DNA demethylation through 5-methylcytosine excision. Molecular basis and potential applications

Abstract

La metilación del DNA en el carbono 5 de la citosina (5-metilcitosina, 5-meC) es una marca epigenética estable, pero reversible, que promueve el silenciamiento génico y que desempeña un papel importante en el desarrollo y en la defensa del genoma frente a elementos transponibles. Los patrones de metilación del DNA son el resultado dinámico de procesos de metilación y desmetilación, pero estos últimos todavía no se conocen con detalle en células animales. Sin embargo, en plantas hay convincentes pruebas genéticas y bioquímicas de que proteínas de una familia de DNA glicosilasas escinden 5-metilcitosina e inician una ruta de desmetilación activa del DNA a través de una ruta de reparación por escisión de bases (Base Excision Repair, BER). La proteína ROS1 de Arabidopsis thaliana es una enzima representativa de esta familia, cuyos miembros se caracterizan por presentar un dominio catalítico discontinuo, un dominio carboxilo-terminal muy conservado entre ellas pero de función desconocida, y un dominio amino-terminal básico implicado en la unión inespecífica a DNA. Un primer objetivo de esta tesis ha sido investigar cómo ROS1 y sus homólogos reconocen y escinden su base diana. Los resultados obtenidos muestran que ROS1 intercala tres aminoácidos (Q607, R903 y M905) en la doble hélice para interrogar activamente el DNA en busca de 5-meC y para desestabilizar pares de bases 5-meC:G. Durante este proceso, Q607 frena el deslizamiento de ROS1 a lo largo del DNA. ROS1 elimina 5-meC de varios cientos de genes en tejidos vegetativos, aparentemente para contrarrestar una metilación excesiva. Sin embargo, aún no se conoce cómo se dirige la actividad de ROS1 a regiones concretas del genoma. En la cromatina, el DNA está íntimamente asociado a histonas (H2A, H2B, H3 y H4), cuyas colas aminoterminales sufren diferentes modificaciones post-traduccionales. Un segundo objetivo de esta tesis ha sido determinar si ROS1 interacciona con histonas y la posible relevancia funcional de dicha interacción. Se ha encontrado que el dominio carboxiloterminal de ROS1 se une a las colas amino-terminales de las histonas H2A, H3 y H4. Además, la fosforilación de la Ser28 inhibe de forma específica la interacción con H3, lo que sugiere un posible mecanismo para restringir la actividad de ROS1 a posiciones concretas de la cromatina. La desmetilación dirigida a secuencias concretas es un objetivo importante de la Edición Epigenética, cuyo propósito es modular la expresión génica a través de la sobreescritura de marcas epigenéticas en regiones específicas del genoma. Un tercer objetivo de esta tesis ha sido transformar ROS1 es una herramienta para la edición epigenética mediante la fusión de su dominio catalítico a dominios de unión a DNA específicos, con el fin de dirigir su actividad a secuencias diana deseadas. Proteínas recombinantes que contienen el dominio catalítico de ROS1 fusionado al dominio natural de unión a DNA de GAL4 (GBD-ROS1) o a proteínas artificiales de dedos de zinc (ZFP-ROS1) muestran una unión a DNA y una actividad enzimática preferencial sobre secuencias específicas in vitro. Además, la expresión transitoria de GBD-ROS1 en células animales promueve in vivo la desmetilación dirigida y la consiguiente reactivación de un gen reportero silenciado por metilación. Se requieren estudios adicionales para conseguir resultados similares con ZFP-ROS1 o con un sistema dirigido por RNA basado en CRISPR (dCas9-ROS1). En definitiva, los resultados obtenidos en esta tesis han contribuido a aclarar algunos aspectos del mecanismo de desmetilación activa del DNA en plantas y respaldan la posibilidad de utilizar 5-meC DNA glicosilasas como herramientas para la edición epigenética.

DNA methylation at carbon 5 of cytosine (5-methylcytosine, 5-meC) is a stable but reversible epigenetic mark associated to gene silencing, and plays essential roles in development and genome defense against transposons. DNA methylation patterns are the dynamic outcome of methylation and demethylation processes, but the latter are not yet well understood in animal cells. In plants, however, there is genetic and biochemical evidence that a family of DNA glycosylases excise 5-meC and initiate active DNA demethylation through a base excision repair (BER) pathway. Arabidopsis thaliana ROS1 is a representative enzyme of such family, whose members are uniquely characterized by a discontinuous catalytic domain, a conserved carboxy-terminal domain of unknown function, and a basic amino-terminal domain mediating nonspecific binding to DNA. A first aim of this thesis has been to investigate how ROS1 and its homologs recognize and excise its target base. Results obtained show that ROS1 uses three predicted helix-invading residues (Q607, M905 and R903) to actively interrogate DNA in search for 5-meC and to destabilize 5-meC:G base pairs. During this process, Q607 restrains ROS1 sliding on DNA. ROS1 removes 5-meC at several hundred loci across the genome in vegetative tissues, apparently to counteract excessive methylation. However, it is still unknown how ROS1 activity is directed to specific genomic regions. In chromatin, DNA is intimately associated to core histones (H2A, H2B, H3 and H4), whose N-terminal tails undergo different post-translational modifications. A second major aim of this thesis has been to determine whether ROS1 interacts with histones and the possible functional relevance of such interaction. It has been found that the C-terminal domain of ROS1 binds the Ntails of histones H2A, H3 and H4. Importantly, interaction with H3 is specifically abrogated by phosphorylation of Ser28, which suggests a possible mechanism to restrict ROS1 activity to defined chromatin locations. Targeted demethylation is a major objective of Epigenetic Editing, which aims to modulate gene expression by overwriting of epigenetic marks at specific genome regions. A third major aim of this thesis has been to transform ROS1 in an epigenetic editing tool by fusing its catalytic domain to a specific DNA binding domain, in order to direct its activity to desired target sequences. Recombinant ROS1 fused to either the natural GAL4 DNA Binding Domain (GBD-ROS1) or an engineered zinc finger protein (ZFP-ROS1) displays preferential DNA binding and enzymatic activity on specific sequences in vitro. Transient expression of GBD-ROS1 in human cells elicited targeted demethylation and reactivation of a methylation-silenced reporter gene. Additional studies are needed to achieve similar results with ZFP-ROS1 or with an RNA-guided CRISPR-based system (dCas9-ROS1). Altogether, the results obtained in this thesis shed light onto the mechanisms of active DNA demethylation in plants and support the feasibility of using plant 5-meC DNA glycosylases as epigenetic editing tools.