Diversidad genética y patogénica de Sclerotium rofsii Sacc. como factor determinante de epidemias de podredumbre de raíces
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Author
Remesal González, Efrén
Director/es
Navas Cortés, Juan A.Jiménez Díaz, Rafael M.
Publisher
Universidad de Córdoba, Servicio de PublicacionesDate
2012Subject
Patología vegetalFitopatología
Sclerotium rolfsii
METS:
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Las epidemias causadas por el hongo de suelo Sclerotium rolfsii en
numerosos cultivos agrícolas de interés económico siguen siendo de las de
más difícil manejo, constituyendo aún, por tanto, un importante reto para
los fitopatólogos. La dificultad de su manejo está motivada por diversas
características de este patógeno, que incluyen el inusual rango de plantas
huésped, su amplia distribución en suelos agrícolas a nivel mundial, su
poderoso mecanismo de patogénesis con la producción exógena de
encimas degradadoras de la pared celular del huésped, su capacidad para
desarrollarse en un amplio rango de condiciones ambientales y su
habilidad de persistir en los suelos infestados durante largos períodos de
tiempo mediante la formación de estructuras de supervivencia o
esclerocios, lo que unido con la recientemente demostrada variabilidad
genética de sus poblaciones hacen de este patógeno uno de los de más
difícil manejo. Las epidemias causadas por S. rolfsii son especialmente
severas en zonas de clima templado y subtropical donde las elevadas
temperaturas unidas a la elevada humedad de suelo proporcionada por la
práctica del regadío dan lugar a condiciones favorables para el desarrollo
del hongo, la infección y el rápido desarrollo de la enfermedad. En España, S. rolfsii se encuentra ampliamente distribuido en los
suelos agrícolas del Valle del Guadalquivir y las provincias de Cádiz y
Huelva en Andalucía. En esta área, las epidemias más severas causadas
por S. rolfsii se han descrito en cultivos de remolacha azucarera de
siembra otoñal, cuyos rendimientos suponen hasta el 40% de la producción
total a nivel mundial de este tipo de siembra y siendo en esta región donde
el cultivo está más avanzado desde el punto de vista tecnológico y
productivo. A pesar de esto, no se han podido implementar hasta la fecha
medidas eficientes para combatirlas. La coincidencia de los últimos riegos
que recibe el cultivo con las altas temperaturas que se dan en la fecha de
recolección, mayo-julio, ofrecen un escenario óptimo para el crecimiento y desarrollo de S. rolfsii y las enfermedades que causa referida como
Podredumbre blanca o Mal del esclerocio.
En la actualidad, se dispone de un limitado conocimiento acerca de
la estructura y diversidad de las poblaciones de S. rolfsii, y éste es nulo en
el caso de poblaciones infectando cultivos de remolacha azucarera. Este
conocimiento, sería de especial interés para el diseño y desarrollo de
medidas eficientes para el control integrado de las enfermedades causadas
por este patógeno. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centra
en el estudio de dichas poblaciones procedentes de diversas áreas de
cultivo de remolacha azucarera de diferentes regiones del mundo en las
que se practica el mismo tipo de cultivo de siembra otoñal y bajo unas
mismas condiciones climáticas de tipo Mediterráneo, con prevalencia de
severas epidemias de Podredumbre blanca, y tiene como objetivo general
el generar conocimiento sobre la Fitopatología de S. rolfsii en base a su
diversidad molecular y patogénica, e inferir, así, la estructura de dichas
poblaciones como base para el establecimiento medidas de control
eficientes para el manejo de dicha enfermedad y desarrollar estudios
epidemiológicos y de dispersión de sus poblaciones. Esta investigación es
pionera en este importante hongo fitopatógeno al aunar la caracterización
genética a diversos niveles, así como su caracterización patogénica y de
virulencia en el estudio de poblaciones de S. rolfsii. En un primer nivel, la variabilidad genética de las poblaciones de S.
rolfsii se evaluó mediante la ocurrencia de grupos de compatibilidad
miceliar (GCMs) en una amplia colección de aislados del hongo y su
distribución geográfica. Los GCM se establecen en base a las reacciones
de compatibilidad-incompatibilidad entre los aislados enfrentados entre sí
en un medio de cultivo apropiado. Sin embargo, se ha detectado cierta
variabilidad en las características morfológicas de las reacciones
incompatibles que a menudo dificulta la clara distinción de las reacciones
miceliares entre aislados. Esta limitación asociada a las evidencias
macroscópicas se solventó mediante el desarrollo en el transcurso de las
primeras fases de esta investigación de un medio de cultivo (medio
modificado de Patterson: MPM) que favorece la formación de la zona de aversión característica de las interacciones incompatibles entre aislados de
S. rolfsii y permite la identificación inequívoca de las distintas reacciones
miceliares.
La determinación de los GCMs se considera como un método
indirecto para el estudio de la variabilidad genética entre aislados de
hongos fitopatógenos que carecen de fase sexual o ésta rara vez ha sido
descrita y, por lo tanto, se considera irrelevante su papel en el ciclo vital.
En estos hongos, entre los que se encuentra S. rolfsii, se considera que el
intercambio genético se produce exclusivamente entre individuos del
mismo GCM por lo que permanecen genéticamente aislados de los
encuadrados en GCMs diferentes. Este aislamiento genético hace que
estas poblaciones puedan diferir en características de tipo morfológico,
genético o patogénico. Así, entre los 459 aislados de S. rolfsii estudiados
en esta Tesis Doctoral procedentes de ocho localidades de Andalucía
donde se llevaron a cabo muestreos intensos, así como de cuatro
localidades de Chile, una de Italia y cinco de Portugal, se identificaron 12
GCMs. En las parcelas muestreadas intensamente en Andalucía el GCM i
fue el más abundante, apareciendo en todas ellas como el único grupo
presente o junto a otros representados por un menor número de aislados,
excepto en una localidad (Lebrija) donde el GCM más abundante fue el iii,
sugiriendo que el GCM i representa a la población original de S. rolfsii en
Andalucía. Considerando a la totalidad de parcelas muestreadas, el GCM
iii fue el más ampliamente distribuido geográficamente ya que fue
identificado en 10 de las 18 localidades estudiadas y en todos los países muestreados excepto en Italia. Esto sugeriría que el GCM iii pudo haber
sido el que ha sufrido una dispersión más amplia tanto dentro de una
misma zona de cultivo como entre áreas de cultivo, por prácticas culturales
como por el desplazamiento de vehículos y/o material vegetal. El resto de
GCMs identificados mostraron cierta correlación con el origen geográfico
de los aislados al estar localmente distribuidos en varias localidades de
diferentes países (GCM v), localidades dentro de un país (GCM ii, vi y ix) o
en una sola localidad (iv, vii, viii, x, xi, y xii). Una de las hipótesis de partida en esta Tesis Doctoral fue que los
aislados pertenecientes a un mismo GCM serían más similares
genéticamente entre sí que a aquellos de GCMs diferentes. En base a
esto, se analizó la diversidad genética de los aislados de S. rolfsii dentro y
entre los distintos GCMs identificados y sus relaciones filogenéticas. En
una segunda aproximación, se exploró la posibilidad de encontrar
marcadores moleculares para los GCMs que permitiesen su
caracterización e identificación rápida y reproducible. Para ello, se
realizaron análisis RFLP (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restricción) del gen 5.8S del ADN ribosómico (ADNr) y las regiones
espaciadoras internas ITS1/ITS2 que lo flanquean, mediante la digestión
de los productos amplificados de dicha región con las enzimas de
restricción AluI, RsaI, HpaII y MboI. Este análisis reveló la existencia de un
nivel de variabilidad reducido entre aislados de S. rolfsii pertenecientes a
los diferentes GCMs ya que los pertenecientes a un mismo GCM
mostraron idénticos patrones de bandas para las cuatro enzimas, mientras
que los 12 GCMs identificados se agruparon en tres grupos-RFLP que
incluyeron entre uno, tres y ocho GCMs sin que existiese asociación con el
origen geográfico de éstos. Por otro lado, dada la escasa resolución de
esta aproximación para la adecuada caracterización de los aislados de S.
rolfsii a nivel de GCM, se abordó el estudio de las secuencias nucleotídicas
de regiones específicas de genes codificantes de proteínas ricos en
intrones a lo largo de su secuencia, una herramienta molecular apenas
explorada hasta la fecha para estudios de variabilidad molecular en S.
rolfsii. Estas regiones se localizaron en el gen EF1α que codifica para el factor de elongación de la transcripción 1-alfa y en el gen RPB2 que
codifica para la segunda subunidad mayor de la ARN polimerasa II.
Considerando ambas secuencias por separado, los análisis de similitud
mostraron que los aislados de un mismo GCM compartían idéntica
información nucleotídica y que además, era posible caracterizar a los
GCMs atendiendo a sus secuencias, ya que eran únicas para la mayoría
de ellos. Más aún, al combinar ambas regiones génicas, los 12 GCMs de
S. rolfsii identificados fueron entonces resueltos, presentando cada uno de
ellos secuencias nucleotídicas únicas que permitieron su completa caracterización. Este resultado se corroboró en “test ciegos” en los que
nuevos aislados de S. rolfsii no incluidos en la colección inicial, fueron
asignados a alguno de los GCMs previamente identificados mediante el
análisis tanto de dichas secuencias génicas, con una similitud del 100%,
como de las reacciones miceliares en enfrentamientos en medios de cultivo
frente a los aislados “tipo” de cada los diferentes GCMs identificados. Por
tanto, en la presente Tesis Doctoral se propone un set inicial de aislados
“tipo” para la identificación de GCMs en S. rolfsii basada en secuencias
específicas para cada uno de ellos de los genes EF1α y RPB2 que permita
la rápida y correcta caracterización y clasificación de aislados individuales
en los 12 GCMs identificados. Esta herramienta será de gran utilidad para
una mejor compresión de la epidemiología de las enfermedades causadas
por S. rolfsii así como en el estudio de la dispersión espacial y temporal de
las poblaciones de éste. Finalmente, se abordó la caracterización patogénica y de virulencia
de las poblaciones de S. rolfsii evaluadas en la presente Tesis Doctoral, así
como su posible asociación con la variación genética encontrada en los
distintos GCMs identificados, sobre un conjunto de 11 especies vegetales
seleccionadas por representar al amplio rango de plantas huésped
susceptibles que presenta S. rolfsii y por incluir, además, especies monoy
dicotiledóneas de interés agrícola que podrían ser alternativas a los
cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal en las zonas de
producción de regiones con clima de tipo Mediterráneo y cuyas áreas se
están reduciendo de manera constante como consecuencia de diferentes
procesos de reconversión del cultivo. De este modo, a la hora de diseñar
una adecuada rotación de cultivos, es necesario disponer de información a
nivel local sobre la prevalencia de los GCMs presentes y de su espectro de
plantas huésped susceptibles. Por otro lado, la rotación de cultivos se
presenta como una de las pocas medidas de control para la Podredumbre
blanca al contribuir a la reducción del inóculo del patógeno en los suelos
infestados y al mantenimiento del potencial productivo de los suelos
agrícolas. No obstante, la eficiencia de esta medida dependerá de la
reacción que los cultivos incluidos en la rotación presenten frente a las poblaciones del patógeno. En consecuencia, esta investigación respondió
a la necesidad de generar conocimiento acerca de los rangos de plantas
huésped susceptibles a los distintos GCMs en las regiones de estudio de
clima de tipo Mediterráneo y donde esta información no está disponible en
la literatura científica. Los resultados obtenidos demostraron que existe una
elevada variabilidad patogénica entre los aislados representativos de los
diferentes GCMs, así como en el grado de susceptibilidad entre las
especies de plantas huésped evaluadas con una interacción significativa
entre los grupos de GCMs x especies huésped. El análisis de agregación
permitió seleccionar cinco grupos de GCMs y agrupar las especies
huésped en el grupo-especies 1 (brócoli, garbanzo, girasol y tomate) y 2
(algodón, pimiento, remolacha azucarera y sandía). Los grupos-GCM 1
(GCMs i y ix), 2 (GCMs ii, iii, vi y viii) y 5 (x, xii) fueron moderadamente
virulentos sobre el grupo-especies 1 y ligeramente virulentos frente al
grupo-especies 2. En cambio, los grupos-GCM 3 (GCMs iv, v y xi) y 4
(GCM vii) fueron ligeramente virulentos sobre ambos grupos de especies.
De la misma forma, para el conjunto de los 12 GCMs, la reacción media de
las diferentes especies de plantas huésped se estimó como: altamente
susceptible (garbanzo y girasol), susceptible (algodón, pimiento, tomate y
sandía), moderadamente resistente (brócoli, melón y remolacha azucarera)
y resistente (maíz y trigo). Además, cabe destacar que entre los aislados
de S. rolfsii pertenecientes a un mismo GCM, existe un bajo nivel de
variabilidad patogénica, lo cual sugiere una correlación entre los
componentes de un GCM y su capacidad patogénica y de virulencia. En base a estos resultados que muestran claras diferencias en virulencia entre
los diferentes aislados de S. rolfsii, asociadas además a la diversidad
genética de los mismos determinada por los GCMs en los que se agrupan,
junto con la ocurrencia de hasta tres GCMs diferentes en una misma
parcela o localidad, dificultan la recomendación de la rotación de cultivos
como única medida de control frente a la Podredumbre blanca.
Esta Tesis Doctoral ha permitido explorar por vez primera el estudio
y caracterización de la estructura genética y patogénica de las poblaciones
de S. rolfsii infectando cultivos de remolacha azucarera de siembra otoñal en regiones de clima de tipo Mediterráneo. La información generada en la
presente Tesis Doctoral ha permitido establecer las bases para: (i) la
inequívoca evaluación de las distintas reacciones miceliares entre los
aislados de S. rolfsii; (ii) la identificación y caracterización rápida de GCMs
en base a marcadores moleculares; (iii) el establecimiento de una
colección de referencia de aislados representativos de GCMs para futuros
estudios sobre las poblaciones del patógeno; y (iv) la caracterización de la
reacción de un conjunto de especies de plantas huésped de interés
económico y agrícola frente a las poblaciones de S. rolfsii prevalentes en
áreas de clima Mediterráneo.
Desde un punto de vista práctico, los resultados obtenidos en esta
Tesis Doctoral permitirán establecer medidas más eficientes de control de
las enfermedades causadas por S. rolfsii tanto en remolacha azucarera
como en otros alternativos que se establezcan en áreas con historia del
patógeno. En base a nuestros resultados, dichas medidas deben estar
basadas fundamentalmente en los principios de prevención y escape, y
deberán ser implementadas mediante la utilización de cultivos no huésped
del patógeno o con un nivel adecuado de resistencia a las poblaciones del
mismo prevalentes en la zona de cultivo, así como la práctica de la rotación
de cultivos que incluya preferentemente cultivos no huésped a S. rolfsii.