Redox regulation of proteome, metabolism and signaling in hepatocarcinoma tumor cells

Abstract

The redoxins Thioredoxin (Trx), Glutaredoxin (Grx) and Peroxiredoxins (Prdx) play a very important role both in the maintenance of redox homeostasis and in signaling through reversible oxidation/reduction reactions in cysteine residues key to the regulation of protein function. The main objective of this project is to demonstrate that redoxins exert a role in the control of metabolic flux of tumor cells by regulating the redox state of metabolic enzymes and proteins involved in cell signaling. To study the functions of human Trx1 and Grx1, we have used the hepatocarcinomaderived HepG2 cell line as an experimental model under both normal and oxidative/nitrosative conditions. We have shown that silencing of Trx1 or Grx1 causes major changes in the redox proteome reflected in significant changes in the reduced/oxidized ratio of enzyme cysteines such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Cys247 and triosephosphate isomerase (TPI) Cys255 that affect their activity. Trx1 silencing increases glycolytic flux and induces membrane remodelling as indicated by the increase in sphingomyelins and ceramides. On the other hand, Grx1 silencing decreases the glycolytic fluxand increases the synthesis of fatty acids and phospholipids stimulating lipogenesis. These results indicate that, although both redoxins have some common target cysteines, their down-regulation causes different metabolic changes. Among the redox targets of Grx1 is the “extra” non-peroxidatic Cys91, of Prdx6, the only member of the 1-Cys peroxiredoxin family in humans, which in addition to having characteristic peroxidase activity is the only one that also has phospholipase A2 activity calcium independent (iPLA2). Prdx6 silencing in HepG2 cells decreases proliferation and increases cell volume without changing the number of cells; decreases the rate of glucose entry and nucleotide biosynthesis while the levels of amino acids, polyamines, phospholipids and most glycolipids increase. Changes in the global proteome reflect an increase in vesicle traffic while the redox proteome shows changes in various enzymes among which are hexokinase 2 (HK2) Cys368, phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (PCK2) Cys55-63, and 3-phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH) Cys18-19 and Cys281. These results indicate that Prdx6 silencing induces both a predominant metabolic remodelling towards a glyconeogenic flow from amino acids with diversion at the synthesis of serine and other biosynthetic pathways, as well as cell cycle arrest at G1/S transition. It remains to be determined which Prdx6 activity is responsible for these effects, whether its peroxidase or PLA2 or both and what are the detailed mechanisms that lead to these effects The next step has been to verify whether these actions of the studied redoxins also take place in advanced states of hepatocarcinoma in which resistance to the standard treatment with Sorafenib is frequent. In line with this, a study has been carried out in three hepatocarcinoma cell lines with different degrees of epithelialmesenchymal transition and therefore with increasing invasive potential and malignancy (HepG2, SNU423 and SNU475), treated with Sorafenib and/or silenced for Trx1. This drug is jnown as a tyrosine kinase inhibitor and we have observed that treatment with Sorafenib induces reductive changes in key tumor signaling proteins, such as STAT3, MAPK and Akt, in the three cell lines but large changes in the global proteome have only been seen in cells of intermediate dedifferentiation state (SNU423). Silencing of Trx1 does not have a great effect on the overall proteome of the three cell lines but it does counteract the reducing effect of Sorafenib on a thiol group at STAT3 and sensitizes the more mesenchymal hepatocarcinoma cell line (SNU475) against Sorafenib, inactivating TGFß1 pathway and stimulating HIPPO signaling. Therefore, these results support the idea that the combined treatment of Sorafenib with Trx1 inhibitors could help to design more effective therapies against advanced hepatocarcinoma resistant to Sorafenib.

Las redoxinas Tiorredoxina (Trx), Glutarredoxina (Grx) y Peroxirredoxina (Prdx) juegan un papel muy importante tanto en el mantenimiento de la homeostais redox como en señalización a través de reacciones de oxido/reducción reversibles en residuos de cisteína claves para la regulación de la función de la proteína. El objetivo principal de este proyecto es estudiar las funciones de las redoxinas en señalización celular y metabolismo en líneas celulares derivadas de hepatocarcinoma sometidas o no a altos niveles de óxido nítrico. Para el estudio de las funciones de la Trx1 y Grx1 hemos empleado como modelo experimental la línea celular derivada de hepatoblastoma (HepG2) bajo condiciones normales y de estrés oxidativo/nitrosativo. Hemos demostrado que el silenciamiento de Trx1 o Grx1 provoca grandes cambios en el proteoma redox tiólico reflejado en cambios significativos en la ratio reducido/oxidado de cisteínas de enzimas como la Cys247 de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y Cys255 de la triosafosfato isomerasa (TPI) los cuales afectan a la actividad de dichas enzimas. El silenciamiento de Trx1 aumenta el flujo glucolítico e induce remodelamiento de la membrana lipídica como indica el incremento de esfingomielinas y ceramidas. Por otro lado, el silenciamiento de Grx1 disminuye el flujo glucolítico y aumenta la síntesis de ácidos grasos y fosfolípidos estimulando lipogenesis. Los resultados indican que, a pesar de que ambas redoxinas tengan algunas cisteínas diana comunes, su silenciamiento provoca cambios metabólicos diferentes. Entre las dianas redox de la Grx1 se encuentra la Cys91, no peroxidática, de la Prdx6, el único miembro de la familia de las peroxiredoxinas de 1-Cys en humanos, que además de poseer la actividad peroxidasa característica, es la única que presenta actividad actividad fosfolipasa A2 independiente de calcio (iPLA2). El silenciamiento de Prdx6 en HepG2 disminuye la proliferación y el número de células mientras que el volumen celular aumenta. Además la entrada de glucosa y la biosíntesis de nucleótidos disminuyen mientras que los niveles de amino ácidos, poliaminas, fosfolípidos y la mayoría de glicolípidos aumentan. El efecto del silenciamiento de Prdx6 sobre el proteoma global muestra un aumento en el tráfico de vesículas mientras que el proteoma redox muestra cambios en diversas enzimas de rutas metabólicas entre las que se encuentran la Cys368 de la hexoquinasa 2 (HK2), la Cys55-63 de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 2 (PCK2), y las Cys18-19 y Cys281 de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH). Los resultados indican que el silenciamiento de Prdx6 induce tanto un remodelamiento metabólico predominante hacia gluconeogénesis desde amino ácidos con desviación hacia la síntesis de serina y otras vías biosintéticas, así como detención del ciclo celular en la transición G1/S. Está por determinar qué actividad de la Prdx6 es responsable de estos efectos, si su peroxidasa o la PLA2 o ambas y cuáles son los mecanismos detallados que conducen a esos efectos. El siguiente paso ha sido comprobar si estas acciones de las redoxinas estudiadas tienen lugar igualmente en estados avanzados de hepatocarcinoma en los que se suele dar una resistencia al tratamiento estándar con Sorafenib. En línea con esto, se ha llevado a cabo un estudio en tres líneas celulares de hepatocarcinoma con distinto grado de transición epitelio-mesenquimal y por tanto, con mayor potencial de invasividad y malignicidad (HepG2, SNU423 y SNU475), tratadas con Sorafenib y/o silenciando la Trx1. El Sorafenib es un medicamento conocido por su actividad como un inhibidor de tirosinas quinasas y nosotros hemos observado que el tratamiento con Sorafenib induce cambios reductores en proteínas clave de señalización tumoral, tales como STAT3, MAPK y Akt, en las tres líneas celulares pero los grandes cambios en el proteoma global se han visto únicamente en células en estado intermedio de desdiferenciación (SNU423). El silenciamiento de Trx1 no tiene un gran efecto en el proteoma global de las tres líneas pero sí contrarresta el efecto reductor del Sorafenib sobre un grupo tiol de STAT3 y sensibiliza a las células de hepatocarcinoma más mesenquimales (SNU475) frente al Sorafenib, inactivando la vía de TGFß1 y estimulando la vía de señalización HIPPO. Por lo tanto, los resultados apoyan la idea de que el tratamiento combinado de Sorafenib con inhibidores de la Trx1 podría ayudar al diseño de terapias más efectivas contra el hepatocarcinoma en estado avanzado resistente a Sorafenib.