bloc, (2) Study their diversity using with 4 microsatellites primers (ISSR); (3) Evaluate their thermal, humidity and UV-B requirements. From the 20 B. bassiana isolates, two haplotypes were obtained, one contained the type sequence of TS1 group and the second one contained the rest of isolates grouped in three type sequences (TS2, 3 and 4), which were apparently polyphyletic, and could represent temporal heterogeneity between these three groups. Besides, similar patterns of isolate grouping were observed by using microsatellites (ISSR) and TEF/Bloc. The analysis revealed that these TS were not linked to isolate habitat (soil or phylloplane) or origin, holm oak dehesa or reforestation. The temperature effect on germination and colony growth was evaluated in the range 15-35 ºC. The optimal temperature for mycelia growth ranged between 23.8 and 28.7 ºC, and the germination percentage (maximum at 25ºC for all isolates) ranged between 64.6 and 94.3 % after 18 hours of incubation. The water activity (aw) effect on conidia germination was evaluated against different values of aw (1 – 0.862), which were obtained adding glycerol to the medium. All isolates showed maximum germination values between 1 and 0996 aw. Only 4 isolates germinated at 0.928 aw. Germination at aw values lower than 0.928 was not observed for any isolate. Finally, conidia were exposed to different irradiances (920 and 1200 mWm-2) during 2, 4 and 6 hours, and germination, culturability and mycelia growth were evaluated. All isolates exhibit an initial delay on germination for higher irradiance and longer exposition time, whereas a recovery seemed to occur as revealed by the higher culturability rates and colony growth values. It could be concluded that a "recovery" of the fungal propagules could occur after exposition to UV-B, even if such recovery is lower for longer exposure times (6h) and irradiance (1200 mW m-1). It could be argued that isolates of entomopathogenic fungi from the phylloplane that are most exposed to abiotic environmental factors could have evolved to resist more unfavorable environmental conditions, the present work results clearly shows that such habitat not always provide the more environmentally competent genotypes.