Identificación de nuevos componentes de la ruta TOR de Fusarium oxysporum y determinación de su papel en la patogénesis
Autor
Navarro Velasco, Gesabel Yaneth
Director/es
Di Pietro, AntonioEditor
Universidad de Córdoba, Servicio de PublicacionesFecha
2013Materia
HongosFusarium oxysporum
Patogénesis
Infecciones fúngicas
Polilla de la cera
Galleria mellonella
Proteína quinasa TOR
Ruta TOR
METS:
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Mostrar el registro completo del ítemResumen
El crecimiento infeccioso de patógenos fúngicos es controlado por
distintas señales ambientales, tal como el estado de nutrientes. El hongo
Fusarium oxysporum es un patógeno del suelo causante de la marchitez
vascular, una enfermedad que provoca pérdidas importantes en a un amplio
rango de especies de plantas. Además, F. oxysporum es un patógeno
oportunista capaz de producir infecciones en humanos, ello queda reflejado
en el aumento de casos de pacientes inmunodeprimidos con infecciones
sistémicas que, en algunas ocasiones, son letales. La capacidad de una
única cepa de F. oxysporum de causar enfermedad tanto en plantas de
tomate como en ratones inmunodeprimidos hace que esta sirva de modelo
para el análisis genético de la patogenicidad en plantas y animales.
El presente trabajo tuvo como primer objetivo poner a punto el uso de
la polilla de la cera Galleria mellonella como modelo de infección alternativo
al ratón, para profundizar en el estudio de los mecanismos de virulencia de F.
oxysporum en animales. F. oxysporum fue capaz de proliferar en larvas de G.
mellonella y matar al hospedador tras inyectar microconidios en el hemocele.
La mortalidad de las larvas dependía de la dosis de inóculo y fue
significativamente más rápida a 30ºC que a 37ºC. Mutantes de F. oxysporum
previamente examinados en plantas de tomate y ratones inmunodeprimidos
fueron inoculados en Galleria, observándose una buena correlación entre los
dos modelos animales de infección. Por tanto, G. mellonella representa un
sistema útil de coste asumible y éticamente aceptable, para el estudio de los
mecanismos de virulencia de F. oxysporum en animales.
La segunda parte del trabajo se centró en la identificación y
caracterización de distintos componentes de la cascada TOR en
F. oxysporum y el papel de dicha ruta en el desarrollo y la virulencia del
hongo. La proteína quinasa TOR está presente en todos los organismos
eucariotas y controla el crecimiento y la proliferación celular en respuesta a
nutrientes y otros estímulos ambientales. Actualmente se desconoce el papel
de dicha ruta en la patogénesis fúngica. El análisis in silico del genoma de F.
oxysporum, reveló la existencia de genes ortólogos de varios componentes
de la ruta TOR caracterizados en mamíferos y en Saccharomyces cerevisiae.
Para estudiar la función de estos componentes en F. oxysporum, se crearon
una serie de mutantes mediante transformación genética y recombinación
homóloga.
El primer aspecto abordado fue el papel del gen rim15, responsable
de una quinasa regulada negativamente por TOR, que controla la entrada en
la fase de quiescencia G0. Aunque la deleción de rim15 no tuvo un efecto
significativo en el crecimiento y el desarrollo del hongo, si causó una
disminución de los síntomas de enfermedad durante la infección de plantas y
de G. mellonella... Infectious growth in fungal pathogens is controlled by environmental
cues, including nutrient status. The fungus Fusarium oxysporum is a soilborne
pathogen that produces vascular wilt disease on a wide range of different crop
species. F. oxysporum is also considered an opportunistic pathogen able to
cause lethal systemic infections in immunodepressed humans. A single strain
of F. oxysporum can cause disease on tomato plants and immunosuppressed
mice, making of it an ideal model for the analysis of virulence on plant and
animal hosts.
The first goal of the present work was to establish the use of the wax
moth Galleria mellonella as an alternative to the mouse model, to study
virulence mechanisms of F. oxysporum in animal hosts. F. oxysporum was
able to proliferate in larvae of G. mellonella and kill the host when injected as
microconidia into the hemocoel. Mortality depended on the dose of inoculum
and was significantly more severe at 30°C than at 37°C. Fungal gene
knockout mutants previously tested in the tomato and immunodepressed
mouse systems were applied in the Galleria model revealing a good
correlation between the two animal models. Thus, G. mellonella represents a
useful, cost-effective and ethically acceptable system for testing animal
pathogenicity in F. oxysporum.
The second part of this work focused on the identification and
characterization of components of the TOR cascade in F. oxysporum. The
TOR protein kinase is conserved in all eukaryotic organisms and controls
cellular growth and proliferation in response to nutrients and other
environmental factors. Currently, the role of this cellular pathway in fungal
pathogenicity is unknown. In silico analysis of the genome of F. oxysporum
revealed the existence of orthologues of several known components of the
TOR pathway in mammals and Saccharomyces cerevisiae. To study the
function of these components in the development and the virulence of F.
oxysporum, a series of mutants were created by genetic transformation and
homologous recombination.
The first approach was to study the role of Rim15 in F. oxysporum.
Rim15 is a kinase negatively regulated by TOR, that controls entry into the G0
quiescence phase. Although deletion of rim15 did not affect growth and
development of the fungus, it caused an attenuation of disease symptoms
during infection of tomato plants and larvae of G. mellonella.
Moreover, we studied the role of TOR signalling pathway by
generating mutations in four upstream components of TOR: the putative
amino acid transporters Slc1A5 and Slc7A5, the GTPase Gtr1 and the
GTPase regulator Tsc2 (tuberous sclerosis complex 2). Deletion of the genes
slc1a5 or slc7a5 did not affect growth and development of F. oxysporum, but
impaired the ability to use certain amino acids such as leucine, and caused a
decrease in disease symptoms during infection of tomato plants and G.
mellonella. Inactivation of Tsc2 or expression of a constitutively active allele of
gtr1 caused hyperactivation of TOR with distinct phenotypical effects. The...