Caracterización de la variabilidad de poblaciones de Pinus occidentalis Swartz en la República Dominicana mediante el empleo de técnicas morfoanatómicas y moleculares

Abstract

1. Introducción o motivación de la tesis. Específicamente los trabajos de investigación realizados con el P. occidentalis en República Dominicana, han estado orientados hacia su manejo como especie forestal, abarcando temas tales como el cálculo de volumen del árbol, predicciones y modelos de crecimiento, enfoques no lineales en el volumen de fuste, y estudio de crecimiento de la especie en diversas localidades, entre otros. Además, existen algunas publicaciones recalcando la importancia social y el potencial económico de la especie, al ser el P. occidentalis una especie maderable, pero se conoce muy poco sobre la características y la variabilidad de sus poblaciones naturales Esto trabajo permitirá conocer el perfil genético de plantaciones y poblaciones de esta especie forestales, pudiendo aplicarse a la certificación de calidad en la producción forestal, conservación y manejo adecuado de la especie, además de caracterizar sus poblaciones y su dinámica a los efectos del cambio climático. 2. Contenido de la investigación. La presente Tesis Doctoral está centrada en el estudio del pino criollo (Pinus occidentalis Swartz), la especie más importante y representativa del ecosistema forestal dominicano, tanto desde el punto de vista medioambiental como económico. Es una especie huérfana en cuanto al estudio de su biología y de la variabilidad poblacional, en especial a nivel molecular. Se ha pretendido, mediante el uso de modelos predictivos, analizar su hábitat de distribución, y su situación futura teniendo en cuenta las condiciones de cambio climático. El estudio de la variabilidad poblacional se ha llevado a cabo mediante técnicas morfoanatómicas y moleculares, incluyendo las técnicas de marcadores de DNA, microsatélites. Por primera vez se ha utilizado la proteómica en la caracterización del proteoma de semillas y polen. Se llevaron a cabo prospecciones, se realizaron mediciones a 375 árboles y se tomaron muestras (semillas y polen) en los siguientes Parques Nacionales (Sierra de Bahoruco, Sierra de Neiba, José del Carmen Ramírez, Armando Bermúdez y Valle Nuevo). El manuscrito se ha estructurado en una introducción, discusión general y 4 capítulos adicionales en los que se han presentado y discutido los resultados relativos a los objetivos generales anteriormente indicados: 1. Determinación del impacto del cambio climático en la distribución potencial de Pinus occidentalis Swartz., en República Dominicana. 2. Determinación de la estructura del arbolado y variabilidad morfo anatómica de poblaciones de Pinus occidentalis Swartz en República Dominicana. 3. Estudio de la diversidad genética en poblaciones naturales de Pinus occidentalis Swartz., de la República Dominicana. 4. Optimización de protocolos para el análisis del proteoma de polen y semillas de Pinus occidentalis Swartz. Para los modelos de predicción se emplearon las 19 variables bioclimáticas recogidas en la base de datos wordclim. Mediante pruebas de ajuste se eligieron las cinco que presentaron mayor correlación. Se utilizó el modelo de distribución de especies R biomod2, mediante el cual se analizaron las curvas de respuesta de las variables dependientes. Para la variable Bio 8, temperatura media del trimestre más lluvioso, la probabilidad de presencia de la especie disminuyó a medida que la temperatura fue superior a los 21,6 ºC. Para Bio 7, rango anual de temperatura, la probabilidad de presencia aumentó a temperaturas por encima de 16 0 C. Para Bio 13, precipitación del mes más lluvioso, la probabilidad fue mayor a valores superiores a los 307 mm. Para la variable Bio 18, precipitación del trimestre más cálido, la probabilidad fue mayor por debajo de los 213 mmm. Por último, para Bio 19, precipitación del trimestre más frío, no hubo grandes variaciones en los valores de probabilidad. Los mapas de distribución potencial actual de la especie indicaron que las áreas más favorables para la especie fueron algunas de las estudiadas, como las de montaña en la parte central y sur de la República Dominicana. Otras zonas potenciales, como la fronteriza con Haití, no se pudieron incluir en el estudio. El estudio de la evolución futura del área potencial de distribución, en un escenario de Cambio Climático, señaló una recesión generalizada del hábitat del pino criollo en toda su área de distribución actual, siendo más acusada para el sur de la Isla donde se encontró que la probabilidad de ocurrencia de la especie disminuirá más del 50% para el año 2050; y casi un 65% para el 2070 en el caso de las poblaciones de Sierra de Neiba y de José Armando Bermúdez. Se observó que hay zonas potenciales de presencia de la especie que en las condiciones más severas (RCP 85 para el año 2070) verán reducida su potencialidad a valores mínimos no significativos. No obstante, la especie encuentra un refugio climático en las zonas más altas de la isla donde incluso en las condiciones más extremas, la probabilidad de ocurrencia seguirá siendo próxima al 100%. En el estudio de la estructura y caracterización morfológica de bosques de Pinus occidentalis en poblaciones naturales (Red de Parques Nacionales de la República Dominicana) se observó que la densidad de los individuos adultos de Pinus occidentalis (Dn≥ 15 cm) varió entre 1100 pies ha-1 (Sierra de Nieba) y 2531 pies ha-1 (José del Carmen Ramírez y Armando Bermúdez), existiendo diferencias significativas entre las diferentes localidades (F=24,27; P<0,001). Los valores de área basimétrica estuvieron comprendidos dentro del rango 151-385 m2 ha-1 (F=20,13; P<0,001). La presencia de individuos jóvenes en todas las poblaciones prospectadas fue muy baja, lo que es indicativo de una pobre regeneración natural de la especie. Todas las variables morfométricas evaluadas presentaron diferencias intrapoblacionales significativas. Los patrones de variación morfológica encontrados en los análisis de componentes principales y de conglomerados convergieron en la existencia de variación continua en las características evaluadas. Esto no permitió una clara diferenciación fenotípica a nivel interpoblacional. La variabilidad genética de las poblaciones se analizó mediante marcadores microsatélites de cloroplasto. Se emplearon trece marcadores, de los que solo ocho fueron polimórficos, siendo el número de haplotipos de 25, con 16 de ellos específicos de población. La población de Sierra de Bahoruco fue la más diferenciada y la que presentó los valores de distancia genética más altos. El análisis de varianza molecular (AMOVA) determinó que las localidades estudiadas se diferenciaron genéticamente en un 12% y la diferenciación intrapoblacional de un 88%. La diversidad genética total entre las zonas (diversidad genética intrapoblacional y la diferenciación de la diversidad), dio como resultado que la Sierra de Bahoruco presentó menor diversidad genética, por lo que requiere mayor grado de atención y de acciones que eviten la pérdida de individuos en esta localidad. Se identificaron dos grupos genéticos según los valores de distancia genética de Nei, el primero correspondió a la Sierra de Bahoruco y el otro a Sierra de Neiba y Cordillera Central. Se llevó a cabo la optimización de protocolos de análisis proteómico de semillas y de polen mediante estrategias complementarias de “gel” y “gel-free”. Mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF se identificaron, a partir de geles un y bidimensionales, 42 especies proteicas en extractos de semilla y 94 en extractos de polen. Mediante la aproximación shotgun se identificaron un total de 187 y 960 especies proteicas en semillas y polen, respectivamente. En las semillas, las proteínas de reserva fueron las más abundantes, y también se identificaron algunos alérgenos y proteasas. En el polen las proteínas relacionadas con el metabolismo fueron las más predominantes. Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen una primera aproximación al estudio molecular de la diversidad genética del pino criollo y su integración con técnicas morfoanatómicas y de predicción de hábitat. Son estudios en los que hay que profundizar dada su importancia de cara al desarrollo de estrategias de manejo y conservación de la especie, en especial en condiciones del predicho cambio climático. 3. Conclusiones. Las principales conclusiones del trabajo realizado corresponden a: 1. Según el modelo de distribución de especies la presencia de Pinus occidentalis en el sur de la Isla de la Española (Sierra de Neiba y Sierra de Bahoruco), ha sufrido una disminución significativa. 2. La validez de los modelos de distribución de especies empleados queda demostrada en el buen ajuste que se obtuvo al emplear modelos que utilizan aproximaciones estadísticas similares, logrando elevadas correlaciones en sus proyecciones, como los métodos basados en técnicas de clasificación (BRT, CART y RF). 3. A diferencia de lo descrito para otras especies, y con los modelos de predicción empleados, no se encontraron evidencias que indiquen una migración de P. occidentalis a altitudes mayores. 4. En un futuro escenario de cambio climático, los modelos prevén un descenso en la ocurrencia de P. occidentalis en Sierra de Neiba, Sierra de Bahoruco y Parque José del Carmen Ramírez, en torno al 50% para el año 2050, y 65% para el año 2070. 5. Las poblaciones de P. occidentalis presentaron densidades que variaron entre 1100 y 2531 pies ha-1, correspondientes a valore de Dn de entre 66 y 35 cm, correspondiendo el primero a poblaciones de mayor (Vallenuevo) y menor (José del Carmen Ramírez) altitud. 6. La regeneración natural de P. occidentalis La distribución de Weibull mostró que la estructura diamétrica de los individuos de P. occidentalis con diámetro mayor de 15 cm se ajustan a curvas sesgadas a la derecha (c>2) indicando la existencia de problemas de regeneración 7. Las dataciones realizadas en el estudio dendrocronológico indicaron que existe una diferencia en la edad de los individuos en las zonas muestreadas, con rango de valores de entre aproximadamente 50 y 70 años, siendo los individuos más jóvenes los encontrados en la zona de Vallenuevo. 8. Existió una mayor variabilidad intra- que inter-poblacional en las características morfométricas medidas: longitud de acícula (de 155 a 172 mm), peso del cono (de 21.9 a 32.2 g), longitud del cono (49 a 60 mm), ancho de la base del cono (22.2 a 28.6 mm) y del ápice del cono (11.8 a 15.8 mm). A partir de los datos morfométricos, se establecieron tres grupos de poblaciones, los formados por Sierra de Neiba, José del Carmen Ramírez y Armando Bermúdez, el primero, Valle Nuevo, el segundo, y Sierra de Bahoruco, el tercero. 9. El estudio de microsatélites permitió la separación de Sierra de Bahoruco, por un lado, y Cordillera Central y Sierra de Neiba, por el otro. Sierra de Bahoruco la zona de mayor diversidad haplotípica y distancia genética, respecto a la Cordillera Central y Sierra de Neiba, pero también la de menor diversidad genética total lo que presupone un mayor énfasis en los trabajos de conservación. 10. Mediante el empleo de aproximaciones proteómicas complementarias, MALDI-TOF/TOF (gel-based) y nLC-LTQ-Orbitrap (gel-free), se caracterizó el proteoma de semillas y polen de P. occidentalis, dando como resultado la identificación de 229 especies proteícas en semillas y 1054 en polen. Los proteomas de semillas mostraron un alto número de proteína de reserva, proteínas relacionadas con la respuesta a estrés, y un metabolismo primario típico en las semillas ortodoxas. Por otra parte, se encontró que el proteoma de polen fue complejo y contenía varias proteínas con funciones designadas en los mecanismos de defensa, el metabolismo energético, síntesis, procesamiento de proteínas y la formación de citoesqueleto.