Heterorresistencia a colistina en aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae con fenotipo de resistencia silvestre o productores de la carbapenemasa OXA-48

Abstract

La heterorresistencia (HR) puede ser definida como la presencia de subpoblaciones resistentes en un aislado que es sensible a un antibiótico. En este trabajo se evalúa la HR a colistina en diversas cepas de Klebsiella pneumoniae con fenotipo silvestre (Kp-WT) y productoras de la carbapenemasa OXA-48 (Kp-OXA48). Para ello, la sensibilidad a colistina se determinó mediante microdilución en caldo (BMD) y la HR mediante análisis de perfil de población (PAP). Los mutantes resistentes se caracterizaron a nivel molecular mediante el análisis del genoma completo y PCR del gen mgrB para identificar la presencia de mutaciones en genes relacionados con la síntesis del lipopolisacárido. La BMD determino que todas las cepas estudiadas fueron sensibles a colistina y el método PAP mostro que las CMIs de algunos mutantes de la placa PAP que contenía 4×MIC de colistina tenían valores absolutos similares a las CMIs parentales y se definieron como variantes persistentes mientras que la HR a colistina de las colonias que crecían en placas con concentraciones de hasta 32-64 mg/L, correspondieron a subpoblaciones mutantes estables. La PCR del gen mgrB identifico diversas secuencias de inserción que inactivaba el gen en 14 mutantes de Kp-WT y en 21 mutantes de Kp-OXA48 pertenecientes principalmente a la familia IS1 (ISKpn14) and IS5 (ISKpn74). En los mutantes de Kp- WT se identificaron mutaciones puntuales en proteínas relacionadas con la síntesis del lipopolisacárido (MgrB, PhoP, PhoQ, PmrB, CrrA y CrrB). En los mutantes de Kp- OXA48 se identificaron también mutaciones puntuales en estas proteínas; la HR a colistina en estos aislados se atribuyó fundamentalmente a las inserciones y mutaciones puntuales detectadas. Los resultados de este estudio podrían mejorar la comprensión de los mecanismos de resistencia a colistina en mutantes de Kp-WT y Kp-OXA48.

Heteroresistance (HR) to colistin can be defined as the presence of resistant subpopulations in an isolate that is susceptible to colistin. In this work, we evaluated the HR to colistin in several strains of Klebsiella pneumoniae with wild-type phenotype (Kp- WT) and producing carbapenemase OXA-48 (Kp-OXA48). For this purpose, colistin susceptibility was determined by broth microdilution (BMD) and HR by population analysis profiling (PAP). Resistant mutants were characterized at the molecular level by whole genome and PCR analysis of the mgrB gene to identify the presence of mutations in genes related to lipopolysaccharide synthesis. BMD determined that all strains studied were susceptible to colistin and the PAP method showed that the MICs of some mutants on the PAP plate containing 4×MIC colistin had absolute values similar to the parental MICs and were defined as persisters variants while the colistin HR of colonies growing on plates with concentrations up to 32-64 mg/L corresponded to stable mutant subpopulations. PCR of the mgrB gene identified several insertion sequences that inactivated the gene in 14 Kp-WT mutants and in 21 Kp-OXA48 mutants belonging mainly to the IS1 (ISKpn14) and IS5 (ISKpn74) families. Point mutations in proteins related to lipopolysaccharide synthesis (MgrB, PhoP, PhoQ, PmrB, CrrA and CrrB) were identified in Kp-WT mutants. Point mutations in these proteins were also identified in Kp-OXA48 mutants; HR to colistin in these isolates was mainly attributed to the insertions and point mutations detected. The results of this study will improve the understanding of the mechanisms of colistin resistance in Kp-WT and Kp-OXA48 mutants.