Análisis transcriptómico y proteómico de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 en respuesta a cianuro

Abstract

El cianuro es un compuesto natural muy tóxico para los seres vivos debido a su elevada afinidad por los metales, lo que provoca la inhibición de metaloenzimas, algunas de ellas esenciales para la vida. Además, esta afinidad del cianuro por los metales podría disminuir de la biodisponibilidad de algunos metales necesarios para procesos biológicos específicos. Muchos organismos son capaces de producir cianuro (cianogénesis), tolerarlo e incluso asimilarlo. Las plantas son la mayor fuente de producción de cianuro en la naturaleza. Algunos microorganismos, incluidos los cianogénicos, han desarrollado mecanismos de resistencia frente a este compuesto tóxico, basados principalmente en la síntesis de una oxidasa alternativa insensible a cianuro implicada en la respiración. La asimilación de cianuro por parte de organismos denominados cianotrofos requiere, además de un sistema de resistencia, una ruta de degradación de cianuro que confiriera la capacidad de utilizar este compuesto como fuente de nitrógeno. Estos organismos cianotrofos tienen un importante potencial biotecnológico ya que pueden ser utilizados en procesos de biorremediación de residuos contaminados con cianuro, incluyendo efluentes procedentes de la joyería y la minería. Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 es una bacteria cianotrofa aislada del río Guadalquivir a su paso por Córdoba. Su carácter alcalófilo permite utilizar condiciones de pH superiores al pKa del par cianuro/ácido cianhídrico (9,2), disminuyendo así el riesgo de volatilización del ácido cianhídrico (HCN) a la atmósfera. Varios estudios han elucidado los principales mecanismos de resistencia y asimilación de cianuro en esta bacteria. En la ruta de asimilación, el cianuro reacciona químicamente con el oxalacetato generando una cianhidrina que es posteriormente utilizada como sustrato por la nitrilasa NitC para formar amonio. A pesar de que la resistencia y asimilación de cianuro han sido ampliamente estudiadas en este microorganismo, se desconoce la respuesta global de la cepa CECT5344 en el metabolismo del cianuro. La secuenciación y el análisis del genoma completo de P. pseudoalcaligenes CECT5344 ha posibilitado llevar a cabo en este trabajo estudios proteómicos y transcriptómicos en respuesta a cianuro. De forma específica se ha estudiado la homeostasis del hierro en relación con el cianuro. Así, se ha establecido la respuesta, a nivel proteómico, de P. pseudoalcaligenes CECT5344 en condiciones de limitación de hierro. Las proteínas inducidas en estas condiciones de escasez de hierro no se indujeron por cianuro, por lo que se descartó que el cianuro genere deficiencia de hierro en la estirpe CECT5344. Mediante micromatrices de DNA se llevó a cabo el análisis transcriptómico de esta bacteria cianotrofa en respuesta a cianuro, a residuo cianurado de la joyería y a condiciones de limitación de nitrógeno. Con los datos obtenidos se realizó un análisis funcional, lo que permitió conocer procesos biológicos específicamente afectados por cianuro, incluyendo el sistema de respiración insensible a cianuro (CIO) y algunas nitrilasas (entre ellas, la nitrilasa NitC). Específicamente inducidos por el residuo joyero se han encontrado genes de tolerancia a metales, tales como genes relacionados con sistemas de extrusión de metales y genes reguladores. Algunos componentes inducidos por cianuro, posiblemente implicados en la resistencia a cianuro, fueron estudiados mediante un análisis mutacional. Los mutantes deficientes en las proteínas DapA (dihidropicolinato sintasa) y AhpC (alquilhidroperóxido reductasa) presentaron un fenotipo sensible a cianuro, lo que confirmó que ambas proteínas participan en el metabolismo del cianuro. En el caso de la proteína DapA podría participar en la reorganización de los centros sulfoférricos afectados por el cianuro, mientras que AhpC podría estar involucrada en la resistencia al estrés oxidativo generado por el cianuro.

Cyanide is a natural toxic compound that displays a very high affinity for metals, inhibiting metaloenzymes which are essential for life. This affinity of cyanide for metals may also be responsible of a decrease in the biodisponibility of essential metals for specific biological processes. A large number of microorganisms are able to synthesize (cyanogenics), tolerate or even assimilate cyanide (cyanotrophics). Plants are the main source of cyanide in nature. Some microorganisms, including cyanogenics, have developed mechanisms of resistance forward cyanide, mainly based on the synthesis of a cyanide insensitive alternative oxidase. In addition to a cyanide resistance system, cyanide assimilation requires a degradation pathway in order to use cyanide as a nitrogen source. Cyanotrophic microorganisms have a significant biotechnological potential because they can be applied in bioremediation of industrial cyanide-containing wastewaters, including jewelry and mining residues. Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 is a cyanotrophic bacterium isolated from the Guadalquivir River (Córdoba). This is an alkaliphilic bacterium, with an optimun pH of growth of 9,5-10. This fact allows to establish a very alkaline pH value, higher than the pKa 9,2 of the CN-/HCN pair, thus avoiding HCN losses. Several studies have elucidated the main mechanisms of cyanide resistance, as well as the cyanide assimilation pathway in P. pseudoalcaligenes CECT5344. In this bacterium cyanide chemically reacts with oxaloacetate producing a cyanohydrin that it is further metabolised to ammonia by the nitrilase NitC. Although cyanide resistance and assimilation have been studied in detail in this bacterium, the global response to cyanide of the strain CECT5344 is unknown. Sequencing and analysis of the whole genome of P. pseudoalcaligenes CECT5344 has facilitated to carry out this work that includes transcriptomic and proteomic studies in response to cyanide. Specifically, we have studied iron bioavailability related with cyanide, and the response of P. pseudoalcaligenes CECT5344 to iron starvation at proteomic level has been established. Proteins induced by iron starvation were not present in the proteome of cyanide-asimilating cells, discarding the hypothesis that cyanide causes iron stress in the strain CECT5344. DNA microarrays were performed in order to study the transcriptome of this cyanotrophic strain in response to cyanide, as well as to cyanide-containing wastewater and nitrogen starvation conditions. A functional analysis of the results allowed the identification of specific biological processes affected by cyanide, including the cyanide insensitive oxidase (CIO) for respiration in the presence of cyanide and several nitrilases (one of then, the nitrilase NitC). Specificaly induced by the jewelry residue were genes involved in tolerance to metals like regulatory genes and metal extrusion related genes. Some of the cellular components induced by cyanide, and possibly involved in cyanide resistance, were studied by mutational analysis. Mutant strains deficient in DapA (dihydrodipicolinate synthase) or AhpC (alkyl hydroperoxide reductase) presented a phenotype more sensitive to cyanide, thus confirming the participation of these proteins in cyanide metabolism in P. pseudoalcaligenes CECT5344. The DapA protein could participate in the reorganization of the iron-sulphur clusters, a target for cyanide, while AhpC could be involved in the resistance to oxidative stress generated by cyanide.