Spliceosomic approach in genitourinary tumors: identification of novel biomarkers and therapeutic targets

Abstract

Prostate (PCa) and bladder cancer (BlCa) are the most prevalent and aggressive genitourinary tumors, accounting for more than 75% of total incidence and mortality within these oncological diseases. Regarding PCa, prostate-specific antigen (PSA) screening programs are currently in place to enhance early detection of the disease. Unfortunately, this biomarker has several limitations thus requiring invasive tools (digital rectal and prostatic biopsy examination) to confirm the presence of tumor cells, which can be associated with several side-effects. For more advanced stages of the disease, the primary pharmacological approach is androgen-deprivation therapy (ADT), due to the crucial role of the androgen receptor (AR) in this pathology. However, 20% of ADTtreated patients will eventually progress from hormone-sensitive (HSPC) to castration resistant PCa (CRPC), a nearly fatal phenotype of the disease. Most CRPC patients exhibit persistent AR signaling driven by various molecular alterations, including the generation of constitutively active AR splicing variants. Despite being treated with potent AR signaling inhibitors (ARSIs; e.g., abiraterone, enzalutamide), nearly all CRPC patients will eventually experience disease progression. In the later stages of the disease, patients are typically treated with taxane-based chemotherapy. However, due to the relatively poor response over time, most patients ultimately die from the disease. On the other hand, early BlCa diagnosis is often challenging due to the lack of biomarkers and distinctive symptomatology. The tumor presence is confirmed by different techniques such as bladder imaging, cystoscopy, and pathological evaluation of a bladder biopsy obtained by a transurethral resection of the bladder tumor (TURBT). Although some alternative diagnostic biomarkers have been proposed, their clinical relevance is still uncertain, underscoring the importance of identifying novel biomarkers with robust clinical validation. Seventy-five percent of diagnosed BlCa are confined within the urothelium or lamina propria, termed as non-muscle invasive BlCa (NMIBC), which are treated with surgery as monotherapy or in combination with intravesical therapy [e.g., Bacillus Calmette-Guerin (BCG), mitomycin-C]. Unfortunately, recurrence rates are significantly high, and 40% of NMIBC patients will progress to a muscle-invasive stage (MIBC), commonly treated with radical cystectomy or trimodal therapy, consisting of TURBT in combination with adjuvant systemic platinum-based chemotherapy and radiotherapy. Based on the information presented herein, it is decisive to design globally effective and long-lasting therapeutic strategies for PCa and BlCa patients. In this regard, lineage plasticity and a soaring molecular heterogeneity are characteristics of these pathologies, compromising drug response. In this scenario, RNA splicing has emerged as a critical source of transcriptomic and proteomic diversity directly involved in the development and progression of diverse tumor pathologies, including PCa and BlCa. Notably, AR splicing variant 7 (AR-V7) is the most well studied splicing variant in PCa, widely described to actively participate into ADT and ARSI resistance mechanisms and to exacerbate tumor evolution to CRPC phenotype. In line with this, we and others have shown that the spliceosome, a complex macromolecular machinery that, together with trans-acting splicing factors, catalyzes the splicing process, is commonly dysregulated in different tumor pathologies, representing a promising source of diagnostic and/or prognostic biomarkers, as well as therapeutic targets. Specifically, our group have recently demonstrated that the splicing machinery is drastically dysregulated in PCa samples, where SRRM1, SNRNP200, and SRSF3 may play pro-oncogenic actions. However, although several spliceosome components and splicing factors have been characterized in PCa, there is still a lack of information regarding the clinical utility and role of some crucial elements of the splicing machinery as biomarkers and therapeutic targets in PCa cells. On the other hand, the evidence available for BlCa is much more limited, mainly constrained to describe the role of discrete elements of the splicing machinery, while no studies have evaluated the potential role of the putative global dysregulation of spliceosome components and splicing factors in this tumor pathology. Apart from that, despite the notorious antitumor actions reported by the treatment with splicing inhibitors in several cancer types (including PCa), to date there is no evidence of its effect in BlCa cells. Altogether, the commented evidence manifests the underpinning role of the splicing process into the pathophysiology of PCa and BlCa. For that reason, the GENERAL AIM of this Doctoral Thesis was to further characterize the putative dysregulation of the splicing machinery in PCa and BlCa to ideally define its hypothetical implication into the pathogenesis and progression of these tumor diseases, with a special interest into pinpointing potential diagnostic and prognostic biomarkers, as well as therapeutic targets to ultimately improve the clinical management of these patients. To achieve that, we have fulfilled different specific objectives whose results have been divided into three different sections, corresponding to five manuscripts directly derived from this Doctoral Thesis, four of them already published or under review in top ranking scientific journal, and one of them is being prepared and completed for submission. Hence, the first section of this Doctoral Thesis aimed to characterize the role of the splicing machinery elements RNA Binding Protein Motif 22 (RBM22) and Serine And Arginine Rich Splicing Factor 6 (SRSF6) in PCa cells. First, we found that the RBM22 gene was consistently downregulated in tumor tissues compared to control samples. Additionally, the expression levels of this spliceosome component were negatively associated with clinical aggressiveness parameters (e.g., Gleason score). Furthermore, RBM22 overexpression significantly decreased functional in vitro and in vivo aggressiveness parameters in PCa cells. Mechanistically, we observed a significant inactivation of cell cycle related pathways in response to RBM22 overexpression, potentially driven by the downregulation of the cell cycle regulators ATR, CDK1, and EPAS1. Secondly, our results revealed a drastic increased in SRSF6 mRNA levels in PCa-derived tissues compared to non-tumor samples. Additionally, the expression levels of this splicing factor were found to be directly associated with clinical parameters of tumor aggressiveness. In line with this, SRSF6 overexpression increased, while its silencing decreased, in vitro and in vivo tumor aggressiveness features. Mechanistically, we found that SRSF6 regulated AR and E2F activity in vitro, by the modulation of the splicing pattern of the HIRA pre-mRNA, stimulating its degradation, and therefore blunting the transcriptional activity of the histone H3.3. Remarkably, pan-cancer analyses suggested that this proposed relation between SRSF6 and H3.3 might not be limited but extended to other tumor types. On the second section of this Doctoral Thesis, we aimed to explore the clinical utility of circulating splicing factors as potential non-invasive biomarkers and therapeutic targets for PCa patients. Thus, we determined, for the first time, that SRRM1, SNRNP200, and SRSF3 proteins are detectable in human plasma samples, being plasma SRRM1 and SNRNP200 protein levels higher in PCa patients. Interestingly, we found that SRRM1 levels were directly associated with CRPC features and, especially, with AR and AR-V7 expression and activity, acting as a potential non-invasive predictive biomarker of ADT response in PCa patients. Apart from that, the in vivo silencing of SRRM1 significantly reduced tumor growth of a preclinical xenograft mouse model and downregulated AR and AR-V7 transcriptional activity. Altogether, results derived from Section I and Section II strengthen the potential of inhibiting the splicing machinery activity as a promising therapeutic strategy for PCa patients. Finally, for the third section of this Doctoral Thesis, we aimed to characterize the role of the putative splicing machinery dysregulation in BlCa cells. First, we comprehensively reviewed the existing evidence exploring this topic. Hence, as previously commented, we exclusively found several reports evaluating the actions of discrete splicing machinery elements, splicing variants and circRNAs over BlCa pathophysiology. Therefore, we next determined the expression levels of a representative set of splicing machinery elements (spliceosome components and splicing factors) in NMIBC and MIBC-derived tumor samples and non-tumor samples, revealing a drastic dysregulation in the expression of splicing machinery components in BlCa. Notably, we found that Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide C (SNRPC) and U2 Small Nuclear RNA Auxiliary Factor 2 (U2AF2) mRNA levels were consistently upregulated in tumor samples, being associated with poor prognosis. Apart from that, we found that molecular subtypes of BlCa might have differential gene expression pattern of the splicing machinery and, an unsupervised clustering analysis identified four molecularly well-characterized cluster of patients exclusively based on the expression of the splicing machinery components, with a special interest in the C1 and C3 clusters by their association with a shorter overall survival. Based on these results, we proceeded to evaluate the functional response to the pharmacological inactivation of the splicing process by isoginkgetin (U4-U5-U6 tri-snRNP inhibitor) and pladienolide B (SF3b complex inhibitor). Both drugs significantly reduced functional aggressiveness parameters in BlCa cells, being isoginkgetin the most biocompatible one. Finally, isoginkgetin significantly induced caspase 3/7 activity (an apoptosis marker) in potential cellular models of the C3 cluster, suggesting a promising therapeutic vulnerability for C3 patients. Taken together, the results derived from this Doctoral Thesis suggest that the splicing machinery might play a crucial role into the pathophysiology of PCa and BlCa, underpinning novel conceptual avenues for these tumor pathologies with promising clinical implications, representing an auspicious source of novel biomarkers and therapeutic targets for PCa and BlCa. Furthermore, our results demonstrate the antitumor actions of splicing inhibitors in BlCa cells, which may pave the way to further evaluate additional splicing-targeting strategies to ultimately improve the clinical management of these patients.

El cáncer de próstata (CaP) y el cancer de vejiga (CaV) son los tumores genitourinarios mas prevalentes y agresivos, representando el 75% de la incidencia y mortalidad asociado a estas patologías tumorales. Con respecto al CaP, los programas de cribado de antígeno prostático especifico (PSA) potencian el diagnóstico temprano de la enfermedad. Lamentablemente, este biomarcador presenta ciertas limitaciones, requiriendo del uso de técnicas invasivas (examen digital rectal y biopsia de próstata) para confirmar la presencia tumoral, lo que conlleva una serie de efectos secundarios negativos para la calidad de vida del paciente. En estadios más avanzados de la enfermedad, la primera herramienta farmacológica se basa en la terapia de deprivación androgénica (ADT) debido al papel crucial del receptor de andrógenos (AR) en esta patología. Sin embargo, el 20% de los pacientes tratados con ADT progresan desde un fenotipo hormono-sensible (HSPC) a un fenotipo resistente a la castración (CRPC), altamente agresivo. La mayoría de los pacientes con CRPC se caracterizan por presentar una activación persistente de la ruta de señalización androgénica promovida por diversas alteraciones moleculares, incluyendo la generación de variantes de splicing de AR constitutivamente activas. A pesar de ser tratados con potentes inhibidores de la señalización mediada por AR (ARSIs; e.g., abiraterona, enzalutamida), la mayoría de los pacientes con CRPC sufrirán la progresión de la enfermedad. En estadios avanzados, los pacientes son tratados con quimioterapia basada en taxanos. Sin embargo, los pacientes finalmente fallecerán debido a la pobre respuesta mantenida durante el tiempo a estas terapias. Por otro lado, el diagnóstico temprano del CaV se ve significativamente dificultado debido a la ausencia de biomarcadores y una sintomatología concreta. La presencia tumoral se confirma mediante diversas aproximaciones como técnicas de imagen, cistoscopia, y la evaluación patológica de una biopsia vesical obtenida a través de una resección transuretral de tejido de vejiga tumoral (TURBT). Aunque se han propuesto algunos biomarcadores de diagnóstico alternativos, su relevancia clínica es incierta, reflejando la necesidad de identificar biomarcadores con una robusta validación clínica. El 75% de los tumores vesicales diagnosticados se encuentran confinados en el epitelio urotelial o la lámina propia, denominados CaV no musculo invasivos (NMIBC), y son tratados con cirugía de resección en monoterapia o en combinación con terapia intravesical [e.g., Bacillus Calmette-Guerin (BCG), mitomycin-C]. Desafortunadamente, las tasas de recurrencia son significativamente elevadas, y un 40% de los pacientes progresara a un estadio musculo invasivo (MIBC) que comúnmente son tratados con cistectomía radical o terapia trimodal, basada en la combinación de TURBT con quimioterapia basada en platino y radioterapia adyuvante. Por todo ello, resulta imperativo diseñar estrategias terapéuticas globalmente efectivas y duraderas para los pacientes con CaP y CaV. En este sentido, la plasticidad celular y heterogeneidad molecular características de estas patologías puede comprometer la respuesta a los medicamentos disponibles. En este escenario, se ha señalado al proceso de splicing del ARN como una fuente relevante de diversidad transcriptómica y proteómica relacionada directamente con el desarrollo y la progresión de un gran número de patologías tumorales, incluyendo CaP y CaV. De hecho, la variante de splicing 7 del AR (AR-V7) es la variante de splicing más estudiada en CaP, ampliamente descrita por promover mecanismos de resistencia a ADT y ARSI, y potenciar la evolución tumoral hacia el fenotipo CRPC. Además de esto, nuestro grupo y otros grupos han demostrado que el spliceosoma, una compleja maquinaria macromolecular que, junto con una serie de factores de splicing, se encarga de catalizar el proceso de splicing, esta comúnmente desregulada en cáncer, representando una fuente prometedora de biomarcadores diagnósticos y/o pronósticos, asi como dianas terapéuticas. Específicamente, nuestro grupo ha demostrado recientemente que la maquinaria de splicing esta drásticamente desregulada en muestras de CaP, donde SRRM1, SNRNP200 y SRSF3 pueden desempeñar papeles pro-tumorales relevantes. Sin embargo, aunque varios componentes del spliceosoma y factores de splicing han sido caracterizados en CaP, hasta la fecha no hay información disponible sobre la utilidad clínica y el papel de algunos elementos cruciales de la maquinaria de splicing como biomarcadores y dianas terapéuticas en células de CaP. Por otro lado, la evidencia disponible para CaV es mucho mas limitada, principalmente restringida a describir el papel de algunos elementos individuales de la maquinaria de splicing, mientras que ningún estudio ha evaluado el potencial papel de la desregulación global del spliceosoma y los factores de splicing en esta patología tumoral. Aparte de eso, a pesar de los notorios efectos antitumorales reportados en diversas patologías cancerígenas tras el tratamiento con inhibidores del proceso de splicing (incluyendo el CaP), hasta la fecha no hay ninguna evidencia de su efecto en células de CaV. En conjunto, los estudios comentados demuestran el papel fundamental del proceso de splicing en la fisiopatología del CaP y el CaV. Por esa razón, el OBJETIVO GENERAL de esta Tesis Doctoral fue caracterizar en profundidad la posible desregulación de la maquinaria de splicing en CaP y CaV para así definir su posible implicación en la patogénesis y progresión de estas enfermedades, con un interés especial en identificar posibles biomarcadores diagnósticos y pronósticos, así como dianas terapéuticas para mejorar finalmente el manejo clínico de estos pacientes. Para lograr esto, hemos propuesto y cumplido diferentes objetivos específicos cuyos resultados se han dividido en tres secciones correspondientes a cinco manuscritos derivados directamente de esta Tesis Doctoral, cuatro de ellos ya publicados o en proceso de revisión por revistas científicas de alto impacto, y uno de ellos está siendo preparado ybb completado para su presentación. Así, la primera sección de esta Tesis Doctoral tenía como objetivo caracterizar el papel de los elementos de la maquinaria de splicing RBM22 y SRSF6 en células de CaP. Primero, encontramos que el gen RBM22 estaba consistentemente menos expresado en tejido tumoral en comparación con muestras no tumorales. Además, sus niveles de expresión estaban negativamente asociados con parámetros clínicos de agresividad (e.g., escala de Gleason). Así, la sobreexpresión del gen RBM22 en células de CaP disminuyó significativamente parámetros funcionales de agresividad tumoral in vitro e in vivo. Molecularmente, identificamos una inactivación significativa de rutas relacionadas con el ciclo celular en respuesta a la sobreexpresión de RBM22, potencialmente promovida por la disminución de la expresión de los reguladores del ciclo celular ATR, CDK1 y EPAS1. En segundo lugar, nuestros resultados revelaron un aumento drástico en los niveles de SRSF6 en tejido derivado de CaP en comparación con muestras no tumorales. Además, se encontró que los niveles de expresión de este factor de splicing estaban directamente asociados con parámetros clínicos de agresividad tumoral. En este sentido, la sobreexpresión de SRSF6 aumentó, mientras que su silenciamiento disminuyó, características de agresividad tumoral in vitro e in vivo. Molecularmente, encontramos que SRSF6 regulaba la actividad de las rutas de AR y E2F in vitro, mediante la modulación del patrón de splicing del pre-ARNm del gen HIRA, promoviendo su degradación y, por lo tanto, atenuando la actividad transcripcional de la histona H3.3. Notablemente, un análisis pan-cáncer sugirió que la asociación entre SRSF6 y H3.3 podría no estar limitada a CaP sino extenderse a otros tipos de tumores. En la segunda sección de esta Tesis Doctoral, se planteó explorar la utilidad clínica de los niveles circulantes de factores de splicing como posibles biomarcadores no invasivos y dianas terapéuticas para pacientes con CaP. Así, detectamos, por primera vez, las proteínas SRRM1, SNRNP200 y SRSF3 en muestras de plasma humano derivadas de pacientes con CaP e individuos sanos. Notablemente, los niveles plasmáticos de las proteínas SRRM1 y SNRNP200 fueron más altos en muestras derivadas de pacientes con CaP. Concretamente, los niveles de SRRM1 se asociaron con características del fenotipo CRPC, especialmente con la expresión y actividad de AR y AR-V7, actuando como un biomarcador predictivo no invasivo de respuesta a ADT. A su vez, el silenciamiento in vivo de SRRM1 redujo significativamente el crecimiento tumoral de un modelo preclínico de ratón xenógrafo paralelamente a la disminución de la actividad transcripcional de AR y AR-V7. En conjunto, los resultados derivados de la Sección I y la Sección II fortalecen el potencial de dirigir fármacos para inhibir la actividad de la maquinaria de splicing como una estrategia terapéutica prometedora para los pacientes con CaP. Finalmente, para la tercera sección de esta Tesis Doctoral, planteamos como objetivo caracterizar el papel de la posible desregulación de la maquinaria de splicing en células de CaV. Primero, se llevó a cabo una exhaustiva revisión bibliográfica de la evidencia existente. Así, como se comentó previamente, encontramos exclusivamente algunos estudios que evaluaban el papel de elementos discretos de la maquinaria de splicing, variantes de splicing y circRNAs sobre la fisiopatología del CaV. De este modo, el análisis de los niveles de expresión de un conjunto representativo de elementos de la maquinaria de splicing (componentes del spliceosoma y factores de splicing) en muestras tumorales NMIBC y MIBC y en muestras no-tumorales, revelo una desregulación drástica de este proceso en CaV. Notablemente, encontramos que los niveles de expresión de SNRPC y U2AF2 estaban consistentemente elevados en muestras tumorales, estando asociados con un peor pronóstico. Aparte de esto, observamos que la expresion de la maquinaria de splicing podría estar alterada en subtipos moleculares del CaV. Posteriormente, un análisis de clustering no supervisado revelo la existencia de cuatro grupos o clústeres de pacientes bien caracterizados molecularmente y con una potencial relevancia clínica basados exclusivamente en la expresión de la maquinaria de splicing. Considerando estos resultados, posteriormente evaluamos la respuesta funcional al bloqueo farmacologico del proceso de splicing mediante los farmacos isoginkgetina (inhibidor del complejo tri-snRNP U4-U5-U6) y pladienolide B (inhibidor del complejo SF3b). Ambos farmacos redujeron significativamente parametros funcionales de agresividad en celulas de CaV, siendo isoginkgetina el farmaco con mayor biocompatibilidad. Finalmente, el tratamiento con isoginkgetina indujo significativamente la actividad de la caspasa 3/7 (marcador de apoptosis) en modelos celulares del cluster C3, sugiriendo una prometedora vulnerabilidad terapeutica para el tratamiento de estos pacientes. En conjunto, los resultados derivados de esta Tesis Doctoral sugieren que la maquinaria de splicing podría desempeñar un papel crucial en la fisiopatología del CaP y CaV, identificando nuevas alternativas conceptuales para estas patologías tumorales con posibles implicaciones clínicas prometedoras, representando una potencial fuente de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas para CaP y CaV. Además, nuestros resultados demuestran que el tratamiento con inhibidores del proceso de splicing ejerce efectos antitumorales en células de CaV, lo que podría servir como base para evaluar otras estrategias terapéuticas dirigidas al bloqueo del proceso de splicing para mejorar en última instancia el manejo clínico de estos pacientes.