Functional role and therapeutic potential of the somatostatin and ghrelin systems and their splicing variants in prostate cancer

Abstract

El cáncer es una de las amenazas más serias y complejas para la salud de la población mundial1. En concreto, el cáncer de próstata es el segundo tipo de tumor solido más frecuente entre los hombres, y causa 300.000 muertes al año en todo el mundo1. Desde su aparición en la década de los 90, el test del PSA (“antígeno prostático específico”) revolucionó el diagnóstico del cáncer de próstata, incrementado el número de pacientes diagnosticados en una fase temprana de la enfermedad 1,2. Sin embargo, debido a la compleja biología y heterogeneidad de los tumores prostáticos, la mayoría de los tumores detectados por el test del PSA presentan una baja agresividad y la probabilidad de que el paciente muera debido a su desarrollo también es relativamente baja 2-4. Desafortunadamente, el tratamiento de tumores de “baja agresividad” puede producir por sí mismo más efectos secundarios que el propio tumor2. Además, debido a que el PSA se puede elevar por causas benignas (prostatitis, toma de medicamentos, etc) presenta un elevada proporción de falsos positivos2. Aunque se están estudiando en la actualidad otros biomarcadores, ninguno de ellos ha mostrado evidencia clínica suficiente como para justificar su uso y, por tanto, se requieren nuevos biomarcadores que complementen y/o mejoren el uso del test de PSA2,5. El cáncer de próstata depende de la estimulación androgénica para su supervivencia y proliferación celular6. En la clínica del cáncer de próstata se pueden diferenciar dos fases: una primera fase en la cual los pacientes se tratan hormonalmente con el objetivo de bloquear la producción de andrógenos mediante anti-andrógenos o con análogos o antagonistas de LHRH7, y una segunda fase conocida como “cáncer de próstata resistente a la castración” (en inglés CRPC “Castration-Resistant Prostate Cancer”), en la cual los tumores se vuelven resistentes a la terapia hormonal6. Actualmente se concede un papel vital a los andrógenos residuales tras la castración y al receptor de andrógenos en la biología del CRPC8,9. De hecho, la aparición de formas truncadas de splicing aberrante del receptor de andrógeno (AR-V7) es uno de los fenómenos más importantes de esta fase, y actualmente, su presencia se considera como un marcador de prognosis e indicador de resistencia a la terapia hormonal10-12. Numerosos neuropéptidos, como los pertenecientes a la familia de factores reguladores del eje hipotálamo-hipofisario, desempeñan multitud de funciones en diversos tejidos bajo condiciones normales o en situaciones patológicas, como el cáncer. Una característica común de muchas de estas situaciones endocrino-metabólicas es la presencia atípica/ectópica, la alteración y/o la pérdida total/parcial de moléculas que, como los neuropéptidos y sus receptores, pueden controlar la función de estas células. De hecho, numerosos estudios indican que los procesos de splicing alternativo, y en particular la aparición de formas de splicing no canónico o aberrante, contribuyen al desarrollo de las patologías tumorales, y en muchos casos son potenciales biomarcadores de la enfermedad, como es el caso de las variantes del receptor de andrógeno en cáncer de próstata. En este sentido, el objetivo de la tesis doctoral se ha centrado en estudiar la presencia y el papel funcional que ejercen dos sistemas pleiotrópicos de control del organismo; en concreto, el sistema formado por la somatostatina (SST), la cortistatina (CORT) y receptores (sst1-5), incluyendo las variantes de splicing sst5TMD4/5, y el sistema de la ghrelina y sus receptores (GHSR1a/b), que incluye la variante de splicing In1-ghrelina, y la enzima GOAT, en muestras humanas de próstata sana y de cáncer de próstata. Asimismo, se evaluó la utilidad de algunas de estas moléculas como nuevos biomarcadores de diagnosis y/o prognosis de la enfermedad, y su potencial terapéutico en cáncer de próstata. 2. Contenido de la investigación El análisis inicial mediante la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de la expresión de los sistemas somatostatina y ghrelina demostró una profunda desregulación de algunos de los componentes de ambos sistemas en cáncer de próstata. Concretamente, se encontró que los receptores sst1 y sst5TMD4 del sistema somatostatina, y la enzima GOAT y la forma de splicing alternativo In1-ghrelina del sistema ghrelina, se encuentran significativamente sobreexpresados en tejidos tumorales prostáticos. La sobreexpresión del receptor sst1 ha sido previamente publicada y se relaciona con la agresividad de la enfermedad13. Por el contrario, nuestros resultados son los primeros que demuestran la sobreexpresión de sst5TMD4, In1-ghrelina y GOAT en cáncer de próstata. La sobreexpresión del receptor truncado sst5TMD4 fue especialmente significativa en los pacientes con presencia de metástasis y con peor prognosis, pudiendo ser por ello un nuevo biomarcador de agresividad. Este resultado fue descubierto inicialmente con la técnica de qPCR y se corroboró después a nivel proteico en otra cohorte de pacientes mediante la técnica de inmunohistoquimica (IHQ). Posteriormente, se analizaron las consecuencias que podría ejercer la sobreexpresión de sst5TMD4 en cáncer de próstata. Para ello, se usaron modelos in vitro (líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-dependientes y líneas resistentes a la castración) e in vivo (xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos) para demostrar que la sobreexpresión de sst5TMD4 incrementa claramente la malignidad de las células prostáticas tumorales (ej. proliferación y migración celular) y que dichos efectos se llevaban a cabo a través de la modulación de diversas vías de señalización celular claves en la biología del cáncer de próstata (ej. MAPK/ERK, MAPK/JNK, MYC/MAX, WNT, RB y TGF-β14), y de la desregulación de la expresión de oncogenes (ej. CAV1, IL-6) y genes supresores de tumores (ej. CDKN2A, APC, SFRP1, NRIP1, RARB, LOXL1). Finalmente, y con el objetivo de demostrar el potencial terapéutico de sst5TMD4 en cáncer de próstata, se silenció la expresión endógena de sst5TMD4 mediante el diseño, validación y utilización de un siRNA (“ARN pequeño de interferencia”) específico para la secuencia de sst5TMD4. El silenciamiento disminuyó la proliferación y migración celular de las células en comparación con células control. Por su parte, la expresión de la enzima GOAT se encontró incrementada en muestras tumorales prostáticas respecto a controles, y dicha expresión se correlacionó con parámetros metabólicos de los pacientes tales como el peso, su índice de masa corporal (IMC) o la presencia de dislipidemia. Este resultado se corroboró a nivel proteico, mediante IHQ, con un anticuerpo específico de GOAT. La sobreexpresión de GOAT se observó también al comparar líneas celulares de cáncer de próstata respecto a líneas celulares de próstata normal. Además, por primera vez se demostró que las células prostáticas tumorales son capaces de secretar enzima GOAT y que el tratamiento con diferentes señales metabólicas (ej. insulina, IGF-1, ghrelina y/o In1-ghrelina) regulan su expresión en la próstata. Mediante un ELISA específico se descubrió que los niveles de esta enzima están aumentados en el plasma y orina de pacientes con cáncer de próstata respecto a controles y que se correlacionan con factores de agresividad de la enfermedad, así como con diferentes parámetros metabólicos, tales como la presencia de diabetes y dislipidemia. Además, demostramos que los niveles plasmáticos de GOAT podrían servir como un nuevo biomarcador no invasivo para el diagnóstico del cáncer de próstata, especialmente en pacientes no diabéticos en los que la sensibilidad y especificidad de los niveles plasmáticos de GOAT para detectar la enfermedad son particularmente elevadas. Asimismo, nuestros resultados demuestran que la expresión de In1-ghrelina, pero no ghrelina nativa, se encuentran significativamente elevados en muestras de tejido y en líneas celulares de cáncer de próstata, así como en muestras de plasma y orina de pacientes con cáncer de próstata en comparación con muestras de tejido normal o de pacientes sanos. Dado que tanto In1-ghrelina como ghrelina nativa se expresaba en tejido sano prostático, investigamos el posible papel funcional que ambas moléculas podrían presentar en la regulación de la función prostática. Para ello se realizaron cultivos celulares de células prostáticas no tumorales, que se trataron con los péptidos acilados de In1-ghrelina o ghrelina nativa. Resultó interesante observar que el tratamiento con los péptidos de la In1-ghrelina, pero no con ghrelina aumenta la expresión (mRNA) y secreción (proteína) de PSA. Además, la sobreexpresión de In1-ghrelina, pero no de ghrelina, aumentó la proliferación de las células prostáticas sanas. Posteriormente analizamos el papel patofisiológico de la sobreexpresión de In1-ghrelina en cáncer de próstata. Para ello, utilizamos diferentes líneas celulares de cáncer de próstata que representan el amplio espectro de la enfermedad. Tanto el tratamiento con péptidos In1-ghrelina como la transfección con un vector de expresión de In1-ghrelina aumentó la proliferación y migración celular de las diferentes líneas celulares de cáncer de próstata. Más aún, este resultado se corroboró en un modelo preclínico in vivo de xenotransplante en ratones inmunodeprimidos. Se comprobó que los efectos patológicos de la In1-ghrelina se llevaban a cabo a través de la modulación de la actividad de la vía de las quinasas ERK, de un aumento de expresión de ciertos oncogenes (ej. CAV1, CAV2, IGFBP-5, LOXL1) y por una disminución de determinados genes supresores tumorales (ej. APC, SFRP1, NRIP1). Finalmente, y con el objetivo de demostrar el potencial terapéutico de In1-ghrelina en cáncer de próstata, se silenció la expresión endógena de In1-ghrelina mediante el diseño, validación y aplicación de dos siRNAs (“ARN pequeño de interferencia”) específicos para la secuencia de In1-ghrelina en varias líneas celulares de cáncer de próstata; dicho silenciamiento disminuyó la proliferación celular y la secreción de PSA de esas células en comparación con células control. 3. Conclusiones Por todo ello, los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral sobre la regulación de la expresión y el papel patofisiológico de las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina y de la enzima GOAT en el contexto del cáncer de próstata, refuerzan la relevancia de los sistemas somatostatina y ghrelina, especialmente de sus formas de splicing alternativo, en el desarrollo y progresión tumoral del cáncer de próstata. Específicamente, nuestros hallazgos demuestran que las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina y la enzima GOAT están sobreexpresadas en cáncer de próstata, donde inducen importantes alteraciones relacionadas con la agresividad tumoral. Por tanto, estas moléculas podrían servir como nuevos biomarcadores de diagnóstico y/o pronóstico y podrían representar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata.