Cultivo de neuronas de ganglios ciliares de embrión de pollo, sobre poliornitina, polilisina, colágeno y gelatina

Abstract

Our technique for dissection of ciliary ganglia has several advantages. It does not requiere pinning the embryo head and is faster than procedure of Helfand et al, Our method for dissociation requieres using Pasteur pipettes, wick have a 20121 micropipett (Volupett) joined on the tip by Araldite. This reduces the harvest variability, making it lower than when the orifice is reduced by a microflame. Our research produced the following results. In a non-conditioned F12S10 medium neurons did not survive on poly-L-ornitine, poly-D-lysine, colagen, and gelatin. In HCM neurons extended neurites, formed nets, and survived on p-orn or p-lys for a week or a little longer. On isotonic colagen and on gelatin the neurons grow well for 24hours. The they decreased in number or died. This was due to the competition pressure of non-neurons. A larger number of neurons seemed to be able to grow and survive on p-orn than on p-lys. Densities higher than 3.6 x 104 cells per dish did not improve the results. The addition of 0.75 ml of HCM to 3 ml of F12S10 reinforced the growth and survival of neurons for at least 24 hours. A medium conditioned on skeletal muscle cells had deletereous effect on neurons. The author considers each dish of nerve cell cultures as an ecosystem (neuroecosystem), having an adaptive evolution (neurosere). Considering the neuroseres of cultures grown on p-orn, the population of neurons N+ dereases rapidly, even at high plating densidties. The N- population reached its maximun density on the third day when the number of N+ fell. On p-lys extintion process followed a similar pattern, even at a plating density of 1.3 x 105.

Nuestra técnica de disección obtusa de ganglios ciliares no requiere sujetar la cabeza del embrión con alfileres y es mas rápida que la de Helfand y col. Disociamos los ganglios con pipetas Pasteur a las que se pegan sendas micropipetas Volupett de 20µl, previo acoplamiento mediante un corto tubito de teflón. Los resultados son mas uniformes que cuando se cierra parcialmente el orificio con microllama. En medio F 1251 O no condicionado las neuronas no cultivan ni sobreviven en substratos de p-L-ornitina, p-D-lisina, colágeno isotónico o gelatina. Con medio cardiocondicionado (MCC) las neuronas cultivan y sobreviven en p-orn y p-lis, durante una semana o poco mas. Sobre colágeno isotónico o gelatina crecen bien hasta las 24 horas; después sucumben bajo la competencia de los otros tipos celulares (NN). Sobre p-orn parece mantenerse una población de neuronas mayor que sobre p-1is. El incremento del numero de células sembradas por placa, en p-orn, p-lis y colágeno, con densidades de S x 104, 6.5 x 104, 7.6 x 104 y 1.3 x 105, no parece mejorar los resultados obtenidos partiendo de 3.6 x 104 células por inoculo. La adicion de 0.75 ml de MCC a 3 ml de F12S1O permite el crecimiento y la supervivencia de neuronas, al menos durante 24 horas. Un medio condicionado por músculo esquelético (SKMCM) resultó letal para las neuronas. Consideramos que cada placa de cultivo de células nerviosas es un ecosistema que proponemos llamar neuroecosistema, con una evolución adaptativa temporal que denominamos neurosere. En nuestras neuroseres sobre p-orn la población de neuronas NI- disminuye aceleradamente, independientemente de la densidad de siembra. La población de N- tiene su máximo al tercer coincidiendo con la caída numérica de las N+. Sobre p-D-lisina la curva de extinción es similar aun a densidades de 1.3 x 105.