Efecto de la Hipoxia sobre la Eficacia Terapéutica de Células Mesenquimales Derivadas de Tejido Adiposo sobre la Regeneración Renal en un Modelo Experimental de Nefropatía Diabética. Estudios In vitro e In vivo

Abstract

1. Antecedentes: La Nefropatía Diabética (ND) constituye una de las complicaciones más severas de la diabetes mellitus (DM), y es la principal causa de insuficiencia renal crónica en el mundo. Los métodos convencionales de tratamiento de la ND, solo son capaces de retrasar su evolución, por lo tanto el paciente llegará a requerir alguna terapia de sustitución renal. En ese contexto el uso de células troncales mesenquimales (MSCs) ha emergido como una alternativa prometedora para el tratamiento de la ND. La DM es una alteración metabólica sistémica que está estrechamente relacionada con el deterioro de la funcionalidad de las MSCs limitando su posible administración autóloga. Por tal motivo, se hace imprescindible establecer técnicas que permitan restaurar o reducir las alteraciones sobre la funcionalidad de las MSCs provocadas por la DM. La mayoría de los protocolos de cultivo de las MSCs mantienen a las células a una concentración de oxígeno igual a la atmosférica, del 20% al 21% (normoxia). No obstante, in vivo éstas residen en un microambiente hipóxico entre el 1% al 5% de concentración de oxígeno. Numerosos estudios in vitro han demostrado que el cultivo de MSCs en concentraciones de oxígeno cercanas a las fisiológicas mejora su funcionalidad, por lo tanto, el preacondicionamiento de MSCs en hipoxia, previo a su trasplante, podría mejorar los resultados de su aplicación. Los resultados obtenidos de la presente tesis doctoral pretenden contribuir al conocimiento del efecto del preacondicionamiento hipóxico sobre la funcionalidad de MSCs derivadas de tejido adiposo (ASCs), procedentes de ratas diabéticas inducidas, y evaluar su efectividad terapéutica en un modelo animal inducido de ND. 2. Objetivos: Evaluar el efecto, in vitro, del preacondicionamiento hipóxico sobre la funcionalidad de las ASCs obtenidas de ratas diabéticas y sanas; y su eficacia terapéutica in vivo, en un modelo murino de ND inducida por estreptozotocina (STZ). 3. Materiales y métodos: Para el estudio in vitro se aislaron ASCs de ratas Wistar isogénicas sanas (ASCs-C), y diabéticas (ASCs-D). Ambas poblaciones celulares fueron expandidas hasta el pase 2 en normoxia (N=21% O2). En ese punto las células fueron divididas en dos grupos. Uno fue mantenido en normoxia y el otro fue preacondicionado en hipoxia (H=3% O2) durante 48h, generándose así cuatro grupos experimentales de células: ASCs-CN, ASCs-CH, ASCs-DN y ASCs-DH. Las poblaciones celulares fueron caracterizadas fenotípica y funcionalmente por citometría de flujo y por ensayos de diferenciación, respectivamente. Así mismo, se llevaron a cabo estudios de duplicación celular, angiogénesis, secreción de factores paracrinos y migración. Con la finalidad de identificar los cambios genómicos de cada uno de los cuatro tipos de células, se desarrolló un estudio de microarrays, para lo que se establecieron cuatro grupos comparativos: grupo 1. ASCs-CH vs. ASCs-CN, grupo 2. ASCs-DH vs. ASCs-DN, grupo 3. ASCs-DN vs. ASCs-CN y grupo 4. ASCs-DH vs. ASCs-CH. Una vez identificada la expresión diferencial de genes (DEGs) de cada grupo comparativo, se llevó a cabo un estudio bioinformático de enriquecimiento con el interfaz web DAVID y la herramienta clusterProfiler. Además, se construyeron redes de interacción proteica (PPI) con la herramienta STRING. En el punto de partida del experimento in vivo (día 0), los animales fueron divididos aleatoriamente en un grupo control conformado por ratas sanas (C) y otro formado por ratas a las que se les indujo ND. El día 15 del estudio los animales pertenecientes al grupo de ratas ND fueron randomizados y divididos en cinco subgrupos de tratamiento por lo que el estudio in vivo quedó formado por seis grupos experimentales: grupo 1. Ratas sanas control que recibieron placebo (Solución fisiológica) (C+P), grupo 2. Ratas ND que recibieron placebo (ND+P), grupo 3. Ratas ND tratadas con ASCs-CN (ND+ASCs-CN), grupo 4. Ratas ND tratadas con ASCs-CH (ND+ASCs-CH), grupo 5. Ratas ND tratadas con ASCs-DN (ND+ASCs-DN) y grupo 6. Ratas ND tratadas con ASCs-DH (ND+ASCs-DH). Durante todo el estudio se monitorizó el peso, la glucosa, urea y creatinina en sangre, y la albúmina en orina. Esta última fue corregida por la creatinina (ratio albúmina/creatinina). También se calculó el incremento/decremento neto de estos parámetros el día 30 respecto al día 15 y el día 45 respecto del día 30. Finalmente, el día 45 se sacrificaron a los animales y se extrajeron muestras de tejido renal para la realización de un estudio histológico con microscopía óptica y electrónica de transmisión. 4. Resultados: Respecto a la caracterizaciónlos resultados mostraron que tanto las ASCs-C como las ASCs-D cultivadas en normoxia o hipoxia mantuvieron su perfil citométrico y su capacidad de diferenciación a adipocitos y osteoblastos. La cuantificación de la tasa de duplicación no fue alterada en las ASCs-C o las ASCs-D por las condiciones de cultivo. Respecto a la capacidad angiogénica de las ASCs, los resultados mostraron que la exposición a la hipoxia incrementó significativamente la capacidad de formación de estructuras tubulares, tanto en las ASCs-C como en las ASCs-D. Se observó también una menor capacidad angiogénica en las ASCs-D, independientemente de las condiciones de cultivo, en comparación con sanas. En general la cuantificación de factores de secreción demostró que el preacondicionamiento en hipoxia no modificó significativamente la secreción de VEGF, IL-6, EGF, HGF, IDO e IGF-1 por las ASCs-D respecto a sus homólogas cultivadas en condiciones normoxia. Sin embargo, la secreción de VEGF por parte de las ASCs-D fue menor en relación a las ASCs-C cuando ambas fueron cultivadas en hipoxia. Por otro lado,la secreción de IL-6 fue significativamente mayor por parte de las ASCs-D en comparación a las ASCs-C, en ambas condiciones de cultivo. También, se encontró una reducción significativa de la secreción de EGF por las ASCs-D en relación a las ASCs-C en normoxia. Los ensayos de migración hacia el VEGF no mostraron diferencias significativas ni por las condiciones de cultivo, ni por el estado de salud de las células. Al contrario, las ASCs-D mostraron una capacidad de migración hacia el SDF-1 significativamente menor respecto a las ASCs-C tras el preacondicionamiento en hipoxia. De los resultados derivados del ensayo de migración al factor EPO no se obtuvieron diferencias significativas en ninguna de las comparaciones realizadas. El análisis bioinformático del grupo 1 (ASCs-CH vs. ASCs-CN) arrojó un total de 498 DEGs, un enriquecimiento de términos relacionados con la membrana celular y una infrarrepresentación de términos vinculados con la mitosis. Además, las interacciones proteicas ntre el Abcc9-Kcnj8 y el Cenpk-Cenpn fueron las más representativas en la construcción de sus PPIs con los DEGs sobre y subexpresados, respectivamente. El estudio bioinformático del grupo 2 (ASCs-DH vs. ASCs-DN) mostró un total de 201 DEGs y el único resultado significativo derivó de la construcción de PPI con los DEGs sobreexpresados donde la interacción entre Ntrk1-Adora2a fue la más representativa. Respecto al estudio realizado en el grupo 3 (ASCs-DN vs. ASCs-CN) los resultados mostraron un total de 444 DEGs, así como, el enriquecimiento y la infrarrepresentación de términos relacionados con la glicosilación proteica y la regulación positiva de la expresión génica, respectivamente. En cuanto a la construcción de PPIs, las interacciones entre Blnk- Dapp1 y Hist1h3c-Hist2h4 fueron las más significativas de los DEGs sobre y subexpresados, respectivamente. La comparación con herramientas bioinformáticas del grupo 4 (ASCs-DH vs. ASCs-CH) reveló un total de 2213 DEGs. Además del enriquecimiento y la infrarrepresentación de términos vinculados con la glicosilación proteica y la regulación positiva de la expresión génica, respectivamente. También el uso de la herramienta clusterProfiler mostró el enriquecimiento de la vía de interacción ligando-receptor neuroactivo de la vía del ribosoma y de la vía del calcio y la infrarrepresentación de la vía de infección por virus linfotrófico humano de células T tipo 1, de la vía de desregulación transcripcional en cáncer y de la vía del factor de necrosis tumoral. Respecto a la construcción de PPIs, las interacciones entre Rpl11-Rps5 y Kdr-Vegfa fueron las más significativas para los DEGs sobre y subexpresados, respectivamente. El estudio in vivo mostró que el día 0 del modelo, el peso y los parámetros bioquímicos de todos los animales incluidos en el trabajo se encontraban dentro de valores normales. También se evidenció que entre el día 15 y el día 45, las ratas pertenecientes a los grupos ND inducidos con STZ (ND+P, ND+ASCs-CN, ND+ASCs-CH, ND+ASCs-DN y ND+ASCs-DH) mostraron una reducción significativa y constante de la ganancia de peso, así como un incremento significativo y sostenido de sus valores de glucosa en sangre y albúmina en orina, que no se vieron afectados por ninguno de los tratamientos suministrados. Los resultados derivados de la cuantificación de urea y creatinina en sangre, así como del cálculo del incremento/decremento neto de los parámetros bioquímicos no mostraron cambios significativos a lo largo de todo el estudio. En general, el análisis semicuantitativo realizado en el tejido renal de los diferentes grupos experimentales mostró una reducción significativa de lesiones renales claramente identificadas como expansión mesangial, mesangiolisis, necrosis tubular aguda, presencia de microaneurismas y depósitos tubulares, cambio a células claras, engrosamiento de la membrana basal tubular y glomerulomegalia en el grupo de ratas con ND inducida que habían recibido alguno de los tratamientos celulares, independientemente del tipo celular administrado. Pero también se observó que el grupo tratado con ASCs-CH presentó una mayor reducción de ciertas lesiones como el cambio a células claras y la glomerulomegalia. Además, la reducción de lesiones renales como la presencia de quistes tubulares, de fibrosis intersticial y de infiltrado inflamatorio resultó estadísticamente significativa en el grupo de ratas ND tratadas con ASCs- CH respecto al grupo ND-placebo. Los resultados de la microscopía electrónica mostraron la ultraestructura del intenso daño renal causado por la ND e identificó las lesiones más características de este cuadro. 5. Conclusiones: El presente estudio demuestra que el preacondicionamiento en hipoxia no afecta al fenotipo ni a la funcionalidad de las ASCs in vitro. Además, con el modelo experimental de ND se ha demostrado que la inyección intravenosa de ASCs derivadas de ratas sanas y preacondicionadas durante 48 horas en hipoxia posee un efecto beneficioso sobre la recuperación del daño renal.

1. Background: Diabetic Nephropathy (DN) is one of the most severe complications of diabetes mellitus (DM),and it is the leading cause of chronic kidney disease all over the world. Unfortunately, the current treatments of DN are just effective in delaying the progression of diabetic kidney disease to the subsequent establishment of end stage renal diseasewhere patients would require renal replacement therapy. With the emergence of cell-based therapy, mesenchymal stem cells (MSCs) hold remarkable potential for modifying the evolution of DN and even in repairing injured kidney tissue. DM is a metabolic disorder which is associated with functional abnormalities of MSCs. Thus, the use of autologous MSCs in diabetic patients might be limited. Therefore, it is required to establish techniques which restore diabetes-dependent alterations on MSCs functionality. The physiological microenvironment where MSCs are located in vivo present a lower oxygen concentration ranging from 1% to 5% (hypoxia) than most of the best practice for cellular culture, commonly performed under normoxia (20-21% O2). Several in vitro studies have reported that the culture of MSCs under hypoxia conditions increase their capabilities. Therefore, hypoxic preconditioning of MSCs prior to their transplantation could generate better therapeutic outcomes. The results obtained from this doctoral thesis are intended to determine the effects of hypoxia preconditioning in the adipose-derived MSCs (ASCs) capacities isolated from diabeticinduced rats and to analyze their therapeutic effectiveness in a murine model of DN. 2. Objectives: To evaluate the effects of hypoxic preconditioning on the functionality, in vitro, of ASCs obtained from diabetic and healthy rats, and their therapeutic efficacy in a murine model of streptozotocin (STZ)-induced DN. 3. Materials and methods: Firstly, in the in vitro study, ASCs were obtained from healthy isogenic Wistar rats (ASCs-C) and diabetic rats (ASCs-D). ASCs-C and ASCs-D were isolated and cultured to passage 2 under normoxia (N=21% O2): In this point, ASCs were divided into two groups: The N group continued at the same culture conditions but the hypoxia group were preconditioned under hypoxia (H=3% O2) for 48h. As a result, four in vitro study groups were established: ASCs-CN, ASCs-CH, ASCs-DN and ASCs-DH. All ASCs were characterized phenotypically and functionally by flow cytometry and differentiation assays, respectively. With the purpose of analyze their in vitro capacities population doubling (PD), angiogenesis, paracrine activity and migration assays were carried out. To identify the molecular changes of each study group, a microarray study was developed. Thus, four comparative groups were established: group 1. ASCs-CH vs. ASCs-CN, group 2. ASCs-DH vs. ASCs-DN, group 3. ASCs-DN vs. ASCs-CN andgroup 4. ASCs-DH vs. ASCs-CH. After differentially expressed genes (DEGs) identification from each comparative group, a bioinformatics enrichment study was carried out using DAVID and clusterProfiler tools. In addition, the protein-protein interaction networks (PPIs) were constructed using STRING. On day 0, considered as the starting point of the in vivo study, the animals were randomly divided in two groups: healthy rats (C) and DN rats. 15 days after diabetic induction, all animals included in ND group were randomized into 5 groups according to the specific treatment to receive. So, finally, 6 experimental groups were formed: Group 1. Healthy control rats which received placebo (saline solution) (C+P), Group 2. DN rats which received placebo (DN+P), Group 3. DN rats treated with ASCs-CN (DN+ASCs-CN), Group 4. DN rats treated with ASCs- CH (DN+ASCs-CH), Group 5. DN rats treated with ASCs-DN (DN+ASCs-DN) and Group 6. DN rats treated with ASCs-DH (DN+ASCs-DH). Throughout the in vivo study weight, blood parameters (glucose, urea and creatinine) levels, as well as urinary albumin were measured. The levels of urine albumin were normalized by creatinine (albumin/creatinine ratio). It was also calculated the net increase/decrease of these parameters on day 30 with compared to day 15 and day on 45 with compared to day 30. Finally, on day 45 all animals were sacrificed, and samples of renal tissue were extracted for the development of a histological study on the basis of optical and electronic microscopy. 4. Results: Regarding phenotypic and functional characterization,the results showed that ASCs-C and ASCs-D cultured in normoxia or hypoxia conditions maintained their cytometric profile and their capacity to differentiate into adipocytes and osteoblasts. The results derived from PD quantification of ASCs showed that culture conditions did not significantly affect any of both cell types, regardless of the culture conditions. The angiogenic capacity of ASCs showed that hypoxia preconditioning significantly increasedthe number of tubular structures formed by both cell types, and besides that, in both culture conditions, the ASCs-D showed a significantly lower capacity to form tubular structures than healthy ASCs. The quantification of growth factors secreted by ASCs showed that hypoxia preconditioning did not modify the secretion capacity of VEGF, IL-6, EGF, HGF, IDO and IGF- 1 by ASCs-D in relation to their counterparts cultured in normoxia. Moreover, it was observed a significant reduction of VEGF and EGF secretion by ASCs-D in relation to ASCs-C in hypoxia and normoxia conditions, respectively. On the contrary, ASCs-D secreted higher levels of IL-6 in both culture conditions. Regarding to the migration assays performed with the VEGF, SDF-1 and EPO chemoattractants, the migratory capacity analyzed in ASCs-D showed that hypoxia preconditioning did not improve this capacity in relation to ASCs-C, regardless the culture conditions. But a lower migration capacity in ASCs-D toward SDF-1 in comparison to ASCs-C, after hypoxic preconditioning was observed. The bioinformatics analysis of group 1 (ASCs-CH vs. ASCs-CN) revealed a total of 498 DEGs, the overrepresentation (OR) of cell membrane-related terms and the underrepresentation (UR) of mitosis-related terms. In addition, the protein interactions between Abcc9-Kcnj8 and Cenpk-Cenpn were the most significant in the construction of their PPIs with up- and downregulated DEGs, respectively. The bioinformatics study of group 2 (ASCs-DH vs. ASCs-DN) showed a total of 201 DEGs and just a significant results in the construction of PPIs with up-regulated DEGs, where the interaction between Ntrk1-Adora2a was the most significant. The enrichment study of group 3 (ASCs-DN vs. ASCs-CN) showed a total of 444 DEGs, terms related to protein glycosylation and positive regulation of gene expression for OR and UR terms, respectively. Regarding the construction of PPIs, the interactions between Blnk-Dapp1 and Hist1h3c-Hist2h4 were the most significant of the up- and down-regulated DEGs, respectively. The study of group 4 (ASCs-DH vs. ASCs-CH) revealed a total of 2213 DEGs. and terms linked to protein glycosylation and positive regulation of gene expression as OR and UR terms, respectively. In addition, the clusterProfiler tool showed OR the ligand-receptor neuroactive interaction pathway, the ribosome pathway and the calcium pathway, and the UR of the human lymphotropic virus type 1 infection pathway, the transcriptional deregulation pathway in cancer, and the tumor necrosis factor pathway. Furthermore, the PPIs construction revealed that interactions between Rpl11-Rps5 and Kdr-Vegfa as the most significants for up and down regulated DEGs, respectively. The in vivo study showed that on day 0, the body weight and the levels of the biochemical markers were corresponded to values of healthy animals. Furthermore, 15, 30 and 45 days after STZ-injection, ND-induced rats’groups (DN+P, DN+ASCs-CN, DN+ASCs-CH, DN+ASCs-DN and DN+ASCs-DH) showed a significant reduction of their weight gain, and a significant increase in blood glucose levels and urine albumin excretion, regardless of the treatment administrated. The results derived from the measurement of blood and creatinine levels, as well as, of the quantification of the net increase/decrease of biochemical parameters did not suffer substantial changes during all study. Results derived from semiquantitative study performed on renal tissue showed a significant reduction of the mesangial expansion, mesangiolysis, microaneurysms, acute tubular necrosis, tubular deposits, clear cells change, and glomerulomegaly in DN-rat groups after cellular treatment, regardless the cell type administered, in comparison to DN-induced rats treated with placebo. The most significant reduction was observed in DN-rat groups treated with ASCs-CH for the clear cells changes and glomerulomegaly. All cellular treatments produced a reduction of tubular cysts, interstitial fibrosis and inflammatory infiltration, however these semiquantitative results were not statistically significant. Nonetheless, ASCs-CH showed greater effectiveness in reducing these lesions achieving significance in all cases. The ultrastructural analysis performed by electron microscopy displayed the severe damaged produced by DN and identified its most characteristics histological lesions. 5. Conclusions: The current study demonstrates that hypoxia preconditioning affects neither phenotype nor functionality of in vitro cultured ASCs. Furthermore, the experimental model of diabetic nephropathy reveals that intravenous administration of hypoxia-preconditioned ASCs for 48 hours isolated from healthy rats possesses a beneficial effect on renal recovery.