Papel de la N-glicosilación de proteinas en la virulencia de Fusarium oxysporum

Abstract

Protein glycosylation is a process widely studied in eukaryotes, localized in two different cellular compartments but functionally connected: the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Due to the complexity and diversity of its reactions, some enzymatic pathways are still unknown in many organisms, emerging as new research topics in filamentous fungi. The initial glycosylation steps localized in the ER are highly conserved in eukaryotes, by contrast GA steps show wide variations in the sequential addition of monosaccharides that conform the elongation of the previously synthesized glycans, being some of these enzymatic reactions substrate specific. Protein glycosylation in mammalian species presents a high structural diversity in which glycans are decorated by fucose, xilose, glucose, sialic acid and mannose in terminal positions. Fungal and yeast have less diversity and only present galactose, glucose, uronic acids and mannose as terminal residues. N-acetylglucosamine transferases participate in terminal glycosylation, attaching GlcNAc to enlarge glycan molecules, but considering other studies on eukaryotes, this monosaccharide can be localized in terminal position or at bisecting points in the polysaccharide chains. With the aim to decipher the molecular dialogue and cross talk between Fusarium oxysporum f.sp. lycopersci and the host during infection and to understand the molecular bases that govern fungal pathogenicity, we have analyzed the genes encoding N-acetylglucosaminyl transferases, presumably involved in glycosylation of glycoproteins, glycolipids, proteoglycans or small molecule acceptors. In silico analysis revealed the existence of seven putative N-glycosyl transferase encoding genes in the F. oxysporum f.sp. lycopersici genome. Deletion mutants in the N-acetylglucosaminyl transferase gene gnt2 showed a dramatic reduction in virulence on both plant and animal hosts. The Δgnt2 mutants had alterations in cell wall properties related to terminal α- or β-linked N-acetylglucosamine. In the present study we conclude that is indeed a terminal monosaccharide, based on the cytometry analyses by fluorescence quantification of the lectin GSII-FITC bound to germling cell walls, although we can not discard a bisecting position as well. Mutant conidia and germlings also differed from the wild type in surface structure and physicochemical surface properties. Spore and hyphal aggregation in liquid culture differ between the mutant and the wild type, in a pH independent manner. Transmission electron micrographs of mutant germlings show strong cell-to-cell adherence likely caused by increased formation of an extracellular chemical matrix. Δgnt2 cell walls showed a significant reduction in N-linked oligosaccharides...

El proceso de glicosilación de proteínas, ampliamente estudiado en eucariotas, tiene lugar en dos compartimentos celulares separados aunque funcionalmente conectados: el retículo endoplásmico (RE) y el aparato de Golgi (AG). Debido a su complejidad, aún se desconocen algunas de las rutas enzimáticas que lo constituyen en muchos organismos, resultando un tema muy novedoso de estudio en hongos filamentosos. Las etapas de glicosilación iniciales localizadas en el RE están muy conservadas en eucariotas, mientras que las etapas del AG son más variables y corresponden a la adición secuencial de monosacáridos que alargan el glicano sintetizado, siendo algunas específicas de sustrato. En mamíferos la elongación de glicanos es muy diversa, dando lugar a cadenas oligosacarídicas decoradas con fucosa, xilosa, glucosa, ácido siálico o manosa terminales. En hongos y levaduras la diversidad es menor, presentando tan solo residuos galactosa, glucosa, ácidos urónicos o manosa en los extremos. El análisis in silico del genoma de F. oxysporum harevelado la existencia de seis posibles genes de N-acetilglucosamina transferasas (Gnt) ortólogos a GNT1 de Saccharomyces cerevisiae, proteína identificada como enzima de glicosilación anclada a la membrana del AG. Para estudiar el papel de gnt2 en la fisiología y virulencia de F. oxysporum, en este trabajo se ha llevado a cabo la deleción de ambas copias del gen y la posterior complementación de los mutantes resultantes, con el alelo silvestre. El proceso de infección con el mutante deficiente .gnt2, tanto en plantas de tomate como en la larva de la polilla de la cera Galleria mellonella, ha resultado en una reducción de la capacidad de invasión de los tejidos del huésped y en un retraso significativo en el desarrollo de enfermedad. Por el contrario, los individuos infectados con el transformante complementado han mostrado un desarrollo de la enfermedad similar a la estirpe silvestre, con la recuperación total de la virulencia. La anulación de gnt2 produce cambios en la pared celular que conllevan la alteración de la sensibilidad y la afinidad a compuestos que interaccionan con la pared celular fúngica y a enzimas líticas de pared, así como una reducción en la formación de puentes de fusión entre conidias e hifas, dando como resultado un micelio menos cohesionado. Estos análisis han revelado en el mutante un aumento en la sensibilidad a dichos compuestos tóxicos, y mayor resistencia a la acción de glucanasas y quitinasas, así como menor afinidad por el colorante Alcian Blue.