Molecular Characterisation of a Pisum spp. Germplasm for Resistance to Fusarium oxysporum and Orobanche crenata by DArtSeq for Genome Wide Association Studies (GWAS)

Abstract

Pea (Pisum sativum L.), a globally cultivated proteinaceous legume, is a vital source of food and feed for humanity. It offers a versatile solution for soil amendment through nitrogen fixation and green manuring, contributing to improved soil health. Its status as a legume aligns with sustainable agricultural practices, enhancing environmental benefits and food security. However, production is significantly limited by soilborne diseases, particularly fusarium wilt and parasitic broomrapes, which pose major challenges in pea-growing regions. Yet, current control strategies for pea soilborne diseases are often ineffective or environmentally harmful. Breeding for resistance is a more sustainable approach. Limited genetic diversity and the large pea genome pose challenges to breeding efforts. Fortunately, the genome of pea has been decoded with the availability of three chromosomal level genomes. Expanding the genetic diversity of elite lines through effective utilization of pea germplasm is crucial. Therefore, genotyping large germplasm collections alongside their phenotyping is crucial for informed selection. To accelerate the introduction of desired traits into elite pea varieties, marker-assisted selection holds significant promise. Therefore the first chapter of the thesis aimed to develop and to characterise at molecular level a wide pea core collection. Developing pea core collections improves our understanding of pea evolution and could improve genetic pool of breeding programs. We assembled a pea core collection of 324 accessions from worldwide origin and covering all Pisum species and subspecies. Then this collection was genotyped by DArTSeq approach yielding a set of 35,790 polymorphic markers, including 24,279 SilicoDArT and 11,511 SNP markers that were used to estimate the genetic diversity and population structure of the collection. Over 90% of these markers were mapped to the pea reference genomes. The average LD50 distance was 0.48 Mbp for SilicoDArT markers and 1.38 Mbp for SNP markers. The pea core collection showed a wide genetic diversity and clustered into three or six subpopulations, with evidence of admixtures. Our findings support the classification of the Pisum genus into P. fulvum and P. sativum. The high genetic diversity, LD, and marker coverage facilitate trait discovery and association studies in the subsequent Chapters aiming the phenotyping of the collection against fusarium wilt and broomrape respectively and the implementation of GWAS approach to identify novel molecular markers and candidate gene associated with resistance. Previous QTL mapping has identified loci associated with resistance to Fusarium oxysporum f. sp. pisi race 1 and 2, and O. crenata in pea, nonetheless limited allelic variation and recombination rates in bi-parental populations hinder fine mapping and marker efficiency. GWAS offer a solution by leveraging the natural allelic variation in diverse germplasm. This approach, based on linkage disequilibrium, identifies associations between genes and traits, improving genetic map resolution. Therefore Chapter 2 continued from the previous genetic determination of the pea core collection to characterise its response to Fop and identify novel molecular markers associated with Fop resistance. The collection was phenotyped against isolates from Fop race 1 and 2 under controlled conditions. A wide variation of response was detected against both races of Fop ranging from complete resistance to susceptibility. In addition, the phenotypic variations observed confirmed the quantitative nature of resistance to both Fop races. Wild accessions and landraces emerged as valuable sources of Fop resistance. GWAS using MLM, FarmCPU, and BLINK models in GAPIT identified a total of 34 significant MTAs for Fop races 1 and 2 and allowed the identification of several putative candidate genes for Fop resistance. For Fop race 1, four genes were found near markers 3551059, 3641226, 3552330, and 5929725. Notably, 3552330 is located within the confidence interval of the Fw resistance locus. The linked genes are implicated in several molecular pathways in response to pathogen attacks, plant growth and secretion of defense-related proteins that enable plants adaptation and survival under stress conditions. For Fop race 2, seven candidate genes were identified near markers 3544513, 3566463, 3547272, 3542143, 356990, 3553942, and 3568469. These markers are associated with genes participating in legume plant health, root nodulation, detoxification, stress response, and defense functions. Accordingly, these markers are valuable and might participate in Fop race 1 and 2 resistance in pea. On the final chapter, we focused on identifying sources of resistance to parasitic O. crenata in the pea collection. Field screenings were conducted over four seasons in Córdoba. Results presented a quantitative mode of resistance. Novel sources of resistance were primarily identified within the wild P. fulvum and P. sativum subsp. elatius. The GWAS analysis with FarmCPU and BLINK models yielded 73 significant MTAs, corresponding to 50 unique SilicoDArT markers. These markers were distributed across all pea chromosomes, with a hotspot on chromosome 5. Some associated markers were located within the confidence intervals of previously identified QTLs. The genomic regions surrounding these markers, identified 37 candidate genes. These candidate genes participated in various cellular processes, including vesicle trafficking, transport, DNA transcription regulation, and defense. Ultimately, our findings provide a genetic foundation for O. crenata resistance, enabling sustainable control strategies. Future integration of these novel loci into breeding programs through marker-assisted selection can enhance genetic diversity and improved cultivars. Altogether, the research performed during this thesis have Improve our understanding of pea population and clarified pea taxonomy that are still under debate. More importantly it provides novel sources of resistance to two of its main constraints, fusarium wilt and broomrape and a set of novel molecular markers associated with resistance. All these results bring new breeding opportunities to improve resistance in the field to these diseases. In addition, a set of candidate gene has been located near the associated molecular marker Identifying them as promising candidate genes that could be further exploited for breeding.

El guisante (Pisum sativum L.), una leguminosa proteica cultivada a nivel mundial, es una fuente vital de alimentos y piensos para la humanidad. El guisante ofrece una solución versátil para mejorar la calidad y fertilidad del suelo mediante la fijación de nitrógeno y el abono verde. Su condición de leguminosa se alinea con las prácticas agrícolas sostenibles aportando. beneficios ambientales y contribuye a la seguridad alimentaria. Sin embargo, la producción de guisante está limitada por enfermedades de suelo, en particular el marchitamiento vascular y el jopo, que plantean grandes desafíos en las regiones productoras de guisantes. Las estrategias actuales de control de las enfermedades de suelo suelen ser ineficaces o perjudiciales para el medio ambiente. La mejora por resistencia es un enfoque más sostenible. La limitante explotación de la diversidad genética del guisante y su gran genoma dificultan los esfuerzos de mejora. Afortunadamente, el genoma del guisante ha sido decodificado con la disponibilidad de tres genomas a nivel cromosómico. Es crucial ampliar la diversidad genética de las líneas de élite mediante la utilización eficaz del germoplasma de guisantes. Por lo tanto, el genotipado de grandes colecciones de germoplasma junto con su fenotipado detallado es crucial para una selección informada. Para acelerar la introducción de los rasgos deseados en las variedades de guisantes de élite, la selección asistida por marcadores es muy prometedora. El uso de populación de mapeo biparentales ha permitid localizar varios QTL de resistencia a la fusariosis vascular y al jopo. Sin embargo, la limitada variación alélica y la baja diversidad genética de estas poblaciones dificultan el mapeo fino y la eficiencia de los marcador moleculares. Las aproximaciones de mapeo de associación (GWAS) ofrecen una solución alternativa que aprovecha la gran variación alélica presente en poblaciones naturales diversas permitiendo localizar QTL con una mayor precisión. Este enfoque, basado en el desequilibrio de ligamiento, identifica asociaciones entre marcadores moleculares y rasgos de interés, mejorando la resolución del mapa genético. Así, para identificar regiones genómicas responsable de la resistencia a Fop y O. crenata, hemos seleccionado y genotipado una colección núcleo de guisante (Capitulo 1) que hemos usado para encontrar nuevas fuentes de resistencia y marcadores moleculares asociados a la resistencia a la fusariosis vascular (Capitulo 2) y a jopo (Capitulo 3). El desarrollo de colecciones básicas de guisantes mejora nuestra comprensión de la evolución de los guisantes y podría mejorar el acervo genético de los programas de mejoramiento. Asi, hemos desarrollado una colección de 324 entradas de guisante de origen variada que cubren todas las especies y subespecies del género Pisum. Su genotipado mediante aproximación de DArTSeq generó 35.790 marcadores polimórficos, incluyendo 24.279 marcadores SilicoDArT y 11.511 SNP. Más del 90% de estos marcadores fueron localizado sobre el genoma de referencia del guisante. La distancia LD50 promedio de estos marcadores fue de 0,48 Mbp para los marcadores SilicoDArT y de 1,38 Mbp para los marcadores SNP. La carácterización m olecular de la colección demostro la alta diversidad genética contenido en esta colección e detecto tres o seis subpoblaciones, con evidencia de multiples evento de hibridación intraespecifica. Nuestros hallazgos apoyan la clasificación del género Pisum en P. fulvum y P. sativum. La alta diversidad genética contenida en esta colección y la amplia cobertura cromosomica de los marcadores facilitan el descubrimiento de regiones genomicas que controlan la resistencia y la implementación de la selección asistida por marcadores. Para explotar esta diversidad, hemos evaluado esta colección frente a la fusariosis vascular /capítulo 2) y el jopo (capitulo 3). El capítulo 2, la colección fue fenotipada frente a aislados de la raza 1 y 2 de Fop en condiciones controladas. El fenotipado confirmo la gran variabilidad de respuesta de la colección frente a ambos aislado cubriendo desde resistencia completa hasta susceptibilidad. Además, este estudio permitio establecer la naturaleza cuantitativa de la resistencia a ambas razas de Fop. Las accesiones silvestres y las variedades locales surgieron como fuentes valiosas de resistencia Fop. La implementación de aproximación GWAS utilizando los modelos MLM, FarmCPU y BLINK en GAPIT identificó un total de 34 MTA para las razas 1 y 2 de Fop asi como varios genes candidatos conteniendo y situado muy cerca de los marcadores significativamente asociado a la resistencia. Para la raza 1 de Fop, se encontraron cuatro genes cerca de los marcadores 3551059, 3641226, 3552330 y 5929725. En particular, 3552330 se encuentra dentro del intervalo de confianza del gen Fw. Los genes vinculados están implicados en varias procesos celulares o biologicos incluyendo respuesta de defensa a patógenos, crecimiento y secreción de proteínas relacionadas con la defensa que permiten a las plantas adaptarse y sobrevivir en condiciones de estrés. Frente a la raza 2, se identificaron siete genes candidatos cerca de los marcadores 3544513, 3566463, 3547272, 3542143, 356990, 3553942 y 3568469. Estos marcadores están asociados con genes que participan en la salud de las leguminosas, la nodulación de las raíces, la desintoxicación, la respuesta al estrés y las defensas. Estos marcadores son valiosos y podrían participar en la resistencia de las razas 1 y 2 de Fop en guisantes. En el último capítulo, nos centramos en identificar fuentes de resistencia al parásito O. crenata en la colección de guisantes. El fenotipado de la colección frente a jopo se realizaron en cuatro campañas de campo en una parcela experimental localizada en Los resultados presentaron un modo cuantitativo de resistencia. Se identificaron nuevas fuentes de resistencia principalmente en las especies silvestres P. fulvum y P. sativum subsp. elatius. El análisis GWAS con los modelos FarmCPU y BLINK arrojó 73 MTA significativos, correspondientes a 50 marcadores SilicoDArT únicos. Estos marcadores se distribuyeron sobre todos los cromosomas del guisantes, con un punto caliente sobre el cromosoma 5. Algunos marcadores asociados se ubicaron dentro de los intervalos de confianza de algunos de los QTL identificados previamente. Además, 37 genes candidatos potenciales han sido localizado próximo a los marcadores asociados. Estos genes candidatos participan en varios procesos celulares, incluido el transporte de sustancia intra y extracelular, la regulación de la transcripción del ADN y la defensa. En última instancia, nuestros hallazgos proporcionan una base genética para la resistencia de O. crenata, lo que permite estrategias de control sostenibles. En su conjunto, estos trabajos han permitido establecer la gran diversidad genética disponible para el guisante para su mayor explotación. Además, permitío aclarar la taxonomía del guisante. Por otra parte, ha permitido identificar nuevas fuentes de resistencias para profundizar en los mecanismos de resistencia a las enfermedades de suelo y la mejora por resistencia. Además, mediante las aproximaciones de GWAS hemos identificado y localizado varios marcadores moleculares associado a la resistencia que permitirán la implementación de herramienta de selección asistida por marcadores para facilitar y acelerar la mejora por resistencia. Finalmente se ha propuestos diferentes genes candidatos que servirán para profundizar en nuestro entendimiento de la resistencia.