Identification of new biomarkers to predict the risk of Type 2 Diabetes Mellitus in patients with Cardiovascular Disease: CORDIOPREV-DIAB study

Abstract

During the last years, the prevalence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) has steadily increased; it has been estimated that the current number of T2DM patients worldwide will double over the next two decades, and similar trends have been reported for obesity. In addition, T2DM frequently goes undiagnosed for many years because hyperglycemia develops gradually, and, in its earlier stages, is not severe enough for the patient to note any of the classic symptoms of diabetes. It is, therefore, critical that there be early identification of individuals at high risk for developing diabetes in order to devise prevention strategies aimed at controlling the factors related to the development of the disease. The traditional biomarkers used to identify patients at risk of developing the disease, including fasting glucose, glucose after 2 hours of OGTT, HbA1c, glucose-homeostasisrelated parameters, lipid types and scores such as the Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC), have limitations leading to low accuracy and efficiency. Therefore, it is necessary to research into new biomarkers to improve sensitivity and specificity and increase the predictive value. Insulin resistance (IR) and impaired beta-cell function are key determinants of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Previous studies have demonstrated the role of endotoxemia in the develop of IR. Intestinal absorption of bacterial components such us endotoxin lipopolysaccharides (LPS) activates the toll-like receptors inducing inflammation, and this in turn, leads to IR. However, this sequence of events is not well-established, and it is still unclear whether IR precedes the changes in the microbiota or vice-versa. Recently, an association between endotoxemia and the risk of developing diabetes was demonstrated; although, this study was subject to severe, uncontrolled confounding factors. In addition, microRNAs (miRNAs) are recognized as important regulators of gene expression and central players in the control of several biological and pathological processes, including insulin signaling and beta cell dysfunction. Previous studies suggest the use of miRNAs as biomarkers of T2DM, and they may be a more sensitive way to predict development of the disease than the tools currently used. However, longterm follow-up studies in larger populations with incident cases of T2DM are necessary to identify the role of miRNAs during the development of the disease and to use that information to help identify new T2DM predictive biomarkers. Hypothesis Our hypothesis is that plasma levels of different biological markers, such as miRNAs, LPS and metabolite profile, could become highly valuable and useful as predictive biomarkers to identify normoglycemic and prediabetic patients with a higher risk of developing T2DM., Objectives To identify new biomarkers with the potential to evaluate the probability and predict the develop of type 2 diabetes mellitus in high-risk patients with coronary heart disease. Subjects, design and methodology of the publications Paper 1: We included in the present work the 462 patients who had not been clinically diagnosed with T2DM at baseline in the CORonary Diet Intervention with Olive oil and cardiovascular PREVention study (CORDIOPREV)(NTC00924937). Of these, 107 patients developed T2DM according to the American Diabetes Association (ADA) diagnosis criteria after a median follow-up of 60 months (Incident-DIAB group), whereas 355 patients did not develop the disease during this period (Non-DIAB group). Two metabolic challenges, a fat overload and an oral glucose tolerance test, were performed on consecutive days at the beginning of the study and after 3 years of follow-up. Plasma levels of LPS were measured in the whole population and lipopolysaccharide binding protein (LBP), IL-6, MCP1 and TNF-a were determined in a subpopulation of 226 patients. Cox proportional hazards regression analyses were performed in order to determine the potential use of LPS postprandial levels as a predictor of T2DM development. Paper 2: The study was conducted in the 462 non-diabetic patients at baseline of the CORDIOPREV study. The plasma levels of 24 miRNAs were measured at baseline by qRT-PCR, and other strong biomarkers to predict diabetes were also measured. Orthogonal Partial Least Squares Discriminant (OPLS-DA), Receiver Operating Characteristic (ROC) and Cox regression analysis were used to evaluate the potential predictive value of the circulating miRNAs in the development of T2DM. Paper 3: This study included the 462 patients without disease at baseline from the CORDIOPREV study. After a median follow-up of 60 months, 107 of the subjects developed the disease, 30 developed prediabetes, 223 maintained prediabetes and 78 remained disease-free. The plasma levels of four miRNAs linked to insulin signaling and beta-cell function were measured by RT-PCR. We analyzed the relationship between the miRNAs levels and insulin signaling and release indexes at baseline and after the follow-up period. The risk of developing the disease was evaluated through a Cox analysis based on tertiles (T1-T2-T3) of baseline miRNAs levels. Other approach: A group of 52 patients from the CORDIOPREV study without T2DM at baseline was selected, 26 of whom developed the disease after 3 years of follow-up. We studied the differences in the metabolomic profile between groups in plasma samples in the fasting and postprandial states at baseline. Principal component analysis (PLS-DA and OPLS-DA) and ROC analysis were carried out with the plasma levels of the metabolites identified to evaluate the predictive value of T2DM development. Results Paper 1: We observed a postprandial increase in lipopolysaccharide (LPS) levels in the Incident-DIAB at baseline (P < 0.001), whereas LPS levels were not modified in the Non-DIAB. The COX regression analysis based on the LPS postprandial fold change improved the T2DM risk assessment as compared with the previously described FINDRISC score (hazard ratio of 2.076, 95% CI 1.149-3.750 vs. 1.384, 95% CI 0.740- 2.589). Moreover, a COX regression analysis merging the LPS postprandial fold change and FINDRISC score together showed a hazard ratio of 3.835 (95% CI 1.323-11.114), linked to high values of both parameters. Paper 2: The ROC analysis identified 9 miRNAs, which, added to HbA1c, have a greater predictive value in the early diagnosis of type 2 diabetes (AUC = 0.8342) tan HbA1c alone (AUC = 0.6950). The miRNA and HbA1c-based model did not improve when the FINDRISC was included (AUC = 0.8293). The COX regression analyses showed that patients with low miR-103, miR-28-3p, miR-29a, and miR-9 and high miR- 30a-5p and miR-150 circulating levels have a higher risk of disease (HR = 11.27; 95% CI = 2.61–48.65). Paper 3: We observed higher miR-150 and miR-30a-5p and lower miR-15a and miR-375 baseline levels in type 2 diabetes than disease-free subjects. Patients with high miR-150 and miR-30a-5p baseline levels had lower disposition index (p=0.047 and p= 0.007, respectively). A higher risk of disease was associated with high levels (T3) of miR-150 and miR-30a-5p (HRT3-T1 = 4.218 and HRT3-T1 = 2.527, respectively), and low levels (T1) of miR-15a and miR-375 (HRT1-T3 = 3.269 and HRT1-T3 = 1.604, respectively). Other approach: Our study suggests that in both the fasting and postprandial state, the metabolomic profile allows us to differentiate between subjects who develop (new- T2DM) or do not develop (non-T2DM) type 2 diabetes mellitus after 3 years of followup. In fact, the ROC analysis showed that the plasma levels of specific metabolites could potentially be used as biomarkers to predict the development of the disease. Our results show an AUC of 0.794 (sensibility = 0,808, specificity= 0.731 and accuracy= 72.8%) in a model designed with the metabolites identified in the fasting analysis and a VIP score>1.5, which belongs mostly to the glycerophosphocholines family. In addition, we obtained an AUC of 0.849 (sensibility = 0,814, specificity= 0.727 and accuracy= 74.1%) with the metabolites identified in the postprandial analysis, which belong mostly to the fatty acids family. Conclusion The plasma levels of certain miRNAs, LPS and metabolite profile could have a valuable potential as biomarkers to evaluate the probability and predict the develop of type 2 diabetes mellitus in high-risk patients with coronary heart disease.

Introducción. En los últimos años, la prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) ha aumentado considerablemente. De hecho, se estima que el número actual de pacientes con DMT2 se duplicará en las próximas dos décadas con cifras similares para la obesidad. Por otra parte, la DMT2 puede permanecer sin diagnosticar durante muchos años porque la hiperglucemia se desarrolla de forma gradual, y, en etapas tempranas, no es lo suficientemente severa como ser detectada. Por tanto, es crucial la identificación temprana de aquellos pacientes con alto riesgo de desarrollar DMT2 para poder diseñar estrategias de prevención y controlar los factores de riesgo de la enfermedad. Los biomarcadores tradicionales usados para identificar pacientes en riesgo de desarrollo de la enfermedad, entre los que se encuentran la glucosa plasmática en ayunas, la glucosa tras 2 horas del OGTT, hemoglobina glicada (HbA1c), parámetros relacionados con la homeostasis de glucosa, especies lipídicas y test como el Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC), muestran ciertas limitaciones y no son lo suficientemente eficientes y precisos. Por ello, es necesaria la búsqueda de nuevos biomarcadores que mejoren la sensibilidad, la especificidad y aumenten el valor predictivo. La resistencia a la insulina (IR) y el deterioro de la función de las células beta son factores determinantes del desarrollo de DMT2. Estudios previos han demostrado el papel de la endotoxemia en el desarrollo de resistencia a la insulina. La absorción intestinal de componentes bacterianos, como el lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram negativas, activa los receptores tipo toll induciendo inflamación, y esto a su vez IR. Sin embargo, esta secuencia de eventos no está bien establecida, y aún no está claro si la IR precede a los cambios en la microbiota o viceversa. Recientemente, se ha sugerido la asociación entre la endotoxemia y el riesgo de desarrollar DMT2, no obstante, los resultados obtenidos se vieron afectados por diversos parámetros no controlados. Adicionalmente, los microARNs (miRNAs) son reconocidos como importantes reguladores de la expresión génica y actores centrales en el control de varios procesos biológicos y patológicos, entre los que se incluyen la señalización de la insulina y la funcionalidad de la célula beta. Estudios previos sugieren el uso de los miRNAs como biomarcadores de DMT2, los cuales podrían tener una mayor sensibilidad y eficiencia para predecir el desarrollo de la enfermedad que las herramientas utilizadas actualmente. Sin embargo, son necesarios estudios longitudinales en poblaciones grandes de casos incidentes de DMT2 para conocer el papel de los miRNAs durante el desarrollo de la enfermedad y utilizar esa información en la búsqueda de nuevos biomarcadores predictivos. Hipótesis Nuestra hipótesis es que los niveles plasmáticos de ciertos marcadores biológicos, tales como los miRNAs, LPS y perfil de metabolitos pueden ser altamente valiosos y útiles como biomarcadores predictivos para identificar a los sujetos normoglucémicos y prediabéticos con mayor riesgo de desarrollar DMT2. Objetivo general Identificar nuevos biomarcadores con potencial para evaluar la probabilidad y predecir el desarrollo DMT2 en pacientes con enfermedad coronaria de alto riesgo. Sujetos, diseño y metodología de las publicaciones Artículo 1: En este trabajo se incluyeron todos los pacientes no diagnosticados con diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV (NTC00924937). De ellos, 107 pacientes desarrollaron DMT2 de acuerdo con los criterios de diagnóstico de la Sociedad Americada de Diabetes (ADA) tras una mediana de seguimiento de 60 meses (grupo Incident-DIAB). Se llevó a cabo una sobrecarga grasa y una sobrecarga oral de glucosa (OGTT) en días consecutivos al inicio del estudio y tras 3 años de seguimiento. Seguidamente, se determinaron los niveles plasmáticos de LPS, LBP (proteína de unión a lipopolisacárido), IL-6, MCP1 y TNF-alpha. Por último, se realizaron análisis de regresión de COX para evaluar el potencial de los niveles postprandiales de LPS como predictor del desarrollo de DMT2. Artículo 2: Este trabajo se llevó a cabo en la misma población no diabética al inicio del estudio CORDIOPREV. Los niveles plasmáticos de 24 miRNAs se determinaron en la situación basal mediante qRT-PCR. Además se realizaron análisis de componentes principales (OPLS-DA), curvas ROC y de regresión de COX para evaluar el poder predictivo de los miRNAs circulantes en el desarrollo de DMT2. Artículo 3: Se incluyeron los 462 pacientes sin diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV. Tras una mediana de seguimiento de 60 meses, 107 de ellos desarrollaron DMT2, 30 desarrollaron prediabetes, 223 mantuvieron la prediabetes y 78 estaban libres de enfermedad. Los niveles plasmáticos de cuatro miRNAs relacionados con la señalización de la insulina y la funcionalidad de la célula beta se determinaron mediante qRT-PCR. Adicionalmente, analizamos la relación entre los niveles de miRNAs y los índices relacionados con la señalización de la insulina en la situación basal y después del periodo de seguimiento. El riesgo de desarrollar la enfermedad fue evaluado mediante análisis de regresión de COX en función de los niveles de miRNAs en la situación basal categorizados por tertiles. Otra aproximación: Seleccionamos un grupo de 52 pacientes sin diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV, 26 de los cuales desarrollaron la enfermedad tras 3 años de seguimiento y otros 26 que no la desarrollaron. Estudiamos las diferencias en el perfil metabolómico entre ambos grupos en muestras de plasma tomadas en la situación basal, tanto en el estado de ayuno como en el postprandial. Se llevaron a cabo análisis de componentes principales (PLS-DA y OPLS-DA) y de curvas ROC con los niveles plasmáticos de los metabolites identificados para evaluar el poder predictivo del desarrollo de DMT2. Resultados Artículo 1: Observamos un aumento en los niveles de LPS postprandiales en la situación basal en los pacientes que desarrollan diabetes (P < 0.001), mientras que no se encontraron cambios en el grupo de no-diabéticos. El análisis de regresión de COX, basado en los cambios postprandiales de LPS, mejoró el poder predictivo del desarrollo de DMT2 en comparación con el FINDRISC (hazard ratio de 2.076, 95% CI 1.149- 3.750 vs. 1.384, 95% CI 0.740-2.589). Además, el análisis de regresión de COX combinando ambos parámetros mostró que los pacientes con niveles postprandiales elevados de LPS y alto FINDRISC tienen un mayor riesgo de desarrollo de diabetes (hazard ratio de 3.835 (95% CI 1.323-11.114)). Artículo 2: El análisis de ROC identificó 9 miRNAs, los cuales, añadidos a la HbA1c, tienen un mayor valor predictico en el diagnóstico temprano de la DMT2 (AUC = 0.8342), en comparación con la HbA1c (AUC = 0.6950). Este modelo de miRNAs y HbA1c no mejoró cuando se incluyó el FINDRISC (AUC = 0.8293). El análisis de regresión de COX mostró que los pacientes con bajos niveles circulantes de miR-103, miR-28-3p, miR-29a, y miR-9, y, altos de miR-30a-5p y miR-150 en la situación basal tienen mayor riesgo de desarrollar la enfermedad (HR = 11.27; 95% CI = 2.61–48.65). Artículo 3: Observamos mayores niveles de miR-150 y miR-30a-5p y menores niveles de miR-15a y miR-375 en la situacion basal en los pacientes que desarrollan DMT2 que en los que no la desarrollan. Además, los pacientes con niveles altos de miR- 150 y miR-30a-5p mostraron una peor funcionalidad de la célula beta (menor disposition index) (p=0.047 y p= 0.007, respectivamente). Por último, un mayor riesgo de desarrollar DMT2 también se asoció con altos niveles (T3) de miR-150 y miR-30a-5p (HRT3-T1 = 4.218 y HRT3-T1 = 2.527, respectivamente), y bajos niveles (T1) de miR-15a y miR-375 (HRT1-T3 = 3.269 and HRT1-T3 = 1.604, respectivamente) en la situación basal. Otra aproximación: Nuestro estudio sugiere que el perfil de metabolitos en la situación basal, tanto en el estado de ayunas como en el postprandio, permite diferenciar entre sujetos que desarrollan DMT2 y aquellos que no la desarrollan tras tres años de seguimiento. De hecho, el análisis de curvas ROC mostró que los niveles plasmáticos de metabolitos específicos podrían tener potencial como biomarcadores predictivos del desarrollo de la enfermedad. Nuestros resultados mostraron un AUC de 0.794 (sensibilidad = 0,808, especificidad= 0.731 y precisión= 72.8%) en un modelo construido con los metabolitos identificados en el estado de ayunas y con VIP>1.5, lo cuales pertenecen principalmente a la famila de las glicerofosfocholinas. Además, obtuvimos un AUC de 0.849 (sensibilidad = 0,814, especificidad= 0.727 y precisión= 74.1%) con los metabolitos identificados en el análisis postprandial, los cuales pertenecen en su mayoría a la familia de ácidos grasos. Conclusión Los niveles plasmáticos de ciertos miRNAs, LPS y perfil de metabolitos podrían tener potencial como biomarcadores para evaluar la probabilidad y predecir el desarrollo DMT2 en pacientes de alto riesgo con enfermedad coronaria.