Interacción Patógeno-Hospedador en la salmonelosis porcina. Modulación de la respuesta inmune intestinal por Salmonella y mecanismos de persistencia

Abstract

El establecimiento de medidas de control eficientes que reduzcan la prevalencia de Salmonella en cerdos, principalmente el serotipo S. Typhimurium, es importante para disminuir la incidencia de esta zoonosis y para mejorar la sanidad animal. Para implementar nuevas estrategias de prevención es imprescindible conocer en profundidad la naturaleza de la interacción patógeno-hospedador. El uso de técnicas "ómicas" de vanguardia abre nuevos enfoques para abordar esta interacción en las enfermedades infecciosas. El estudio de la salmonelosis generalmente se ha abordado centrándose en el comportamiento de virulencia del patógeno o la respuesta inmune del hospedador por separado. En esta tesis doctoral se planteó como objetivo general profundizar en el conocimiento de los mecanismos de infección de S. Typhimurium, así como en la reacción del hospedador a dicha infección. Para abordar este objetivo se usaron modelos de infección in vivo e in vitro. En primer lugar se realizó un estudio histológico y molecular que evaluó factores como la colonización intestinal, la diseminación de la bacteria en heces y la persistencia de la bacteria. En él se analizaron muestras de los diferentes tramos del intestino y el tejido linfoide asociado (nódulos linfáticos mesentéricos, NLMs) tras una infección experimental in vivo de 30 días de duración con S. Typhimurium, definiendo 2 días post infección (d.p.i.) como el punto fuerte de la infección en todos los tejidos analizados y encontrando a 30 d.p.i. marcaje de Salmonella en las trabéculas de los NLMs. Para analizar el perfil transcripcional de patógeno y hospedador en el sistema gastrointestinal durante la infección, se realizaron estudios mediante dual RNA-seq de mucosa de íleon porcino y NLMs regionales. En íleon infectado a 2 d.p.i. observamos la sobreexpresión de genes inflamatorios que indican la presencia de una intensa respuesta inflamatoria mediada por IL1 y TNFa, así como la subexpresión de genes regulados por la ruta de señalización de FXR relacionados con la inhibición del ciclo de absorción de las sales biliares. Para investigar en profundidad el papel de las células epiteliales intestinales, se realizó un estudio in vitro de infección de la línea celular IPI-2I tras 24 horas de infección. Se vio en el hospedador una elevada respuesta inflamatoria mediada por NF-κB y la alteración de la expresión de genes relacionados con la ruta de la autofagia (familias ULK y ATG). Por otro lado, los genes sobreexpresados del patógeno indicaron la presencia de una gran cantidad de efectores de las SPI-1 y SPI-2, a su vez englobados en funciones tan importantes como la invasión celular, la inmunomodulación y la formación de la vacuola que contiene Salmonella (SCV). Ensayos funcionales demostraron que cuando se inhibe la autofagia, la capacidad de replicación intracelular de Salmonella es limitada. La respuesta a la infección en nódulos linfáticos regionales se abordó mediante el estudio de la respuesta transcriptómica en nódulos linfáticos mesentéricos (NLMs) porcinos infectados a 2 y 30 d.p.i., con S. Typhimurium. Inicialmente, la expresión diferencial de genes relacionados con la respuesta inmunitaria fue analizada y correlacionada con cambios en la morfología tisular y carga del patógeno, revelando una abundante infiltración de células fagocíticas y la sobreexpresión de genes proinflamatorios a 2 d.p.i., que desaparece a 30 d.p.i. Se observó una fuerte respuesta inflamatoria a consecuencia del reconocimiento mediado por TLR y la activación del inflamasoma, que contribuyen a la activación de la respuesta innata y muerte celular por piroptosis, procesos que desaparecen a 30 d.p.i. Mediante ensayos de presentación antigénica, se demostró la existencia de presentación cruzada, indicando que antígenos de Salmonella son presentados en moléculas MHC de clase I, dependientes de la activación del proteasoma.

The establishment of efficient control programs for reducing prevalence and infection of Salmonella in pigs (mainly the S. Typhimurium serotype) is important to reduce the incidence of this zoonosis and to improve animal health. An effective management of this disease involves the knowledge and investigation of the host-pathogen interactions. The use of cutting-edge "omics" techniques in host-pathogen interactions opens up new approaches and lines of research to address infectious diseases. The study of salmonellosis has usually been addressed by focusing on either the virulence behavior of the pathogen or on the host immune response, separately. Due to this, this doctoral thesis proposed to deepen on the knowledge of the mechanisms of infection of S. Typhimurium, and to describe the routes and molecular interactions involved in the immune response prompted by the host. To pursue this objective, in vivo and in vitro study models were used. First, a histological and molecular study was performed to evaluate infection factors, such as intestinal colonization, the spread of bacteria in feces and the persistence of bacteria in tissues. Samples of the different sections of the intestine and associated lymphoid tissue (mesenteric lymph nodes, MLNs) were analyzed after a 30-day in vivo experimental infection with S. Typhimurium, defining 2 days post infection (d.p.i) as the strongest point of infection in all the tissues analyzed and finding that at 30 d.p.i. Salmonella persisted on the trabeculae of the MLNs. For analyzing the transcriptional profile of pathogen and host in the gastrointestinal system during infection, we evaluated using dual RNA-seq the porcine ileum and regional MLNs. In infected ileum at 2 d.p.i. we observed an intense IL1 and TNFa mediated inflammatory response, as well as repression of genes regulated by the FXR signaling pathway, which inhibits the bile acid absorption. To further investigate the role of intestinal epithelial cells, we performed an in vitro 24h infection study on the IPI-2I cell line. The data obtained from the host indicated the presence of a high inflammatory response mediated by NF-κB and the alteration of the expression of genes related to the autophagy route (ULK and ATG families). On the other hand, differentially expressed genes obtained from the pathogen indicated the presence of a large number of SPI-1 and SPI-2 effectors, which are involved in such important functions such as cell invasion, immunomodulation and the formation of Salmonella containing vacuole (SCV). Functional studies demonstrated that when autophagy is inhibited, intracellular replication of Salmonella is limited. Response to infection in regional lymph nodes was investigated by obtaining the transcriptional profile of infected MLNs at 2 d.p.i. and 30 d.p.i. Initially, the differential expression of genes related to the immune response was analyzed and correlated with changes in tissue morphology and pathogen load. Results revealed abundant phagocytic cell infiltration and overexpression of proinflammatory genes at 2 d.p.i., which disappears at 30 d.p.i. A strong TLR-mediated inflammatory response and inflammasome activation were found, contributing to innate response activation and cell death by pyroptosis (processed that at 30 d.p.i. are no longer overexpressed). By means of antigenic presentation assays, we demonstrated the cross-presentation phenomenon, indicating that Salmonella antigens are presented by MHC class I molecules dependent on proteasome activation.