Regulación de la supervivencia celular por sobreexpresión de NOS3 en la línea de hepatoma HepG2
Autor
Linares Luna, Clara Isabel
Director/es
Mata García, Manuel de laFerrín Sánchez, Gustavo
Muntané Relat, Jordi
Editor
Universidad de Córdoba, UCOPressFecha
2017Materia
Cáncer de hígadoPatologías tumorales
Carcinoma hepatocelular
Hepatocarcinoma humano HepG2
Óxido nítrico sintasa endotelial (NOS3)
Líneas celulares
Terapia génica antitumoral
Proteómica
METS:
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El hepatocarcinoma (CHC) representa la tercera causa de muerte relacionada con el
cáncer en el mundo. Además, debido a su relación con otras patologías como la diabetes o
la obesidad, su incidencia y mortalidad asociada siguen en aumento. La esperanza de vida
de la mayoría de los pacientes de CHC es corta y, en la mayoría de los casos, solamente la
ablación percutánea de tumores pequeños, la cirugía de resección y el trasplante hepático
son capaces de curar la enfermedad. No obstante, debido a que el diagnóstico del CHC
suele realizarse en estadios avanzados de la enfermedad, el porcentaje de casos con
probabilidad de recibir alguno de los tratamientos curativos se sitúa entre el 40-50%. Por
ello, es necesario obtener un mayor conocimiento de la enfermedad que nos permita el
desarrollo de nuevas terapias frente al CHC.
Las líneas tumorales establecidas son valiosos modelos en investigación oncológica
y, aunque no pueden reemplazar a los ensayos in vivo, constituyen una alternativa muy útil.
El óxido nítrico (ON) es una molécula químicamente inestable y de vida media muy corta,
la cual puede ser sintetizada en muchos tejidos (incluido el hepático) a partir de las óxido
nitrico sintasas (NOS). El ON desempeña un relevante papel fisiopatológico en la
transducción de la señal, ejerciendo diferentes efectos en función de distintos factores. El
papel del ON como regulador de la apoptosis está bien establecido, pudiendo actuar como
agente pro- o antiapoptótico. Sin embargo, el mecanismo molecular responsable de este
efecto contradictorio no se conoce con profundidad. Como proapoptótico, el uso de
donadores de ON ha sido sugerido como potencial terapia frente al cáncer. En este sentido,
la sobreexpresión de la óxido nítrico sintasa endotelial (NOS3) también ha sido relacionada
con la muerte celular a través del incremento del estrés nitro-oxidativo celular y de la
expresión de p53 y del receptor de muerte Fas, y ha sido sugerida como posible terapia
génica frente al cáncer.
El objetivo de esta tesis fue identificar el mecanismo a través del cual la
sobreexpresión de NOS3 se relaciona con la actividad antitumoral, en la línea celular de
CHC humano HepG2 con sobreexpresión estable de la NOS3 (4TO-NOS). Asimismo,
hemos valorado la sensibilidad de la línea 4TO-NOS a la muerte celular inducida por anti-
Fas. Para ello, y considerando la naturaleza del ON y sus efectos fisiológicos, analizamos
la localización de la NOS3, el efecto del ON sobre la cadena de transporte electrónico
mitocondrial y el perfil de expresión diferencial de proteínas en la línea celular 4TO-NOS.
Nuestros resultados demostraron que NOS3 se localiza en la membrana
mitocondrial externa. La sobreexpresión de NOS3 se asoció con el incremento del
contenido mitocondrial de proteínas nitradas, pero no con la alteración de la capacidad respiratoria celular. En este sentido, se observó un incremento del número de copias de
ADN mitocondrial en la línea 4TO-NOS, que coincidió con una mayor expresión de
proteína del complejo IV mitocondrial.
La muerte celular y el estrés oxidativo relacionados con la sobreexpresión de NOS3
fueron asociados al incremento de la expresión de genes proapoptóticos y a una mayor
expresión/actividad de las enzimas adrenodoxina oxidorreductasa mitocondrial (AR) y
catepsina D (CATD). Interesantemente, la sobreexpresión de CATD en la línea celular
4TO-NOS se relacionó con la inducción de apoptosis de manera independiente a su
actividad catalítica. Además, la inhibición de la actividad CATD no fue efectiva en
bloquear la apoptosis inducida por anti-Fas. En resumen, la sobreexpresión de NOS-3
resultó en una mayor sensibilidad a la muerte celular inducida por anti-Fas,
independientemente de la expresión de AR y de la actividad CATD. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third leading cause of cancer-related death
in the world. In addition, due to its relationship with other pathologies such as diabetes and
obesity, its incidence and associated mortality continues to increase. The life expectancy of
most HCC patients is short and, in most cases, only surgery and liver transplantation are
curative treatments. However, since the diagnosis of HCC is commonly made in advanced
stages of the disease, the percentage of cases with the probability of receiving a curative
treatment is between 40-50%. Therefore, it is necessary to obtain a greater knowledge of
the disease that allows us the development of new therapies against HCC.
Established tumor lines are valuable models in oncology research and, although
they cannot replace in vivo assays, they are a very useful alternative. Nitric oxide (NO) is a
chemically unstable molecule with a very short half-life, which can be synthesized in many
tissues (including hepatic tissue) from NO synthases (NOS). NO plays a relevant role in
signal transduction in pathophysiology, exerting different effects depending on several
factors. The role of NO as a regulator of apoptosis is well established, having both
antiapoptotic and proapoptotic functions. However, the molecular mechanisms responsible
for its opposite effect are not fully understood. As antiapoptotic, the use of NO donors has
been suggested as a potential cancer therapy. In this sense, the overexpression of
endothelial nitric oxide synthase (NOS3) has also been related to cell death through the
increase of cellular nitro-oxidative stress and expression of p53 and Fas death receptor. In
addition, NOS-3 overexpression has been suggested as a therapy against cancer.
The aim of this thesis was to identify the mechanism by which the NOS3
overexpression is related to the antitumor activity in the human HCC cell line HepG2 with
stable overexpression of NOS3 (4TO-NOS). Also, we assessed the sensitivity of 4TO-NOS
cells to anti-Fas-induced cell death. Taking into account factors such as the chemical
nature of NO and its physiological effects, we analysed the location of NOS3, the effect of
NO on the mitochondrial electronic transport chain and the differential expression profile
of proteins in the 4TO-NOS cell line.
Our results showed that NOS3 is located in the outer mitochondrial membrane.
This was associated with the increase in the mitochondrial content of nitrated proteins but
it was not related to altered cellular respiratory capacity. In this sense, we observed an
increase in mitochondrial DNA copy number in the 4TO-NOS cell line, which coincided
with a greater expression of mitochondrial IV complex protein.
Cell death and oxidative stress related to NOS3 overexpression were associated
with the expression increase of proapoptotic genes and with a greater expression and/or activity of adrenodoxin oxidoreductase mitochondrial (AR) and cathepsin D (CATD)
enzymes. Interestingly, overexpression of CATD in the 4TO-NOS cell line was related to
the induction of apoptosis independently of its catalytic activity. In addition, inhibition of
CATD activity was not effective in blocking anti-Fas-induced apoptosis. In summary, the
NOS3 overexpression resulted in increased sensitivity to anti-Fas-induced cell death,
independently of AR expression and CATD activity.