Estudio del hígado y líquido peritoneal en fases tempranas de ovejas infectadas experimentalmente con Fasciola hepatica

Abstract

La fasciolosis causada por Fasciola hepatica es una enfermedad parasitaria de gran repercusión sanitaria y económica en rumiantes, principalmente en zonas de clima templado. Este parásito ha desarrollado mecanismos capaces de modular o suprimir la respuesta inmunitaria del hospedador, haciéndola inefectiva y permitiendo la instauración crónica del parásito. La investigación de los mecanismos de inmunomodulación de F. hepatica resulta crucial para poder diseñar una vacuna eficaz que pueda solventar el problema de la instauración de resistencias frente a los antihelmínticos tradicionalmente utilizados en el control de esta enfermedad. Se han llevado a cabo numerosos estudios para determinar los mecanismos de respuesta inmunitaria y acción del parásito en las fases crónicas de la enfermedad. Sin embargo, los estudios en las fases tempranas, cuando el parásito atraviesa el intestino y migra hacia el hígado a través del compartimento peritoneal son escasos y casi todos en el modelo murino. El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral es estudiar la respuesta inmunitaria en el compartimento peritoneal y en el hígado en las fases tempranas de infecciones experimentales con F. hepatica en la oveja. Para la consecución de este objetivo, se llevaron a cabo dos experimentos (experimento 1 y experimento 2). En cada experimento se utilizaron 25 ovejas de 8 meses de edad de raza Merina las cuales fueron divididas en 5 grupos (n=5), cuatro de los cinco grupos se infectaron oralmente con una dosis de 150 metacercarias de F. hepatica. Estos grupos fueron eutanasiados a los 1, 3, 9 y 18 días post-infección (dpi). El quinto grupo se utilizó como grupo control no infectado y se sacrificó al final del experimento. Durante la necropsia, se realizaron lavados peritoneales de los animales inmediatamente después de los sacrificios para la recogida del líquido peritoneal y, posteriormente, se tomaron muestras de hígado. En los experimentos 1 y 2, el líquido peritoneal se utilizó para realizar el contaje absoluto y diferencial de los leucocitos peritoneales. Los resultados revelaron un reclutamiento activo de leucocitos hacia la cavidad peritoneal de la oveja en los animales infectados a partir de los 9 dpi, principalmente representado por eosinófilos. Los frotis de células peritoneales se sometieron a la técnica de inmunocitoquímica para determinar la expresión de los marcadores celulares: CD68, CD14, CD206, iNOS, CD83 y MHC-II, los cuales están presentes en macrófagos y en células dendríticas. El aumento significativo en la expresión de CD206 y escasa variación en la expresión de iNOS en los macrófagos peritoneales en ambos experimentos sugieren que existe una polarización hacia un fenotipo de activación alternativa o M2 desde el día uno tras la infección. El aumento significativo en la expresión del marcador CD14 desde el 3 dpi en comparación con el grupo no infectado en ambos experimentos, podría estar relacionado con fenómenos tanto de activación fagocítica en los macrófagos como de fibrosis. En el experimento 1, se observó un aumento en la expresión del marcador de células dendríticas maduras CD83 y del marcador de células presentadoras de antígeno MHC-II desde el 1 dpi. Sin embargo, este hecho no ocurrió de una manera tan obvia en el experimento 2, debido a la elevada variabilidad entre animales. El estudio de la expresión de citoquinas del líquido peritoneal mediante qRT-PCR de ovejas infectadas (18 dpi) y no infectadas del experimento 1, determinó la presencia elevada de las citoquinas IL-10, IL- 12, IL-13, IL-23 y TGF-β en ovejas a los 18 dpi, aunque sin diferencias significativas en comparación con los resultados del grupo control no infectado, indicando que la respuesta inmunitaria en este compartimento no ha sido todavía estimulada hacia una de tipo Th2, asociada con la enfermedad crónica. Con el fin de evaluar la presencia de posibles biomarcadores en la infección temprana con F. hepatica, se realizó un estudio de proteómica con muestras del líquido peritoneal y de inmunohistoquímica con muestras de hígado de los animales infectados y sacrificados a los 18 dpi y de los animales control no infectados del experimento 1. En el estudio proteómico del líquido peritoneal se identificaron proteínas relacionadas con la infección, incluyéndose diversas proteínas estructurales derivadas de la matriz extracelular hepática, relacionadas con el tejido conectivo y el epitelio, y proteínas relacionadas con el sistema inmunitario. Cabe destacar el marcado aumento de la proteína periostina en el líquido peritoneal y en el citoplasma de los hepatocitos localizados alrededor de los focos necróticos de animales infectados a los 18 dpi. Se ha relacionado que la periostina podría ser un biomarcador de respuestas inflamatorias de tipo Th2 en las que están involucradas los eosinófilos. El origen de la presencia de esta proteína en el líquido peritoneal podría ser el propio tejido hepático dañado por el parásito o los eosinófilos peritoneales, estando esta proteína involucrada en procesos de fibrosis. La molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) también fue identificada mediante proteómica, estando presente de manera abundante en el líquido peritoneal de ovejas infectadas (18 dpi) y, además, se observó una marcada expresión en el tejido hepático. Esta proteína se asocia con procesos crónicos y podría estar involucrada, junto con la periostina, en la mediación del reclutamiento leucocitario que tiene lugar en la cavidad peritoneal, estando también relacionadas con desórdenes inflamatorios caracterizados por una eosinofilia marcada.

Fascioliasis is a parasitic disease caused by Fasciola hepatica with important sanitary and economic repercussion on ruminants in temperate zones. This parasite has developed mechanisms that are able to suppress the host immune response, thus allowing the establishment of the parasite and resulting in chronic disease. Research based on the understanding of F. hepatica immunomodulatory mechanisms is crucial for the designing of an effective vaccine to solve the issue of the emerging resistance to the traditionally use of antihelmintic drugs. Numerous studies have been carried out to determine the modulatory effects of the parasite in the chronic phase of the disease. However, studies in the early stages of the infection are scarce and mostly focused on murine models. The principal aim of this Thesis is to study the immune response to F. hepatica infection in the early stages of infection within the peritoneal compartment and liver in sheep. Two experiments were carried out, namely experiment 1 and experiment 2. In each experiment, twenty-five 8-month-old Merino-breed sheep were used for each experiment and were allocated into five groups (n = 5). Four of the five groups were orally infected with a dose of 150 metacercariae of F. hepatica and euthanized at 1, 3, 9 and 18 days postinfection (dpi). The fifth additional group was used as uninfected control. During the necropsy, peritoneal lavages were performed and liver samples were taken. In experiments 1 and 2, absolute and differential number of peritoneal leucocytes were obtained. The absolute number of leucocytes increased from 9 dpi onwards in both experiments compared to the uninfected control group, being these leucocytes mainly composed by eosinophils. These results suggest that there is an active recruitment of leucocytes into the peritoneal cavity at these eary stages of infection. The peritoneal cells were fixed in smears and subjected to the immunocytochemistry technique to assess the following cellular markers: CD68, CD14, CD206, iNOS, CD83 and MHC-II. Macrophages and dendritic cells were considered for the immunocytochemical assessment. Peritoneal macrophages showed a marked increase in CD206 expression since one dpi onwards in both experiments respect to the uninfected control group, while mild change in iNOS expression was found along the infection in both experiments. These results suggest that a polarization towards an alternative phenotype (M2) was taking place in peritoneal macrophages from the first dpi onwards. The expression of CD14 increased since 3 dpi onwards in macrophages from both experiments comparing with the uninfected control group, which may be due to an increase in the macrophage activity related to tissue repair and phagocytosis. In experiment 1, there was an increase in the expression of the mature dendritic cell marker CD83 and the antigen-presenting cell marker MHC-II since one dpi onwards compared to the uninfected control group. Nevertheless, this fact was not found in experiment 2, perhaps due to the high individual variability found between sheep of the same group. In experiment 1, a study of the peritoneal fluid of infected (18 dpi) and uninfected sheep was carried out using the qRT-PCR technique. Cytokines IL-10, IL-12, IL-13, IL-23 and TGF-β gene expression showed a tendency to be enhanced with respect to the uninfected control group. Nevertheless, no statistical differences were found, suggesting that the immune response has not yet been skewed towards a Th2 type, associated with chronic disease. With the aim of evaluating the presence of possible biomarkers in the early infection with F. hepatica, a proteomic study using peritoneal fluid together with an immunohistochemical study with liver samples from infected (18 dpi) and non-infected animals from experiment 1 was conducted. Proteomic analysis of the peritoneal fluid identified infectionrelated proteins, including several structural proteins derived form the liver extracellular matrix, connective tissue and epithelium, and immune systemrelated proteins. A marked increase in the amount of periostin protein in the peritoneal fluid and in the cytoplasm of the hepatocytes located around the necrotic foci of infected animals at 18 dpi was observed. It has been pointed out that periosin could be a biomarker for Th2 type immune reponses in which eosinophils are involved. The vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) was also identified by proteomics, with marked increase at 18 dpi respect to the uninfected control group and strong expression within the liver tissue. This protein has been associated with chronic processes and could be involved, along with periostin, in the mediation of leucocyte recruitment that takes place in the peritoneal cavity of infected animals, being also present in inflammatory disorders characterized by marked eosinophilia.