Regulación fisiológica mitocondrial y de señalización autofágica a través de intervenciones nutricionales con diferentes fuentes lipídicas y antioxidantes

Abstract

1. Introducción o motivación de la tesis La autofagia es un proceso intracelular por el que se degradan partes de citoplasma, orgánulos como mitocondrias y peroxisomas, agregados proteicos y agentes infecciosos, por acción de los lisosomas. Se han definido tres tipos de autofagia: macroautofagia (designada de aquí en adelante como autofagia), microautofagia y autofagia mediada por chaperonas (CMA). La autofagia comienza con el aislamiento de una sección de membrana conocido como fagóforo, que puede originarse a partir de bicapas lipídicas procedentes de retículo endoplásmico (RE), y/o de la red trans del complejo de Golgi, así como de endosomas [1, 2]. Este proceso está regulado por la acción de diversos complejos multiproteicos que actúan en la formación de las vesículas autofágicas que contendrán el material a degradar, denominadas autofagosomas. El primer complejo que facilitará el aislamiento de membrana es el de “pre-iniciación”, compuesto por la quinasa ULK1y las proteínas ATG13, ATG101 y FIP200. Éste, a su vez, actuará sobre el complejo de iniciación formado por VPS34, VPS15, Beclina 1 y ATG14, que permitirá el ensamblado de la maquinaria de elongación del fagóforo. Posteriormente, dos sistemas de conjugación similares a los de ubiquitinación trabajarán en la elongación del fagóforo y la posterior maduración del autofagosoma. La primera reacción de conjugación dará lugar al complejo ATG12/ATG5/ATG16L1, y éste a su vez participará en la conjugación de las proteínas de la familia ATG8, y concretamente de LC3, con el lípido fosfatidiletanolamina (PE), procesos que determinarán la elongación del fagóforo, la hemifusión de sus extremos dando lugar a los autofagosomas y la posterior maduración del mismo [3, 4]. Una vez maduras, estas vesículas se unen con los lisosomas para la degradación de su contenido, proceso facilitado por la acción del citoesqueleto [5] y de proteínas tales como RAB7 [3]. La regulación del proceso está mediada por sensores metabólicos celulares entre los que destacan la quinasa AMPK, que actúa como regulador positivo de dicha ruta y el complejo mTORC1, que la regula negativamente. Ambas actúan de forma directa o indirecta sobre la proteína ULK1 [6]. También se producen modificaciones post-traduccionales sobre el complejo de iniciación, concretamente sobre la proteína Beclina 1, que también intervienen en la regulación del proceso [7-9]. El proceso autofágico puede ser no específico en condiciones de deprivación de nutrientes o, estar dirigido a orgánulos celulares concretos. Cuando se dirige de forma específica a la mitocondria se conoce como mitofagia, que puede producirse por dos vías fundamentalmente: una mediada por la proteína BNIPL/NIX, que actúa en los procesos madurativos de algunas líneas celulares, y otra mediada por las proteínas PINK1/Parkin, que se encarga del recambio de mitocondrias no funcionales [10]. En este último caso también participa de manera activa la proteína p62 [11]. Otro punto importante del presente trabajo trata sobre las especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés Reactive Oxygen Species), término que se utiliza para referirse a diversos derivados reactivos del oxígeno, sean o no radicales libres [12]. Las principales ROS que podemos encontrar a nivel celular son el radical hidroxilo (OH·), el radical superóxido (O2·-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2). Éstas interaccionan con las principales biomoléculas celulares causando daño en el ADN, proteínas [13] y lípidos [14] dando lugar a numerosos procesos deletéreos. La mitocondria juega un papel fundamental en el metabolismo celular pues es la encargada de generar ATP mediante la acción de la cadena de transporte electrónico (CTE), compuesta por un conjunto de complejos multiproteicos localizados en la membrana mitocondrial interna (IMM) [15, 16]. Además, la mitocondria ha sido identificada como una de las principales fuentes de ROS a nivel celular [17, 18]. Concretamente, la formación de O2·-dentro de la CTE se concentra principalmente en dos puntos: el complejo I (NADH-deshidrogenasa) destacándose los mononucleótidos de flavina y centros ferrosulfurados como los responsables de liberar O2·- hacia la matriz mitocondrial, y el complejo III (Ubiquinol:citocromo c óxido-reductasa), que produce esta especie reactiva a partir del ciclo del coenzima Q hacia el lado citosólico de la IMM [19, 20]. La producción de ROS parece deberse al estancamiento de los electrones en los complejos producido cuando la ratio de entrada de los mismos excede el ritmo de paso de los electrones por los componentes de la cadena [21]. En la presente Tesis se analiza también el papel de diferentes compuestos fenólicos en procesos como autofagia y función mitocondrial. Los compuesto fenólicos, metabolitos secundarios de las plantas, presentan en su estructura un anillo aromático acompañado de uno o más grupos hidroxilo [22], y se clasifican atendiendo a distintos criterios tales como su abundancia, origen, función biológica y estructura química. En función de su abundancia pueden clasificarse en dos grupos: los flavonoides y los no flavonoides. Los primeros son los más abundantes y se caracterizan por poseer 15 carbonos y dos anillos aromáticos conectados entre ellos por 3 puentes de carbono. Diversos estudios han demostrado la gran capacidad antioxidante de los flavonoides [23, 24], por lo que su consumo está asociado con un menor riesgo de sufrir cáncer o enfermedades cardiovasculares [25]. Además, también tienen capacidad de mitigar el daño oxidativo en el ADN y de prevenir la peroxidación lipídica en una gran cantidad de tipos celulares [26, 27]. No obstante, a concentraciones elevadas pueden actuar como pro-oxidantes induciendo procesos como la apoptosis [24, 28, 29]. Dentro de estos compuestos, el kaempferol (3,5,7,4-tetrahidroxiflavona) es un flavonol presente en gran cantidad de vegetales y frutas, que muestra una gran cantidad de funciones biológicas entre las que destaca su capacidad antiinflamatoria [30]. Numerosos estudios realizados en distintas líneas celulares han determinado el efecto de esta sustancia mitigando la producción de ROS [31, 32]. No obstante, el tratamiento con ella a altas concentraciones y durante periodos largos incrementa la producción de dichas especies en otros modelos de estudio [33, 34]. Este compuesto puede actuar, además, como modulador de la ruta de autofagia actuando sobre diferentes dianas, favoreciendo con ello procesos tan diversos como la protección celular frente a distintos tipo de estrés o la diferenciación celular [33, 35, 36]. Otra molécula importante sobre la que hemos centrado nuestras investigaciones, es el coenzima Q (Q), lípido cuya estructura comprende un anillo benzoquinónico conectado a una cola lateral de isoprenos [37]. Esta molécula desempeña numerosas funciones que pueden dividirse entre las que realiza a nivel local en la mitocondria, y las que lleva a cabo en otros compartimentos celulares. En la mitocondria, podemos encontrarla formando parte de la CTE actuando como transportador electrónico [38]. Además, actúa como cofactor de proteínas desacoplantes (UCPs), previene la apertura del poro de transición de permeabilidad (PTPm) y puede actuar como aceptor final de electrones en la síntesis de pirimidinas [39]. En cuanto a sus funciones extra-mitocondriales, forma parte del sistema rédox de la membrana plasmática (PMRS) y constituye parte de la defensa antioxidante no enzimática junto a otras moléculas como los flavonoides o el glutatión. Los ácidos grasos son biomoléculas compuestas por un grupo carboxilo unido a una cadena hidrocarbonada, que suelen encontrarse formando parte de moléculas lipídicas más complejas, siendo componentes fundamentales de las membranas biológicas. Pueden clasificarse en dos tipos atendiendo a la presencia de dobles enlaces (insaturaciones) en su cadena hidrocarbonada: ácidos grasos saturados (SFA), que carecen de dobles enlaces, e insaturados, que sí los poseen. Dentro de estos últimos se pueden distinguir dos subgrupos en función de si presentan un único doble enlace, denominándose ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), o varios, denominándose entonces ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). Ante la imposibilidad de las células de sintetizar ciertos tipos de ácidos grasos necesarios para las funciones biológicas, éstos son captados a partir de la dieta. A estos ácidos grasos se les conoce como “ácidos grasos esenciales” (EFA), y se clasifican principalmente en dos familias: la serie n-3 y la serie n-6. Diversos estudios han determinado la capacidad de las membranas celulares para adaptar su composición lipídica en función de la grasa predominante presente en la dieta [40-42], lo que puede conllevar una serie de alteraciones bioquímicas en las células y en especial en las membranas mitocondriales [43]. De esta forma, las grasas ricas en PUFA, como el aceite de soja y pescado, dan lugar a membranas que son más susceptibles de sufrir daño oxidativo, pues los carbonos que forman parte de las insaturaciones son más propensos a ello, que las grasas ricas en SFA y MUFA, como la grasa animal o el aceite de oliva respectivamente. Es por ello que estas alteraciones en el lipidoma pueden relacionarse con procesos como el envejecimiento [44]. Numerosos estudios han sugerido que los ácidos grasos pueden regular el proceso autofágico. Por ejemplo, el ácido palmítico (PA) incrementa este proceso en células β pancreáticas INS-1 de rata protegiéndolas de la apoptosis. No obstante, otros investigadores han determinado que es el ácido oleico (OA), y no el PA, el que favorece la formación de vesículas autofágicas incrementando también la expresión de proteínas relacionadas con este mecanismo en células HepG2 y hepatocitos primarios de ratón. La autofagia inducida por los PUFA de la serie n-3, contribuye a una recuperación más eficiente del daño renal inducido por isquemia/reperfusión en ratones Fat-1. Además, el aumento en la eficiencia de esta ruta promovido por estos ácidos grasos favorece la citotoxicidad en células tumorales favoreciendo la apoptosis. Por último, los ácidos grasos de la serie n-6 favorecen el flujo autofágico, lo que parece estar relacionado con el incremento de la longevidad en C. elegans [45]. Otro punto fundamental del presente trabajo es el estudio de diferentes intervenciones nutricionales sobre el envejecimiento, y más concretamente sobre la relación de éste con la ruta de autofagia. El envejecimiento puede definirse como la pérdida progresiva de función en los distintos tejidos de un organismo debido a la degradación de sus componentes a nivel molecular dependiente del tiempo, lo que implica una menor fertilidad y un aumento en la susceptibilidad de sufrir gran número de enfermedades de diversa índole [46]. Aunque no exenta de controversia, la denominada “Teoría de los Radicales Libres” sobre el envejecimiento [47] proporciona unas bases sólidas para explicar dicho proceso. En ella se postula que la producción de ROS, sobre todo a nivel mitocondrial, daña progresivamente distintas biomoléculas celulares. La imposibilidad de la célula de contrarrestar este daño oxidativo mediante la respuesta antioxidante resulta en la acumulación de lesiones y, en última instancia, en la pérdida de funcionalidad de estos componentes. En estrecha relación con esta teoría se encuentra la hipótesis que propone que las características de los lípidos que conforman las membranas celulares condicionan la intensidad del daño oxidativo al que se ven expuestas afectando, por tanto, al envejecimiento y la longevidad. Diversos estudios comparativos han determinado que en animales con una menor longevidad máxima aparece un mayor índice de dobles enlaces (DBI) en los lípidos de membrana [48, 49]. La restricción calórica (RC), es decir, una disminución en la ingesta de calorías sin malnutrición, es la intervención no genética ni farmacológica que de forma más fehaciente es capaz de incrementar la longevidad y favorecer un envejecimiento saludable en diversas especies [50, 51]. Esta intervención puede actuar disminuyendo la producción de ROS, potenciando la respuesta antioxidante encargada de la eliminación de las mismas y promoviendo también la corrección de los daños inducidos por ellas [52]. Puesto que la mitocondria es una de las principales fuentes de generación de ROS, parte de los efectos beneficiosos de la RC sobre la longevidad provienen, muy probablemente, de una mejora en la función mitocondrial [53]. Además, esta intervención puede redistribuir el tipo de insaturación de los ácidos grasos predominante en ciertos tejidos, haciendo que las membranas sean menos susceptibles al daño oxidativo [54, 55]. Ha sido ampliamente establecido que durante el envejecimiento se produce una disminución en la capacidad proteolítica celular considerada responsable, al menos en parte, de la acumulación de componentes celulares dañados en los tejidos de animales viejos. En diversos tejidos, como corazón, cerebro, hígado, músculo y riñón, se han observado determinadas características morfológicas (como la expansión de los compartimentos lisosomales, acumulación de vacuolas y deposición de material no digerido rico en lipofucsina) que apuntan a una pérdida de eficiencia en la ruta de autofagia en animales viejos [56]. Otras investigaciones llevadas a cabo mediante abordajes genéticos en distintos modelos de estudio han determinado que la falta de funcionalidad de ciertos genes relacionados con la autofagia da lugar a fenotipos asociados al envejecimiento, provocando en algunos casos una disminución en la longevidad máxima en dichos organismos. Defectos en la ruta de autofagia han sido asociados también a enfermedades que presentan una alta prevalencia en la población envejecida: desórdenes neurológicos, cáncer, distintos procesos de inmunosenescencia, así como miopatías (revisado en [57]). Existen indicios de que la RC introduce mejoras en el proceso autofágico, ya que individuos sometidos a esta intervención presentan una menor cantidad de componentes celulares y biomoléculas dañadas que los que son alimentados ad libitum [57]. Se ha descrito, además, que la RC induce alteraciones en la ruta autofágica por la activación de dos “sensores energéticos a nivel celular”: AMPK [6, 57-59] y sirtuina 1, los cuales establecen un bucle de retroalimentación positiva para su activación mutua [60]. Además, esta intervención promueve procesos autofágicos inhibiendo la ruta de señalización mediada por factores de crecimiento similares a insulina, lo que resulta finalmente en la inhibición de mTOR [60]. El recambio de mitocondrias mediante el proceso de mitofagia se ve favorecido también por esta intervención nutricional, pues incrementa la expresión de proteínas relacionadas con este proceso (PINK1, Parkin y BNIP3L) en riñón de ratas viejas frente a otras alimentadas con una dieta altamente calórica [61]. Aunque parece evidente que un mejor funcionamiento de la ruta de autofagia previene la aparición de eventos asociados al envejecimiento, la activación persistente de esta ruta no parece ser una intervención anti-envejecimiento ideal, ya que investigaciones llevadas a cabo en ratones con progeria mostraron que dicho incremento contribuyó a la degeneración sistémica sufrida por estos animales [62]. Por último, hay que recalcar la importancia de los procesos de dinámica mitocondrial, que permiten a las células adaptarse a los requerimientos de demanda energética, biogénesis de lípidos y síntesis de ácidos grasos, etc. en función de las condiciones del medio. Para ello, las mitocondrias están sujetas a modulación de sus propiedades dinámicas, pudiendo fusionarse, dividirse, moverse o anclarse a otros orgánulos como el RE [63]. En este proceso participa una familia de GTPasas incluida en la subfamilia DRPs. Dentro de éstas, en la fisión mitocondrial participan proteínas como Drp1 y Fis1, mientras que en la fusión juegan un papel fundamental las mitofusinas 1 y 2 (Mfn1 y Mfn2) y la proteína OPA1. Alteraciones en la maquinaría de dinámica mitocondrial han sido asociadas con numerosas patologías [64]. Una de las principales motivaciones de la presente Tesis Doctoral es determinar el papel del Q en la fisiología mitocondrial y en la ruta de autofagia en distintos sistemas in vitro a través de intervenciones farmacológicas y nutricionales: En el primero de ellos, la línea celular Tkpts, se utilizaron sustancias capaces alterar los niveles de Q actuando como precursores de su síntesis endógena (kaempferol (K) y ácido para-hidroxibenzoico (pHB)), como inhibidores de la misma (ácido para-aminobenzoico (PABA)) o mediante aporte directo de un suplemento con Q10. Con el fin de estudiar estos mismos procesos celulares en otro modelo in vitro, la línea celular Hepa 1.6, las células fueron tratadas con distintas emulsiones lipídicas ricas en ácidos grasos de distinta naturaleza (ácidos grasos poliinsaturados de las series n-3 (Lipoplus) y n-6 (Lipofundina)) o en ácidos grasos monoinsaturados n-9 (ClinOleic)), también capaces de alterar los niveles de Q en estas células. La otra motivación esencial de este trabajo es analizar de qué manera la RC y el componente graso de la dieta modulan la ruta autofágica y el daño oxidativo en un modelo animal, ratones de la estirpe C57BL/6, centrándonos en un tejido post-mitótico (músculo esquelético) y en otro mitótico (hígado). Para ello, los animales se sometieron a una restricción calórica del 40% estableciéndose 4 grupos experimentales: uno control alimentado con el 95% de la ingesta ad libitum, previamente calculada para evitar la obesidad de los individuos, y tres sometidos a RC cuya fuente grasa fue distinta: en el grupo control (grupo Ctrl.Soy) y en uno de los grupos de RC (grupo CR.Soy) fue aceite de soja (rico en PUFA n-6), mientras que en los grupos de RC restantes la grasa fue aceite de pescado (rico en PUFA n-3, grupo CR.Fish) o manteca de cerdo (rica en SFA y MUFA n-9, grupo CR.Lard).