Estudio Preclínico de Linfocitos CAR-T Universales con Subpoblaciones Definidas de Células T

Abstract

Las células T modificadas para expresar receptores de antígeno quiméricos (CAR) han transformado de manera significativa el panorama clínico, especialmente en el tratamiento de neoplasias de células B. Este producto ha demostrado una notable eficacia en pacientes diagnosticados con estas patologías, a los que las líneas de tratamiento convencionales no han producido el efecto esperado. A pesar de las altas tasas de respuesta a la terapia CAR-T, sigue habiendo un alto porcentaje de pacientes que recae tras el tratamiento, principalmente por la falta de persistencia del producto celular final. La naturaleza de las terapias CAR-T actuales es de carácter autólogo, lo cual conlleva ciertas limitaciones principalmente debidas a la calidad de los linfocitos usados como material de partida. Para abordar estas limitaciones, el uso de células de carácter alogénico permitiría producir células CAR-T a partir de linfocitos de donantes sanos, lo cual se ha demostrado que aumenta la eficacia del producto final. Sin embargo, el uso de células alogénicas podría desencadenar en los pacientes tratados reacciones de rechazo del injerto, o desencadenar la enfermedad injerto contra huésped, ambas reacciones mediadas por el HLA-I y el TCR, respectivamente, presente en la superficie de los linfocitos T. En este trabajo se ha desarrollado una estrategia basada en el sistema de edición genómica CRISPR/Ca9 y el uso de vectores lentivirales para generar células CAR-T universales (uCAR-T) que no induzcan reacciones derivadas de la alorreactividad entre donantes. Mediante ensayos funcionales se ha demostrado que las células uCAR-T in vitro presentan la misma eficacia frente a líneas tumorales CD19+ que las células CAR-T no editadas, sin alteraciones fenotípicas importantes debidas a la edición de las mismas. Las herramientas de edición genómica, a pesar de su gran eficacia demostrada in vitro, generan alarma debido a la posibilidad de provocar efectos secundarios genotóxicos en las células editadas con las mismas. En este trabajo se combinaron dos técnicas de análisis bioinformático, CRISPRroots y CAST-Seq, para evaluar la seguridad de la estrategia de edición desde un punto de vista transcriptómico y genómico. Como resultado de esta evaluación, se pudo determinar que la edición de los loci HLA-I y TCR no conllevaba la alteración de sitios inespecíficos, y por tanto la estrategia seguida resulta segura a nivel de secuencia. Por otro lado, otra de las principales causas de falta de persistencia de las células CAR-T es debida al estado de diferenciación de las células que componen el producto final. Así, células T con un fenotipo terminalmente diferenciado debido a la enfermedad, al tratamiento previo recibido, o a las propiedades intrínsecas de las células de un individuo, determinan una peor prognosis del tratamiento, ya que estas presentan un tiempo de vida corto en circulación. En base a esto, se ha desarrollado como parte de esta tesis un protocolo de aislamiento de los estadios celulares menos diferenciados (TSCM y TCM), para enriquecer el producto final con estos fenotipos. Los experimentos in vitro con células uCAR-T enriquecidas en fenotipos memoria presentaron gran eficacia funcional frente a células CD19+ ante repetidos estímulos con el antígeno tumoral, con un patrón de secreción de citoquinas disminuido respecto a las células uCAR-T sin enriquecer. Esto sugiere que podrían tener mejor perfil de seguridad en cuanto a toxicidad, respecto a las actuales terapias comercializadas. En conclusión, se ha demostrado in vitro la viabilidad de producir células CAR-T universales seguras con un fenotipo de memoria definido, lo cual podría contribuir al avance de esta terapia, mejorando los resultados clínicos en pacientes con neoplasias hematológicas.

Genetically modified T cells expressing chimeric antigen receptors (CAR-T cells) have significantly transformed the clinical landscape of B cell malignancies treatment. This product has shown a remarkable efficacy in recognizing and attacking tumoral cells with high selectivity and specificity. This behaviour has led 6 products to get the approval for clinical use from the American Food and Drug Administration (FDA). However, approved therapies are currently based on autologous products, hence carrying some limitations as the high pricing and, in some cases, a reduction in the resulting efficiency due to the lack of persistence and cellular adequacy from the patients. Furthermore, some of the side effects of this therapy have been associated with the phenotype these cells show at the time of the infusion, which can have low functionality from baseline. To address these limitations, we have developed a strategy based on the CRISPR/Cas9 genomic edition system and the implementation of lentiviral vectors to generate universal CAR-T cells (uCAR-T) with a memory phenotype enrichment. Our approach proposes the use of allogenic cells instead of autologous cells, a transformation that implies hampering the expression of the surface molecules TCR and HLA-I, thus decreasing the main side effects of allogenic therapies: graft versus host and host versus graft reactions. Besides, we enriched the cell culture with less differentiated T cells to improve the persistence of the new uCAR-T cells. In vitro experiments confirmed that uCAR-T cell generation was a viable process, indicating a lower reactivity of these cells when put in co-culture with cells obtained from a different donor. When combining uCAR-T cells with the enriched fraction in memory T cells, we found a functional profile characterized by a strong lytic capacity against tumoral cells and a less pronounced cytokine secretion profile. Genomic safety was assessed thoroughly in our approach using different strategies, and we did not find anomalies derived from the deletion of TCR and HLA-I, strongly indicating that the universal CAR-T cells production protocol hereby described seems safe. Altogether, we have proved the viability and safety of producing in vitro universal CAR-T cells with a defined memory phenotype.