Estudios de los mecanismos de respuesta a estrés y valor nutricional en encina (Quercus ilex) mediante una aproximación proteómica

Abstract

La encina (Quercus ilex subsp. ballota [Desf.] Samp.) es la especie más representativa del bosque mediterráneo y ecosistema agrosilvopastoral "Dehesa", un patrimonio natural de gran relevancia ambiental, ecológica, social y económica. Históricamente significativa, sus bellotas fueron antaño un alimento básico en la dieta humana, estando hoy en día ligadas a la alimentación animal y a la industria del cerdo ibérico de alta calidad. El renovado interés por las bellotas como alimento humano podría aumentar el valor económico de la especie. A pesar de su importancia, la encina se enfrenta a amenazas de diferentes causas, antropogénicas, sobreexplotación, incendios, escasa regeneración y factores ambientales bióticos y abióticos. El aumento de la mortalidad de los árboles observado en los últimos 30 años se asocia principalmente al oomiceto Phytophthora cinnamomi, una situación que puede empeorar en un escenario de cambio climático. La presente tesis doctoral pretende profundizar en el conocimiento molecular de la encina, centrándose tanto en aspectos básicos como traslacionales. La investigación examinó los efectos y respuestas al estrés, centrándose en la identificación de marcadores moleculares de resiliencia (Capítulo II), y la caracterización fitoquímica de las bellotas, incluyendo alérgenos (Capítulo III) y péptidos bioactivos (Capítulo IV). Estos últimos estudios están directamente relacionados con el consumo humano de bellotas, mejorando la seguridad alimentaria y la trazabilidad. La proteómica ha sido el enfoque metodológico central, complementado con análisis morfológicos, fisiológicos y metabolómicos. El Capítulo II aborda el estudio del efecto y la respuesta de plántulas de encina a P. cinnamomi y sequía. El experimento se realizó con plántulas de árboles de dos procedencias andaluzas, Huelva y Córdoba. En ambas localidades se seleccionaron árboles con síntomas (clorosis, marchitez y defoliación) y sin síntomas de daño. Las plántulas se sometieron a tratamientos con P. cinnamomi, sequía o combinados. Tras los análisis morfofisiológicos, se recogieron las hojas cuando la fluorescencia de la clorofila disminuyó un 35% en plántulas estresadas con respecto a las plántulas control. La mortalidad de las plántulas junto con los valores de fluorescencia de las hojas mostraron mayor susceptibilidad en la población de Huelva que en la de Córdoba. Los resultados de proteómica y metabolómica indicaron respuestas específicas de la población, sin diferencias entre las plántulas inoculadas con riego y sin él. Además, estos análisis confirmaron mayor resistencia en plántulas procedentes de árboles asintomáticos que de sintomáticos. El análisis comparativo de los perfiles de proteínas y metabolitos de las dos poblaciones reveló cambios en diferentes grupos funcionales y vías metabólicas en respuesta al patógeno, incluyendo el metabolismo de aminoácidos y carbohidratos (Huelva) y el metabolismo de terpenoides y flavonoides (Córdoba). La activación de la vía de la glioxalasa, junto con una serie de enzimas ROS, y de las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides y flavonoides podría ofrecer un mecanismo de detoxificación más eficaz para la población de Córdoba que el de Huelva, lo que conecta con la reducción observada en la fluorescencia de la clorofila foliar en plántulas inoculadas, que fue más pronunciada en la población de Huelva. En este estudio, enzimas como la glioxalasa I, la glutatión reductasa, la tiorredoxina reductasa y la cinamil alcohol deshidrogenasa se proponen como posibles marcadores de resiliencia. En el Capítulo III, se presenta el estudio sobre la presencia de alérgenos en bellotas de encina. Se realizó una búsqueda preliminar in silico en el genoma y transcriptoma de encina, seguido de un análisis proteómico y de inmunodetección en los extractos de bellota. Para el primero, se creó una lista de epítopos descritos en otras especies vegetales, que fue utilizada para buscar las secuencias de estos epítopos en el genoma de Q. ilex y en el transcriptoma de bellota. Para el análisis proteómico, se obtuvieron extractos proteicos de distintos tipos de bellotas, inclu yendo dulces, amargas, y recolectadas de árboles con y sin síntomas de daño. Por último, se realiz ó análisis de inmunotransferencia con sueros de pacientes alérgicos a frutos secos. Se identificaron 83 genes y 69 transcritos que contienen epítopos en sus secuencias. Estos genes pertenecen a las familias funcionales de respuesta a estrés, metabolismo de carbohidratos, señalización y transporte , entre otras. El análisis proteómico de los cuatro tipos de bellotas permitió la identificación de 41 proteínas que contenían epítopos en sus secuencias. Las familias alergénicas más representadas, tanto en el análisis in silico como en el análisis shotgun fueron Heat Shock Protein y Bet v1. Los perfiles de proteínas alergénicas revelaron dferencias entre los distintos tipos de bellotas; las bellotas procedentes de árboles sintomáticos tenían un mayor contenido en alérgenos, vinculado a la presencia de proteínas relacionadas con el estrés. Las proteínas alergénicas identificadas de las bandas inmunoreacivas con mayor intensidad pertenecen a las familias Bet v1, profilinas, nsLTP, prolaminas, Hsp70 y ciclofilinas. Además, se realizó una comparación entre las familias alergénicas encontradas en bellota y las que están presentes en otros frutos secos, encontrando un perfil alergénico similar al de las avellanas y los cacahuetes, compartiendo 5 familias de alérgenos, entre las que encontramos las cupinas y las prolaminas. El Capítulo IV aborda la búsqueda de péptidos bioactivos (BAPs) en harina de bellota. Para ello, se utilizó una combinación de un enfoque in silico e in vitro. Inicialmente se construyó una lista de BAPs descritos en plantas, con una longitud de 5 a 50 aminoácidos, obtenida de la base de datos BIOPEP y de la literatura actual. Las secuencias aminoacídicas de los BAPs se buscaron en el genoma de la encina y en el transcriptoma y proteoma de bellota. Se encontraron 73 BAPs en las secuencias de 599 genes y 535 transcritos, y 27 BAPs en 57 proteínas. Las actividades más representadas en estos péptidos fueron la antihipertensiva y opioide. El análisis peptidómico basado en espectrometría de masas de un filtrado de péptidos de harina de bellota con un Mw inferior a 10kDa permitió identificar 3261 péptidos. De ellos, solo 65 péptidos se encontraron en 52 proteínas y solamente uno contenía un BAP en su secuencia. Dado que los resultados del análisis peptidómico ofrecen una visión limitada de la presencia de BAPs descritos, nos centramos en la predicción de posibles BAPs dentro del conjunto de péptidos identificados. Para ello, se realizó un análisis de predicción in silico basado en las propiedades fisicoquímicas de los péptidos y en métodos de cribado virtual con dianas moleculares relacionadas con actividades antihipertensivas, antidiabéticas, anti proliferativas y antiinflamatorias. Se evaluaron los descriptores fisicoquímicos de todos los péptidos y se seleccionaron los mejores 250. A continuación, se filtraron los péptidos en busca de dianas específicas y se evaluó la disponibilidad de 12 dianas para recibir ligandos (péptidos). Estos análisis nos premitieron cribar los péptidos, seleccionando 20 peptidos que podrían unirse a 3 de las dianas: complejo CDK9/ciclina T1 , GLP-1 y GLU II. Se obtuvieron tres péptidos multidiana que se unen a estas tres proteínas, con efectos antiproliferativos y antidiabéticos, con las siguientes secuencias RGIYAYGFEKP, MINEVDADGNGTIDFP y VADPDEPVHGAP. En resumen, esta tesis doctoral pone de manifiesto los mecanismos de resiliencia y el potencial nutricional y nutracéutico de Q. ilex. Los resultados contribuyen a la comprensión del efecto y la respuesta de las plántulas de Q. ilex de dos poblaciones andaluzas a estreses individuales y combinados de P. cinnamomi y sequía, y proporcionan información útil para la industria agroalimentaria, fomentando el uso de bellotas en aplicaciones alimentarias y garantizando la seguridad alimentaria.

Holm oak (Quercus ilex subsp. ballota [Desf.] Samp.) is the most representative species of the Mediterranean forest and agrosilvopastoral ecosystem “Dehesa”, a natural heritage of great environmental, ecological, social, and economic relevance. Historically significant, its acorns were once a human dietary staple, being nowadays linked to animal feeding and the highquality Iberian pork industry. Renewed interest in acorns as human food could enhance the economic value of the species. Despite its significance, the holm oak faces threats of different causes, anthropogenic, overexploitation, fires, poor regeneration, and biotic and abiotic environmental cues. The increased tree mortality observed in the last 30 years is mostly associated to the oomycete Phytophthora cinnamomi, a situation that can be worsen in a climate change scenario. The present doctoral thesis aimed to deepen the molecular understanding of holm oak, focusing on both basic and translational aspects. The research examined the effects and responses to stresses, focusing on the identification of molecular markers of resilience (Chapter II), and the phytochemical characterization of acorns, including allergens (Chapter III) and bioactive peptides (Chapter IV). The latter studies are directly linked to human consumption of acorns, enhancing food security and traceability. Proteomics was the central methodological approach, complemented by morphological, physiological, and metabolomic analyses. Chapter II deals with the study of the effect and response of holm oak seedlings to P. cinnamomi and drought. The experiment was carried out with seedlings from trees of two Andalusian provenances, Huelva and Cordoba. Trees with symptoms (chlorosis, wilting and defoliation) and without symptoms of damage were selected from both locations. Seedlings were subjected to P. cinnamomi, drought or combined treatments. After morpho-physiological analyses, leaves were harvested when chlorophyll fluorescence decreased by 35% in stressed plants respect the control seedlings. Seedling mortality and leaf fluorescence values showed higher susceptibility in the Huelva than the Cordoba population. Proteomics and metabolomics results indicated population- specific responses, with no differences between irrigated and non-irrigated inoculated plants. Furthermore, these analyses confirmed a higher resistance in seedlings from asymptomatic trees than from symptomatic trees. The comparative analysis of the protein and metabolite profiles in the two populations revealed changes in different functional groups and metabolic pathways in response to the pathogen, including amino acid and carbohydrate metabolism (Huelva) and terpenoid and flavonoid metabolism (Cordoba). The activation of the glyoxalase pathway, along with a range of ROS enzymes, and the phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis pathways might offer a more effective detoxification process for Cordoba population compared to Huelva, this aligns with the observed reduction in leaf chlorophyll fluorescence in inoculated seedlings, which was more pronounced in the Huelva population. In this study, enzymes like glyoxalase I, glutathione reductase, thioredoxin reductase and cinnamyl alcohol dehydrogenase emerged as potential resilience markers. In Chapter III, the study on the presence of allergens in holm oak acorns is presented. A preliminary in silico search in the holm oak genome and transcriptome was performed, followed by a proteomics and immunodetection analysis of acorn flour extracts. For the first, a list of epitopes reported in other plant species was created and used in the search of similar sequences in Q. ilex genome and acorn transcriptome. For the second, protein extracts were obtained from different acorn types, including sweet and bitter, as well as those harvested from trees showing or not damage symptoms. Finally, immunoblot analysis was conducted using sera from patients allergic to various nuts. At least, 83 genes and 69 transcripts containing epitope sequences have been identified in, respectively, the holm oak genome and acorn transcriptome. These genes belonged to the functional families of stress response, carbohydrate metabolism, signalling and transport, among others. Shotgun analysis enabled the identification of 41 proteins containing epitopes in their sequence across all types of acorns. The most represented allergen families in both in silico and shotgun analyses were Heat Shock Protein and Bet v1. The allergen protein profiles revealed differences among the different type of acorns; thus, a corns from symptomatic trees had higher allergens content, linked to the presence of stress-related proteins. Major Immunoreactive bands belonged to the Bet v1, profilin, nsLTP, prolamin, Hsp70, and cyclophilin families. In addition, a comparison was made between the allergen families found in acorns and those found in other nuts, finding an allergen profile similar to that of hazelnuts and peanuts, sharing 5 allergen families, among them, the cupin and prolamin families. Chapter IV deals with the search of bioactive peptides (BAPs) in acorn flour. For that, a combination of in silico and in vitro approaches were used. Initially, a list of plant BAPs, 5-50 amino acid length, was retrieved from BIOPEP database and the current literature. The BAPs amino acid sequences were searched in the holm oak genome, and acorn transcriptome and proteome. It led to 73 encrypted BAPs found in 599 genes and 535 transcripts, and 27 encrypted BAPs in 57 proteins. The most represented groups were those of antihypertensive and opioid activities. A MS-based peptidomic analysis of a filtrate of peptides with a Mw lower than 10 kDa led to the identification of 3261 peptides. Out of the total, only 65 peptides were found encrypted in 52 proteins, and just one was previously reported as BAP. Since the results of the peptidomic analysis provided limited insight into the presence of the described BAPs, we focused on the prediction of putative BAPs within the identified peptide set. For this purpose, it was performed an in silico predictive analysis based on the physicochemical properties of peptides and docking -virtual screening methods with molecular targets related to antihypertensive, antidiabetic, antiproliferative and anti-inflammatory activities. The physicochemical descriptors of all peptides were evaluated, and the 250 best peptides were selected. The peptides were then filtered for specific targets, and the availability of 12 targets to receive ligands (peptides) was assessed. These analyses allowed us to screen the peptides, selecting 20 peptides that could bind to 3 of the targets: CDK9/cyclin T1 complex, GLP-1 and GLU II. Three multitarget peptides that bind to these three proteins, having anti-proliferative and anti-diabetic effects were obtained, with the following sequences: RGIYAYGFEKP, MINEVDADGNGTIDFP, and VADPDEPVHGAP. In summary, this PhD thesis highlights the resilience mechanisms and nutritional and nutraceutical potential of Q. ilex. The results contribute to our understanding of the effect and response of Q. ilex seedlings from two Andalusian populations to individual and combined P. cinnamomi and drought stresses and provide useful information for the agri-food industry, encouraging the use of acorns in food applications and guaranteeing food safety.