Análisis transcriptómico y proteómico de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 en respuesta a cianuro
Autor
Escribano Fernández, María de la Paz
Director/es
Roldán Ruiz, María DoloresLuque Almagro, Víctor M.
Editor
Universidad de Córdoba, UCOPressFecha
2016Materia
Bacterias cianotrofasPseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344
Análisis transcriptómico
Análisis proteómico
Cianuro
Residuos cianurados
METS:
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Mostrar el registro completo del ítemResumen
El cianuro es un compuesto natural muy tóxico para los seres vivos debido a su elevada
afinidad por los metales, lo que provoca la inhibición de metaloenzimas, algunas de ellas
esenciales para la vida. Además, esta afinidad del cianuro por los metales podría disminuir
de la biodisponibilidad de algunos metales necesarios para procesos biológicos específicos.
Muchos organismos son capaces de producir cianuro (cianogénesis), tolerarlo e incluso
asimilarlo. Las plantas son la mayor fuente de producción de cianuro en la naturaleza.
Algunos microorganismos, incluidos los cianogénicos, han desarrollado mecanismos de
resistencia frente a este compuesto tóxico, basados principalmente en la síntesis de una
oxidasa alternativa insensible a cianuro implicada en la respiración. La asimilación de
cianuro por parte de organismos denominados cianotrofos requiere, además de un sistema
de resistencia, una ruta de degradación de cianuro que confiriera la capacidad de utilizar
este compuesto como fuente de nitrógeno. Estos organismos cianotrofos tienen un
importante potencial biotecnológico ya que pueden ser utilizados en procesos de
biorremediación de residuos contaminados con cianuro, incluyendo efluentes procedentes
de la joyería y la minería.
Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 es una bacteria cianotrofa aislada del río
Guadalquivir a su paso por Córdoba. Su carácter alcalófilo permite utilizar condiciones de
pH superiores al pKa del par cianuro/ácido cianhídrico (9,2), disminuyendo así el riesgo de
volatilización del ácido cianhídrico (HCN) a la atmósfera. Varios estudios han elucidado los
principales mecanismos de resistencia y asimilación de cianuro en esta bacteria. En la ruta
de asimilación, el cianuro reacciona químicamente con el oxalacetato generando una
cianhidrina que es posteriormente utilizada como sustrato por la nitrilasa NitC para formar
amonio. A pesar de que la resistencia y asimilación de cianuro han sido ampliamente
estudiadas en este microorganismo, se desconoce la respuesta global de la cepa CECT5344
en el metabolismo del cianuro. La secuenciación y el análisis del genoma completo de P.
pseudoalcaligenes CECT5344 ha posibilitado llevar a cabo en este trabajo estudios
proteómicos y transcriptómicos en respuesta a cianuro. De forma específica se ha
estudiado la homeostasis del hierro en relación con el cianuro. Así, se ha establecido la
respuesta, a nivel proteómico, de P. pseudoalcaligenes CECT5344 en condiciones de
limitación de hierro. Las proteínas inducidas en estas condiciones de escasez de hierro no se indujeron por cianuro, por lo que se descartó que el cianuro genere deficiencia de hierro
en la estirpe CECT5344.
Mediante micromatrices de DNA se llevó a cabo el análisis transcriptómico de esta
bacteria cianotrofa en respuesta a cianuro, a residuo cianurado de la joyería y a
condiciones de limitación de nitrógeno. Con los datos obtenidos se realizó un análisis
funcional, lo que permitió conocer procesos biológicos específicamente afectados por
cianuro, incluyendo el sistema de respiración insensible a cianuro (CIO) y algunas nitrilasas
(entre ellas, la nitrilasa NitC). Específicamente inducidos por el residuo joyero se han
encontrado genes de tolerancia a metales, tales como genes relacionados con sistemas de
extrusión de metales y genes reguladores. Algunos componentes inducidos por cianuro,
posiblemente implicados en la resistencia a cianuro, fueron estudiados mediante un análisis
mutacional. Los mutantes deficientes en las proteínas DapA (dihidropicolinato sintasa) y
AhpC (alquilhidroperóxido reductasa) presentaron un fenotipo sensible a cianuro, lo que
confirmó que ambas proteínas participan en el metabolismo del cianuro. En el caso de la
proteína DapA podría participar en la reorganización de los centros sulfoférricos
afectados por el cianuro, mientras que AhpC podría estar involucrada en la resistencia al
estrés oxidativo generado por el cianuro. Cyanide is a natural toxic compound that displays a very high affinity for metals, inhibiting
metaloenzymes which are essential for life. This affinity of cyanide for metals may also be
responsible of a decrease in the biodisponibility of essential metals for specific biological
processes. A large number of microorganisms are able to synthesize (cyanogenics),
tolerate or even assimilate cyanide (cyanotrophics). Plants are the main source of cyanide
in nature. Some microorganisms, including cyanogenics, have developed mechanisms of
resistance forward cyanide, mainly based on the synthesis of a cyanide insensitive
alternative oxidase. In addition to a cyanide resistance system, cyanide assimilation
requires a degradation pathway in order to use cyanide as a nitrogen source. Cyanotrophic
microorganisms have a significant biotechnological potential because they can be applied in
bioremediation of industrial cyanide-containing wastewaters, including jewelry and mining
residues.
Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 is a cyanotrophic bacterium isolated
from the Guadalquivir River (Córdoba). This is an alkaliphilic bacterium, with an optimun pH
of growth of 9,5-10. This fact allows to establish a very alkaline pH value, higher than the
pKa 9,2 of the CN-/HCN pair, thus avoiding HCN losses. Several studies have elucidated
the main mechanisms of cyanide resistance, as well as the cyanide assimilation pathway in
P. pseudoalcaligenes CECT5344. In this bacterium cyanide chemically reacts with
oxaloacetate producing a cyanohydrin that it is further metabolised to ammonia by the
nitrilase NitC. Although cyanide resistance and assimilation have been studied in detail in
this bacterium, the global response to cyanide of the strain CECT5344 is unknown.
Sequencing and analysis of the whole genome of P. pseudoalcaligenes CECT5344 has
facilitated to carry out this work that includes transcriptomic and proteomic studies in
response to cyanide. Specifically, we have studied iron bioavailability related with cyanide,
and the response of P. pseudoalcaligenes CECT5344 to iron starvation at proteomic level
has been established. Proteins induced by iron starvation were not present in the
proteome of cyanide-asimilating cells, discarding the hypothesis that cyanide causes iron
stress in the strain CECT5344.
DNA microarrays were performed in order to study the transcriptome of this
cyanotrophic strain in response to cyanide, as well as to cyanide-containing wastewater and nitrogen starvation conditions. A functional analysis of the results allowed the
identification of specific biological processes affected by cyanide, including the cyanide
insensitive oxidase (CIO) for respiration in the presence of cyanide and several nitrilases
(one of then, the nitrilase NitC). Specificaly induced by the jewelry residue were genes
involved in tolerance to metals like regulatory genes and metal extrusion related genes.
Some of the cellular components induced by cyanide, and possibly involved in cyanide
resistance, were studied by mutational analysis. Mutant strains deficient in DapA
(dihydrodipicolinate synthase) or AhpC (alkyl hydroperoxide reductase) presented a
phenotype more sensitive to cyanide, thus confirming the participation of these proteins in
cyanide metabolism in P. pseudoalcaligenes CECT5344. The DapA protein could participate
in the reorganization of the iron-sulphur clusters, a target for cyanide, while AhpC could
be involved in the resistance to oxidative stress generated by cyanide.