Identification of Biomarkers from Periprostatic Adipose Tissue in relation to Prostate Cancer Progression

Abstract

Prostate cancer (PCa) comprises a heterogeneous group of tumoral pathologies with a great endocrine component, representing the second cancer type in terms of incidence and the fifth in terms of mortality worldwide among the male population. The systematic implementation of screening systems based on prostate specific antigen (PSA), although far from being perfect, has significantly improved the diagnosis of this disease, although complementary and invasive techniques such as digital rectal examination (DRE) or prostate biopsy are still necessary to confirm the presence of the tumor, which has some negative effects. On the other hand, regarding the physiological dependence of the gland on male hormones, the first pharmacological tool against this type of tumors is based on androgen deprivation (ADT), although between 15-30% of patients exposed to these therapies (considered hormone-sensitive) progress to a highly aggressive castration resistance phenotype (CRPC), which currently remains incurable. Regarding its appearance, there are a number of well-known risk factors, among which age, genetic inheritance, family history or ethnicity stand out, while others, mainly attributed to modifiable behaviors (lifestyles) are beginning to gain significant relevance. In this sense, the high rate of coexistence between PCa and metabolic-related disorders, such as obesity, has placed this disease in the spotlight as a factor that has already amply demonstrated its relationship with other types of tumor pathologies. Obesity, which according to the World Health Organization (WHO) is defined as a complex and chronic disease characterized by an excessive or abnormal accumulation of adipose tissue, is reaching truly pandemic proportions. In fact, over the last few decades, global obesity rates have tripled, coinciding with an increase in the development of a wide variety of tumors. In obesity, adipose tissue becomes dysfunctional and is characterized by the appearance of a series of profound and highly interrelated changes, including dysfunction and occasional death (necrosis) of adipocytes, abnormal remodeling of the extracellular matrix (ECM), with important changes in several of its components and development of fibrosis, the establishment of a generalized state of hypoxia, dysregulation of angiogenesis, infiltration of the tissue by immune cells, and inflammation and alteration in the pattern of secretion and release of adipokines (adipose tissue signaling molecules). Consequently, a generalized, systemic, chronic, low-grade inflammatory state is produced, defined by some authors as metainflammation, in addition to lipotoxicity processes that affect many tissues and organs which, as a whole, contribute to the development of the comorbidities of obesity. In this regard, although the relationship between obesity and PCa is not yet as well supported as in other tumor pathologies, there are a considerable number of studies indicating that patients who present simultaneously with both types of pathologies often exhibit more aggressive tumor phenotypes, which ultimately result in higher mortality. In this context, it has been proposed that common mechanisms underlying both types of disorders, such as inflammation, pathological remodeling of the ECM, or altered secretion pattern of signaling molecules, could underlie such pathophysiological connection. In this scenario, in recent years a role for periprostatic adipose tissue (PPAT) has been proposed as a possible mediator between the metabolic state of the patient and the origin/development/progression of PCa. This visceral depot, which has unique characteristics that distinguish it from other fatty deposits, is in intimate contact with the prostate, thus being able to exert a direct influence that impacts the development of the gland in a tumor context. In fact, some studies have already shown that isolated factors originated from PPAT such as IL-6, TNF-α or CCL7, among others, might exert protumorigenic effects, promoting proliferation, migration, invasion and, ultimately, more aggressive phenotypes. However, to date, most studies have focused on the individualized study of single factors, while the molecular characterization of PPAT, from a generic point of view, and especially under conditions of obesity, is still quite limited. For these reasons, the GENERAL OBJECTIVE of this Doctoral Thesis has been to deeply characterize the dysregulation of PPAT at multiple levels (matrisome, adipokine profile, inflammatory status) in patients with PCa, in order to define its posible implication in the pathogenesis and progression of this pathology under normal (nonaltered) metabolic conditions or when it is manifests parallelly with obesity. The final interest of these studies is to identify possible diagnostic and prognostic biomarkers, as well as therapeutic targets to ultimately improve the clinical management of these patients. To this end, different specific objectives have been proposed and successfully fulfilled wherein the associated results have been divided into three sections linked to four manuscripts derived directly from this Doctoral Thesis, two of them already published, and two additional manuscript that are currently in revision process. Thus, the first section of this Doctoral Thesis has been aimed at establishing, from a methodological point of view, a working scheme to identify valid internal reference genes (IRGs; constitutively expressed) to be used in gene expression studies on human-derived PPAT samples, regardless of their origin (tumor vs. control), and the metabolic condition of the patient (normoweight vs. obesity). The results generated (reported in Article I) revealed that, among a pre-selection of up to 15 potential IRGs, three of them (LRP10, PGK1 and RPLP0) passed the quality thresholds and fit as suitable qualities in terms of genomic stability, according to the parameters of up to three different algorithms specialized in the selection of IRGs. These results were also confirmed empirically by observing the expected changes in genes associated with adipose tissue under conditions of obesity and/or tumor contexts, after the application of a normalization factor generated from the three candidate genes. In summary, this first work has allowed us to establish the guidelines to be able to carry out future, solid transcriptomic analyses in PPAT under tumoral and obesity conditions. In the second section, we decided to carry out the characterization of a key element in the pathophysiology of adipose tissue, the extracellular matrix (ECM). Specifically, we evaluated the matrisome (i.e., the set of ECM-related proteins), revealing that it was profoundly dysregulated in the PPAT of PCa patients. Specifically, we found that a structural component of the basal lamina, belonging to the LAN-411 isoform, laminin beta 1 (LAMB1), was consistently overexpressed in PPAT of patients with PCa, as well as in the corresponding secretome derived from PPATs, coinciding, moreover, with the overexpression, in prostatic glandular tissue, of a specific laminin receptor (RPSA). This data allowed us to define, for the first time, the relevance of the LAMB1 (from TAPP)/ RPSA (at the prostate level) axis, whose inhibition, through specific silencing of the receptor, demonstrated a high efficacy, interrupting all the tumor aggressiveness properties evaluated, both in several prostate cell models in vitro and in preclinical in vivo models. Moreover, such responses at the molecular level were linked to tumor pathways described as essential in the context of PCa (such as, for example, MYC or androgen signaling), coincident also with significant changes in receptor distribution in the different subcellular compartments. Taken together, our results demonstrate that the LAMB1/RPSA axis may represent a novel therapeutic target in patients with PCa. Finally, in the third section we aimed to characterize PPAT from a functional point of view as an adipokine-secreting organ. Thus, we analyzed a broad panel of adipokines, demonstrating a generalized dysregulation of adipokines from PPAT in patients with PCa. Furthermore, we found unique molecular fingerprinting patterns associated with the tumor-derived samples, which allowed a clear distinction of patients into two subgroups based on their metabolic status. Notably, among all the adipokines found to be dysregulated in PCa-associated TAPP samples, we highlighted lipocalin-2 (LCN2), a pleiotropic molecule that we demonstrated to affect cell migration in prostate cell models using in vitro approaches, in addition to observing its effect on the secretory profile of cells exposed to this protein and the concomitant impact on the inflammasome machinery in these cells. In this regard, this section concludes with a literature review article (Article IV) demonstrating that the inflammasome is a central molecular machinery associated to the immune response and a molecular “meeting point” for the inflammatory processes underlying PCa and obesity disorders.

El cáncer de próstata (CaP) comprende un conjunto heterogéneo de patologías de origen tumoral con un alto componente endocrino, que representa el segundo tumor en términos de incidencia y el quinto en términos de mortalidad a nivel mundial entre la población masculina. La implementación sistemática de los sistemas de cribado basados en el antígeno prostático específico (PSA), aunque lejos de ser perfectas, han mejorado notablemente el diagnóstico de esta enfermedad, si bien siguen siendo necesarias técnicas complementarias e invasivas como el examen digital rectal (DRE) o la biopsia de próstata para la confirmación de la presencia tumoral, lo que conlleva una serie de efectos negativos. Por otro lado, en cuanto a la dependencia fisiológica de la glándula de hormonas masculinas, la primera herramienta farmacológica contra este tipo de tumores se basa en la deprivación androgénica (ADT), aunque entre el 15-30% de pacientes expuestos a estas terapias (considerados hormonosensibles) progresan hacia un fenotipo de resistencia a la castración (CRPC), altamente agresivo, y que actualmente permanece incurable. Respecto a su aparición, existen una serie de factores de riesgo bien conocidos, entre los que destacan la edad, la herencia genética, la historia familiar o la etnia, mientras que otros, principalmente atribuidos a conductas modificables (estilos de vida) están comenzando a cobrar alta relevancia. En este sentido, la alta tasa de coexistencia entre el CaP y trastornos relacionados con trastornos metabólicos, como ocurre en obesidad, han situado a esta enfermedad en el foco por ser un factor que ya ha demostrado sobradamente su relación con otros tipos de patologías tumorales. La obesidad, que según la organización mundial de la salud (OMS), se define como una enfermedad compleja y crónica caracterizada por una acumulación excesiva o anómala de tejido adiposo, está alcanzando cifras verdaderamente pandémicas. De hecho, durante las últimas décadas, las tasas de obesidad a nivel global se han triplicado, coincidiendo con el incremento en el desarrollo de una amplia variedad de tumores. En obesidad, el tejido adiposo se transforma en disfuncional y se caracteriza por la aparición de una serie de cambios profundos, altamente relacionados entre sí, entre los que se encuentran la disfunción y ocasional muerte (necrosis) de los adipocitos, un remodelado anómalo de la matriz extracelular (ECM), con importantes cambios en varios de sus componentes y desarrollo de fibrosis, el establecimiento de un estado generalizado de hipoxia, desregulación de la angiogénesis, infiltración del tejido por celular inmunes e inflamación y alteración en el patrón de secreción y liberación de adipoquinas (moléculas señalizadoras del tejido adiposo). Como consecuencia, se produce un estado inflamatorio generalizado, sistémico, crónico y de bajo grado, definido por algunos autores como metainflamación, además de procesos de lipotoxicidad que afectan a muchos tejidos y órganos y que, en conjunto, contribuyen al desarrollo de las comorbilidades de la obesidad. En este sentido, aunque la relación entre obesidad y CaP no está aún tan sustentada como en otras patologías tumorales, sí que hay existe un número considerable de estudios que indican que los pacientes que presentan simultáneamente ambos tipos de patologías a menudo exhiben fenotipos tumorales más agresivos, que acaban redundando en una mayor mortalidad. Se ha propuesto que los mecanismos comunes subyacentes a ambos tipos de trastornos, como la inflamación, el remodelado patológico de la ECM, o la alteración en el patrón de secreción de moléculas señalizadoras, podrían subyacer en dicha conexión fisiopatológica. En este escenario, en los últimos años se ha propuesto un papel clave para el tejido adiposo periprostático (TAPP) como un posible mediador entre el estado metabólico del paciente y el origen/desarrollo/progresión del CaP. Este depósito visceral, que presenta unas características únicas que lo distinguen de otros depósitos grasos, está en contacto íntimo con la próstata, pudiendo ejercer así una influencia directa que impacte en el desarrollo de la glándula en un contexto tumoral. De hecho, algunos estudios ya han demostrado que, de forma aislada, factores provenientes del TAPP tales como IL-6, TNF-α o CCL7, entre otros, tienen efectos protumorales, promoviendo la proliferación, migración, invasión y, en definitiva, fenotipos más agresivos. Sin embargo, hasta la fecha, la mayor parte de los estudios han estado centrados en el estudio individualizado de factores singulares, mientras que la caracterización molecular del TAPP, de forma genérica, y, especialmente, bajo condiciones de obesidad, sigue siendo bastante limitada. Por esas razones, el OBJETIVO GENERAL de esta Tesis Doctoral ha sido caracterizar en profundidad la desregulación de TAPP en múltiples niveles (matrisoma, perfil de adipoquinas, estado inflamatorio) en pacientes con CaP, para así definir su posible implicación en la patogénesis y progresión de esta patología en condiciones metabólicas no alteradas o cuando se manifiesta en paralelo con obesidad. El interés último de estos estudios es identificar posibles biomarcadores diagnósticos y pronósticos, así como dianas terapéuticas para mejorar finalmente el manejo clínico de estos pacientes. Para ello, se han propuesto y cumplido con éxito diferentes objetivos específicos cuyos resultados se han dividido en tres secciones correspondientes a cuatro manuscritos derivados directamente de esta Tesis Doctoral, encontrándose dos de ellos ya publicados, y otros dos adicionales en proceso de revisión. Así, la primera sección de esta Tesis Doctoral ha tenido como objetivo el establecimiento, desde el punto de vista metodológico, de un esquema de trabajo para poder identificar genes internos de referencia (IRGs; con expresión constitutiva) válidos para ser utilizados en estudios de expresión génica en muestras de TAPP humano, independientemente de su origen (tumoral vs. control), y la condición metabólica del paciente (normopeso vs. obesidad). Los resultados generados (recogidos en el artículo I) revelaron que, de entre una preselección de hasta 15 potenciales IRGs, tres de ellos, LRP10, PGK1 y RPLP0, pasaron los filtros de calidad y mostraron unas cualidades de idoneidad en cuanto a estabilidad genómica, de acuerdo con los parámetros de hasta tres algoritmos diferentes especializados en la selección de IRGs. Dichos resultados fueron, además, confirmados empíricamente mediante la observación de los cambios esperados en genes asociados al tejido adiposo en condiciones de obesidad y/o contextos tumorales, tras la aplicación de un factor de normalización generado a partir de los tres genes candidatos. En definitiva, este primer trabajo ha permitido establecer las directrices para poder llevar a cabo futuros análisis transcriptómicos de mayor profundidad en TAPP en condiciones tumorales y de obesidad. En la segunda sección, decidimos llevar a cabo la caracterización de un elemento clave en la fisiopatología del tejido adiposo, la matriz extracelular (ECM). Concretamente, evaluamos el matrisoma (esto es, el conjunto de proteínas relacionadas con la ECM), revelando que este se encontraba profundamente desregulado en el TAPP de pacientes con CaP. Específicamente, encontramos que un componente estructural de la lámina basal, perteneciente a la isoforma LAN-411, la laminina beta 1 (LAMB1), se encontró consistentemente sobreexpresada en TAPP de pacientes con PCa, así como en el secretoma correspondiente de dicho tejido, coincidiendo, además, con la sobreexpresión, en el tejido glandular prostático, de un receptor específico de lamininas (RPSA). Esto nos permitió definir, por primera vez, el eje protumoral LAMB1 (del TAPP) / RPSA (de la próstata), cuya inhibición, a través del silenciamiento específico del receptor demostró una elevada eficacia interrumpiendo todas las propiedades de agresividad tumoral evaluadas tanto en líneas celulares modelo de CaP como en modelos preclínicos de CaP in vivo. Además, dichas respuestas a nivel molecular se vincularon a rutas tumorales descritas como esenciales en el contexto del CaP (como, por ejemplo, MYC o señalización por andrógenos), coincidentes además con cambios significativos en la distribución del receptor RPSA en los distintos compartimentos subcelulares. En conjunto, nuestros resultados apoyan la propuesta de que este eje puede representar una novedosa diana terapéutica en pacientes con CaP. Por último, en la tercera sección planteamos como objetivo la caracterización del TAPP desde el punto de vista de su función como órgano secretor de adipoquinas. Así, se abordó el estudio de un amplio panel de adipoquinas, demostrando una desregulación generalizada de las adipoquinas provenientes de TAPP de pacientes con CaP. Además, encontramos unos patrones de huella molecular únicos asociados a las muestras de origen tumoral, que permitían una distinción clara de los pacientes en dos subgrupos en función de su estado metabólico. Notablemente, de entre todas las adipoquinas desreguladas en las muestras de TAPP asociadas a PCa, destacamos la lipocalina-2 (LCN2), una molécula pleiotrópica que demostramos que afecta a la migración celular en modelos celulares de próstata mediante aproximaciones in vitro, además de observar su efecto sobre el perfil secretor de las células expuestas a esta proteína y el impacto concomitante sobre la maquinaria del inflamasoma en dichas células. A este respecto, esta sección concluye con un trabajo de revisión bibliográfica (Artículo IV) que pone en el centro precisamente al inflamasoma como una maquinaria esencial en la respuesta inmune y punto molecular de encuentro a los procesos inflamatorios subyacentes a los trastornos de CaP y obesidad.