Role of splicing process alterations in the appearance of endocrine-metabolic diseases and tumor pathologies

Abstract

Global human health is currently threatened by highly prevalent diseases such as obesity, diabetes and cancer. A common hallmark shared by these endocrine-metabolic and tumor diseases is the consistent alteration of the normal splicing process, which leads to the presence of aberrant mRNA variants. Splicing represents an essential biological process by which the introns of an immature pre-mRNA are excised and the exons are fused to generate mature mRNAs capable to be translated into functional proteins. However, most eukaryotic genes can also undergo alternative splicing, which is a physiologic process that allows eukaryotic organisms to exponentially increase the number of transcripts generated from a given gene. During the process of alternative splicing, the coding and non-coding regions of a gene are reorganized in order to generate different mRNA variants. Unfortunately, dysregulations of this process are associated to the appearance of diverse protein isoforms that could exhibit strong pathological potential. In this sense, it should be noted that the control of the appropriate RNA expression and the generation of the correct splicing variants and their homeostasis is mainly regulated by the spliceosome, a complex cellular machinery comprised by ribozymes and associated proteins (splicing factors) that dynamically interact to catalyze the splicing process. The appropriate functioning of this cellular machinery is essential to maintain the cellular, tissue and body homeostasis and, therefore, the dysregulation of this process has been associated to different diseases, including endocrine-metabolic and tumor pathologies. For these reasons, alterations in the splicing process could represent a novel source for the identification of diagnostic, prognostic and therapeutic targets in highly prevalent and healththreatening diseases such as endocrine-metabolic pathologies (obesity and diabetes) and cancer. To explore this promising research avenue, different experimental and methodological approaches have been implemented in the present Doctoral Thesis. First, to determine the relationship between the dysregulation of the splicing machinery components and the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM), the expression pattern of selected components of this machinery was determined in the peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) of individuals at high risk of T2DM development, under fasting and postprandial conditions. This approach showed that the expression levels of key splicing machinery components was altered in the PBMCs from individuals that developed T2DM compared with non-T2DM controls (patients that did not develop T2DM during the 5 years of follow-up). The molecular fingerprints comprised by the fasting and the postprandial levels of certain of these splicing machinery components were capable to predict the future development of T2DM in individual patients with high precision, outperforming the capacity of classical predictors of T2DM development, such as HbA1c or FINDRISK, and could become a valuable, non-invasive, new tool for early risk assessment of T2DM. In this scenario, it has been shown that the risk of T2DM may be reduced or even reversed with healthy dietary interventions; however, the molecular mechanisms underlying this association are still to be elucidated. Since the studies derived from this Thesis have demonstrated that the expression pattern of the splicing machinery is associated with the risk of T2DM development, we aimed to further evaluate the influence of a 3-years dietary intervention in the expression pattern of the splicing machinery components in PBMCs from the same group of individuals at high risk of T2DM development. In particular, the expression pattern of the splicing machinery components was determined, after 3-years of follow-up, in PBMCs from all patients who developed T2DM (n=107) and from 108 randomly selected non-T2DM patients. These patients were randomly enrolled in two healthy dietary interventions (Mediterranean or Low-Fat Diet). The results indicated that a long-term dietary intervention, regardless of the type of diet (Mediterranean or low-fat), influences the expression levels of key components of the splicing machinery (overexpression of SPFQ, RMB45, RNU6, etc. or decrease expression of RNU2 o SRSF6). It was also noted that some of these changes in the expression levels of components of the splicing machinery were induced differentially between those patients who developed T2DM and those patients who did not develop T2DM after five years of follow-up. Therefore, this study suggest that a long-term dietary intervention could modulate the expression levels of key components of the splicing machinery in PBMCs of patients at high risk of developing T2DM, and that such changes would be clearly differential in patients who end up developing T2DM and those patients who do not develop T2DM after five years of follow-up, which could be used as a valuable tool to monitor the progression of T2DM. Due to the rising prevalence of obesity and T2DM, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is rapidly emerging as an important and growing health issue in western countries. In an attempt to determine the possible relationship between the dysregulation of the splicing machinery components and the development of NAFLD, the expression pattern of the components of the splicing machinery was measured in liver biopsies from obese patients with different degrees of liver steatosis that underwent bariatric surgery. This experimental approach shown that the liver of steatotic obese patients exhibited an overt but differential (patientdependent) alteration of the cellular machinery responsible for the regulation of the splicing process. The expression pattern of the spliceosome components and splicing factors analyzed herein was not associated with the grade of hepatic steatosis but seemed to identify three discrete molecularly defined subpopulations of steatotic obese patients characterized by the dysregulated expression of certain spliceosome components and splicing factors. Remarkably, these subpopulations presented specific clinical characteristics and also a differential response to bariatric surgery after one year of follow-up. The fact that these spliceosome alterations were not associated with the grade of hepatic steatosis suggests their role as triggers for initiating fat deposition within the liver. Indeed, an in vitro approach suggested that alterations in splicing machinery components could precede the development of hepatic steatosis. These findings shed light to the possible underlying molecular mechanisms responsible for the development of hepatic steatosis in obese patients and provide novel information to explore the development of efficient screening strategies, diagnostic, prognostic or therapeutic tools for obesity-related NAFLD. Finally, to further expand our knowledge on the pathological interplay between aberrant splicing processes and cancer, a more profound characterization of the oncogenic role of the truncated receptor SST5TMD4 on endocrine-related cancers was performed. Specifically, the functional and mechanistic consequences of the SST5TMD4-specific, splicing-derived C-terminal domain were evaluated in different cancer cells types. First, an in silico analysis revealed the existence of two putative cleavage sites for matrix metalloproteases (MMPs) in the SST5TMD4 Cterminal extracellular domain, which could be the substrate for MMP2, 9 and 14 and/or MMP16, respectively, to generate three derived peptides with 7, 10 and 17 aminoacids. These three SST5TMD4-derived peptides were capable to enhance the malignant characteristics of multiple cancer cell lines derived from diverse tumor pathologies (neuroendocrine tumor, breast, prostate and liver cancer); however, some of these actions seemed to exhibit different dynamics (i.e. proliferation rate) or, even, be cell-line dependent (i.e. migration or tumorosphere formation). In any case, this study demonstrate that the three derived peptides were able to increase tumor malignancy likely through the activation of PI3K/AKT and/or of MEK/ERK pathways and by the modulation key pro-oncogenic genes. Therefore, this study suggests that peptides derived from the spliced SST5TMD4 receptor could contribute to the strong oncogenic role of SST5TMD4 previously observed in multiple tumor pathologies, and, therefore, represent potential candidates to identify novel diagnostic, prognostic or therapeutic targets in cancer. Altogether, the results presented in this Doctoral Thesis constitute novel, valuable and germane information supporting the contention that the dysregulation of the splicing process, including the alterations in the spliceosome components, the splicing factors or the surrogate markers of the splicing process, is closely related to the instauration and/or development of several and highly prevalent pathologies such as diabetes, NAFLD or cancer.

La obesidad y la diabetes, así como el cáncer representan graves problemas de salud pública en todo el mundo. Una característica común compartida por estas patologías endocrinometabólicas y tumorales es la alteración del proceso normal de splicing, lo cual podría conducir a la presencia de variantes aberrantes de ARNm. En concreto, el splicing es un proceso biológico esencial por el cual los intrones del pre-ARNm son escindidos para unir los exones y generar así ARNs maduros capaces de ser traducidos a proteínas funcionales. Concretamente, la mayoría de genes de organismos eucariotas pueden sufrir procesos de splicing alternativo, el cual constituye un proceso fisiológico que permite a estos organismos aumentar exponencialmente el número de transcritos generados a partir de un mismo gen. Durante el proceso de splicing alternativo, las regiones no codificantes y codificantes de un gen se reorganizan para generar diferentes variantes de ARNm. Desafortunadamente, las desregulaciones de este proceso están asociadas a la aparición de diversas isoformas de splicing aberrantes que pueden exhibir un fuerte potencial patológico. En este sentido, debe tenerse en cuenta que el control de la expresión del ARN y la correcta generación de variantes de splicing, así como su homeostasis, se lleva a cabo por el spliceosoma, una maquinaria celular compleja compuesta por ribozimas y proteínas asociadas (factores de splicing) que interaccionan de forma dinámica para catalizar el proceso de splicing. Por tanto, el funcionamiento apropiado de esta maquinaria celular es esencial para mantener la homeostasis celular, tisular y del organismo y, por ello, la desregulación de este proceso ha sido asociada al desarrollo de diferentes enfermedades, incluyendo las patologías endocrinometabólicas y tumorales. Por este motivo, las alteraciones en el proceso de splicing podrían representar un nuevo campo para el estudio y la identificación de marcadores diagnósticos, pronósticos y dianas terapéuticas en enfermedades tan prevalentes, como las patologías endocrino-metabólicas (obesidad y diabetes) y el cáncer. Para explorar esta prometedora vía de investigación, se han seguido diferentes enfoques experimentales y metodológicos en la presentes Tesis Doctoral. En primer lugar, para determinar la relación entre la desregulación de los componentes de la maquinaria de splicing y el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), se midieron los niveles de expresión de algunos componentes de esta maquinaria en células mononucleares de sangre periférica de pacientes en alto riesgo de desarrollar DMT2, en condiciones tanto de ayuno como postprandiales. Esta aproximación mostró que los niveles de expresión de algunos componentes clave de esta maquinaria estaban alterados en aquellos pacientes que desarrollarían DMT2 en comparación con aquellos pacientes control que no desarrollan la enfermedad durante los 5 años que duraba el estudio. Además, la huella molecular compuesta por los niveles de expresión de estos componentes en ayunas y durante el postprandio, era capaz de predecir con elevada precisión el desarrollo futuro de DMT2 en pacientes individuales, mejorando la capacidad predictora de parámetros clásicos como la hemoglobina glicosilada o el test FINDRISK, lo cual sugería que esta huella podría representar una nueva herramienta no invasiva para la detección temprana del riesgo de desarrollar DMT2. En este contexto, se ha demostrado que el riesgo de desarrollar DMT2 puede reducirse o incluso revertirse como consecuencia de la aplicación de intervenciones dietéticas saludables; sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a esta asociación están aún por dilucidar. Puesto que los resultados derivados de la presente Tesis han demostrado que el patrón de expresión de la maquinaria de splicing está asociado con el riesgo de desarrollar DMT2, nos propusimos evaluar la influencia de la intervención dietética durante 3 años en el patrón de expresión de la maquinaria de splicing en las células periféricas mononucleares (PBMCs, por sus siglas en inglés) obtenidas de este mismo grupo de pacientes en alto riesgo de desarrollar DMT2. En concreto, el patrón de expresión de los componentes de la maquinaria de splicing se determinó, tras tres años de seguimiento, en las PBMCs de todos los pacientes que desarrollaron DMT2 (n=107) y 108 pacientes que no desarrollaron DMT2, seleccionados aleatoriamente. Estos pacientes fueron asignados aleatoriamente en dos grupos dietéticos saludables, dieta mediterránea o dieta baja en grasa. Los resultados indicaron que la intervención dietética, independientemente del tipo (dieta mediterránea o baja en grasa), modula los niveles de expresión de componentes clave de la maquinaria de splicing (sobreexpresión de SPFQ, RMB45, RNU6, etc. o disminución de RNU2 o SRSF6). También se observó que algunos de estos cambios en los niveles de expresión de componentes de la maquinaria de splicing fueron inducidos diferencialmente entre aquellos pacientes que desarrollaron DMT2 y aquellos acientes que no la desarrollaron tras cinco años de seguimiento. Por tanto, este estudio sugeriría que una intervención dietética a largo plazo podría modular los niveles de expresión de componentes clave de la maquinaria de splicing en células mononucleares de sangre periférica de pacientes en alto riesgo de desarrollar DMT2, y que dichos cambios serían claramente diferenciales en pacientes que terminan desarrollando DMT2 y aquellos pacientes que no la desarrollan tras cinco años de seguimiento, lo que podría utilizarse como en una herramienta valiosa para monitorizar la progresión de DMT2. Debido a la creciente prevalencia de la obesidad y la DMT2, la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) está emergiendo rápidamente como un problema de salud grave en los países occidentales. Para determinar la posible relación entre la desregulación de la maquinaria reguladora del splicing y el desarrollo de NAFLD, se analizó el patrón de expresión de los componentes del spliceosoma y factores de splicing en biopsias de hígado de pacientes obesas con diferentes grados de esteatosis hepática que fueron sometidas a cirugía bariátrica. Los resultados de esta aproximación mostraron que el hígado de las pacientes obesas con esteatosis presentaba una alteración manifiesta pero diferencial (dependiente del paciente) de la maquinaria celular responsable de la regulación del proceso de splicing. Concretamente, el patrón de expresión de los componentes del spliceosoma y los factores de splicing analizados no se asoció con el grado de esteatosis hepática, pero identificó tres subpoblaciones de pacientes con esteatosis molecularmente definidas y caracterizadas por la expresión alterada de ciertos componentes del spliceosoma y factores de splicing. Cabe destacar, que estas subpoblaciones presentaban características clínicas específicas, así como una respuesta diferencial a la cirugía bariátrica después de un año de seguimiento. El hecho de que estas alteraciones del spliceosoma no estuvieran asociadas con el grado de esteatosis sugiere su papel como esencadenante del inicio de la acumulación de grasa en el hígado. De hecho, una aproximación in vitro indicó que las alteraciones en los componentes de la maquinaria de splicing podrían preceder al desarrollo de la esteatosis hepática. Estos resultados arrojan luz sobre los posibles mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo de la esteatosis hepática en pacientes obesos y proporcionan información novedosa para explorar el desarrollo de estrategias de diagnóstico, pronóstico o herramientas terapéuticas eficaces para el NAFLD. Por último, para ampliar el conocimiento sobre la interacción patológica entre los procesos de splicing aberrantes y el cáncer, se realizó una caracterización del papel oncogénico del receptor truncado SST5TMD4 en patologías tumorales endocrinas. En concreto, se evaluaron las consecuencias funcionales del posible procesamiento proteolítico del dominio C-terminal de esta variante de splicing aberrante del receptor SST5 en diferentes tipos celulares representativos de estas patologías tumorales. Específicamente, un análisis in silico reveló la existencia de dos sitios de corte para metaloproteasas de matriz (MMP) en el dominio C-terminal extracelular de la variante de splicing SST5TMD4, que podrían ser utilizados por MMP2, 9 y 14 y/o MMP16, respectivamente, para generar tres péptidos con 7, 10 y 17 aminoácidos. El tratamiento con estos tres péptidos fueron capaces de aumentar parámetros funcionales de agresividad en diferentes líneas celulares derivadas de distintas patologías tumorales (tumores neuroendocrinos, cáncer de mama, próstata e hígado); sin embargo, algunas de estas acciones parecían ejercer diferentes dinámicas, como es el caso de la proliferación celular, o, incluso, ser dependiente de la línea celular, como ocurrió con la migración o la formación de tumorosferas. En cualquier caso, los tres péptidos aumentaron de forma general las características de malignidad de dichas líneas celulares tumorales, probablemente a través de la activación de las rutas PI3K/AKT y/o MEK/ERK y la modulación de genes pro-oncogénicos clave. Este estudio sugiere que los péptidos derivados del receptor truncado SST5TMD4 podrían contribuir al fuerte papel oncogénico de este receptor, observado previamente en múltiples patologías tumorales y, por lo tanto, representan posibles candidatos para identificar nuevas dianas diagnósticas, pronosticas o terapéuticas en el cáncer. En conjunto, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral constituyen una información novedosa y valiosa que respalda la idea de que la desregulación del proceso de splicing, tanto las alteraciones en los componentes del spliceosoma y los factores de splicing, como en las variantes resultantes de dicho proceso, está estrechamente relacionada con la instauración y/o el desarrollo de diversas patologías relevantes como la diabetes, el hígado graso o el cáncer.