Proteomic approaches to study seed development and responses to fungi in Quercus ilex and Hordeum vulgare

Abstract

The Holm oak (Quercus ilex L.) is the dominant tree species of the Mediterranean forest and the Spanish agrosilvopastoral ecosystem “Dehesa.” It has been, since the prehistoric period, an important part of the Iberian population from a social, cultural, and religious point of view, providing an ample variety of goods and services, and forming the basis of the economy in rural areas. Currently, there is renewed interest in its use for dietary, diversification and sustainable food production. It is part of cultural richness, both economically (tangible) and environmentally (intangible) and must be preserved for future generations. However, a worrisome degradation of the species and associated ecosystems is occurring, observed in an increase in tree decline and mortality, which requires urgent action. It is because of that the responsible of the forestry policy and the productive sector is urging for practices that ensures the sustainable conservation and exploitation of the species. In this regard national breeding programs are being established focused on specific traits such as resilience to environmental cues associated to the decline syndrome and the climate change, and the increase in the acorn productivity for food and industrial uses. The only plausible breeding strategy in Q. ilex is the selection of elite genotypes assister by molecular markers. This is the objective of the present Thesis and that of the research group where it has been carried out (Plant and Agroforestry Biochemistry, Proteomics and Systems Biology; AGR-164, University of Cordoba). It is pretended, and by following the central dogma of the molecular biology, deepen in the knowledge of the species as a necessary previous step to the proposal of biotechnological approaches to face the problems and challenges of the species. Concretely, in the present Thesis, three different aspects of the Holm oak Concretely, in the present Thesis, three different aspects of the Holm oak (Quercus ilex L. subsp. ballota (Desf.) Samp.) biology have been studied, including: i) The recalcitrance character of the seeds (chapter 1). ii) The process of germination and early seedling growth (chapter 1). iii) The effect and responses to Phytophthora cinnamomi (chapter 2). In addition, a last chapter (chapter 3) dealing with the study of the responses of Hordeum vulgare to Alternaria alternata and the use of nanotechnology in the control of the disease, has been included. Q. ilex belongs to the group of plants with non-orthodox or recalcitrant seeds. The molecular bases of the recalcitrance, as well as the maturation and germination processes in recalcitrant seeds, differently from orthodox ones, have been poorly investigated. This research is crucial because of the translational purposes, including conservation practices, breeding and reforestation programs, and genetic diversity preservation. The study of the recalcitrance in Q. ilex and the seed germination and early seedling growth, presented in chapter 1, was approached by two complementary proteomics, mass spectrometry, platforms, those based, respectively, on two-dimensional gel electrophoresis coupled to MALDI-TOF, and gel-free, LC-ESI-MS, or shotgun. Protein content and profiles of the three seed tissues (cotyledon, embryonic axis and tegument) in mature seeds were quite different. By using 2-DE-MALDI-TOF, two hundred and twenty-six variable proteins among the three seed parts have been found. The cotyledon contained the highest number of metabolic and storage proteins (89 % of them are legumin) compared to the embryonic axis and tegument. The embryonic axis had the highest number of the species within the protein fate group. The tegument presented the largest number of the defence-/stress-related and cytoskeleton proteins. This distribution is in good agreement with the biological role of the tissues. The study of the seed tissue proteome demonstrated a compartmentalization of pathways and a division of metabolic tasks between embryonic axis, cotyledon and tegument. By also using 2-DE-MALDI-TOF MS, changes in the protein profile along the seed maturation, germination and early seedling growth were analyzed in cotyledons and embryo/radicle, with surveyed samples corresponding to early, middle, and late seed maturation, early, and late germination stages; the protein profile was also evaluated in nonviable seeds. Identified variable proteins were grouped according to their function, being the energy, carbohydrate, lipid, and amino acid metabolisms, together with protein fate, redox homeostasis, and response to stress are the most represented groups. Beyond the visual aspect, morphometry, weight, and water content, each stage had a specific protein signature. Clear tendencies for the different protein groups throughout the maturation and germination stages were observed for, respectively, cotyledon and the embryo axis. Proteins related to metabolism, translation, legumins, proteases, proteasome, and those stress related were less abundant in nongerminating seeds, it related to the loss of viability. Cotyledons were enriched with reserve proteins and protein-degrading enzymes, while the embryo axis was enriched with proteins of cell defense and rescue, including heat-shock proteins (HSPs) and antioxidants. The peaks of enzyme proteins occurred at the middle stages in cotyledons and at late ones in the embryo axis. Unlike orthodox seeds, proteins associated with glycolysis, tricarboxylic acid cycle, carbohydrate, amino acid and lipid metabolism are present at high levels in the mature seed and were maintained throughout the germination stages. Shotgun, LC-ESI-Orbitrap, resulted in a higher number of proteins identified, allowing a deeper proteome coverage. By using this platform, 2409 proteins were identified, with 560 being variable among developmental stages. The main differences between gel and gel-free approaches concerned hormone metabolism, storage and late embryogenesis abundant proteins. Shotgun resulted in a greater number of metabolic pathways represented, as gibberellin biosynthesis, not visualized in the gel-based analysis. On the contrary, several storage proteins, highly abundant in cotyledons and well represented in gel-based platform were not identified using the shotgun one. These results support that when analyzing plant biological processes, both platforms are complementary rather than redundant, that favors an in-depth proteomic coverage and a more confident biological interpretation of the data. In any case, both, gel and gel-free, supported similar biological conclusions. Based on the proteomics data, and as main conclusions, it is proposed that, contrary to the orthodox seeds, recalcitrant Holm oak seeds possess the enzymatic machinery to start germination during the maturation phase. Also, the lack of desiccation tolerance in Q. ilex seeds may be associated with the repression of some genes, late embryogenesis abundant proteins being one of the candidates. The effect and responses of Q. ilex to the oomycete P. cinnamomi has been studied by using a proteomics approached, this study presented in chapter 2. The pathogen is one of the agents that trigger the decline syndrome in Quercus spp., this being a serious threat to Mediterranean Holm oak forest sustainability and reforestation programs. While the interaction has been studied from a morphological, physiological, and ecological point of view, the molecular basis of the interaction is mostly unknown. Such a knowledge is necessary in order to understand the variability within the genus and to stablish breeding programs assisted by molecular markers and based on the selection of elite, resistant, genotypes. Quercus ilex responses to P. cinnamomi have been studied in one-year olds seedlings from two Andalucía provenances, assessing the physiological water status and photosynthesis-related parameters. Upon inoculation with mycelium a reduction in water content, chlorophyll fluorescence, stomatal conductance and gas exchange was observed along a 90 days post inoculation period in both provenances. The reduction was higher in the most susceptible than in the most tolerant one, being these typical plant responses to drought stress. Leaf protein profiles were analyzed in non-inoculated and inoculated seedlings from the two provenances by using a 2-DE coupled to MS proteomics strategy. Ninety-seven proteins changing in abundance in response to the inoculation were identified. The largest group of variables identified proteins were chloroplast ones, and they were involved in the photosynthesis, Calvin cycle and carbohydrate metabolism. It was noted that a general tendency was a decrease in the protein abundance as a consequence of the inoculation, being it less accused in the least than in than in the most susceptible one. This trend is clearly manifested in photosynthesis, amino acid metabolism and stress/defense proteins. On the contrary, some proteins related to starch biosynthesis, glycolysis and stress related peroxiredoxin showed an increase upon inoculation. These changes in protein abundance were correlated to the estimated physiological parameters and have been frequently observed in plants subjected to drought stress. The presented study opens up a new perspective to find variability in the Q. ilex response to P. cinnamomi. In addition, common proteins up accumulated in both genotypes could be considered as marker candidates of resistance to the pathogen, among them those implicated in redox homeostasis with antioxidant activity. Alternaria is considered one of the main fungi causing damage in cereal crop such as barley. In chapter 3, the study on the barley- A. alternata interaction, and the potential role of silicon dioxide nanoparticles (SiO2 NPs) in enhancing barley's resistance to the fungi is presented. Twenty-day-old seedlings were irrigated either with tap water or with SiO2 NPs solutions at 20 and 200 ppm for one week, and then inoculated. Fungal attack reduced seedlings biomass, hydration status, nutriome and photosynthetic performance, increased total phenolics and flavonoids contents; however, total antioxidant activity and DPPH decreased, compared with those of the non-inoculated seedlings. The SiO2 NPs application prior inoculation at both concentrations (20 and 200 ppm) mitigated the effect of the pathogen attack by enhancing gas exchange parameters (net CO2 assimilation rate and internal CO2 concentration transpiration and stomatal conductance) and nutriome (macro and micronutrients) and increasing TAA and DPPH antioxidant activity. The application of SiO2 NPs, in absence of inoculation, had the strongest ameliorative effect on shoot and root growth and physiology performance. This exploratory work highlights the protective role of SiO2 NPs in barley seedlings under pathogen attack conditions possibly due to the Si-mediated protection against oxidative stress and photosynthesis modulation. Using SiO2 NPs as a supplement can be an eco-friendly and costeffective option for sustainable agriculture as they facilitate the delivery of nutrients, assist plants to mitigate biotic stress and enhances plant resistance.

La encina (Quercus ilex L. subsp. ballota (Desf.) Samp.) es la especie arbórea dominante del bosque mediterráneo y del ecosistema agrosilvopastoral español "Dehesa". Ha sido, desde la prehistoria, una parte importante de nuestro entorno, subsistencia y cultura y religión, proporcionando una amplia variedad de bienes y servicios, base de la economía en zonas rurales. Actualmente, existe un renovado interés por su uso alimentario e industrial. Forma parte de nuestra riqueza, tanto desde el punto de vista económico (tangible) como medioambiental (intangible), una riqueza que debe preservarse para generaciones futuras. Sin embargo, la especie y ecosistemas asociados están sufriendo una preocupante degradación, observándose una creciente muerte de arbolado, asociado al síndrome se la Seca y el cambio climático, lo que requiere medidas urgentes. Es por ello por lo que los responsables de la política forestal y desde el sector productivo se están demandando soluciones que aseguren el manejo sostenible, la conservación y explotación de la especie. En esta dirección, se están estableciendo programas nacionales de mejora genética centrados en caracteres específicos como la resiliencia a estreses ambientales asociadas al síndrome de decaimiento y al cambio climático, y al incremento de la productividad de bellota para uso alimentario e industrial. Desde un enfoque biotecnológico, la única estrategia de mejora plausible es la selección de genotipos élite asistida por marcadores moleculares. El citado objetivo constituye la línea de investigación del grupo “Bioquímica Vegetal y Agroforestal, Proteómica y Biología de Sistemas (AGR-164, Universidad de Córdoba), donde se ha realizado la presente Tesis. Se pretende, y siguiendo el dogma central de la biología molecular, profundizar en el conocimiento de la especie como paso previo a la propuesta de enfoques biotecnológicos para afrontar los problemas y retos a los que se enfrenta la misma. En concreto, tres son los estudios abordados en esta Tesis, que serán desarrollados en los diferentes capítulos, 1 y 2: i) El carácter recalcitrante de las semillas (capítulo 1). ii) El proceso de germinación y crecimiento de plántulas (capítulo 1). iii) El efecto y la respuesta a Phytophthora cinnamomi (capítulo 2). Además, se ha incluido un último capítulo (capítulo 3) que aborda el estudio de las respuestas de Hordeum vulgare a Alternaria alternata y el uso de la nanotecnología en el control de la enfermedad. Q. ilex pertenece al grupo de plantas con semillas no ortodoxas o recalcitrantes. Las bases moleculares de la recalcitrancia, así como los procesos de maduración y germinación en semillas recalcitrantes, a diferencia de las ortodoxas, han sido poco estudiadas. Esta investigación es crucial por sus posibles implicaciones prácticas en propagación, programas de mejora, reforestación y conservación de la diversidad genética. El estudio de la recalcitrancia en Q. ilex y la germinación de semillas y el crecimiento de plántulas, presentado en el capítulo 1, se abordó mediante dos plataformas complementarias de proteómica, espectrometría de masas, las basadas, en electroforesis bidimensional en gel acoplada a MALDI-TOF, y las de libre de gel, LC-ESI-MS, o shotgun. Se analizó el perfil proteico del tegumento, cotiledón y eje embrionario, y los cambios ocurridos a lo largo del proceso de maduración, germinación de semillas y desarrollo de plántulas. El contenido y los perfiles proteicos de los tres tejidos de la semilla (cotiledón, eje embrionario y tegumento) en semillas maduras eran diferentes. Mediante 2-DE-MALDI-TOF, se han encontrado doscientas veintiséis proteínas variables entre las tres partes de la semilla. El cotiledón contenía el mayor número de enzimas del metabolismo y de almacenamiento (el 89 % de ellas son leguminosas) en comparación con el eje embrionario y el tegumento. En el eje embrionario abundaban proteínas relacionadas con la proteostasis. El tegumento presentó el mayor número de proteínas relacionadas con la defensa/estrés y el citoesqueleto. Esta distribución concuerda bien con la función biológica de cada uno de los tejidos. El estudio del proteoma de la semilla evidenció una compartimentación de las rutas metabólicas entre el eje embrionario, el cotiledón y el tegumento. Mediante proteómica 2-DE-MALDI-TOF MS se analizaron los cambios en el perfil proteico a lo largo de la maduración de la semilla, la germinación y el crecimiento temprano de la plántula, tanto en cotiledones como en embrión/radícula. Se llevaron a cabo muestreos en estadios tempranos, medios y tardíos de maduración de la semilla, y tempranos y tardíos de germinación, llevándose a cabo también el análisis en semillas no viables. Las proteínas variables identificadas se agruparon según su función, siendo las del metabolismo energético, de carbohidratos, lípidos y aminoácidos, junto con el destino proteico, la homeostasis redox y la respuesta al estrés los grupos más representados. Más allá del aspecto visual, la morfometría, el peso y el contenido de agua, cada estadio presentaba un perfil proteico específico. Se observaron tendencias claras para los distintos grupos de proteínas a lo largo de las etapas de maduración y germinación para, respectivamente, el cotiledón y el eje del embrión. Las proteínas relacionadas con el metabolismo, la traducción, las leguminas, las proteasas, el proteasoma y las relacionadas con el estrés fueron menos abundantes en las semillas no germinadas, lo que se relaciona con la pérdida de viabilidad. Los cotiledones estaban enriquecidos en proteínas de reserva y proteasas, mientras que en el eje embrionario eran más abundantes las proteínas de defensa y rescate celular, incluyendo proteínas de choque térmico (HSPs) y antioxidantes. Los picos de abundancia de proteínas enzimáticas tuvieron lugar en los estadios medios en los cotiledones y en los tardíos en el eje embrionario. A diferencia de las semillas ortodoxas, en las recalcitrantes como las de Q. ilex, las proteínas asociadas al metabolismo central, la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo de los hidratos de carbono, los aminoácidos y los lípidos están presentes en altos niveles en la semilla madura y se mantuvieron durante todas las fases de germinación analizadas. Mediante proteómica shotgun, LC-ESI-Orbitrap, se incrementó el número de proteínas identificadas, permitiendo una mayor cobertura del proteoma. Utilizando esta plataforma, se identificaron 2409 proteínas, de las cuales 560 eran variables entre las distintas etapas de desarrollo. Las principales diferencias entre los enfoques con y sin gel incluyeron proteínas del metabolismo, de almacenamiento y las LEA (“Late Abundant Embryogenesis”). Mediante la estrategia shotgun se identificaron un mayor número de proteínas de diferentes rutas metabólicas, como por ejemplo la biosíntesis de giberelinas, no visualizada en el análisis basado en gel. Por el contrario, varias proteínas de almacenamiento, muy abundantes en cotiledones y bien representadas en la plataforma basada en gel, no se identificaron utilizando la de shotgun. Estos resultados confirman que, a la hora de analizar los procesos biológicos de las plantas, ambas plataformas son complementarias y no redundantes, lo que favorece una mayor cobertura del proteoma y una interpretación biológica más fiable de los datos. En cualquier caso, ambas, con y sin gel, apoyaron conclusiones biológicas similares. En base a los datos proteómicos, y como principales conclusiones, se propone que, contrariamente a las semillas ortodoxas, las semillas recalcitrantes como las de encina poseen la maquinaria enzimática necesaria para iniciar la germinación desde las últimas etapas de la maduración, por lo que ambas etapas, maduración y germinación, tienen lugar como un continuo. Además, la falta de tolerancia a la desecación en las semillas de Q. ilex puede estar asociada a la represión de algunos genes, siendo las LEAs uno de ellos. El estudio del efecto y las respuestas de Q. ilex al oomiceto Phytophthora cinnamomi, capítulo 2, se ha abordado mediante una aproximación de proteómica 2-DE-MALDI-TOF MS. El patógeno es uno de los agentes causantes del síndrome de la Seca en especies del género Quercus. Dicho síndrome constituye, en estos momentos, una seria amenaza para los encinares mediterráneos. Mientras que la investigación de la interacción ha sido abordada desde un punto de vista morfológico, fisiológico y ecológico, la base molecular de la misma es, en gran medida, desconocida. Dicho conocimiento es necesario para entender la variabilidad dentro del género y para establecer programas de mejora asistidos por marcadores moleculares y basados en la selección de genotipos élite resistentes. Se han estudiado las respuestas de Quercus ilex a Phytophthora cinnamomi en plántulas de un año de dos procedencias andaluzas, evaluando los daños, muerte de las plántulas, el estado hídrico y la actividad fotosintética durante un periodo de 90 días tras la inoculación. Se observaron diferencias en los porcentajes de mortalidad, con diferencias en resistencia entre las dos poblaciones estudiadas. La inoculación originó un descenso en el contenido hídrico de las hojas, fluorescencia de clorofila, conductancia estomática. Dicho patrón es típico de plantas sometidas a estrés por sequía. La reducción fue mayor en la procedencia susceptible que en la resistente. Se analizaron los perfiles proteicos de las hojas en plántulas inoculadas y no inoculadas de las dos procedencias mediante una estrategia de proteómica de 2-DE acoplada a MS. Se identificaron 97 proteínas cuya abundancia cambiaba en respuesta a la inoculación. El mayor grupo de proteínas variables identificadas fueron cloroplásticas y estaban implicadas en la fotosíntesis, el ciclo de Calvin y el metabolismo de los carbohidratos. Se observó, como tendencia general, una disminución en la abundancia de proteínas como consecuencia de la inoculación, siendo menos acusada en la procedencia más resistente. Esta tendencia se manifiesta claramente en las proteínas de fotosíntesis, del metabolismo de aminoácidos y de estrés/defensa. Por el contrario, algunas proteínas relacionadas con la biosíntesis del almidón, la glucólisis y la peroxiredoxina mostraron un aumento tras la inoculación. Estos cambios en la abundancia de proteínas se correlacionaron con los parámetros fisiológicos estimados y se han observado con frecuencia en plantas sometidas a estrés por sequía. El estudio presentado abre una nueva perspectiva para encontrar variabilidad en la respuesta de Q. ilex a P. cinnamomi. Además, las proteínas comunes acumuladas en ambos genotipos podrían ser consideradas como marcadores candidatos de resistencia al patógeno, entre ellas las implicadas en la homeostasis redox y con actividad antioxidante. Alternaria se considera como uno de los principales hongos causantes de daños en cultivos de cereales como la cebada. En el capítulo 3 se presenta el estudio sobre la interacción cebada-A. alternata y se evalúa la eficacia de las nanopartículas de dióxido de silicio (NPs SiO2) en la mejora de la resistencia de la cebada a este hongo. El diseño experimental consistió en el riego de las plántulas con agua (control) o con soluciones de SiO2 NPs a 20 y 200 ppm durante una semana (tratamiento), tras la cual se procedió a la inoculación. Se evaluaron la biomasa, el estado de hidratación, el nutrioma y el rendimiento fotosintético de las plántulas, y aumentó el contenido total de fenoles y flavonoides, así como la actividad antioxidante. Se observó que la inoculación redujo los valores de los diferentes parámetros analizados en plantas no tratadas con las nanopartículas. La aplicación de SiO2 NPs antes de la inoculación en ambas concentraciones (20 y 200 ppm) mitigó el efecto del ataque del patógeno mejorando los parámetros de intercambio gaseoso (tasa neta de asimilación de CO2 y concentración interna de CO2 transpiración y conductancia estomática) y nutrioma (macro y micronutrientes) e incrementando la actividad antioxidante TAA y DPPH. La aplicación de NPs de SiO2, en ausencia de inoculación, tuvo un efecto mejorador sobre el crecimiento y la fisiología de brotes y raíces. Este trabajo exploratorio muestra como la nanotecnología, en concreto el uso de las nanopartículas SiO2, es una estrategia eficaz en el control de Alternaria en cebada, estando el efecto protector asociado a un aumento de los sistemas antioxidantes y a la modulación de la fotosíntesis.