Substrate specificity of AP endonucleases and AP lyases during base excision repair in animals and plants

Abstract

Abasic sites (also known as apurinic/apyrimidinic sites or AP sites) arise in DNA due to spontaneous base loss or as intermediates following the enzymatic removal of damaged bases. Their repair requires an incision in the sugar-phosphate backbone, which can be catalysed by either AP lyases or AP endonucleases. However, the relative roles of these two types of enzymes and the biological relevance of their apparently redundant activities remain unclear. One of the objectives of this thesis was to determine whether features such as the sequence flanking the AP site or the orphan base on the opposite strand influence the probability of processing an AP site by either an AP endonuclease or an AP lyase. Previous studies suggest that ARP, the primary AP endonuclease in the model plant Arabidopsis thaliana, processes more efficiently AP sites opposite guanine, whereas the main AP lyase, FPG, is more efficient when the orphan base is cytosine. This work demonstrates that FPG binds its substrate with higher affinity and dissociates more rapidly from its product when the base opposite the AP site is cytosine. This orphan base-dependent affinity involves an invariant proline required for catalytic activity. Unlike plants, human cells exhibit no clear preference for the opposite base in either their main AP endonuclease, APE1, or their set of AP lyases. Nevertheless, the activity and specificity of both plant and animal AP lyases and AP endonucleases are modulated by the sequence surrounding the abasic site. Another objective of this thesis was to understand the molecular basis for the different substrate specificities of animal and plant AP endonucleases. We found that, unlike the human protein APE1, its ortholog in Arabidopsis, ARP, exhibits orphan base-dependent activity on double-stranded DNA (dsDNA) and lacks significant activity on single-stranded DNA (ssDNA). Using site-directed mutagenesis, we found that these differences are due to variation in two residues that intercalate into the DNA and have evolved divergently in metazoan and plant AP endonucleases. Swapping the identity of the residue invading the minor groove is sufficient to exchange the orphan base preference of ARP and APE1 in dsDNA. Meanwhile, activity on ssDNA is determined by the residue that intercalates into the major groove; swapping this residue exchanges the capacity of both enzymes to process AP sites in ssDNA. Additionally, we found that this residue is essential for the role of APE1 in immunoglobulin class switch recombination, suggesting an evolutionary advantage for ssDNA activity. Both APE1 and ARP belong to the ExoIII family, whose members are characterized by also possessing 3′-5′ exonuclease activity. A third objective of this thesis was to determine whether the molecular differences between APE1 and ARP extend to their 3′-5′ exonuclease activity. We found that both enzymes exhibit low processivity, requiring multiple cycles of DNA binding and dissociation, but they differ in their efficiency when processing substrates of different sizes. Although their exonuclease activity is modulated by the two residues that intercalate into DNA, both enzymes remove paired and unpaired nucleotides with equal efficiency, showing no preference for the opposite base. Furthermore, the N-terminal region of ARP, which is larger than that of APE1 and includes a DNA-binding SAP domain, plays an important role in regulating its AP endonuclease and 3′-5′ exonuclease activities.

Los sitios abásicos (también denominados sitios apurínicos/apirimidínicos o sitios AP) surgen en el ADN por la pérdida espontánea de bases o como intermediarios tras la eliminación enzimática de bases dañadas Su reparación requiere una incisión en el esqueleto azúcar-fosfato, que puede ser catalizada tanto por AP liasas como por AP endonucleasas. Sin embargo, no se conocen con exactitud las funciones relativas de ambos tipos de enzimas ni la relevancia biológica de su aparente redundancia funcional. Uno de los objetivos de esta tesis ha sido determinar si características como la secuencia que flanquea el sitio AP o la base huérfana en la cadena opuesta influyen en la probabilidad de que dicho sitio sea procesado por AP liasas o AP endonucleasas. Estudios previos sugieren que ARP, la principal AP endonucleasa de la planta modelo Arabidopsis thaliana, procesa con mayor eficiencia sitios AP enfrentados a guanina, mientras que la principal AP liasa, FPG, es más eficiente cuando la base huérfana es citosina. En este trabajo se demuestra que FPG se une con mayor afinidad a su sustrato y se disocia más rápidamente de su producto cuando la base opuesta al sitio AP es una citosina. En esta afinidad dependiente de la base huérfana interviene una prolina invariante necesaria para la actividad catalítica. A diferencia de plantas, en células humanas tanto su principal AP endonucleasa, APE1, como el conjunto de sus AP liasas no muestran una clara preferencia por la base opuesta. No obstante, la actividad y la especificidad de AP liasas y AP endonucleasas, tanto animales como vegetales, se ven moduladas por la secuencia que flanquea el sitio abásico. Otro de los objetivos de este trabajo ha sido entender las bases moleculares de las diferentes especificidades de sustrato de AP endonucleasas animales y vegetales. Hemos encontrado que, a diferencia de la proteína humana APE1, su ortólogo en Arabidopsis ARP exhibe una actividad dependiente de la base huérfana sobre ADN de cadena doble (dsDNA) y carece de actividad significativa sobre ADN de cadena sencilla (ssDNA). Mediante mutagénesis dirigida demostramos que estas diferencias se deben a la variación en dos residuos que se intercalan en el ADN y que han evolucionado de forma divergente en las AP endonucleasas de metazoos y de plantas. El intercambio de la identidad del residuo que penetra en el surco menor es suficiente para intercambiar la preferencia de base huérfana de ARP y APE1 en dsDNA. Por otra parte, la actividad sobre ssDNA está determinada por el residuo que se intercala en el surco mayor, y al intercambiar su identidad se intercambia la capacidad de ambas enzimas para procesar sitios AP en ssDNA. Además, demostramos que dicho residuo es esencial para la función de APE1 en la recombinación de cambio de clase de inmunoglobulinas, lo que sugiere una ventaja evolutiva para la actividad sobre ssDNA. Tanto APE1 como ARP pertenecen a la familia ExoIII, cuyos miembros se caracterizan por poseer también actividad 3′-5′ exonucleasa. Un tercer objetivo de esta tesis ha sido determinar si las diferencias moleculares entre APE1 y ARP se extienden a su actividad 3′-5′ exonucleasa. Encontramos que ambas enzimas son muy poco procesivas y requieren múltiples ciclos de unión y disociación del ADN, pero difieren en su eficacia para procesar sustratos de diferentes tamaños. Aunque su actividad exonucleasa se ve modulada por los dos residuos que se intercalan en el ADN, ambas enzimas eliminan con la misma eficacia tanto nucleótidos apareados como desapareados, sin mostrar especificidad por la base opuesta. Por otra parte, la región N-terminal de ARP, que es mayor que la de APE1 e incluye un dominio SAP de unión al ADN, desempeña un papel importante regulando su actividad AP endonucleasa y 3′-5′ exonucleasa.