Implementation of targeted massive sequencing for the diagnostic and prognostic classification of Acute Myeloblastic Leukemia

Abstract

Acute myeloblastic leukemia (AML) is a neoplasm characterized by the clonal expansion of immature myeloid precursors, causing dysregulation of hematopoiesis and accumulation of blasts in the bone marrow, peripheral blood, and even in other tissues. The median age is 68 years, being the most common leukemia in adults, with a 5-year survival rate of 30%, which is reduced by half in those over 65 years of age. The standard treatment for patients consists of the intensive “7+3” regimen and is complemented by targeted therapies. However, several patients, due to advanced age or associated comorbidities, receive non-intensive treatments. Given the AML heterogeneity, diagnostic and prognostic stratification is essential for selecting an optimal treatment. As a result of advances in technologies such as next-generation sequencing (NGS), classifications have evolved, with the most up-to-date being WHO2022 and ICC2022 for diagnosis, and ELN2022 for prognosis. These classifications were based on patients receiving intensive chemotherapy, which limited their applicability to patients receiving non-intensive modalities. Consequently, the ELN2024 recommendations were published, being the first classification designed for patients treated with less intensive therapies. One of the most controversial categories within these classifications is LAM with CEBPA mutations, which is associated with a favorable prognosis. Nevertheless, the type of alterations in this gene that were related to this improved survival has been refined from biallelic mutations to bZIP-in-frame mutations (ELN2022). ELN2024 did not include them as a separate entity, including a small number of genes and stating the need for further validation in large cohorts. In this context, the objective of this Doctoral Thesis was to conduct a genetic-molecular study using NGS on samples from AML patients in order to evaluate and categorize their diagnostic and prognostic profile, assessing current classifications and their subcategories, especially the entity of AML with CEBPAmut, to provide new knowledge about this type of leukemia. The results obtained were divided into three sections. In the first section, the impact of the evolution of risk classifications (MRC, ELN2010, ELN2017, and ELN2022) was analyzed, showing how the adverse risk category has been increasing, in addition to the fact that between 14% and 21% of patients have been reclassified, affecting therapeutic decisions. The unfavorable prognostic value of advanced age and the very adverse outcome of TP53mut patients were confirmed. In the second section, we analyzed the CEBPAmut in intensively treated pateints, confirming the association of bZIP-in-frame with a better prognosis, although our results suggested that all mutations in bZIP could be considered favorable. We identified CEBPA-bZIP-inf/CEBPA-bZIP co-mutation patterns that differed from those of other CEBPA mutations, highlighting a decrease in survival in patients with CEBPA-bZIP/bZIP-inf and TET2mut. Patients with CEBPA-bZIP showed a distinctive gene expression pattern, with upregulation of genes related to granulocytic differentiation and immune response, and downregulation of epigenetic regulators, which could be related to their better prognosis. Finally, in the third section, CEBPA mutations were analyzed in patients treated with non-intensive therapies, reporting that their mutational landscape differed from those with intensive modalities, highlighting mutations in genes related to myelodysplasia. Patients with CEBPAmut who received HMA (monotherapy or with venetoclax) had a survival rate similar to that of the favorable group defined by ELN2024. However, patients with other mutations in CEBPA had a worse prognosis and should not be included in this risk category. Taken together, these results underscore the importance of molecular analysis using NGS to improve diagnosis, prognosis, and progress in personalized therapy for AML.

La Leucemia Aguda Mieloblástica (LAM) es una neoplasia caracterizada por la expansión clonal de precursores mieloides inmaduros, provocando una desregulación de la hematopoyesis y acumulación de blastos en médula ósea, sangre periférica y otros tejidos. La mediana de edad es de 68 años, siendo la leucemia más común en adultos, y con una supervivencia a los cinco años del 30%, que se reduce a la mitad en mayores de 65 años. El tratamiento estándar para los pacientes consiste en el esquema intensivo “7+3” y se complementa con terapias dirigidas, sin embargo, hay pacientes que, por edad avanzada o comorbilidades asociadas, reciben alternativas menos agresivas. Dada la heterogeneidad de la LAM, la estratificación diagnóstica y pronóstica es esencial para seleccionar el tratamiento adecuado. Gracias al avance de tecnologías como la secuenciación masiva (NGS), las clasificaciones han evolucionado, siendo las más actualizadas la OMS2022 e ICC2022 para el diagnóstico, y la ELN2022 para el pronóstico. Estas clasificaciones se basaron en pacientes con quimioterapia intensiva, lo que limitaba su utilidad para pacientes con otras modalidades. Por ello, se publicaron las recomendaciones ELN2024, primera clasificación orientada a pacientes tratados con terapias menos intensivas. Una de las categorías más controversiales dentro de estas clasificaciones es la LAM con mutaciones en CEBPA, asociándose a un pronóstico favorable, sin embargo, el tipo de alteraciones en este gen que se relacionaban con esta mejor supervivencia ha ido afinándose desde las mutaciones bialélicas hasta las mutaciones bZIP-in-frame (ELN2022). La ELN2024 no las incluyó como entidad diferenciada, incluyendo un número reducido de genes y manifestando la necesidad de validación adicional en cohortes extensas. En este contexto, el objetivo de esta Tesis Doctoral fue realizar un estudio genético-molecular mediante NGS en muestras de pacientes con LAM con el fin de evaluar y categorizar su diagnóstico y perfil pronóstico, valorando las clasificaciones actuales y sus subcategorías, especialmente la entidad de LAM con CEBPAmut, con el fin de aportar nuevo conocimiento sobre este tipo de leucemia. Los resultados obtenidos se dividieron en tres secciones. En la primera se analizó el impacto de la evolución de las clasificaciones de riesgo (MRC, ELN2010, ELN2017 y ELN2022), mostrando como la categoría de riesgo adverso ha ido aumentando, además de que entre 14%-21% de pacientes han sido reclasificados, afectando directamente las decisiones terapéuticas. Se confirmó el valor pronóstico negativo de la edad avanzada y el muy adverso de las TP53mut. En la segunda sección se estudiaron las CEBPAmut, confirmando la asociación de las bZIP-in-frame con mejor pronóstico, aunque nuestros resultados sugieren que todas las mutaciones en bZIP podrían considerarse favorables. Identificamos patrones de co-mutación de CEBPA-bZIP-inf/CEBPA-bZIP, diferentes al de otras mutaciones en CEBPA y destacó un descenso de la supervivencia en aquellos pacientes con CEBPA-bZIP/bZIP-inf y TET2mut. Los pacientes con CEBPA-bZIP mostraron un patrón de expresión génica distintivo, con una regulación al alza en genes relacionados con diferenciación granulocítica y respuesta inmunitaria, y regulación a la baja de reguladores epigenéticos, lo que podría estar relacionado con su mejor pronóstico. Finalmente, en la tercera sección se analizaron las CEBPAmut en pacientes tratados con terapias no intensivas, observando que su panorama mutacional difería de aquellos con modalidades intensivas, destacando las mutaciones en genes relacionados con mielodisplasia. Los pacientes con CEBPAmut que recibieron HMA (monoterapia o con venetoclax), tuvieron una tasa de supervivencia similar a la del grupo favorable definido por ELN2024. Sin embargo, los pacientes con otras mutaciones en CEBPA tuvieron peor pronóstico y no deberían incluirse en esta categoría de riesgo. En conjunto, estos resultados subrayan la importancia del análisis molecular mediante NGS para mejorar el diagnóstico, el pronóstico y avanzar en la terapia personalizada de la LAM.