Evaluación del daño hepático y respuesta inmunitaria local en cabras vacunadas con Catepsina L1 e infectadas con Fasciola Hepatica

Abstract

El objetivo del presente estudio ha sido estudiar la eficacia protectora, así como las lesiones hepáticas y la respuesta inmunitaria inmunitaria local en cabras inmunizadas con catepsina L1 recombinante (CL1) de F. hepática con dos adyuvantes (Montanide Isa 70 VG y Quil A), con el segundo adyuvante se estudiaron las lesiones y respuesta inmunitaria en fases tempranas y tardías de la enfermedad. Para alcanzar los objetivos propuestos se realizaron dos experiencias, en la Experiencia 1 se utilizaron 21 cabras, hembras, de raza Florida Sevillana de 4 meses de edad que fueron divididas en tres grupos: los grupos 1 y 2 correspondieron al grupo adyuvante (n=8) (Montanide) y grupo inmunizado con CL1 en Montanide (n=8), respectivamente; el grupo 3 (n=5) correspondió al grupo control negativo (no infectado y no inmunizado). Sobre los grupos 1 y 2 se realizaron tres inmunizaciones separadas entre ellas por un periodo de 3 semanas. Posteriormente, en la 10ª semana desde la primera inmunización, los animales fueron infectados con 200 metacercarias viables de F. hepatica procedentes de la Universidad de Bristol (Reino Unido), y finalmente sacrificados 15 semanas después de la infección (15 spi) para estudiar el número de parásitos, eliminación de huevos, lesiones hepáticas y respuesta inmunitaria en fases tardías. En la Experiencia 2 se utilizaron 27 cabras, machos, de raza Malagueña de 4 meses de edad que fueron dividas también en 3 grupos: los grupos 4 y 5 correspondieron al grupo adyuvante (n=10) (Quil A) y grupo inmunizado con CL1 utilizando Quil A como adyuvante (n=10) respectivamente; el grupo 6 (n=7) correspondió al grupo control negativo (no infectado y no inmunizado). En los grupos 4 y 5 se realizaron dos inmunizaciones separadas por 4 semanas y posteriormente se infectaron en la semana 10 con una dosis de 100 metacercarias de F. hepatica de origen ovino (Ridgeway Research Ltd., UK). Además, en este ensayo tres animales de cada grupo fueron sacrificados por inyección intravenosa de tiobarbital a los 7, 8 y 9 días después de la infección (dpi) para estudiar los cambios durante las primeras etapas de la misma. Las cabras restantes (7 animales en los grupos 4 y 5; 4 animales en el grupo 6) fueron eutanasiadas 15 semanas después de la infección (15 spi). Las dos experiencias fueron aprobadas por el Comité de bioética de la Universidad de Córdoba para experimentación animal, referencia N. 7119. El estudio parasitológico no mostró diferencias significativas entre los grupos vacunados y controles adyuvantes en ambas experiencias, tanto en el número de parásitos recuperados como en la tasa de implantación. El análisis estadístico llevado a cabo respecto a la longitud y anchura de los parásitos adultos tampoco mostró diferencias significativas entre los grupos de ambas experiencias, exceptuando el ancho observado en los animales pertenecientes a la experiencia 1 donde esta medida si fue significativamente menor en el grupo vacunado. Respecto a la ganancia de peso no hubo diferencias entre grupo vacunado y control adyuvante en la experiencia 1, mientras que en la experiencia 2 sí hubo una ganancia de peso significativamente mayor en el grupo vacunado respecto al control de adyuvante. El estudio anatomopatológico macroscópico en las fases tardías de ambas experiencias mostró lesiones típicas de la infección por F. hepatica y coinciden de forma genérica con las observadas por otros autores en ovinos y caprinos. Si bien los animales de ambas experiencias mostraron lesiones similares, éstas fueron más severas en los animales de la experiencia 1 respecto a los de la experiencia 2 como cabría esperar debido a la mayor dosis de infección y mayor número de parásitos recuperados. Respecto a los nódulos linfáticos hepáticos en ambas experiencias se observó un aumento significativo en el tamaño y el peso de los grupos infectados respecto al control no infectado...

The aim of this study was to investigate the protective efficacy as well as liver damage and local immune response in goats immunized with recombinant cathepsin L1 (CL1) of Fasciola hepatica with two adjuvants (Montanide ISA 70 VG and Quil A). Hepatic damage and local immune response in early and late stages of the infection were studied in the second adjuvant trial. To achieve these objectives two experiments were conducted, in the first one 21 females, Florida Sevillana, 4-months of age goats were divided into three groups: groups 1 and 2 correspond to the adjuvant group (n = 8 ) (Montanide) and CL1 in Montanide (n = 8), respectively; Group 3 (n = 5) corresponded to the negative control group (not infected and not immunized). On groups 1 and 2 three immunizations were administered subcutaneously 3 weeks apart. Subsequently, at week 10 from the first immunization, the animals were infected with 200 F. hepatica metacercariae (University of Bristol,UK), and finally animals were sacrificed 15 weeks post infection (15 wpi) to study the number of parasites, egg output, liver damage and local immune response. In second trial 27 male, Malagueña, 4-months of age goats were also divided into 3 groups: Groups 4 and 5 corresponded to the adjuvant group (n = 10) (Quil A) and immunized group CL1 (n=10), respectively; Group 6 (n = 7) corresponded to the negative control group (not infected and not immunized). In groups 4 and 5 two subcutaneous immunizations were administered 4 weeks apart, and 10 weeks after first immunization animals were orally infected with a dose of 100 F. hepatica metacercariae of ovine origin (Ridgeway Research Ltd., UK). Moreover, in this trial three animals from each group were sacrificed by intravenous injection of thiobarbital at 7, 8 and 9 days after infection (dpi) to study liver damage and local immune response in the early stages of infection. The remaining goats (7 animals in groups 4 and 5; 4 animals in Group 6) were euthanized 15 weeks after infection (15 wpi). The two experiments were approved by the Bioethics Committee of the University of Cordoba to animal experiments, reference N. 7119. Parasitological study showed no significant difference between vaccinated groups and adjuvants groups in the two experiences, for both the number of parasites recovered as the implantation rate. The statistical analysis carried out with respect to the length and width of the adult parasites also showed no significant differences between vaccinated and adjuvant controls, except the fluke width which was lower in the vaccinated group respect to the adjuvant group. Animal weight gain did not differ between adjuvant and vaccinated group in vaccine trial 1, while significantly greater in the vaccinated group compared to the adjuvant control group the second vaccine trial The macroscopic pathologic examination at 15 wpi in both experiences showed lesions typical of chronic fasciolosis such as whitish tortuous scars over the liver surface, mainly involving the left lobe, enlarged bile ducts and gallbladder. The severity of gross hepatic lesions was higher in animals from the first vaccine trial which was correleated with the higher dose administered and higher number of parasite recovered. In the two vaccine trial the severity of gross hepatic lesions was similar in vaccinated and their adjuvant control groups. Regarding the hepatic lymph nodes in both experiences a significant increase in the size and weight of the infected compared to uninfected control groups, were noted. Liver microscopic lesions observed at 15 wpi of both experiences were similar to those described by other authors in chronic infections of F. hepatica. Comparison between vaccinated and adjuvant control groups showed no significant differences, except for the increased number of eosinophils and globular leukocytes in the first trial CL1 vaccinated group, while the Montanide group showed higher number of granulomas...