Non-targeted quantitative proteomics for the identification of diagnostic/prognostic biomarkers and therapeutic targets in hepatocellular carcinoma

Abstract

Primary liver cancer is the third leading cause of cancer-related mortality and the sixth in incidence worldwide. Hepatocellular carcinoma (HCC) accounts for 85% of cases, while hepatoblastoma (HB), although rare, is the most frequent pediatric liver tumor. Advances in “omics” technologies have enabled the genomic and transcriptomic characterization of liver tumors, generating molecular classifications with clinical relevance. However, proteome alterations remain poorly explored and mainly focused on specific etiologies.

The general objective of this Doctoral Thesis was to characterize the proteomic fingerprint of HCC using quantitative proteomics in a well-defined patients cohort, aiming to identify diagnostic and prognostic biomarkers as well as potential therapeutic targets. The analysis revealed a profound alteration of two cellular machineries crucial for gene expression regulation: the aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) family and the splicing machinery.

ARSs catalyze the attachment of amino acids to tRNAs, but they also possess non-canonical functions relevant to cancer, and their role in liver tumors remains unknown. Likewise, splicing dysregulation is a common feature in tumor development and progression, although its complexity requires more exhaustive investigation.

In the first section of this Doctoral Thesis, untargeted quantitative proteomics (SWATH-MS) was applied to cytosolic and nuclear fractions of tumor tissues and adjacent non-tumor tissues (TANTs) from HCC patients. The proteomic signature enabled discrimination between tumors and TANTs and identified two HCC tumor subclasses, with the most aggressive one associated with ARS and splicing dysregulation.

Among the ARSs altered in HCC, VARS1 and DARS1 were consistently deregulated across multiple patient cohorts and were associated with greater aggressiveness, reduced survival, and higher recurrence rates. Experimental modulation of VARS1 revealed that its reduction decreases stem-like properties, whereas its overexpression increases aggressiveness and tumor-forming capacity. Proteomic analysis identified MAGI1 as a tumor suppressor mediating the effects of VARS1.

In the case of DARS1, its upregulation was observed in both tissues and plasma from HCC patients and was linked to worse prognosis. Its overexpression promoted stem-like features and tumorigenesis, while genetic or pharmacological inhibition reduced aggressiveness. Molecular analyses showed greater abundance of aspartate-rich proteins and more accurate protein translation, linking DARS1 to improved translational efficiency. Furthermore, a nuclear interaction between DARS1 and the SAGA complex was identified, associated with MYC regulation and drug-induced senescence.

Subsequently, the role of ARSs in HB was examined, revealing a complex expression pattern. Overexpression of VARS1 and FARSA was associated with poorer prognosis and more aggressive subtypes, possibly regulated by MYC. Silencing these genes decreased aggressiveness, and again, MAGI1 acted as a tumor suppressor mediating VARS1-dependent effects.

In the second section, 66 splicing regulators altered in HCC were identified using quantitative proteomics. LSM2 stood out due to its association with poor prognosis, increased aggressiveness, and tumor growth, as well as its impact on RNU6 expression, splicing efficiency, and the splicing patterns of tumor cells. Its inhibition increased sensitivity to ATM inhibition, suggesting a potential combined therapeutic strategy.

Finally, using a proteogenomic approach, functionally relevant splicing variants were identified, including PNKD-202, which was overexpressed in HCC and promoted aggressiveness and mitochondrial respiration. RBM22 was identified as a key regulator of this variant, forming an RBM22–PNKD axis central to the mitochondrial dynamics of tumor cells.

Overall, this Doctoral Thesis demonstrates that quantitative proteomics provides essential information for precision medicine and highlights ARSs and splicing as new sources of biomarkers and therapeutic targets in liver tumors.

El cáncer de hígado primario es el tercer cáncer en mortalidad y el sexto en incidencia. El carcinoma hepatocelular (CHC) constituye el 85% de los casos, mientras que el hepatoblastoma (HB), aunque raro, es el tumor hepático pediátrico más frecuente. Las tecnologías “ómicas” han permitido caracterizar a nivel genómico y transcriptómico los tumores hepáticos, generando clasificaciones moleculares con valor clínico. Sin embargo, las alteraciones del proteoma siguen poco estudiadas y centradas en etiologías específicas. Esta Tesis Doctoral se planteó como objetivo general caracterizar la huella proteómica del CHC mediante proteómica cuantitativa en una cohorte bien definida, con el fin de identificar biomarcadores de diagnóstico y pronóstico, así como potenciales dianas terapéuticas. El análisis reveló una alteración profunda de dos maquinarias celulares cruciales en la regulación génica: la familia de las aminoacil-ARNt sintetasas (ARSs) y la maquinaria de splicing. Las ARSs catalizan la unión de aminoácidos a los ARNt, aunque también poseen funciones no canónicas relevantes en cáncer y su papel en tumores hepáticos era desconocido. Por otra parte, la alteración del splicing es una característica frecuente en el desarrollo y progresión tumorales, aunque su complejidad requiere estudios más exhaustivos. En la primera sección de esta Tesis Doctoral se empleó proteómica cuantitativa no dirigida (SWATH-MS) en fracciones citosólicas y nucleares de tejidos tumorales y adyacentes (TANTs) de pacientes con CHC. La huella proteómica permitió distinguir tumores de TANTs e identificar dos subclases tumorales de CHC, la más agresiva asociada a la desregulación de ARSs y del splicing. Entre las ARSs alteradas en CHC, VARS1 y DARS1 aparecieron consistentemente desreguladas en múltiples cohortes de pacientes y se asociaron a mayor agresividad, menor supervivencia y mayor recurrencia. La modulación experimental de VARS1 reveló que su disminución reduce propiedades de célula madre, mientras que su sobreexpresión aumenta agresividad y capacidad tumorigénica. El análisis proteómico identificó a MAGI1 como supresor tumoral mediador del efecto de VARS1. En el caso de DARS1, su aumento se observó tanto en tejidos como en plasma de pacientes con CHC, y se relacionó con peor pronóstico. Su sobreexpresión promovió características de célula madre y tumorigénesis, mientras que su inhibición —genética o farmacológica— redujo la agresividad. El análisis molecular mostró mayor presencia de proteínas ricas en aspartato y una traducción más precisa, vinculando DARS1 a la eficiencia de la síntesis proteica. Además, se identificó la interacción de DARS1 con el complejo SAGA en el núcleo, asociado a regulación de MYC y senescencia inducida por fármacos. Posteriormente, se estudió la relevancia de las ARSs en HB, encontrándose un patrón de expresión complejo. La sobreexpresión de VARS1 y FARSA se asoció a peor pronóstico y a subtipos agresivos, posiblemente regulada por MYC. Su silenciamiento redujo la agresividad y, de nuevo, MAGI1 actuó como supresor tumoral mediando el efecto de VARS1. En la segunda sección, se identificaron 66 reguladores del splicing alterados en CHC a partir del análisis de proteómica cuantitativa. Destacó LSM2, asociado a peor pronóstico, mayor agresividad y crecimiento tumoral, así como a la expresión de RNU6, la eficiencia del splicing y la modulación del patrón de splicing de células tumorales. Su inhibición aumentó la sensibilidad a la inhibición de ATM, sugiriendo una estrategia terapéutica combinada. Finalmente, mediante un enfoque proteogenómico, se identificaron variantes de splicing funcionales, entre ellas PNKD-202, sobreexpresada en CHC y promotora de agresividad y respiración mitocondrial. Se identificó al regulador RBM22 como modulador clave de esta variante, formando un eje RBM22-PNKD central en la dinámica mitocondrial tumoral. En conjunto, la Tesis Doctoral muestra que la proteómica cuantitativa aporta información esencial para la medicina de precisión y destaca a las ARSs y al splicing como nuevas fuentes de biomarcadores y dianas terapéuticas en tumores hepáticos.