Nuevas tendencias en el uso de nanopartículas metálicas en análisis agroalimentario

Abstract

Introducción: Las prestaciones de la Nanotecnología en distintas áreas científicas justifican que la finalidad de esta Tesis haya sido la propuesta y establecimiento de metodologías analíticas dinámicas que se beneficien de las ventajas que pueden aportar los nanomateriales como herramientas en las distintas etapas del proceso analítico. La Tesis Doctoral ha estado dirigida a proponer nuevas metodologías analíticas sensibles y selectivas basadas en el uso de inmunoensayo, técnicas luminiscentes, sistemas de flujo y desarrollo de reacciones de derivatización en técnicas de separación. El Grupo de Investigación en el que ha desarrollado la Tesis Doctoral tenía experiencia en la utilización de nanopartículas metálicas de distinta composición: Au [1], sílice [2] y lantánidos [3] con fines analíticos. La presente Tesis Doctoral ha expandido el campo de aplicación de diversos nanomateriales, tales como NPs metálicas, de oro y plata, y con núcleos integrados por óxidos magnéticos y superficies recubiertas de elementos metálicos, como el Au, en análisis agroalimentario, con frecuencia dificultado por las matrices complejas de las muestras analizadas. Los nanomateriales arriba mencionados se han utilizado en esta Tesis como reactivos analíticos para la determinación simultánea de especies que ejercen un efecto agregante sobre dichos nanomateriales y el uso de medidas ópticas para la detección de dicha agregación. En la literatura, se ha descrito la determinación de tioles en preparados farmacéuticos [4] al inducir la agregación de NPs de oro, pero su aplicación al análisis de alimentos ha sido más restringida. Asimismo, con esta Tesis se ha ampliado el campo de aplicación de los nanomateriales en técnicas de separación aplicadas al análisis agroalimentario. Durante el planteamiento de la Tesis, los nanomateriales se habían utilizado con éxito en la inmunoextracción de fármacos y agentes biológicos [5,6] y en aplicaciones clínicas y biotecnológicas, como la determinación de hormonas como la β- gonadotropina coriónica humana [7] y testosterona y epitestosterona [8]. Esta Tesis Doctoral ha contribuido a demostrar la utilidad de las nanopartículas de composición metálica como como soportes en inmunoextracción y como reactivos marcadores para mejorar la detección en cromatografía de inmunoafinidad con aplicación en análisis agroalimentario, ámbito en el que las aplicaciones hasta la fecha habían sido realmente escasas Contenido de la investigación: La presente Tesis Doctoral está compuesta por un primer capítulo, a modo de introducción, en el que se presentan los distintos tipos de NPs metálicas, haciendo especial énfasis en aquellos objetos de la Tesis Doctoral. Se describen los usos y principales aplicaciones de las nanopartículas metálicas para la determinación simultánea de especies, con métodos basados en la medida de los cambios debidos a la agregación de las nanopartículas en presencia de los analitos. También son objeto de revisión la contribución de las nanopartículas en cromatografía de inmunoafinidad y en inmunoextracción, tanto como soportes de la fase estacionaria en ambas técnicas, como para la mejora de la detección en cromatografía de inmunoafinidad mediante el uso de las nanopartículas metálicas como marcador para la detección indirecta de los analitos de interés. Se ha remitido la propuesta de un artículo de revisión para su publicación en una revista especializada de Química Analítica. Se describen de forma separada en un segundo capítulo las herramientas analíticas empleadas en el transcurso de la presente Tesis Doctoral El capítulo 3 está dedicado al uso de las nanopartículas metálicas para las determinaciones simultáneas de especies y está constituido por dos investigaciones diferentes. La primera aborda la determinación de tiamina libre y total en muestras de alimentos utilizando nanopartículas de oro y fosfatasa alcalina. El método se basa en el uso de nanopartículas de oro (AuNPs) que se agregan en presencia de tiamina debido a la interacción de su átomo de azufre con las AuNPs, que origina un cambio de color de rojo vino a azul púrpura y un aumento en la absorbancia medida a 590 nm. Dicho efecto no se observa para los fosfatos de tiamina directamente, sino que su determinación es posible mediante su hidrólisis en presencia de fosfatasa alcalina. El uso de dos alícuotas de muestra, una en presencia y otra en ausencia de fosfatasa alcalina, permite la determinación de tiamina total y libre, respectivamente. El intervalo dinámico del método es 0,15 - 3,5 μM y un límite de detección de 54 nM para la tiamina. Los resultados del estudio de recuperación, realizado añadiendo tiamina y su éster pirofosfato a distintos alimentos, proporcionaron valores comprendidos entre 88,8 y 100,7%. El capítulo 4 de la Tesis Doctoral está dedicado a demostrar la utilidad analítica de las nanopartículas magnéticas en técnicas de separación, ya sea como marcadores para lograr la detección indirecta en cromatografía de inmunoafinidad o como soportes en inmunoextracción. En el primer caso, se desarrolló un método para la determinación de las proteínas alérgenas gliadinas en diferentes muestras de alimentos. Para ello, se utilizaron columnas de Proteína G como soporte sobre los que movilizar los inmunocomplejos gliadina-anticuerpos anti-gliadina. Para conseguir la detección indirecta de las gliadinas, se sintetizó un marcador mediante la inmovilización de gliadinas sobre AuNPs utilizando fenómenos de adsorción. Para realizar el análisis, se preincubaron mezclas de anticuerpos anti-gliadina, gliadinas y gliadinas marcadas con AuNPs y la mezcla se inyectó en la columna de proteína G, en las que se retuvieron los inmunocomplejos, al mismo tiempo que el marcador libre no quedó retenido y llegó al detector, originando un pico debido a la dispersión de la radiación del marcador gliadinas-AuNPs que fue directamente proporcional a la concentración de gliadinas en la muestra. El método se aplicó de forma satisfactoria al análisis de muestras de alimentos, en concreto, cervezas sin gluten y con gluten. Se realizó un estudio de recuperaciones y se obtuvieron valores de recuperación en el intervalo 71.2 – 101.7%. La segunda aportación del capítulo está relacionada con la utilidad de nanomateriales híbridos basados en nanopartículas metálicas como soportes en inmunoextracción, en concreto, se ha desarrollado un método basado en inmunoextracción utilizando nanopartículas magnéticas recubiertas de oro como soporte para la inmovilización de anticuerpos antiproteína de soja para la determinación de proteínas de soja en alimentos. La inmunoextracción se realiza en formato de fase sólida dispersiva, y la señal debida a la proteína de soja extraída se obtiene en presencia del fluoróforo de larga longitud de onda, violeta de cresilo, en presencia del tensoactivo aniónico sulfato de dodecilo sódico a pH neutro en un sistema de flujo. El método implica el uso de dos alícuotas de muestra, la primera se mide mediante la inyección directa de la muestra, mientras que la segunda se mide tras la retención de la proteína de soja sobre el inmunosorbente, siendo la diferencia entre la altura de los dos picos obtenidos directamente proporcional a la concentración de proteína de soja en la muestra. El método, con un límite de detección de 0,35 mg/L, ha demostrado su utilidad práctica al análisis de muestras de bebidas de soja, que ha proporcionado valores de recuperación en el intervalo 80,0 – 107,3%. Conclusión: Las metodologías desarrolladas en esta Tesis Doctoral han contribuido a demostrar la aplicabilidad de las nanopartículas metálicas en análisis agroalimentario, con herramientas altamente innovadoras en Química Analítica, tales como: 1) El uso de fenómenos de agregación ha demostrado su utilidad para la resolución de mezclas binarias en muestras de alimentos, habiéndose estudiado por primera vez la determinación simultánea de tiamina y sus ésteres fosfato como tiamina libre y tiamina total. 2) Se ha descrito por primera vez el uso de las AuNPs como marcador para la detección indirecta en cromatografía de inmunoafinidad, utilizando gliadinas como analito modelo y columnas comerciales de Proteína G como soporte. 3) La rápida respuesta de los métodos desarrollados permite determinaciones analíticas en muestras complejas, como las de alimentos, con frecuencias de muestreo relativamente elevadas y, en el caso de la cromatografía de inmunoafinidad y la extracción con niveles de selectividad adecuados teniendo en cuenta la complejidad de las matrices de las muestras analizadas. 4) Los esquemas de cromatografía de inmunoafinidad e inmunoextracción desarrollados permiten un menor consumo de inmunorreactivos que otros métodos inmunoquímicos utilizados con el mismo fin, como p. ej, inmunoensayos tipo ELISA.