Optimization of donkey sperm freezing and vitrification

Abstract

Assisted reproductive technologies such as artificial insemination (AI) and semen cryopreservation are important tools to maintain the genetic diversity and preserve endangered species, including most of the European donkey breeds. The aim of this Thesis was to develop conventional freezing and vitrification, avoiding the use of permeable cryoprotectant agents (CPAs), as alternative methods for donkey sperm cryopreservation. In Chapter 1, the sole use of nonpermeable CPAs at different concentrations were evaluated for conventional freezing. Sucrose 0.25 molar (M) combined with bovine serum albumin showed similar sperm quality (motility, plasma membrane and DNA integrity) after thawing than conventional freezing with glycerol for fertile donkeys, but is not an option for subfertile ones. In Chapter 2, vitrification in spheres by directly dropping the sperm into the liquid nitrogen was performed for the first time in donkey sperm. Sucrose and bovine serum albumin as non-permeable CPAs resulted in better sperm parameters after warming than the use of extenders containing glycerol. Chapter 3 was designed to develop and optimize a donkey sperm vitrification protocol using straws. It was shown that volumes up to 160 μL could be vitrified at 300 million sperm/mL using 0.25 mL straws with outer covers. Best percentages of total (55.7 ± 16.4 %) and progressive (44.0 ± 11.5 %) sperm motility after vitrification were found using an extender containing eggyolk and sucrose. Vitrification in straws showed higher motility results when compared to spheres method. In Chapter 4, vitrification of larger volumes of sperm in 0.5 mL straws was tested. Although high warming rates seemed to be more adequate, sperm parameters after vitrification were lower when compared to conventional freezing. In Chapter 5, conventionally frozen and optimized vitrified donkey sperm in straws were compared in terms of sperm quality and fertility. It was found that straws could be directly vitrified and warmed in a water bath at 43 ºC/10 s obtaining similar sperm parameters as conventional freezing-thawing for total motility (52.7 ± 15.6 % vs. 58.2 ± 16.1 %), progressive motility (44.3 ± 15.0 % vs. 44.7 ± 18.2 %), plasma membrane integrity (49.2 ± 11.2 % vs. 55.4 ± 9.0 %) and acrosome integrity (45.0 ± 11.0 % vs. 38.4 ± 19.6 %), respectively. Uterine inflammatory response after AI was similar using vitrified or frozen semen, but uterine reaction solved faster using vitrified semen. Pregnancy rates were greater for vitrified (22 %) than frozen semen (10 %) but not statistically different. These findings confirm the possibility to use vitrified semen as an alternative for AI in jennies.

La inseminación artificial (IA) y la crioconservación de esperma son algunas de las técnicas de reproducción asistida más eficaces para el mantenimiento de la diversidad genética, así como para la conservación de especies en peligro de extinción, incluyendo la mayoría de las razas asnales en Europa. El objetivo de la presente Tesis fue desarrollar la congelación convencional y la vitrificación del esperma de asno como métodos de crioconservación alternativos, evitando el uso de agentes crioprotectores (CPAs) permeables. En el Capítulo 1 se estudió la congelación convencional utilizando únicamente CPAs no permeables a distintas concentraciones. Empleando un diluyente con sacarosa a 0,25 molar (M) combinada con albúmina sérica bovina, se obtuvieron parámetros espermáticos (movimiento, integridad de la membrana plasmática y del ADN), similares a los que se obtienen tras la congelación convencional empleando glicerol en asnos fértiles. Sin embargo, en asnos subfértiles ninguna concentración de sacarosa resultó en valores similares a los obtenidos tras la congelación convencional. En el Capítulo 2 se llevó a cabo, por primera vez, la vitrificación de esperma de asno en esferas. Sacarosa y albúmina sérica bovina fueron añadidas al diluyente, como CPAs no permeables, resultando en una mejor calidad espermática tras la descongelación, en comparación con los diluyentes que contienen glicerol. El Capítulo 3 fue diseñado para desarrollar y mejorar la técnica de vitrificación de esperma en esta especie, empleando pajuelas. Se determinó como óptima la vitrificación de volúmenes de hasta 160 μL en pajuelas de 0,25 mL, empleando una concentración de 300 millones de espermatozoides/mL. Los mejores porcentajes de movimiento total (55,7 ± 16,4 %) y progresivo (44,0 ± 11,5 %), tras la vitrificación, se obtuvieron empleando un diluyente suplementado con yema de huevo y sacarosa. El método de vitrificación en pajuelas obtuvo mayores porcentajes de movimiento espermático cuando se comparó con la vitrificación en esferas. En el Capítulo 4 se estudió la vitrificación en volúmenes mayores, empleando pajuelas de 0,5 mL. Aunque altas velocidades de calentamiento parecen ser más adecuadas, los parámetros espermáticos tras la vitrificación fueron bajos en comparación con la congelación convencional. En el Capítulo 5, la técnica optimizada para la vitrificación en pajuelas se comparó, en cuanto a calidad espermática y fertilidad, con la técnica convencional de congelación, empleando glicerol como CPA. Las pajuelas vitrificadas pueden ser directamente calentadas a 43 ºC/10 s, obteniendo parámetros espermáticos tras la descongelación similares a los que se obtienen con el método convencional para el movimiento total (52,7 ± 15,6 % vs. 58,2 ± 16,1 %), movimiento progresivo (44,3 ± 15,0 % vs. 44,7 ± 18,2 %), integridad de la membrana plasmática (49,2 ± 11,2 % vs. 55,4 ± 9,0 %) e integridad de la membrana acrosómica (45,0 ± 11,0 % vs. 38,4 ± 19,6 %), respectivamente. La respuesta inflamatoria uterina tras la IA fue similar empleando dosis sometidas a ambos tratamientos de congelación, pero ésta se resuelve antes empleando esperma vitrificado. Las tasas de gestación fueron mayores empleando esperma vitrificado (22 %) que congelado (10 %), pero las diferencias no fueron significativas. Estos hallazgos confirman la posibilidad de emplear la vitrificación de esperma como alternativa a la congelación convencional para la IA de asnas.

L'inseminazione artificiale (IA) e la crioconservazione del seme sono le tecniche di riproduzione assistita più efficaci per il mantenimento della diversità genetica e la conservazione delle specie e razze in via di estinzione, tra cui la maggior parte delle razze di asini in Europa. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare il congelamento e la vitrificazione convenzionale dello sperma di asino, come metodi alternativi di crioconservazione, evitando l'uso di agenti crioprotettivi permeabili (CPA). Nel Capitolo 1 è stato valutato l'uso esclusivo di CPA non permeabili a diverse concentrazioni per il congelamento convenzionale. Utilizzando un diluente con saccarosio 0,25 molare (M) combinato con albumina di siero bovino i parametri spermatici ottenuti (motilità, integrità della membrana plasmatica e DNA), sono risultati simili a quelli ottenuti dopo il congelamento convenzionale con glicerolo in asini fertili. Tuttavia, negli asini subfertili nessuna concentrazione di saccarosio ha prodotto valori simili a quelli ottenuti dopo il congelamento convenzionale. Nel Capitolo 2 è stata sviluppata la tecnica di vitrificazione in sfere (pellets), ottenuta facendo cadere gocce di seme di asino in azoto liquido. Il saccarosio e l'albumina sierica bovina aggiunti al diluente come CPA non permeabili sono risultati in migliori caratteristiche spermatiche dopo lo scongelamento rispetto all'uso di diluenti con glicerolo. Il Capitolo 3 è stato disegnato per sviluppare e ottimizzare la tecnica di vitrificazione dello sperma degli asini usando paillettes. I risultati migliori sono stati ottenuti quando è stato usato un volume fino a 160 μl, concentrazione di 300 milioni di spermatozoi/mL e paillettes da 0.25 mL. Le migliori percentuali di motilità totale (55.7 ± 16.4%) e progressiva (44.0 ± 11.5%) dopo la vitrificazione sono state ottenute utilizzando un diluente con tuorlo d'uovo e saccarosio. Il metodo di vitrificazione nelle paillette ha ottenuto percentuali più elevate di motilità dello sperma rispetto alla vitrificazione nelle sfere. Nel Capitolo 4 è stata testata la vitrificazione usando volumi di seme maggiori e paillettes da 0.5 mL. I parametri dopo lo scongelamento sono risultati migliori usando velocità di scongelamento elevate, ma sono risultati peggiori rispetto al congelamento convenzionale. Nel Capitolo 5, la tecnica ottimizzata per la vitrificazione nelle paillette in 0.25 mL è stata confrontata con la tecnica convenzionale di congelamento del seme con glicerolo per quanto riguarda alla qualità dello sperma e la fertilità. Le paillette vitrificate possono essere riscaldate direttamente a 43 ºC/10 s, ottenendo parametri spermatici dopo lo scongelamento simili a quelli ottenuti con il metodo convenzionale per la motilità totale (52.7 ± 15.6 % vs. 58.2 ± 16.1 %), motilità progressiva (44.3 ± 15.0 % vs. 44.7 ± 18.2 %), integrità della membrana plasmatica (49.2 ± 11.2 % vs. 55.4 ± 9.0 %) e integrità della membrana acrosomiale (45.0 ± 11.0 % vs. 38.4 ± 19.6 %), rispettivamente. L'endometrite dopo IA è risultata simile utilizzando entrambi i trattamenti di congelamento, ma la infiammazione uterina si è risolta più velocemente utilizzando sperma vitrificato. I tassi di gravidanza sono stati più alti utilizzando sperma vitrificato (22%) rispetto a quelli congelati (10%), ma le differenze non erano statisticamente significative. Questi risultati confermano la possibilità di utilizzare la vitrificazione del seme di asino come alternativa al congelamento convenzionale.