Control of verticillium wilt of olive using nutrients, biostimulants and resistance inducers

Abstract

Verticillium wilt of olive (Olea europaea; VWO), caused by the hemibiotrophic fungus Verticillium dahliae, is the most serious biotic challenge to this crop in the Mediterranean basin since it causes high levels of tree mortality and fruit yield reduction. Due to the lack of a truly efficient method to control VWO, an integrated management strategy is needed to reduce both pathogen dispersal and disease incidence in olive groves. Thus, the use of natural or biological compounds arises as a potential complementary and eco-friendly control tool against VWO. In this context, the Agroforestry Pathology Research Group AGR-216 from the University of Cordoba (Spain) has been developing an extensive research line on biocontrol of VWO since 2011, which has contributed markedly in generating knowledge on such topic towards to obtain potential biological solutions against the disease in the near future. To reach this goal, more than 280 compounds including microorganisms (fungi, bacteria), organic amendments (waste from animals and food industry), natural substances (essential oils, plant extracts), nutrients and resistance inducers have been tested through a massive screening under controlled conditions. Thus, the main goal of this PhD Thesis was to continue evaluating a broad diversity of biological treatments against the disease as well as determining the mode of action of the most effective treatments. To this end, the first objective of this PhD Thesis was to evaluate the effect of 32 compounds including microorganisms, biostimulants, copper fertilizers and resistance inducers against the V. dahliae in vitro and the disease progress in olive plants of cv. Picual. Among all the compounds tested, Phoma sp. and Aureobasidium pullulans fungal strains were the most effective in disease reduction in planta with foliar application; whereas two phosphite salts, one with copper and the other with potassium, were the most effective in disease reduction in planta when they were applied by irrigation, followed by A. pullulans and Bacillus amyloliquefaciens strains. This study served to select the best candidates to conduct a set of experiments to determine their possible modes of action. The objective 2 was to evaluate the influence of the cultivar, biocontrol treatments and their interaction on the effect of olive stem extracts (OSE) on the viability of V. dahliae conidia. The results indicated that the influence of biological treatments against the pathogen depends on the genotype, since the higher the resistance of the cultivar, the lower the effect of the treatments on the ability of the OSE to inhibit the germination of conidia. In ‘Picual’, the biological control agent B. amyloliquefaciens and copper phosphite were the most effective treatments in inhibiting conidia germination by the OSE. The objective 3 was to set up a collection method for root exudates from young olive plants by testing three collection media (deionized distilled water, 0.01 M CaSO4 solution, Hoagland nutrient solution) and four collection periods (2, 4, 6, 12 h). Once the protocol was set up, the effect of root exudates from different cultivars , biocontrol treatments and their interaction on the viability of conidia and microsclerotia (MS) of V. dahliae was evaluated. In addition, the dissolved organic carbon (DOC) exudation level from the root exudates was estimated. A 0.01 M CaSO4 solution and 4 h may be regarded a preferential medium and timing combination to collect root exudates from olive. Root exudates induced the germination of V. dahliae conidia and MS, with genotype affecting significantly on this ability. Aureobasidium pullulans was the most effective biocontrol treatment to enhance the effectiveness of root exudates decreasing the viability of conidia and MS. DOC in the exudate solutions varied depending on the olive cultivars and/or on the biocontrol treatments. The objective 4 aimed to determine the effectiveness of A. pullulans, B. amyloliquefaciens and copper phosphite 3 enhancing the plant defence system in olive plants of cv Picual against V. dahliae by means of assessing biochemical parameters involved in plant resistance such as reactive oxygen species (ROS) response (H2O2) and plant hormones by relative gene expression. High levels of salicylic acid (SA) were detected on leaves from all treatment combinations, but without significant enhancements compared to the non-treated control. Regarding the gene expression related to SA, only the WRKY5 gene has shown a strong enhancement in the tr eatment with B. amyloliquefaciens. On the other hand, a high accumulation of jasmonic acid (JA) and JA-isoleucine in plants treated with A. pullulans was observed in leaf, stem and root tissues as well as in roots of plants treated with B. amyloliquefaciens and the copper phosphite 3. In parallel, the objective 5 was conducted to evaluate the influences of nutritional imbalances of nitrogen (N) and potassium (K) in V. dahliae infection to olive. To this end, adjusted treatments with N excess (↑N+↑Na), K deficiency (↓K) a n d their combination (↑N+↑Na+↓K) were evaluated on the viability of V. dahliae MS; as well as on disease development in olive plants. In parallel, the potential indirect effect of the treatments through the stimuli of root exudates was evaluated on the viability of conidia and MS of V. dahliae. Treatments ↑N+↑Na and ↑N+↑Na+↓K decreases MS germination and disease progress; whereas ↓K significantly increases both parameters. Root exudates from treated plants increased V. dahliae conidia germination, but reduced MS germination. Finally, the objective 6 was a complementary study to characterize the bacterial microbiome of tomato plants to search for new potential biological control agents against V. dahliae by evolving the most effective bacterial strains towards Ave1 effector protein tolerance. All the knowledge generated through this PhD Thesis represents a relevant step towards the biological control of VWO, and opens a variety of new paths to explore to better understand the mechanism of action of biological treatments in olive trees against V. dahliae.

La Verticilosis del olivo (Olea europaea; VO), causada por el hongo hemibiotrofo Verticillium dahliae, es el desafío biótico más grave para este cultivo en la cuenca mediterránea, ya que causa altos niveles de mortalidad en los árboles y reducción del rendimiento de la cosecha. Debido a la falta de un método realmente eficaz para el control de la VO, es necesaria una estrategia de gestión integrada para reducir tanto la dispersión del patógeno como la incidencia de la enfermedad en los olivares. De este modo, el uso de compuestos naturales o biológicos surge como una herramienta potencial de control complementaria y ecológica contra la VO. En este contexto, el Grupo de Investigación Patología Agroforestal AGR-216 de la Universidad de Córdoba (España) viene desarrollando desde 2011 una amplia línea de investigación sobre el biocontrol de la VO, que ha contribuido notablemente en la generación de conocimiento en este tema hacia la obtención de soluciones biológicas potenciales contra la enfermedad en un futuro próximo. Para alcanzar este objetivo, se han evaluado más de 280 compuestos que incluyen microorganismos (hongos, bacterias), enmiendas orgánicas (residuos de animales y de la industria alimentaria), sustancias naturales (aceites esenciales, extractos de plantas), nutrientes e inductores de resistencia mediante un cribado masivo en condiciones controladas. Así, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue seguir evaluando una amplia diversidad de tratamientos biológicos contra la enfermedad, así como determinar el modo de acción de los tratamientos más eficaces. Para ello, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar el efecto de 32 compuestos incluyendo microorganismos, bioestimulantes, fertilizantes cúpricos e inductores de resistencia contra V. dahliae in vitro, y el progreso de la enfermedad en plantas de olivo cv. Picual. De entre todos los compuestos evaluados, las cepas fúngicas Phoma sp. y Aureobasidium pullulans fueron las más eficaces en la reducción de la enfermedad en planta por aplicación foliar; mientras que dos sales de fosfito, una a base cobre y otra de potasio, fueron las más eficaces en la reducción de la enfermedad en planta cuando se aplicaron por riego, seguidas de las cepas de A. pullulans y Bacillus amyloliquefaciens. Este estudio sirvió para seleccionar los mejores candidatos y realizar un conjunto de experimentos para determinar sus posibles modos de acción. El objetivo 2 fue evaluar la influencia del cultivar, los tratamientos de biocontrol y su interacción en el efecto de los extractos de tallo de olivo (OSE) sobre la viabilidad de los conidios de V. dahliae. Los resultados indicaron que la influencia de los tratamientos biológicos contra el patógeno depende del genotipo, ya que cuanto mayor es la resistencia del cultivar, menor es el efecto de los tratamientos sobre la capacidad de los OSE para inhibir la germinación de los conidios. En 'Picual', el agente de control biológico B. amyloliquefaciens y el fosfito de cobre fueron los tratamientos más efectivos para inhibir la germinación de conidios por parte del OSE. El objetivo 3 fue establecer un método de recolección de exudados radiculares de plantas jóvenes de olivo, probando tres medios de recolección (agua destilada desionizada, solución de CaSO4 0,01 M, solución nutritiva Hoagland) y cuatro períodos de recolección (2, 4, 6, 12 h). Una vez establecido el protocolo, se evaluó el efecto de los exudados radiculares de diferentes cultivares, los tratamientos de biocontrol y su interacción sobre la viabilidad de los conidios y miscrosclerocios (MS) de V. dahliae. Además, se estimó el nivel de exudación de carbono orgánico disuelto (DOC) de los exudados radiculares. La solución de CaSO4 0,01 M y 4 h puede considerarse la combinación preferente de medio y tiempo para recoger los exudados de las raíces del olivo. Los exudados radiculares indujeron la germinación de conidios y MS de V. dahliae, y el genotipo afectó significativamente a esta capacidad. Aureobasidium pullulans fue el tratamiento de biocontrol más efectivo para aumentar la eficacia de los exudados radiculares disminuyendo la viabilidad de los conidios y los MS. El DOC en las soluciones de exudado varió en función de los cultivares de olivo y/o de los tratamientos de biocontrol. El objetivo 4 pretendía determinar la eficacia de A. pullulans, B. amyloliquefaciens y fosfito de cobre 3 en la mejora del sistema de defensa de las plantas de olivo cv Picual frente a V. dahliae mediante la evaluación de los parámetros bioquímicos implicados en la resistencia de la planta, como la respuesta de las especies reactivas del oxígeno (ROS) (H2O2) y las hormonas vegetales mediante expresión de genes relativa. Se detectaron altos niveles de ácido salicílico (SA) en las hojas de todas las combinaciones de tratamiento, pero sin mejoras significativas en comparación con el control no tratado. En cuanto a la expresión de genes relacionados con el SA, sólo el gen WRKY5 mostró un fuerte aumento en el tratamiento con B. amyloliquefaciens . Por otro lado, se observó una alta acumulación de ácido jasmónico (JA) y JA-isoleucina en las plantas tratadas con A. pullulans en los tejidos de la hoja, el tallo y la raíz, así como en las raíces de las plantas tratadas con B. amyloliquefaciens y el fosfito de cobre 3. En paralelo, el objetivo 5 se llevó a cabo para evaluar la influencia de los desequilibrios nutricionales de nitrógeno (N) y potasio (K) en la infección de V. dahliae en olivo. Para ello, se evaluaron tratamientos ajustados con exceso de N (↑N+↑Na), déficit de K (↓K) y su combinación (↑N+↑Na+↓K) sobre la viabilidad de MS de V. dahliae; así como sobre el desarrollo de la enfermedad en lplantas de olivo. Paralelamente, se evaluó el potencial efecto indirecto de los tratamientos a través de los de los exudados radiculares sobre la viabilidad de los conidios y MS de V. dahliae. Los tratamientos ↑N+↑Na y ↑N+↑Na+↓K disminuyen la germinación de MS y el progreso de la enfermedad; mientras que ↓K aumenta significativamente ambos parámetros. Los exudados radiculares de las plantas tratadas aumentaron la germinación de conidios de V. dahliae, pero redujeron la germinación de MS. Finalmente, el objetivo 6 fue un estudio complementario para caracterizar el microbioma bacteriano de plantas de tomate en busca de nuevos agentes potenciales de control biológico contra V. dahliae mediante la evolución de las cepas bacterianas más eficaces hacia la tolerancia a la proteína efectora Ave1. Todo el conocimiento generado a través de esta Tesis Doctoral representa un paso relevante hacia el control biológico de la VO, y abre una diversidad de nuevos caminos a explorar para entender mejor el mecanismo de acción de los tratamientos biológicos en olivos contra V. dahliae.