Genome-wide identification and expression analysis of the subtilisin-like protease gene family in Quercus ilex

Abstract

The holm oak (Quercus ilex) is the defining species of the agrosilvopastoral ecosystem dehesa, carrying a great significance from an environmental and economic point of view. The recent availability of its first draft genome (Rey et al., 2022) offers the novel possibility of analysing entire gene families. This work is focused on a comprehensive characterization of the subtilisin-like gene family of Q. ilex (QiSBT), a large family of proteases linked to a myriad of biological functions. One of these proteins was previously selected as a putative drought resistance marker in Q. ilex (San-Eufrasio et al., 2021b). A total 79 QiSBT genes were identified and classified into 7 clades or subfamilies (SBT1-7, plus 2 ungrouped genes “SBT0”) located unevenly in clusters along the 12 Q. ilex chromosomes, where SBT4 is the most represented. Of these, 43 tandem-duplicated pairs were detected, confirming that this mode of gene duplication was the main responsible in the expansion of this large gene family. QiSBTs were mainly predicted to be extracellular, and the majority had signal peptides associated with the secreted pathway. Cis-element analysis of QiSBT promoter regions showed genes possessed many elements related to response to abiotic stress (1395), followed by light response (1004) and hormone response (672), whereas development-related (432) and biotic stress-responsive elements (237) were less abundant. We identified 38 QiSBT genes at the transcript level in leaves and seeds; 15 genes were differentially expressed, with 3 genes (gene-37794, gene-24273 and gene-3101) being up-regulated in response to combined (drought and Phytophthora cinammomi) stress in leaves at different sampling or response times (early or late). Additionally, 25 proteins corresponding to 15 genes were found at the protein level in leaves, seeds, and roots; gene-22799 and gene-18239 were found to be upaccumulated at both the early and late response in leaves subjected to drought stress and combined stress, respectively. We found that 4 proteins corresponding to 3 genes (gene-12612, gene-5563, and gene-10488) were up-accumulated in germinated acorns compared to mature acorns. Gene-39028 exhibited up-accumulation after methyl jasmonate (MeJa) treatment in roots, implying that this gene could be induced by this biostimulant. As main practical conclusion, some members of the subfamilies QiSBT4 (gene-37794 and gene-3031) and QiSBT1 (gene-27799 and gene-18239) are proposed as good marker candidates for breeding programs based on the selection of elite genotypes resilient to stresses, especially those related to the decline syndrome and climate change.

La encina (Quercus ilex) es la especie definitoria del ecosistema agrosilvopastoral dehesa, que tiene un gran significado desde el punto de vista ambiental y económico. La reciente disponibilidad de su primer borrador de genoma (Rey et al., 2022) ofrece la nueva posibilidad de analizar familias de genes enteras. Este trabajo se centra en una caracterización de la familia de genes “subtilisin-like” de Q. ilex (QiSBT), una superfamilia de proteasas ligadas a una multitud de funciones biológicas. Una proteína de este tipo fue previamente seleccionada como marcador de resistencia a la sequía en Q. ilex (San-Eufrasio et al., 2021b) Hemos identificado y clasificado 79 genes QiSBT en 7 clados o subfamilias (SBT1-7, y 2 genes no agrupados “SBT0”) ubicados desigualmente en agrupaciones a lo largo de los 12 cromosomas de Q. ilex, donde SBT4 es el clado más representado en la especie. Se detectaron un total de 43 pares duplicados en tándem, lo que confirma que este modo de duplicación de genes fue el principal responsable de la expansión de esta gran familia de genes. La localización subcelular de las QiSBTs fue principalmente la categoría extracelular, y la mayoría tenía péptidos señal asociados con la vía secretora. El análisis de elementos cis de las regiones promotoras de QiSBTs mostró que los genes poseían muchos elementos relacionados con la respuesta al estrés abiótico (1395), seguidos de elementos de respuesta a la luz (1004) y a hormonas (672), mientras que los relacionados con el desarrollo (432) y los elementos de respuesta al estrés biótico (237) eran menos abundantes. Se identificaron 38 genes QiSBT a nivel de transcrito en hojas y semillas; 15 genes fueron expresados diferencialmente, donde 3 genes (gene-37794, gene-24273 y gene-3101) estuvieron sobreexpresados en respuesta al estrés combinado (sequía y Phytophthora cinammomi) en hojas en diferentes tiempos de muestreo o respuesta (temprana o tardía). Adicionalmente, se encontraron 25 proteínas correspondientes a 15 genes en hojas, semillas y raíces; se encontró que el gene-22799 y el gene-18239 se acumularon tanto en la respuesta temprana como tardía en hojas sometidas a estrés por sequía y estrés combinado, respectivamente. 4 proteínas correspondientes a 3 genes (gene-12612, gene- 5563 y gene-10488) fueron acumuladas en bellotas germinadas en comparación con bellotas maduras. El gene-39028 exhibió una mayor acumulación después del tratamiento del metil jasmonato (MeJa) en raíces, implicando que este gen podría ser inducido por este bioestimulante. Como principal conclusión práctica, algunos miembros de las subfamilias QiSBT4 (gene-37794 y gene-3031) y QiSBT1 (gene-27799 y gene-18239) se proponen como buenos candidatos marcadores para programas de mejoramiento basados en la selección de genotipos de élite resistentes al estrés, especialmente los relacionados con el síndrome de la seca y el cambio climático.