Cicatrización en la piel de trachemys scripta: efectos de la aplicación tópica de secretoma de células madre mesenquimales y tolerancia a adhesivos quirúrgicos

Abstract

Los reptiles tienen interés veterinario tanto por las especies empleadas como animales de compañía como por las incluidas en programas de protección y conservación. Las heridas son frecuentes en estas especies pero muchas de las terapias usadas en mamíferos no se han empleado en reptiles. En esta tesis doctoral se evalúa el uso de adhesivos quirúrgicos (ensayo 1) y de terapias regenerativas (ensayo 2) en heridas de piel blanda de reptiles, utilizando como modelo experimental tortugas de la especie Trachemys scripta. El ensayo 1 estudió la tolerancia tisular y eficacia de los adhesivos de cianoacrilato (CA) para el cierre de incisiones cutáneas inducidas experimentalmente. Se llevaron a cabo dos experimentos con 12 tortugas cada uno. Bajo anestesia general, se realizaron dos incisiones de 1 cm de longitud en la piel dorsal de cada extremidad posterior (4 heridas por animal).En el experimento 1, los adhesivos quirúrgicos butil-CA y octil-CA, se aplicaron sobre la superficie de la herida, evitando su contacto con los tejidos internos. Como controles se emplearon sutura con hilo monofilamento absorbible 2/0 y etil-CA, un tipo de CA de cadena corta no autorizado para uso médico por su riesgo de histotoxicidad. El experimento 2 siguió un diseño igual pero se emplearon los adhesivos potencialmente más histotóxicos butil-CA y etil-CA, aplicados entre los bordes de las heridas. Se mantuvo una herida control con sutura, mientras una cuarta herida se dejó sin tratar, como control para las heridas que sufriesen dehiscencia. Los tratamientos se asignaron de forma aleatoria y se establecieron 4 tiempos de control, a los 2, 7, 14 y 21 post-inducción de la herida. En cada control, todas las heridas se evaluaron clínicamente y la evaluación histológica se realizó a partir de la biopsia completa de cada herida en 3 tortugas seleccionadas al azar. Durante el estudio las tortugas se mantuvieron al aire libre y con acceso al agua. En el experimento 1, la respuesta inflamatoria fue más intensa en las heridas cerradas con etil-CA. La principal complicación en todas las heridas fue su dehiscencia, observada desde los 2 días en 2 de las heridas. Al finalizar el estudio todas las heridas cerradas con CAs, habían sufrido dehiscencia por ninguna de las suturadas. Los CAs formaron precipitados macroscópicos, de mayor entidad y persistencia con butil-CA. Microscópicamente, la reacción inflamatoria fue más intensa en las heridas tratadas con etil-CA, y leve a moderada en las cerradas con el resto de adhesivos e hilo de sutura. La reepitelización se observó a los 21 días en todas las heridas cerradas con adhesivos, pero con grados variables de progresión, independientemente del adhesivo aplicado. Por el contrario, las 3 heridas cerradas con sutura mostraron una re-epitelización completa con diferenciación de todos los estratos epidérmicos. Ninguno de los 3 adhesivos ensayados, incluido etil-CA, produjo signos de histotoxicidad cuando se aplicaron sobre los bordes de las heridas. En el experimento 2, el adhesivo etil-CA, aplicado en el interior de la herida, provocó una respuesta inflamatoria más intensa que el butil-CA. La proporción de heridas con dehiscencia fue menor, solo 4 heridas al finalizar el estudio, 3 con etil-CA y 1 con butil-CA. Este último fue el adhesivo más efectivo pero formó precipitados persistentes entre los bordes unidos de las heridas. Microscópicamente, el etil-CA, se asoció con una reacción inflamatoria más intensa pero ninguno de los adhesivos, incluso aplicados dentro de la herida, ocasionó microscópicos indicativos de histotoxicidad. En conclusión, los adhesivos quirúrgicos a base de CA son bien tolerados en piel blanda de T. scripta, independientemente del método de aplicación. El segundo ensayo de esta tesis doctoral evaluó la terapia con células madre mesenquimales (CMM) como promotora de la cicatrización por segunda intención en piel blanda de tortugas. Se realizaron dos experimentos (experimentos 3 y 4) con un diseño igual. Bajo anestesia general se extrajo una pieza completa de piel de 6 mm de diámetro en la cara dorsal de cada extremidad posterior (2 heridas por animal). El experimento 3 evaluó el efecto de un secretoma xenogénico de CMM caninas en 14 tortugas. El secretoma se inyectó alrededor de las heridas los días 1, 7 y 14 post-inducción de la herida. En cada punto de inyección se administraron 0.15 ml por vía subcutánea (SC), y se depositaron 2 gotas en el lecho de la herida. Como control negativo se usó un mismo volumen de Ringer lactato. El porcentaje de retracción de la herida y su aspecto clínico, se registraron en todos los animales los días 7, 14 y 21 y en 11 animales el día 28. El estudio microscópico se realizó a partir de cortes histológicos de biopsias de las heridas de 3 tortugas (n=3) seleccionadas al azar los días 21, 28, 42 y 63 post-inducción de la herida. Se evaluaron los parámetros morfológicos que indican la progresión de la cicatrización, como el grado de reepitelización y la producción y maduración del tejido de granulación. El experimento 4 mantuvo el diseño anterior pero previamente se cultivaron y caracterizaron CMM autólogas obtenidas a partir de muestras de tejido adiposo extraídas quirúrgicamente. Se utilizaron 18 tortugas (n=18), en las que se realizó una sola aplicación del secretoma autogénico el día 3 post-inducción de la herida. Se administraron 0,5 ml de secretoma repartidos en dos puntos de inyección y solución de Ringer lactato como control negativo. La evaluación clínica, midiendo el área de la herida y su aspecto macroscópico, se realizó en todos los animales los días 0, 7 y 14; en 14 animales los días 21 y 28 y en 8 animales los días 35 y 42. Las variables microscópicas se analizaron, el día 14, en 4 animales; el día 28, en 6 animales y el día 42 en 8 animales. Adicionalmente, se hizo un estudio morfométrico cuantitativo con el recuento de células inflamatorias (heterófilos, macrófagos, linfocitos y fibroblastos) en biopsias de heridas tomadas a los 14, 28 y 42 días (4, 6 y 8 animales, respectivamente). Clínicamente, las heridas tratadas con CMM xenogénicas mostraron un mejor aspecto y mayor grado de retracción pero sin alcanzar diferencias estadísticamente significativas respecto a las heridas control. Microscópicamente no se observaron diferencias significativas en la cicatrización de las heridas tratadas respecto de sus controles. Al finalizar el estudio, se observó que en 3 de los 12 animales incluidos en el análisis histopatológico, las heridas tratadas con secretoma de CMM caninas, presentaban una cicatrización más avanzada en comparación a su control interno; mientras que, en el resto (9 animales), las heridas tratadas con secretoma evolucionaron de forma similar a sus controles. No se observó reacción adversa alguna atribuible a la aplicación del secretoma de CMM. En el experimento 4, tras la aplicación de CMM autólogas, tampoco se observaron diferencias estadísticamente en la retracción de la herida. El aspecto clínico de las heridas tratadas y control fue similar. Microscópicamente, en los 3 tiempos de control, no se observaron lesiones asociadas con una reacción adversa, como degeneración o necrosis de los tejidos dermo-epidérmicos. En el estudio morfométrico la media de linfocitos y fibroblastos fueron significativamente inferiores en las heridas tratadas con CMM (P=0,0439 y P=0,0499 respectivamente). Aunque la terapia con CMM autólogas no tuvo un efecto positivo clínicamente relevante, las diferencias del estudio morfométrico indicarían que efectivamente su secretoma es capaz de modificar la respuesta inflamatoria. Este efecto biológico podría ser mayor modificando parámetros como frecuencia, volumen y concentración del secretoma aplicado lo que, teniendo en cuenta la fácil obtención y cultivo de las CMM de tejido adiposo, abre un nuevo campo para el ensayo de terapias regenerativas en esta especie.

Reptiles are of veterinary interest both for species used as companion animals and for those included in protection and conservation programmes. Wounds are common in these species but many of the therapies used in mammals have not been used in reptiles. This doctoral thesis evaluates the use of surgical adhesives (trial 1) and regenerative therapies (trial 2) on soft skin wounds in reptiles, using turtles of the species Trachemys scripta as an experimental model. Trial 1 studied the tissue tolerance and efficacy of cyanoacrylate (CA) adhesives for closure of experimentally induced skin incisions. Two experiments were conducted with 12 tortoises each. Under general anaesthesia, two 1 cm long incisions were made in the dorsal skin of each hind limb (4 wounds per animal). In experiment 1, butyl-CA and octyl-CA surgical adhesives were applied to the wound surface, avoiding contact with internal tissues. Sutures with 2/0 absorbable monofilament thread and ethyl-CA, a type of short-chain CA not approved for medical use due to its risk of histotoxicity, were used as controls. Experiment 2 followed the same design but used the potentially more histotoxic butyl-CA and ethyl-CA adhesives, applied between the wound edges. One control wound was kept sutured, while a fourth wound was left untreated as a control for wounds suffering from dehiscence. Treatments were randomised and four control times were established at 2, 7, 14 and 21 post wound induction. At each control, all wounds were evaluated clinically and histological evaluation was performed from complete biopsy of each wound in 3 randomly selected tortoises. During the study, tortoises were kept outdoors with access to water. In experiment 1, the inflammatory response was more intense in wounds closed with ethyl-CA. The main complication in all wounds was dehiscence, observed from 2 days in 2 of the wounds. At the end of the study, all wounds closed with CAs had dehiscence and none of the sutured wounds had dehiscence. The CAs formed macroscopic precipitates, of greater entity and persistence with butyl-CA. Microscopically, the inflammatory reaction was more intense in the wounds treated with ethyl-CA, and mild to moderate in those closed with the other adhesives and suture thread. Re-epithelialisation was observed at 21 days in all wounds closed with adhesives, but with varying degrees of progression, irrespective of the adhesive applied. In contrast, the 3 wounds closed with suture showed complete re-epithelialisation with differentiation of all epidermal layers. None of the 3 adhesives tested, including ethyl-CA, produced signs of histotoxicity when applied to the wound edges. In experiment 2, the ethyl-CA adhesive, applied inside the wound, provoked a more intense inflammatory response than butyl-CA. The proportion of wounds with dehiscence was lower, only 4 wounds at the end of the study, 3 with ethyl- CA and 1 with butyl-CA. The latter was the most effective adhesive but formed persistent precipitates between the fused wound edges. Microscopically, ethyl- CA was associated with a more intense inflammatory reaction but none of the adhesives, even when applied inside the wound, caused microscopic evidence of histotoxicity. In conclusion, CA-based surgical adhesives are well tolerated in soft T. scripta skin, irrespective of the method of application. The second trial of this PhD thesis evaluated mesenchymal stem cell (MSC) therapy as a promoter of second intention healing in tortoise soft skin. Two experiments (experiments 3 and 4) were performed with an equal design. Under general anaesthesia, a complete piece of skin 6 mm in diameter was removed from the dorsal side of each hind limb (2 wounds per animal). Experiment 3 evaluated the effect of a xenogeneic canine MSCs secretome in 14 tortoises. The secretome was injected around the wounds on days 1, 7 and 14 post-wound induction. At each injection site, 0.15 ml was administered subcutaneously (SC), and 2 drops were deposited in the wound bed. An equal volume of lactated Ringer's lactate was used as a negative control. Wound retraction percentage and clinical appearance were recorded in all animals on days 7, 14 and 21 and in 11 animals on day 28. Microscopic study was performed on histological sections of wound biopsies from 3 randomly selected tortoises (n=3) on days 21, 28, 42 and 63 post wound induction. Morphological parameters indicating the progression of healing, such as the degree of re-epithelialisation and the production and maturation of granulation tissue, were assessed. Experiment 4 maintained the previous design but first cultured and characterised autologous MSCs obtained from surgically harvested adipose tissue samples. Eighteen turtles (n=18) were used and a single application of the autogenic secretome was performed on day 3 post wound induction. Two injection sites were administered with 0.5 ml of secretome and lactate Ringer's solution as a negative control. Clinical evaluation, measuring wound area and macroscopic appearance, was performed in all animals on days 0, 7 and 14; in 14 animals on days 21 and 28 and in 8 animals on days 35 and 42. Microscopic variables were analysed on day 14 in 4 animals, on day 28 in 6 animals and on day 42 in 8 animals. Additionally, a quantitative morphometric study was performed with inflammatory cell counts (heterophils, macrophages, lymphocytes and fibroblasts) in wound biopsies taken at 14, 28 and 42 days (4, 6 and 8 animals, respectively). Clinically, wounds treated with xenogeneic MSCs showed a better appearance and a higher degree of retraction but no statistically significant differences compared to control wounds. Microscopically, no significant differences in wound healing were observed between treated wounds and controls. At the end of the study, it was observed that in 3 of the 12 animals included in the histopathological analysis, the canine MSC secretome-treated wounds showed more advanced healing compared to their internal control; while in the rest (9 animals), the secretome-treated wounds evolved similarly to their controls. No adverse reactions attributable to the application of the MSC secretome were observed. In experiment 4, after application of autologous MSCs, no statistical difference in wound retraction was observed either. The clinical appearance of treated and control wounds was similar. Microscopically, in the 3 control times, no lesions associated with an adverse reaction, such as degeneration or necrosis of the dermo-epidermal tissues, were observed. In the morphometric study, mean lymphocyte and fibroblast counts were significantly lower in MSC-treated wounds (P=0.0439 and P=0.0499 respectively). Although autologous MSC therapy did not have a clinically relevant positive effect, the differences in the morphometric study would indicate that indeed their secretome is able to modify the inflammatory response. This biological effect could be enhanced by modifying parameters such as frequency, volume and concentration of the applied secretome, which, taking into account the ease of obtaining and culturing MSCs from adipose tissue, opens a new field for the testing of regenerative therapies in this species.