Study of the pathogenesis of caprine tuberculosis and paratuberculosis. Control by means of immunoprophylaxis with inactivated mycobacteria and their immunoprotein derivatives

Abstract

Tuberculosis (TB) and paratuberculosis (PTB) are chronic diseases caused by mycobacteria, which can affect multiple hosts, including domestic animals, wildlife, and humans. These diseases are widely distributed worldwide, exerting a significant health, economic, and conservation impact on certain affected species. Mycobacterial infections are characterized by their ability to persist within the host, evading effective immune responses, largely due to the formation of granulomas ‒complex pathological structures that include, among others, immune cell populations whose function is modulated by cytokines‒. Despite advancements in understanding the immune response to TB and PTB, many aspects remain unclear. Thus, studying their immunopathology is essential for the subsequent development and evaluation of control strategies based on immunoprophylaxis. In this context, goats, although a significant reservoir for maintaining and transmitting mycobacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), are not systematically included in official eradication programs across Spain, compromising TB control efforts in cattle. Regarding PTB, Spain lacks eradication programs in livestock, contributing to its persistence in caprine populations and potentially in other species. This scenario underscores the need to deepen our understanding of the pathogenesis of mycobacterial infections in goats as a target species in the epidemiological cycle of these diseases and to develop and/or evaluate alternative control strategies to mitigate the risks they pose to humans and animals. Immunoprophylaxis emerges as a key tool to mitigate clinical symptoms and reduce mycobacterial burden in animals, thereby decreasing environmental mycobacterial contamination and transmission in animal populations not included in eradication programs or in regions where such programs are not feasible. Regarding TB, the only commercially authorized vaccine is the Bacillus Calmette-Guérin (BCG), an attenuated M. bovis strain used in humans as well as in clinical trials with livestock and wildlife, yielding a variable efficacy range (0–80%). However, BCG has inherent limitations associated with live vaccines, such as the risk of persistence in host tissues, potential shedding into the environment, interference with TB diagnostic tests, and the requirement for cold-chain maintenance prior to application. These limitations underscore the need for safer and more effective vaccination strategies, such as inactivated vaccines. For PTB, while vaccination in cattle has been prohibited due to its interference with TB eradication programs (Directive 78/52/EEC), its use in species not subject to such programs is of great interest. The implementation of an immunization strategy to control PTB has demonstrated significant benefits, reducing the prevalence of the disease in affected populations, minimizing economic losses in the livestock sector associated with the disease, and addressing potential public health concerns. Considering that immune evasion plays a pivotal role in the pathogenesis of mycobacterial diseases and that the use of alternatives to live vaccines could be effective in controlling TB and PTB in goats, the objective of this doctoral thesis was to study in depth the immunopathogenesis of TB, identifying the most relevant immunological markers to evaluate the efficacy of different vaccine candidates against TB and PTB in goats, and elucidating the immune mechanisms that determine their success or failure in host protection. To achieve this, this work is structured into four chapters, encompassing and compiling the various scientific studies conducted: the study of the immunopathogenesis of TB, the evaluation of different vaccine candidates for TB in goats, and the assessment of inactivated mycobacteria for the control of PTB in goats. Chapter 1 presents a thorough and up-to-date literature review aimed at gathering the necessary information to deeply explore the immunopathogenic mechanisms of TB in different species, identifying key changes in cellular dynamics and immune mediators involved in the immune modulation associated with disease progression. This review highlights that Toll like receptors (TLR)2 and TLR4 receptors play a critical role in the early stages of infection by facilitating host-pathogen interactions, alongside cathelicidins ‒peptides with microbicidal functions‒ and antigen-presenting cells, which are pivotal in initiating T-cell activation and establishing adaptive immunity. Additionally, M1 macrophages (MΦs) are recognized as central players in defence against the MTC, producing mediators such as tumor necrosis factor alpha (TNFα), interleukin (IL)-12, and inducible nitric oxide synthase (iNOS), whose bactericidal effects are crucial for controlling infection. Their function is supported by CD4+ T lymphocytes and their associated mediators, including interferon (IFN)γ, IL-2, and IL-17, which drive a Th1 cellular response. However, the presence of M2 MΦs and anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-10 and transforming growth factor beta (TGF-β), while playing immunoregulatory roles, can diminish the immune response and potentially affect vaccine efficacy. This characterization of the immunological mediators involved in the response to TB can serve as a guide for evaluating more effective immunoprophylaxis strategies against this disease. Chapter 2 presents an experimental study on caprine TB, focused on characterizing the immunopathogenic mechanisms involved in the development of pulmonary TB in animals naturally infected with M. bovis based on the immune mediators described in Chapter 1. This study examined how variations in pulmonary immune responses may influence disease progression and the severity of tuberculous lesions. Differences were observed in cellular dynamics, cytokine profiles, and other immunological mediators between animals with visible pulmonary tuberculous lesions (TBLL+) and those that, despite being infected, did not develop lesions (TBLL-). TBLL+ animals showed a high presence of neutrophils, MΦs, and lymphocytes, along with increased IFNγ expression. In contrast, TBLL- animals exhibited high expression of TLR2, TLR4, TNFα, IL-2, iNOS, and IL-10, which suggested an immune response profile that could control or delay the formation of tuberculous lesions. The connection between the findings from the literature review in Chapter 1 and the experimental study results in Chapter 2 has enabled the identification of response patterns to TB and the definition of key immunological markers. These markers enhance the evaluation of novel immunoprophylactic strategies against mycobacterial infections in goats. Chapter 3 of this doctoral thesis is divided into three scientific studies, focuses on the in vitro and in vivo evaluation of the immunostimulatory potential of two vaccine candidates against TB: one based on heat-inactivated M. bovis (HIMB) and the other on an immunoprotein complex derived from bovine tuberculin (P22PI). In Chapter 3.1, the study on the in vitro immunostimulatory potential of HIMB and the protein immune complex P22 (P22PI) in bovine foetal lung cells is presented. The results demonstrated the ability of both products to activate the innate immune system in the absence of a secondary stimulus, for example, through TLR receptors, cathelicidins and proinflammatory cytokines. These mycobacterial-derived immunostimulants demonstrate strong potential to elicit a robust innate immune response, essential for defending against mycobacteria or other heterologous pathogens. Building upon these findings, the subsequent Chapters focus on evaluating the protective capacity of these vaccine candidates against TB under in vivo infection conditions. Chapter 3.2 evaluates the immunogenic and protective efficacy of the P22PI complex against TB in naïve goats and goats pre-infected with M. bovis. Both groups of goats immunized with P22PI exhibited elevated antibody levels after exposure; however, the tuberculous lesions were more severe and extensive in these animals than those observed in non-immunized animals. These findings suggest that, despite inducing a strong humoral response, P22PI is not suitable for the prevention and control of caprine TB and may even exacerbate the pathology of the disease. Similarly, Chapter 3.3 analyses the protective efficacy of HIMB in naïve goats exposed to M. caprae. The results revealed that HIMB immunization significantly reduced the incidence and severity of pulmonary lesions compatible with TB. Moreover, in immunized animals, the reduction in pulmonary lesions was associated with an increased presence of M1 MΦs producing iNOS and proinflammatory mediators, as well as an increase in the expression of cytokines involved in a Th1 response, such as IFNγ, which are critical for an effective immune response against mycobacteria. This reduction in pulmonary pathology in HIMB-immunized animals would, in turn, decrease clinical symptoms and the shedding of mycobacteria into the environment. Overall, an inactivated vaccine such as HIMB could be a promising candidate in the fight against caprine TB. This potential protective effect of inactivated vaccines against mycobacteria was also evaluated in Chapter 4, which focuses on PTB and analyses the safety and efficacy of the commercial vaccine Gudair®, based on inactivated Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), in adult goats with PTB. This chapter consists of an experimental study that addresses the impact of Gudair® immunization on immunopathology and PTB-compatible lesions in target organs. The study demonstrated that Gudair®-vaccinated animals exhibited a significant reduction in the severity of PTBcompatible lesions in the intestinal lymph nodes and the ileocecal valve, while nonvaccinated animals showed increased pathology and a higher mycobacterial load. The results also revealed an increase in CD3+ T lymphocytes in the vaccinated animals, as well as in IFNγ and iNOS, although the increase in these markers was not significant. These findings indicate that Gudair® is safe and effective in limiting granulomatous lesions and mycobacterial load, highlighting its therapeutic potential for PTB and suggesting that future studies in this area will help further understand its mechanisms of action. In summary, the studies conducted in this doctoral thesis emphasize the importance of identifying the immune mediators involved in the response to TB and PTB, and how the activation of certain mediators, such as TLRs, iNOS, or TNFα, may be linked to resistance to these diseases with significant health and economic impacts. We therefore consider that the results obtained represent a significant contribution to the understanding of the immunopathogenesis of TB and PTB in goat populations, advancing immunoprophylaxis strategies against these mycobacterial infections. Additionally, the characterization of the protective and therapeutic efficacy of immunostimulants, such as HIMB in TB and Gudair® in PTB, leads us to propose safer and more effective control measures for these diseases in goats, with potential applications in other species affected by these zoonoses.

La tuberculosis (TB) y la paratuberculosis (PTB) son enfermedades crónicas causadas por micobacterias, que pueden afectar a múltiples hospedadores, incluyendo animales domésticos, silvestres y humanos. Estas enfermedades están ampliamente distribuidas a escala mundial, teniendo un alto impacto sanitario, económico y en la conservación de algunas especies afectadas. Las infecciones micobacterianas se caracterizan por su capacidad de perdurar en el huésped, evitando una respuesta inmunitaria eficaz, asociada en gran medida a la formación de granulomas, estructuras patológicas complejas que incluyen, entre otras, poblaciones celulares inmunitarias cuya función se encuentra modulada por citoquinas. Aunque se ha avanzado en la comprensión de la respuesta inmunitaria frente a la TB y la PTB, aún existen muchos aspectos por esclarecer, por lo que el estudio de su inmunopatogenia es fundamental para el desarrollo y evaluación de estrategias de control basadas en la inmunoprofilaxis. En este contexto, el ganado caprino, a pesar de ser un reservorio significativo para el mantenimiento y la transmisión de micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT), no está sujeto a campañas oficiales de erradicación de forma generalizada en todo el territorio español, lo que compromete el control de la TB en el ganado bovino. En el caso de la PTB, en España tampoco existen programas de erradicación en el ámbito ganadero, lo que contribuye a su persistencia en poblaciones caprinas y en otras especies de rumiantes asociadas. Este escenario resalta la necesidad de profundizar en la patogenia de las micobacteriosis en el ganado caprino como especie diana en el ciclo epidemiológico de estas enfermedades, así como desarrollar y/o evaluar estrategias de control alternativas para mitigar el riesgo que representan en personas y animales. La inmunoprofilaxis surge como una herramienta clave para reducir los síntomas clínicos y la carga de micobacterias en animales, reduciendo así la contaminación micobacteriana en el medio ambiente y su transmisión en poblaciones de animales que no están bajo programas de erradicación o en regiones donde la aplicación de estos programas no es posible. En lo que respecta a la TB, la única vacuna comercial actualmente autorizada es el bacilo de Calmette-Guérin (BCG), una cepa atenuada de M. bovis utilizada tanto en humanos como en ensayos clínicos con ganado y fauna silvestre, dando lugar a un rango variable de eficacia (0-80%). Sin embargo, la BCG conlleva ciertas limitaciones inherentes a las vacunas vivas, como el riesgo de persistencia de las micobacterias en los tejidos del hospedador, su posible excreción al medio ambiente, la interferencia con pruebas diagnósticas de TB y la necesidad de mantener una cadena de frío antes de su aplicación. Estas limitaciones subrayan la necesidad de desarrollar otras estrategias vacunales más seguras y efectivas, como podrían ser las vacunas inactivadas. En relación con la PTB, aunque la vacunación en bovinos ha sido prohibida debido a su interferencia con los programas de erradicación de la TB (Directiva 78/52/CEE), su aplicación en especies no sometidas a tales programas es de gran interés. En este sentido, la implementación de una estrategia de inmunización para controlar la PTB ha demostrado ofrecer beneficios significativos, reduciendo la prevalencia de la enfermedad en las poblaciones afectadas y las pérdidas económicas en el sector ganadero asociadas a la enfermedad, así como minimizando también los posibles problemas en salud pública. Considerando que la evasión de la respuesta inmunológica en las enfermedades micobacterianas es de especial relevancia en su patogenia y que el uso de vacunas alternativas a las vacunas vivas podría ser efectivo en el control de la TB y de la PTB caprina, el objetivo de esta tesis doctoral fue estudiar en profundidad la inmunopatogenia de la TB, determinando así los marcadores inmunológicos más relevantes para evaluar la eficacia de diferentes candidatos vacunales frente a la TB y PTB caprina, así como dilucidar los mecanismos inmunológicos que determinan su éxito o fracaso en la protección del huésped. El presente trabajo está estructurado en cuatro capítulos, donde se incluyen los diferentes trabajos científicos realizados: estudio de la inmunopatogenia de la TB, evaluación de diferentes candidatos vacunales en la TB caprina y evaluación del uso de micobacterias inactivadas en el control de la PTB caprina. El Capítulo 1 incluye una revisión exhaustiva y actualizada de la literatura cuyo objetivo fue obtener la información necesaria que nos permitiera abordar en profundidad los mecanismos inmunopatogénicos de la TB en diferentes especies, identificando los cambios más relevantes en la dinámica celular y los mediadores inmunológicos clave en la modulación inmunitaria asociada a la progresión de la enfermedad. Así, se recoge como los receptores tipo Toll (TLR)2 y TLR4 juegan un papel fundamental en las fases iniciales de la infección al facilitar la interacción huésped-patógeno, junto a las catelicidinas ‒ péptidos con funciones microbicidas‒ y células presentadoras de antígenos, claves en el inicio de la activación de las células T y el establecimiento de la inmunidad adaptativa. También, en la defensa contra el CMT, destacamos el papel de los macrófagos (MΦs) M1, productores de mediadores como el Factor de necrosis tumoral alpha (TNF)α, la interleucina (IL)-12 y la enzima inducible óxido nítrico sintetasa (iNOS), cuyo efecto bactericida es crucial para el control de la infección y como su función se ve favorecida por la acción de los linfocitos T CD4+ y sus mediadores inmunológicos, tales como interferón (IFN)γ, IL-2 e IL-17, los cuales inducen una respuesta celular Th1. Sin embargo, la presencia de MΦs M2 y de citoquinas antiinflamatorias como IL-4, IL-10 y factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), a pesar de tener funciones inmunorreguladoras, pueden mermar la respuesta inmunitaria, afectando potencialmente la eficacia de las vacunas. Esta caracterización de los mediadores inmunológicos implicados en la respuesta frente a la TB puede constituir una guía en la evaluación de estrategias de inmunoprofilaxis más efectivas frente a esta enfermedad. El Capítulo 2 aborda un estudio experimental de TB caprina, que estuvo orientado a la caracterización de los mecanismos inmunopatogénicos implicados en el desarrollo de la TB pulmonar en animales infectados naturalmente con M. bovis, estudio basado en los mediadores inmunológicos descritos en el Capítulo 1. En este trabajo se observó cómo las variaciones en la respuesta inmunitaria pulmonar pueden influir en la progresión de la enfermedad y en la gravedad de las lesiones tuberculosas. Se detectaron diferencias en la dinámica celular y en el perfil de citoquinas y de otros mediadores inmunológicos entre animales infectados con M. bovis que desarrollaron lesiones tuberculosas en pulmón (TBLL+) y aquellos que, pese a estar infectados, no las desarrollaron (TBLL-). Este estudio evidenció que los animales TBLL+ mostraban una elevada presencia de neutrófilos, MΦs y linfocitos, así como una expresión aumentada de IFNγ. En contraste, los animales TBLL- presentaron una alta expresión de TLR2, TLR4, TNFα, IL-2, iNOS e IL-10, lo cual sugería un perfil de respuesta inmunitaria que podría controlar o retrasar la formación de lesiones tuberculosas. En conjunto, la conexión entre la información recogida en la revisión bibliográfica del Capítulo 1 y los resultados obtenidos en el estudio experimental del Capítulo 2 nos han permitido definir patrones de respuesta frente a la TB para establecer marcadores inmunológicos claves que pueden mejorar la evaluación de nuevas estrategias inmunoprofilácticas frente a las micobacteriosis en el ganado caprino. El Capítulo 3 de esta tesis doctoral, dividido en tres estudios científicos, se centra en la evaluación in vitro e in vivo del potencial inmunoestimulador de dos candidatos vacunales frente a la TB, basados en M. bovis inactivado por calor (HIMB) y un complejo inmunoproteico derivado de la tuberculina bovina (P22PI). En el Capítulo 3.1 se incluye el estudio sobre el potencial inmunoestimulador in vitro de HIMB y el inmunocomplejo de proteínas P22 (P22PI) en células de pulmón fetal bovino. Los resultados obtenidos evidenciaron la capacidad de ambos productos para activar el sistema inmunitario innato en ausencia de un estímulo secundario, a través, por ejemplo, de los receptores TLRs, las catelicidinas y las citoquinas proinflamatorias. Estos inmunoestimulantes, derivados de micobacterias, mostraron un gran potencial para activar una respuesta inmunitaria innata robusta, fundamental en la defensa del organismo frente a micobacterias o a otros patógenos heterólogos. Como consecuencia de los resultados obtenidos, los siguientes estudios estuvieron centrados en evaluar en una infección in vivo la capacidad protectora de los candidatos vacunales frente a la TB. El Capítulo 3.2 está enfocado en la evaluación de la eficacia inmunogénica y protectora del complejo P22PI frente a la TB en cabras naïve y preinfectadas con M. bovis. Ambos grupos de cabras inmunizadas con P22PI mostraron niveles elevados de anticuerpos tras la exposición; sin embargo, las lesiones tuberculosas fueron más graves y extensas en estos animales que en los animales no inmunizados. Estos hallazgos sugieren que, pese a que P22PI induce una respuesta humoral intensa, esta no es adecuada para la prevención y control de la TB caprina, pudiendo agravar incluso la patología de la enfermedad. En el Capítulo 3.3 se analiza la eficacia protectora de HIMB en cabras naïve expuestas a M. caprae. Los resultados evidenciaron que la inmunización con HIMB reducía significativamente la incidencia y severidad de las lesiones pulmonares compatibles con TB. Además, en los animales inmunizados, esta reducción de las lesiones tuberculosas en pulmón estuvo acompañada de una mayor presencia de MΦs M1 productores de iNOS y mediadores proinflamatorios, así como un aumento en la expresión de citoquinas implicadas en una respuesta Th1, como IFNγ, cruciales para una respuesta inmunitaria efectiva frente a micobacterias. Esta reducción de la patología pulmonar en los animales inmunizados con HIMB disminuiría, a su vez, los síntomas clínicos en los animales y la diseminación de micobacterias al medio ambiente. Por todo ello, una vacuna inactivada como HIMB podría ser una candidata prometedora en la lucha contra la TB caprina. Este potencial efecto protector de las vacunas inactivadas frente a las micobacteriosis iniciado en el Capítulo 3.3, se continúa evaluando en el Capítulo 4, ahora, centrando la atención en la PTB para analizar la seguridad y eficacia de la vacuna comercial Gudair®, basada en Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) inactivadas, en cabras adultas con PTB. Este capítulo abarca un estudio que aborda cómo impacta la inmunización con Gudair® en la inmunopatología y en las lesiones compatibles con PTB en los órganos diana. El estudio demostró que los animales vacunados con Gudair® presentaron una reducción significativa en la severidad de las lesiones compatibles con PTB en los nódulos linfáticos intestinales y en la válvula ileocecal, mientras que los animales no vacunados mostraron una mayor patología y una alta carga de micobacterias. Los resultados también evidenciaron un aumento de los linfocitos T CD3+ en los animales vacunados, así como de IFNγ e iNOS, aunque el incremento de estos marcadores no fue significativo. Estos hallazgos indicaban que Gudair® es segura y efectiva al limitar las lesiones granulomatosas y la carga micobacteriana, destacando su potencial terapéutico para la PTB y sugiriendo que futuros estudios en esta línea ayudarán a comprender mejor sus mecanismos de acción. En resumen, los estudios realizados en esta tesis doctoral nos permiten resaltar la importancia de identificar los mediadores inmunológicos involucrados en la respuesta frente a la TB y la PTB, y cómo la activación de ciertos mediadores, tales como TLRs, iNOS o TNFα, puede estar relacionada con la resistencia frente a estas enfermedades de gran impacto sanitario y económico. Consideramos, por tanto, que los resultados obtenidos representan una aportación significativa al conocimiento de la inmunopatogenia de la TB y de la PTB en el ganado caprino, contribuyendo al avance de estrategias de inmunoprofilaxis frente a estas micobacteriosis. Además, la caracterización de la eficacia protectora y terapéutica de inmunoestimulantes como HIMB en la TB y Gudair® en la PTB, nos conduce a proponer medidas de control más seguras y efectivas para estas enfermedades en ganado caprino, ofreciendo también perspectivas para su aplicación en otras especies afectadas por estas zoonosis.