Reparación por Escisión de Bases en la planta modelo Arabidopsis thaliana: papel en el procesamiento de lesiones inducidas por agentes alquilantes

Abstract

El ADN es la molécula portadora de la información genética, pero continuamente sufre daños entre los que destacan oxidaciones o alquilaciones de bases. La adición de grupos alquilo puede provenir de fuentes endógenas, como la S-adenosilmetionina (SAM), o de agentes externos como el metil metanosulfonato (MMS), que induce mayoritariamente N7-metilguanina (N7-meG). Uno de los principales mecanismos de defensa frente a los daños en el ADN es la ruta de reparación por escisión de bases (Base Excision Repair, BER). Esta ruta es iniciada por ADN glicosilasas, que liberan la base dañada y generan como producto un sitio abásico (sitio AP) que puede ser procesado por AP endonucleasas. Sin embargo, algunas ADN glicosilasas, denominadas bifuncionales, realizan una incisión en el sitio AP mediante una actividad AP liasa. Un subconjunto de tales ADN glicosilasas/AP liasas generan intermediarios con un extremo 3´-P que ha de ser procesado por una fosfatasa de ADN para continuar la reparación. El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral parte de la observación de que plantas de Arabidopsis thaliana deficientes en la ADN 3´-fosfatasa ZDP son sensibles a MMS. Puesto que la lesión más frecuente inducida por este agente alquilante es la N7-meG, se planteó la hipótesis de que durante la reparación de N7-meG o de alguno de sus derivados se generan intermediarios con extremos 3´-P por acción de una ADN glicosilasa/AP liasa. Los resultados obtenidos indican que la ADN glicosilasa/AP liasa FPG de Arabidopsis desempeña un papel esencial en la respuesta de la planta al MMS, ya que inicia la reparación de sitios AP procedentes de la pérdida espontánea de N7-meG. La incisión catalizada por FPG genera un intermediario con un extremo 3´-P que es hidrolizado a 3´-OH por la actividad ADN 3´-fosfatasa de ZDP. La idea generalmente aceptada es que los sitios AP de origen no enzimático son equivalentes a los generados enzimáticamente por ADN glicosilasas y que ambos pueden ser procesados por AP liasas o por AP endonucleasas. Sin embargo, en este trabajo se demuestra que la principal AP endonucleasa de Arabidopsis (ARP) procesa sitios AP procedentes de la escisión enzimática de N7-meG, pero no aquellos generados por la pérdida espontánea de dicha base. Por tanto, los resultados de esta Tesis Doctoral sugieren la existencia de diferencias previamente no detectadas entre sitios AP enzimáticos y no enzimáticos. También arrojan luz sobre las funciones desempeñadas por AP liasas y AP endonucleasas, ayudando a entender la relevancia biológica de ambas clases de enzimas para el mantenimiento de la información genética.

DNA is the carrier of genetic information but it is continuously subjected to base damage, such as oxidation or alkylation. Addition of alkyl groups to DNA bases arises both from endogenous sources, such as S-adenosylmethionine (SAM), and external agents such as methyl methanesulfonate (MMS), which mainly induces N7-methylguanine (N7-meG). A major protection mechanism against DNA damage is the Base Excision Repair pathway (BER). This pathway is initiated by DNA glycosylases, which release the damaged base and generate an abasic site (AP site) that may be processed by AP endonucleases. However, some DNA glycosylases are endowed with an AP lyase activity that cleaves the sugar-phosphate backbone. A subset of such bifunctional DNA glycosylases/AP lyases generate DNA repair intermediates with a blocking 3´-P end that must be processed by a DNA phosphatase to continue the repair pathway. The research work performed in this PhD Thesis originated from the observation that Arabidopsis thaliana plants deficient in DNA 3´-phosphatase ZDP are sensitive to MMS. Since the most abundant DNA lesion induced by this alkylating agent is N7-meG, we hypothesized that during the repair of N7-meG or some of its derivatives DNA repair intermediates with 3'-P ends are generated by the action of a DNA glycosylase/AP lyase. Results obtained indicate that the DNA glycosylase/AP lyase FPG of Arabidopsis plays an essential role in the MMS-induced DNA damage response in plants, since it initiates repair of AP sites from spontaneous base loss of N7-meG. Incision catalysed by FPG at AP sites generates a repair intermediate with a 3´-P end which is hydrolysed to 3´-OH by the DNA 3'-phosphatase activity of ZDP, thus allowing repair completion. It is generally accepted that AP sites arising from spontaneous base loss and those produced through enzymatic removal by DNA glycosylases have analogous biochemical properties and are equivalent substrates for AP endonucleases and AP lyases. However, this work shows that the major AP endonuclease in Arabidopsis (ARP) incises AP sites generated by enzymatic N7-meG excision, but not those resulting from spontaneous N7-meG loss. These findings, which reveal previously undetected differences between products of enzymatic and nonenzymatic base release, shed light on the evolution and biological roles of AP endonucleases and AP lyases.