In Vivo determination of intracellular pH using pHLuorin proteins in Fusarium Oxysporum

Abstract

El pH extracelular juega un papel clave en los niveles de fosforilación de las MAP quinasas de Fusarium oxysporum. Además, existen evidencias significativas de que la virulencia de distintos patógenos fúngicos se ve alterada directamente por el pH extracelular. Actualmente se desconoce como el pH extracelular afecta al pH intracelular. En este trabajo, hemos hecho uso de una proteína fluorescente sensible al pH, la pHluorin. Dicha proteína posee la misma estructura que la GFP, pero con modificaciones que permiten medir el pH en el interior celular como valor radiométrico a dos longitudes de excitación y una de emisión. Esta proteína ha sido ampliamente utilizada en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El objetivo de este trabajo ha sido la construcción de cepas de F. oxysporum que expresan de forma constitutiva el gen de la pHluorin, y la optimización de las condiciones experimentales para la medida del pH intracelular. Una vez optimizada la metodología, se identificaron cambios significativos en el pH intracelular cuando la célula fue sometida a cambios drásticos de pH extracelular. Cuando las germínulas se sometieron a pH 9 se observó una subida rápida, seguida por una bajada gradual hasta alcanzar el valor homeostático entre 5.5 y 6.5. Por el contrario, cuando las germínulas se sometieron a pH 4 se detectó una bajada seguida por una subida muy lenta, siendo aún desconocido el mecanismo por el cual la homeostasis de pH es llevada a cabo. Además se observó una acidificación en presencia de glucosa, de forma opuesta a lo anteriormente descrito en levadura. Esta acidificación puede deberse a la entrada de glucosa en el interior celular, mediada por un sinporte con protones. Futuros experimentos serán necesarios para determinar los mecanismos de regulación de la homeostasis del pH intracelular cuando las germínulas se someten a pH 4 y pH 9 y su papel en la señalización y la virulencia de este patógeno.