Study of RNA biology and splicing in pancreatic cancer and neuroendocrine tumors

Abstract

Cancer is one of the leading causes of death worldwide, with nearly 20 million new cases and around 10 million deaths annually. Mortality is especially pronounced in low- and middle-income countries, where late diagnosis is prevalent and treatment options are limited. By 2050, cancer cases are expected to increase significantly. Cancer theories now encompass genetic mutations, epigenetic changes and the tumor microenvironment, focusing on how cancer cells outcompete normal cells through mechanisms that are not fully understood. Hanahan and Weinberg's concept of the "hallmarks" of cancer, which has been updated to include new elements such as phenotypic plasticity and the influence of the microbiome, highlights the complexity of cancer. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a lethal type of cancer originating from the exocrine component of the pancreas, exemplifies this complexity. It is the twelfth most common cancer and the sixth most deadly cancer worldwide, with more than 500,000 new cases and 450,000 deaths by 2022. Despite advances in its study and treatment, mortality rates for PDAC have not improved significantly. PDAC is characterized by a dense fibrotic stroma, which resists therapies, with FOLFIRINOX and a combination of gemcitabine and nab-paclitaxel being the main treatment options, and although trials with neoadjuvant chemotherapy appear to improve survival chances, the prognosis remains bleak. PDAC develops from mutations, particularly in the KRAS gene, present in 90% of cases, with other significant mutations in TP53, CDKN2A and SMAD4. However, mutations alone do not fully explain its progression, highlighting the role of epigenetic changes and alterations in gene expression. Recent studies have refined the classification of PDAC into two types, classical and basal, the latter being associated with a worse prognosis. Neuroendocrine neoplasms (NEN) also illustrate the heterogeneity of cancer. They range from well-differentiated neuroendocrine tumors (NET) to poorly differentiated neuroendocrine carcinomas (NEC), with different locations, histology and molecular characteristics. Improved diagnostic techniques, together with pathologic-biologic causes yet to be elucidated, have contributed to the increased incidence of these neoplasms, which often give rise to identifiable syndromes such as carcinoid syndrome, which simplifies diagnosis through symptoms such as flushing and diarrhea. Pancreatic NENs (PanNENs), less frequent and with a better prognosis than PDACs, and pulmonary NENs (LungNENs) show significant genetic diversity, which affects treatment and prognosis. RNA biology, an essential part of cellular functioning, involves RNA synthesis, modification, transport, translation and degradation. RNA splicing, carried out by the spliceosome, is crucial for generating multiple RNA and/or protein variants, contributing to cellular diversity and function. The exon junction complex (EJC) plays a key role in ensuring RNA integrity by influencing RNA export, translation and degradation. In fact, various defects in RNA biology are associated with diseases such as cancer, where abnormal splicing variants can contribute to oncogenesis and tumor progression. The importance of the relationship between RNA splicing and cancer is increasingly recognized, and mutations and dysregulation of splicing factors are now considered a hallmark feature of cancer. This dysregulation not only contributes to cancer progression, but also opens new avenues for targeted therapies, such as splicing modulating drugs and antisense oligonucleotides. Emerging technologies such as CRISPR and strategies that take advantage of alternative splicing-derived neoantigens hold promise for enhancing the immune response, especially in cancers with low mutational burden. Understanding the role of RNA splicing in cancer allows us to better understand tumor complexity and identify new therapeutic targets, paving the way for new interventions in cancer treatment. Advances in sequencing and bioinformatics are crucial to identify specific splicing aberrations and understand their functional implications, ultimately improving cancer treatment strategies. In this context, the general aim of this thesis was to study the role of RNA biology and, in particular, splicing, in the development and progression of aggressive PDAC and the poorly studied NETs of the lung and pancreas, with the ultimate goal of understanding the biology of these tumors and, ideally, finding new therapeutic avenues. In Chapter 1 of this thesis, we analyzed the role of RNA splicing in the biology of welldifferentiated lung carcinoids. In particular, we explored the expression profile of 43 genes of the splicing machinery in 23 lung carcinoid samples. Different analyses highlight the dysregulation of splicing machinery expression and evaluate the clinical implications of altered splicing factors, proposing them as potential biomarkers. Key splicing components such as KHDRBS1, NOVA1, PRPF8, SNW1, SRSF1, SRSF10 and SRSF9 are particularly overexpressed in tumor tissue. Further validation was performed using an external cohort, which confirmed the overexpression of several identified splicing components. The investigation then delved into five splicing factors —NOVA1, PRPF8, SRSF1, SRSF9 and SRSF10— that showed the best discriminative ability and clinical relevance to pathology. Protein expression analyses by immunohistochemistry confirmed overexpression of NOVA1, PRPF8 and SRSF10 in tumor tissues compared to adjacent non-tumor tissues, with distinct cytoplasmic and nuclear staining patterns. Additional analyses were performed on RNA-seq data from atypical carcinoids, in which gene set enrichment analysis was used to link the expression of these splicing factors to various molecular pathways. The chapter also discusses the functional implications of splicing factor expression in tumor biology. Silencing of NOVA1, PRPF8 and SRSF10 in lung carcinoid cell lines demonstrated an antitumor effect on cell proliferation and colonyforming ability, indicating their possible roles in modulating tumor behavior. These results suggest that certain splicing factors may have therapeutic potential in lung carcinoids. In Chapter 2, we explored the role of a component of EJC, EIF4A3, in PDAC. By measuring EIF4A3 expression by microfluidic qPCR array in a cohort of 75 PDAC patients, we demonstrated significant overexpression of EIF4A3 in PDAC tumor tissue compared with adjacent non-tumor tissue. Interestingly, increased EIF4A3 expression was associated with advanced tumor staging and metastasis, and with worse patient prognosis in terms of overall survival, progression-free survival and disease-specific survival. All this underscores the relevance of EIF4A3 in the pathogenesis of PDAC and its potential as a target for therapeutic intervention. Molecular pathway analyses using RNA-seq data in PDAC linked EIF4A3 expression to several cancer-related pathways, including cellular stress responses, MTORC1 and MYC metabolism and signaling, as well as its association with other EJC components, indicating a complex role in cellular metabolism and splicing. Experimentally, silencing of EIF4A3 in PDAC cell lines reduced malignant features such as proliferation, migration, and colony and tumorosphere formation, especially in the more aggressive cell lines. These in vitro findings were corroborated by in vivo experiments using a xenograft model, where EIF4A3 silencing led to a reduction in tumor volume, suggesting effective antitumor activity. Furthermore, its silencing altered gene expression of key molecular pathways involved in RNA processing and cellular metabolism, linking changes in EIF4A3 levels to co- and posttranscriptional consequences. Analysis of alternative splicing patterns in EIF4A3- silenced cells showed differential splicing events, particularly in exon skipping and alternative splicing site usage, which are crucial for post-transcriptional regulation of gene expression. Finally, in Chapter 3 of the present thesis, we explore the RNA splicing landscape of a cohort of 174 PanNETs to reveal novel pathological-molecular associations that could inform tumor classification, prognosis, and personalized medicine strategies. This study constitutes the first comprehensive spliceosomic analysis in PanNETs, examining the association of the splicing machinery and splicing patterns with molecular and clinical features. The study identifies three distinct spliceosomic clusters within PanNETs — SPN1, SPN2, and SPN3— each characterized by unique splicing machinery expression profiles associated with different clinical parameters. These groups show significant differences in tumor grade distribution, Ki-67 proliferation indexes, and the presence of metastases. In particular, SPN3 includes all grade 3 PanNETs and shows a higher Ki-67 index, indicating higher proliferative index. In contrast, SPN2 is distinguished by a higher frequency of metastases and a significant concentration of mutations in MEN1 and DAXX/ATRX, suggesting distinct molecular and clinical dynamics. In addition, each spliceosomic group exhibits unique transcriptomic signatures linked to specific biological pathways. For example, SPN1 is associated with protein export and spliceosome-related genes, SPN2 with cell membrane lipid metabolism and immune-related pathways, and SPN3 with hormone production and synapse-related processes. These findings are supported by the distribution of functional versus non-functional tumors in all groups, along with differential infiltration of immune cells, indicating diverse tumor microenvironments. The study extends to an analysis of alternative splicing events in all spliceosomic groups, with exon skipping being the most prevalent, followed by mutually exclusive exons and alternative splicing sites. Each group exhibits distinct patterns of alternative splicing events that correlate with their unique splicing machinery profiles, suggesting a relationship between specific splicing events and the molecular characteristics of the tumors. Further analyses using single-sample gene set enrichment scores identified distinct activations of mTOR pathways, DNA repair, and somatostatin receptor signaling in every group, with significant heterogeneity observed within SPN1 and SPN3. This suggests that each PanNET cluster might respond differently to targeted therapies, allowing the identification of personalized treatment approaches based on splicing profiles. In addition, distinct patterns of alternative splicing events within each cluster affect different biological pathways, predictably influencing tumor behavior and response to treatments. Specifically, alternative splicing events in SPN1 affect protein metabolism and membrane pathways, while in SPN2, they affect cell signaling and lipid metabolism, and in SPN3, they involve the splicing machinery itself and genes related to motor proteins. In view of the above, the main conclusions of this thesis are as follows: 1. The splicing machinery is altered in lung carcinoids compared to adjacent nontumor tissue. This alteration stood out especially in three factors, NOVA1, PRPF8 and SRSF10, pointing them out as possible therapeutic tools and targets for this disease. Thus, their silencing produced antitumor effects on proliferation and colony formation in lung carcinoid cell lines and, at the molecular level, their deregulation was linked to pathways of special functional and pathological relevance. 2. The EJC component EIF4A3 is overexpressed in PDAC, where it is associated with worse prognostic clinical parameters and poorer patient survival. Its modulation reduced the aggressive characteristics of PDAC in vitro and in vivo, and altered gene expression and/or alternative splicing of key cell signaling pathways, such as TNF-alpha and oxidative phosphorylation, as well as of the spliceosome itself. 3. The expression profile of the splicing machinery distinguishes three groups of PanNETs, associated with different clinical parameters. Each of these spliceosomic groups was associated with a specific alternative splicing profile, showing also, for the first time, a relationship between the expression profile of the splicing machinery and the event pattern of its product, the splicing variants. These results unveil new insights into the heterogeneous biology of PanNETs and bring them closer to personalized medicine. As an overall conclusion, the different studies that integrate this thesis have deepened our understanding of the deregulation of RNA biology and, in particular, of splicing, in the pathobiology of PDAC and neuroendocrine tumors. Our findings highlight the potential of different components of the spliceosome and EJC as possible new tools and molecular targets for tumor pathologies and reveal the potential of the spliceosomic landscape as a new method to decipher the molecular mechanisms underlying such cancers and to improve their classification and stratification for precision personalized medicine.

El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo, con casi 20 millones de nuevos casos y unos 10 millones de muertes anuales. La mortalidad es especialmente pronunciada en los países de renta baja y media, donde prevalecen los diagnósticos tardíos y las opciones de tratamiento son limitadas. Se prevé que para 2050 aumenten los casos de cáncer considerablemente. Las teorías sobre el cáncer ahora abarcan las mutaciones genéticas, los cambios epigenéticos y el microambiente tumoral, centrándose en cómo las células cancerosas superan a las normales, a través de mecanismos que no son del todo conocidos. El concepto de los "pilares" o "hallmarks" del cáncer de Hanahan y Weinberg, que se ha actualizado para incluir nuevos elementos como la plasticidad fenotípica y la influencia de los microbiomas, pone de manifiesto la complejidad del cáncer. El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), un tipo letal de cáncer originado del componente exocrino del páncreas, ejemplifica esta complejidad. Es el duodécimo cáncer más frecuente y el sexto más mortal en todo el mundo, con más de 500.000 nuevos casos y 450.000 muertes en 2022. A pesar de los avances en su estudio y tratamiento, las tasas de mortalidad del PDAC no han mejorado significativamente. El PDAC se caracteriza por un estroma fibrótico denso, que resiste las terapias, siendo FOLFIRINOX y una combinación de gemcitabina y nab-paclitaxel las principales opciones de tratamiento y, aunque los ensayos con quimioterapia neoadyuvante parecen mejorar las posibilidades de supervivencia, el pronóstico sigue siendo desolador. El PDAC se desarrolla a partir de mutaciones, en particular en el gen KRAS, presente en el 90 % de los casos, con otras mutaciones significativas en TP53, CDKN2A y SMAD4. Sin embargo, las mutaciones por sí solas no explican totalmente su progresión, destacando el papel de los cambios epigenéticos y las alteraciones de la expresión génica. Estudios recientes han refinado la clasificación del PDAC en dos tipos, clásico y basal, asociándose este último con un peor pronóstico. Las neoplasias neuroendocrinas (NEN) también ilustran la heterogeneidad del cáncer. Se trata de un conjunto que comprende desde los tumores neuroendocrinos bien diferenciados (NET) hasta los carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados (NEC), con distintas localizaciones, histología y características moleculares. La mejora en las técnicas diagnósticas, junto a causas patológico-biológicas aún por esclarecer, han contribuido al aumento de la incidencia de estas neoplasias, que a menudo dan lugar a síndromes identificables como el síndrome carcinoide, que simplifica el diagnóstico a través de síntomas como rubor y diarrea. Los NEN pancreáticos (PanNEN), menos frecuentes y con mejor pronóstico que los PDAC, y los NEN pulmonares (LungNENs) muestran una importante diversidad genética, que afecta al tratamiento y al pronóstico. La biología del ARN, parte esencial del funcionamiento celular, implica la síntesis, modificación, transporte, traducción y degradación del ARN. El splicing del ARN, llevado a cabo por el espliceosoma, es crucial para generar múltiples variantes de ARN y/o proteínas, contribuyendo a la diversidad y función celular. El complejo de unión de exones (EJC, del inglés exon junction complex) desempeña un papel clave para garantizar la integridad del ARN, influyendo en su exportación, traducción y degradación. De hecho, distintos defectos en la biología del ARN se asocian a enfermedades como el cáncer, donde variantes anómalas de splicing pueden contribuir a la oncogénesis y progresión tumoral. Cada vez se reconoce más la importancia de la relación entre el splicing del ARN y el cáncer, y las mutaciones y la desregulación de factores de splicing se consideran ahora una característica —un hallmark— transversal del cáncer. Esta desregulación no sólo contribuye a la progresión del cáncer, sino que también abre nuevas vías para terapias dirigidas, como los fármacos moduladores del splicing y los oligonucleótidos antisentido. Tecnologías emergentes como CRISPR y estrategias que aprovechan los neoantígenos derivados del splicing alternativo son prometedoras para mejorar la respuesta inmunitaria, especialmente en cánceres con baja carga mutacional. Entender el papel del splicing del ARN en el cáncer permite comprender mejor la complejidad del tumor e identificar nuevas dianas terapéuticas, allanando el camino para nuevas intervenciones en el tratamiento del cáncer. Los avances en secuenciación y bioinformática son cruciales para identificar aberraciones específicas del splicing y comprender sus repercusiones funcionales, mejorando en última instancia las estrategias de tratamiento del cáncer. En este contexto, el objetivo general de esta tesis fue estudiar el papel de la biología del ARN y, en particular, del splicing, en el desarrollo y la progresión del agresivo PDAC y en los poco estudiados NETs de pulmón y páncreas, con el fin último de comprender la biología de estos tumores e, idealmente, encontrar nuevas vías terapéuticas. En el Capítulo 1 de esta tesis, analizamos el papel del splicing del ARN en la biología de los carcinoides pulmonares bien diferenciados. En particular, exploramos el perfil de expresión de 43 genes de la maquinaria de splicing en 23 muestras de carcinoides pulmonares. Diferentes análisis destacan la desregulación de la expresión de la maquinaria de splicing y evalúan las implicaciones clínicas de los factores de splicing alterados, proponiéndolos como biomarcadores potenciales. Componentes clave del splicing como KHDRBS1, NOVA1, PRPF8, SNW1, SRSF1, SRSF10 y SRSF9 están particularmente sobreexpresados en tejido tumoral. Se realizó una validación adicional utilizando una cohorte externa, que confirmó la sobreexpresión de varios componentes de splicing identificados. A continuación, la investigación profundizó en cinco factores de splicing –NOVA1, PRPF8, SRSF1, SRSF9 y SRSF10– que mostraron la mejor capacidad discriminativa y relevancia clínica para la patología. Los análisis de expresión proteica mediante inmunohistoquímica confirmaron la sobreexpresión de NOVA1, PRPF8 y SRSF10 en tejidos tumorales en comparación con tejidos adyacentes no tumorales, con patrones de tinción citoplasmática y nuclear distintos. Se realizaron análisis adicionales en datos de RNA-seq de carcinoides atípicos, en los que se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes para vincular la expresión de estos factores de splicing a diversas vías moleculares. El capítulo también analiza las implicaciones funcionales de la expresión de los factores de splicing en la biología tumoral. El silenciamiento de NOVA1, PRPF8 y SRSF10 en líneas celulares de carcinoides pulmonares demostró un efecto antitumoral sobre la proliferación celular y la capacidad de formación de colonias, lo que indica sus posibles funciones en la modulación del comportamiento tumoral. Estos resultados sugieren que ciertos factores de splicing podrían tener potencial terapéutico en los carcinoides pulmonares. En el Capítulo 2, exploramos el papel de un componente del EJC, EIF4A3, en PDAC. Mediante la medición de la expresión de EIF4A3 por array de qPCR por microfluídica en una cohorte de 75 pacientes con PDAC, demostramos una sobreexpresión significativa de EIF4A3 en el tejido tumoral de PDAC en comparación con el tejido adyacente no tumoral. Curiosamente, el aumento de la expresión de EIF4A3 se asoció con la estadificación avanzada del tumor y la metástasis, y con peor pronóstico de los pacientes en términos de supervivencia global, supervivencia libre de progresión y supervivencia específica de la enfermedad. Todo esto subraya la relevancia de EIF4A3 en la patogénesis del PDAC y su potencial como diana para la intervención terapéutica. Los análisis de vías moleculares utilizando datos de RNA-seq en PDAC vincularon la expresión de EIF4A3 a varias vías relacionadas con el cáncer, incluyendo respuestas al estrés celular, metabolismo y señalización de MTORC1 y MYC, así como su asociación con otros componentes del EJC, lo que indica un papel complejo en el metabolismo celular y el splicing. Experimentalmente, el silenciamiento de EIF4A3 en líneas celulares de PDAC redujo características malignas como la proliferación, la migración, y la formación de colonias y tumorosferas, especialmente en las líneas celulares más agresivas. Estos hallazgos in vitro fueron corroborados por experimentos in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto, donde el silenciamiento de EIF4A3 condujo a una reducción del volumen tumoral, lo que sugiere una actividad antitumoral eficaz. Además, su silenciamiento alteró la expresión génica de rutas moleculares clave implicadas en el procesamiento del ARN y el metabolismo celular, vinculando los cambios en los niveles de EIF4A3 a consecuencias co- y post- transcripcionales. El análisis de los patrones de splicing alternativo en células con silenciamiento de EIF4A3 mostró eventos de splicing diferenciales, particularmente en el salto de exones y el uso alternativo de sitios de splicing, que son cruciales para la regulación post-transcripcional de la expresión génica. Por último, en el Capítulo 3 de la presente tesis, exploramos el paisaje de splicing de ARN de una cohorte de 174 PanNETs para revelar nuevas asociaciones patológicomoleculares que podrían informar sobre la clasificación del tumor, el pronóstico y las estrategias de medicina personalizada. Este estudio constituye el primer análisis espliceosómico exhaustivo en PanNETs, examinando la asociación de la maquinaria de splicing y los patrones de splicing con características moleculares y clínicas. El estudio identifica tres grupos espliceosómicos distintos dentro de PanNETs –SPN1, SPN2, y SPN3– cada uno caracterizado por perfiles de expresión de maquinaria de splicing únicos, asociados con diferentes parámetros clínicos. Estos grupos muestran diferencias significativas en la distribución del grado tumoral, los índices de proliferación Ki-67 y la presencia de metástasis. En particular, SPN3 incluye todos los PanNET de grado 3 y muestra un índice Ki-67 más alto, indicando mayor índice proliferativo. Por el contrario, SPN2 se distingue por una mayor frecuencia de metástasis y una concentración significativa de mutaciones en MEN1 y DAXX/ATRX, lo que sugiere una dinámica molecular y clínica distinta. Además, cada grupo espliceosómico exhibe firmas transcriptómicas singulares vinculadas a rutas biológicas específicas. Por ejemplo, SPN1 se asocia con la exportación de proteínas y genes relacionados con el espliceosoma, SPN2 con el metabolismo de los lípidos de la membrana celular y vías relacionadas con el sistema inmune, y SPN3 con la producción de hormonas y procesos relacionados con la sinapsis. Estos hallazgos se ven respaldados por la distribución de tumores funcionales frente a no funcionales en todos los grupos, junto con la infiltración diferencial de células inmunes, que indica la existencia de diversos microambientes tumorales. El estudio se extiende a un análisis de los eventos de splicing alternativo en todos los grupos espliceosómicos, siendo los saltos de exones los más prevalentes, seguidos de los exones mutuamente excluyentes y los sitios alternativos de splicing. Cada grupo presenta patrones distintos de eventos de splicing alternativo que se correlacionan con sus perfiles singulares de maquinaria de splicing, lo que sugiere una relación entre los eventos de splicing específicos y las características moleculares de los tumores. Otros análisis que utilizan puntuaciones de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única identificaron distintas activaciones de rutas de mTOR, reparación del ADN y señalización de receptores de somatostatina en cada uno de los grupos, observándose una heterogeneidad significativa dentro de SPN1 y SPN3. Esto sugiere que los distintos grupos de PanNET podrían responder de forma diferente a las terapias dirigidas, lo que permitiría identificar enfoques de tratamiento personalizados basados en los perfiles de splicing. Además, los distintos patrones de eventos de splicing alternativo dentro de cada grupo afectan a diferentes rutas biológicas, influyendo previsiblemente en el comportamiento del tumor y en su respuesta a tratamientos. En concreto, los eventos de splicing alternativo en SPN1 afectan al metabolismo de las proteínas y a rutas de membrana, mientras que en SPN2, afectan a la señalización celular y al metabolismo de los lípidos, y en SPN3, implican a la propia maquinaria de splicing y a genes relacionados con proteínas motoras. Por todo lo expuesto, las principales conclusiones de esta tesis son: 1. La maquinaria de splicing está alterada en los carcinoides pulmonares en comparación con el tejido adyacente no tumoral. Esta alteración destacó especialmente en tres factores, NOVA1, PRPF8 y SRSF10, señalándolos como posibles herramientas y dianas terapéuticas para esta enfermedad. Así, su silenciamiento produjo efectos antitumorales en la proliferación y formación de colonias en líneas celulares de carcinoides pulmonares y, a nivel molecular, su desregulación se vinculó a rutas de especial relevancia funcional y patológica. 2. El componente del EJC EIF4A3 está sobreexpresado en PDAC, donde se asocia a parámetros clínicos de peor pronóstico y peor supervivencia de los pacientes. Su modulación redujo las características de agresividad de PDAC in vitro e in vivo, y alteró la expresión génica y/o el splicing alternativo de vías clave de señalización celular, como el TNF-alfa y la fosforilación oxidativa, así como del propio espliceosoma. 3. El perfil de expresión de la maquinaria de splicing distingue tres grupos de PanNETs, asociados a diferentes parámetros clínicos. Cada uno de estos grupos espliceosómicos se asoció a un perfil de splicing alternativo específico, mostrando además, por primera vez, una relación entre el perfil de expresión de la maquinaria de splicing y el patrón de eventos de su producto, las variantes de splicing. Estos resultados desvelan nuevos conocimientos sobre la heterogénea biología de los PanNETs y los acercan a la medicina personalizada. Como conclusión global, los diferentes estudios que integran esta tesis han permitido profundizar en nuestra comprensión de la desregulación de la biología del ARN y, en particular, del splicing, en la patobiología del PDAC y los tumores neuroendocrinos. Nuestros hallazgos subrayan el potencial de diferentes componentes del espliceosoma y del EJC como posibles nuevas herramientas y dianas moleculares para patologías tumorales y revelan el potencial del paisaje espliceosómico como un nuevo método para descifrar los mecanismos moleculares que subyacen en dichos cánceres y para mejorar su clasificación y estratificación con vistas a una medicina personalizada de precisión.