Centrifugación coloidal del semen crioconservado del perro para la selección de espermatozoides

Abstract

La crioconservación del esperma es un pilar básico en los programas de reproducción asistida en la especie canina, al eliminar ésta los inconvenientes del transporte de animales, permitir la reproducción de perros genéticamente superiores en aquellos casos en los que el apareamiento natural resulta imposible y al ofertar la posibilidad de almacenar el esperma indefinidamente para su posterior uso. Pese a todas estas ventajas, la fertilidad potencial del esperma congelado se ve comprometida debido a las alteraciones en la estructura y fisiología del espermatozoide que se producen tras el proceso de congelación y descongelación. Por ello, nace la necesidad de desarrollar técnicas de congelación más eficaces y procedimientos que contrarresten estas limitaciones. En la actualidad, las técnicas de separación de espermatozoides mediante la centrifugación coloidal son capaces de mejorar la calidad del esperma criopreservado, seleccionando los espermatozoides más viables (potencialmente fértiles) de una población donde la mayoría están dañados o muertos. En este sentido, la selección de espermatozoides podría ser un prerrequisito para obtener tasas de gestación óptimas tras la inseminación artificial con esperma congelado-descongelado de perro. El gradiente de densidad PureSperm® fue diseñado para la selección de espermatozoides viables y morfológicamente intactos en humanos. No obstante, ha sido empleado con éxito en varias especies animales (p. ej. primates, toro y carnero). Sin embargo, según la bibliografía consultada, no ha sido evaluado en la especie canina. Por lo expuesto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue estudiar la eficacia del coloide comercial PureSperm® para la selección de espermatozoides caninos crioconservados, evaluando diferentes parámetros de calidad seminal (motilidad, morfoanomalías, vitalidad espermática e integridad de acrosoma) en muestras seminales frescas, no seleccionadas (crioconservadas o control) y seleccionadas (crioconservadas y centrifugadas en PureSperm®). En la primera y segunda publicación se evaluó la influencia del proceso de crioconservación y de la centrifugación a través del gradiente de densidad discontinuo PureSperm® 40/80 en la calidad seminal y la estructura de las subpoblaciones cinéticas del esperma canino crioconservado. En la tercera publicación buscamos simplificar la...

Sperm cryopreservation is an integral part of assisted reproductive programs and eliminates disadvantages of animal transportation, and allows genetically superior dogs to reproduce even if natural mating is impossible, and allows breeders to store semen for future use. However, cryopreservation induces both a loss of sperm viability and an impairment of functionally of the spermatozoa surviving the thawing, thus reducing fertilizing ability. Therefore, it is important to develop a suitable technique to cryopreserve mammalian spermatozoa. Currently, centrifugation techniques through layers of colloid has been satisfactorily applied to improve the quality of sperm following cryopreservation, thus selecting the most viable spermatozoa (potentially fertile) from a population where the majority has been damage or is dead. In this sense, sperm selection might be one of the prerequisites for achieving optimal conception rates after artificial insemination with frozen-thawed dog semen. The PureSperm® density-gradient was designed to select viable and morphologically intact human spermatozoa. However, it has been used inter-species (i.e. primates, bull, and ram) with acceptable results. However, to our knowledge, studies on the effect of Puresperm® centrifugation on frozen-thawed dog semen have not been reported. The main aim of this Doctoral Thesis was to investigate if centrifugation through PureSperm® can improved the post-thaw quality of dog semen, based on the evaluation of sperm motility, morphology, viability and acrosome integrity in fresh semen, unselected semen samples (post-thawing or control) and selected preparations (after centrifugation of thawed samples through PureSperm®). In the first and second papers of this series we evaluated the effects of both cryopreservation and discontinuous density-gradient centrifugation through PureSperm® 40/80 on semen quality and structures of motile sperm subpopulations of frozen-thawed dog semen. The third paper tried to simplify the sperm selection technique used in the other ones, using single-layer centrifugation through PureSperm® 80 after cryopreservation. During the experimental period, nine healthy, mature dogs of different breeds (3 Spanish Greyhounds, 1 German Pointer, 1 Crossbreed and 4 Beagles) were used. In total, twenty ejaculates were collected by digital manipulation (10 ejaculates for...