Roldán-Arjona, TeresaRodríguez Ariza, RafaelRamiro-Merina, Ángel2016-02-11T13:33:12Z2016-02-11T13:33:12Z2016http://hdl.handle.net/10396/13245MBD4 es una ADN glicosilasa que ha sido propuesta como un factor central para
el mantenimiento de la integridad del genoma y las respuestas al daño del ADN en
animales. Existen pruebas de que en vertebrados participa en la reparación por escisión
de bases, la reparación de apareamientos erróneos, el control del ciclo celular en
respuesta a daños en el genoma y la desmetilación del ADN. Sin embargo, se desconoce
si en plantas existe alguna proteína que desempeñe funciones similares. En esta Tesis
se ha identificado un gen de la planta modelo Arabidopsis thaliana que codifica un
posible ortólogo de MBD4. El objetivo principal del trabajo ha sido determinar si la
proteína MBD4 de A. thaliana está implicada en el mantenimiento de la estabilidad del
genoma de la planta.
Para la caracterización in vitro de la actividad bioquímica de MBD4 se ha
purificado la enzima en forma recombinante y se ha analizado su actividad catalítica
sobre diferentes lesiones localizadas en diversos contextos de secuencia. Los
resultados indican que posee actividad ADN glicosilasa frente a uracilo (U) y timina (T)
apareados erróneamente con guanina (G), lo que sugiere que previene la mutagénesis
causada por la desaminación espontánea de C y 5-meC a U y T, respectivamente.
Además, los resultados indican que MBD4 se une al sitio abásico que genera en el ADN
tras la escisión de la base, lo que explicaría su baja tasa de recambio in vitro.
Paralelamente a su caracterización bioquímica, se ha estudiado la función in vivo
de esta enzima. Mediante PCR en tiempo real y transformación de plantas con una
construcción del gen GUS precedido del promotor de MBD4 se han analizado los niveles
de expresión en diferentes tejidos y etapas del desarrollo de Arabidopsis. Se ha
observado que MBD4 se expresa en múltiples tejidos y a lo largo de todo el desarrollo de
la planta, lo que concuerda con una función de mantenimiento del ADN en condiciones
normales de crecimiento. Se ha identificado una línea de plantas mutantes
(FLAG_249E06) que presentan una inserción de ADN-T en la región 3’ UTR de MBD4, y se
ha comprobado que las plantas homocigotas para para la inserción (mbd4-/-) tienen un
nivel de expresión de MBD4 muy reducido. Además, se ha llevado a cabo un análisis
fenotípico de las plantas mutantes en comparación con las silvestres y se ha estudiado
su respuesta a la presencia de diferentes mutágenos. Las plantas mbd4-/- muestran un
fenotipo aparentemente normal en condiciones estándar de crecimiento, a excepción de
un tamaño reducido de la roseta basal y una menor longitud de la raíz. Sin embargo, son
más resistentes que las silvestres a los efectos genotóxicos de MMS y 5-FU, y dicha
resistencia aumenta si la deficiencia en MBD4 se combina con una deficiencia en la
uracil ADN glicosilasas UNG. Por otra parte, las plantas mutantes mbd4-/- presentan una
expresión constitutiva de la ciclina CYCB1;1, lo que sugiere una activación continua de la
respuesta a estrés genotóxico en ausencia de MBD4.
3...application/pdfspaUniversidad de Córdoba, UCOPresshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Proteína MBD4ADNADN glicosilasaArabidopsis thalianaPlantasGenomaAnálisis molecular y funcional de la proteína MBD4 de Arabidopsis thalianainfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccess