The effect of increasing temperature on olive trees (Olea europaea L. subsp. europaea) biology: An integrated morphological, phenological and biomolecular study

Abstract

This Doctoral Thesis is focused on olive tree (Olea europaea L. subsp. europaea), the dominant tree crop over large areas of the Western Mediterranean Basin, with a production of 20,872,788 tonnes in 2018. Olive oil is appreciated worldwide because of its chemical composition, nutraceutical value, and organoleptic properties. Like most crops, the olive tree is facing important problems and challenges related to adverse environmental conditions, either biotic or abiotic ones, a situation that can be worsened in a climate change scenario. Hence, understanding the physiological and molecular basis/mechanism of olive tree adaptability and resilience to different environmental stresses, especially to high temperature, is crucial for predicting the consequences of climate warming, for implementing agricultural practices, designing classic or biotechnological breeding programs, and, lately, increasing its production in order to cope with the current demand. In the present work, both the effect and the responses to an increase of 4 °C above ambient temperature have been studied at phenological, physiological and molecular,-omics, levels, in an attempt to integrate all the results in the novel Systems Biology direction. The use of the –omics techniques (transcriptomics, proteomics, and metabolomics), and its integration with physiological and phenological studies constitute the great novelty of this work. It has required an important effort in optimizing different protocols for transcriptome (RNA isolation and qRT-PCR), proteome (shotgun nLC-MS/MS Orbitrap), and metabolome (UHPLC-MS/MS Q-tof) profiling, together with computational tools for the identification and quantification of the different biomolecules, their functional classification, statistical analysis, clustering and networking. Both newly developed tools and knowledge generated will establish the basis for ongoing and future studies to obtain a better understanding of the molecular mechanisms mediating phenotypes of interest (productive, tolerant to environmental cues, nutraceutical value and the selectionof genotypes more resilient to climate warming). The manuscript has been organized and presented in nine chapters as follows: Chapter I summarises the state of the art of the topics covered in this thesis: the experimental system, objectives, hypothesis and methodologies. It starts with the description of the olive tree as a plant species and crop, its economic and cultural importance, problems and challenges related to its cultivation. The chapter continues with the description of, and publications on, environmental stresses with an emphasis on warming temperatures and the denominated “Climate Change”. Responses and mechanisms of tolerance to temperature stress and climate warming will be discussed. This chapter finishes with the description of the methodology employed and the integration of the different approaches. Chapter II presents the general and specific objectives of the Thesis. Chapter III corresponds to two published papers on the warming effect on olive tree phenology: “An approach to global warming effects on flowering and fruit set of olive trees growing under field conditions” and “Global warming effects on yield and fruit maturation of olive trees growing under field conditions” Both were published in Scientia Horticulturae. They present alterations in the flowering and ripening processes, caused by the permanent thermal increase of 4oC above ambient temperatura (AT) applied to adult olive trees (cv. `Picual´) growth underfield conditions. In this chapter, three years were surveyed, analysed and data analysed in relation to climate conditions. In general, earlier and prolonged flowering and ripening were observed under warmer (AT+4oC) conditions. Temperature increase reduced the quantity of perfect (well- developed) flowers and fruits. A decrease in oil quality-related chemical parameters (fat, phenolics, and anthocyanins) was observed under thermal increase conditions. Chapter IV corresponds to two published papers on the effect of different temperature regimes in roots and shoots of olive tree seedlings (cv. Arbequina), a plant growth chamber experiment: “Effect of moderate high temperature on the vegetative growth and potassium allocation in olive plants” and “Effects of olive root warming on potassium transport and plant growth” They were published in Journal of Plant Physiology. The effect of differential thermal 37oC /25oC, exposurebetween root and aerial parton growth, and K uptake and transport were evaluated. At 37oC root, 25oC shoot, potassium uptake increased. 37 °C in both organs inhibited growth, reduced K uptake and transport, and diminished water content. Chapters V, VI and VII are devoted to the different –omics approaches (proteomics, transcriptomics and metabolomics) employed in the molecular study of the effect and responses to warming temperature (+ 4oC) in fruit pulp at three ripening stages: green (0), turning red (called veraison) (3) and purple epicarp (4). A discrepancy between the colouring of the skin, traditionally observed as a reference for phenology studies and harvesting, and the olive pulp’s internal ripeness stage and chemical composition has been found. The veraison stage was the one most affected by the temperature increase. Overall, a reduction in the abundance of major compounds related to olive oil quality (lipids, phenylpropanoids, flavonoids, and terpenes) was observed under warming conditions. Chapter VIII contains an integration of all the data, and a general discussion, with focus on those most relevant parameters from an agronomic point of view, those related to crop productivity, either from a quantitative (fruit production) or qualitative (fruit chemical composition) perspective. Based on the present study, a predictive hypothesis on the olive tree situation and production in a future climate change scenario is presented, proposing alternative management practices to deal with the social demand for this crop. Chapter IX corresponds to the conclusions.

Esta Tesis Doctoral se centra en el olivo (Olea europaea L. subsp. europaea), el cultivo arbóreo dominante en grandes áreas de la cuenca del Mediterráneo Occidental, con una producción de 20.872.788 toneladas en 2018. El aceite de oliva es apreciado en todo el mundo por su composición química, su valor nutracéutico y sus propiedades organolépticas. Como la mayoría de los cultivos, el olivo se enfrenta a importantes problemas y desafíos relacionados con las condiciones ambientales adversas, ya sean bióticas o abióticas, situación que puede empeorar en un escenario de cambio climático. Por lo tanto, comprender la base/mecanismo fisiológico y molecular de la adaptabilidad y resiliencia del olivo a las diferentes tensiones ambientales, especialmente a altas temperaturas, es crucial para predecir las consecuencias del calentamiento climático, implementar prácticas agrícolas, diseñar programas de mejoramiento genético clásicos o biotecnológicos y, en los últimos tiempos, aumentar su producción a fin de hacer frente a la demanda actual. En el presente trabajo se han estudiado tanto el efecto como las respuestas a un aumento de 4 °C por encima de la temperatura ambiente a nivel fenológico, fisiológico y molecular, -ómico, en un intento de integrar todos los resultados en la nueva dirección de la Biología de Sistemas. El uso de las técnicas de la -ómica (transcriptómica, proteómica y metabolómica) y su integración con estudios fisiológicos y fenológicos constituyen la gran novedad de este trabajo. Se ha solicitado un importante esfuerzo en la optimización de diferentes protocolos de perfiles de transcriptoma (aislamiento de ARN y qRT-PCR), proteoma (Orbitrap de escopeta nLC-MS/MS) y metaboloma (UHPLC-MS/MS Q-tof), junto con herramientas computacionales para la identificación y cuantificación de las diferentes biomoléculas, su clasificación funcional, análisis estadístico, clustering y networking. Tanto las herramientas de nuevo desarrollo como los conocimientos generados sentarán las bases de los estudios en curso y futuros para obtener una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que median los fenotipos de interés (productivos, tolerantes a las señales ambientales, de valor nutracéutico y a la selección de genotipos más resistentes al calentamiento climático). El manuscrito ha sido organizado y presentado en nueve capítulos como a continuación se detallan: El capítulo I resume el “estado del arte” de los temas tratados en esta tesis, el sistema experimental, los objetivos, las hipótesis y las metodologías. Comienza con la descripción del olivo, como especie vegetal y cultivo, su importancia económica y cultural, problemas y retos relacionados con su cultivo. El capítulo continúa con la descripción y publicaciones sobre el estrés ambiental con énfasis en el calentamiento de las temperaturas y el denominado "Cambio Climático". Se discutirán las respuestas y los mecanismos de tolerancia al estrés de la temperatura y al calentamiento climático. Este capítulo finaliza con la descripción de la metodología empleada y la integración de los diferentes enfoques. En el capítulo II se presentan los objetivos generales y específicos de la Tesis. El capítulo III corresponde a dos artículos publicados sobre el efecto de calentamiento en la fenología del olivo: "Una aproximación a los efectos del calentamiento global sobre la floración y el cuajado de los olivos que crecen en condiciones de campo". y "Efectos del calentamiento global sobre el rendimiento y la maduración de los frutos del cultivo del olivo en condiciones de campo". Ambos fueron publicados en Scientia Horticulturae. Presenta alteraciones en los procesos de floración y maduración, causadas por un aumento térmico permanente de 4 °C por encima de la temperatura ambiente (AT) aplicada a olivos adultos (cv. `Picual´) en condiciones de campo. En este capítulo se han estudiado, analizado y analizado los datos relativos a las condiciones climáticas durante tres años. En general, se observó una floración y maduración más temprana y prolongada en condiciones más cálidas (AT+4 °C). El aumento de la temperatura redujo la cantidad de flores y frutos perfectos (bien desarrollados). Se observó una disminución de los parámetros químicos relacionados con la calidad del aceite (rendimiento graso, fenólicos y antocianos) en condiciones de aumento térmico. El capítulo IV corresponde a dos artículos publicados sobre el efecto de los diferentes regímenes de temperatura en las raíces y brotes de las plántulas de olivo (cv. `Arbequina´), un experimento de cámara de crecimiento vegetal: "Efecto de las altas temperaturas moderadas sobre el crecimiento vegetativo y la asignación de potasio en las plantas de olivo". y "Efectos del calentamiento de la raíz del olivo en el transporte de potasio y el crecimiento de las plantas" Ambos fueron publicados en Journal of Plant Physiology. Se evaluó el efecto de la diferencia térmica de 25 °C/37 °C, la exposición entre la raíz y la parte aérea sobre el crecimiento, y la absorción y el transporte de K+. En la raíz a 25 °C, brote a 37 °C, la absorción de potasio aumentó. 37 °C en ambos órganos inhibió el crecimiento, redujo la absorción de K+ y el transporte, y disminuyó el contenido de agua. Los capítulos V, VI y VII están dedicados a los diferentes enfoques -ómicos (proteómica, transcriptómica y metabolómica) empleados en el estudio molecular del efecto y las respuestas al calentamiento de la temperatura (+4 °C) en la pulpa del fruto en tres etapas de maduración: verde (0), rojo (llamado envero) (3) y epicarpio púrpura (4). Se ha encontrado una discrepancia entre la coloración de la piel, tradicionalmente observada como referencia para los estudios fenológicos y la recolección, y la fase de maduración interna de la pulpa de la aceituna y la composición química. La fase de envero fue la más afectada por el aumento de temperatura. En general, se observó una reducción en la abundancia de los principales compuestos relacionados con la calidad del aceite de oliva (lípidos, fenilpropanoides, flavonoides y terpenos) en condiciones de calentamiento. El capítulo VIII contiene una integración de todos los datos y una discusión general, centrada en los parámetros más relevantes desde el punto de vista agronómico, relacionados con la productividad de los cultivos, ya sea desde el punto de vista cuantitativo (producción de fruta) o cualitativo (composición química de la aceituna). A partir del presente estudio se presentan hipótesis predictivas sobre la situación del olivo y la producción en un futuro escenario de cambio climático, proponiendo prácticas de gestión alternativas para hacer frente a la demanda social de este cultivo. El capítulo IX corresponde a las conclusiones.