Amplification and cloning of cDNAS of cytochrome P4501A1 and metallothionein genes from Sparus aurata Linnaeus, 1758 and Liza aurata (Risso, 1810) by Race-PCR

Abstract

The biotransformation of xenobiotics found in marine ecosystems is catalysed by inducible systems, a property that makes them useful as early-warning biomarkers of environmental pollution. We have focused our study on cytochrome P4501A1 (CYP 1A1) as a phase I response against organic aromatic xenobiotics, and metallothionein (MT), which reflects pollution by transition metals. The high homology existing between the sequences of both genes, already cloned in different fish species, enabled us to design degenerate oligos to amplify by RT-PCR specific sequences of CYP 1A1 and MT genes in two teleost fish species of the Spanish South Atlantic littoral, the gilthead seabream, Sparus aurata Linnaeus, 1758, and the grey mullet, Liza aurata (Risso 1810). To this end, the expression of both genes was previously induced by intraperitoneal injection with Aroclor 1254 (CYP 1A1) and CdCl2 (MT). The specific sequences for both genes amplified by RT-PCR with degenerate oligos were subsequently used to design new, specific oligos to obtain by Race-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) the complete cDNAs coding for both genes in both fish species, which were subsequently cloned and sequenced. The coding sequences and the corresponding proteins were compared with those already obtained in other fish species. We are currently developing homologous probes for mRNA quantification using molecular biology techniques in both fish species, to be employed as molecular biomarkers of pollution in the Spanish South Atlantic littoral

La biotransformación de xenobióticos presentes en ecosistemas marinos está catalizada por varios sistemas inducibles, lo que permite su uso como biomarcadores de alerta temprana de contaminación ambiental. Este estudio se ha centrado en el citocromo P4501A1 (CYP 1A1), como respuesta de fase I contra xenobióticos orgánicos aromáticos, y la metalotioneína (MT), que refleja la contaminación por metales de transición. La alta homología existente entre las secuencias de ambos genes previamente clonados en diferentes especies de peces permitió diseñar oligos degenerados para amplificar por RT-PCR secuencias específicas de los genes CYP 1A1 y MT en dos especies de peces teleósteos del litoral suratlántico español, la dorada Sparus aurata Linnaeus, 1758 y la lisa Liza aurata (Risso, 1810). Para ello, la expresión de ambos genes se indujo por inyección intraperitoneal con Aroclor 1254 (CYP 1A1) y CdCl2 (MT). Las secuencias específicas de ambos genes, amplificadas por RT-PCR con tales oligos, se usaron posteriormente para diseñar nuevos oligos específicos; éstos se usaron para amplificar por Race-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) los cDNAs completos que codifican tales genes en ambas especies de peces, que fueron posteriormente clonados y secuenciados. Las secuencias codificantes y las proteínas correspondientes se han comparado con las obtenidas en otras especies de peces. Actualmente se desarrollan sondas homólogas para cuantificar por métodos de biología molecular los mRNAs específicos en ambos peces, para su uso como biomarcadores moleculares de contaminación en el litoral suratlántico español