Analysis of the roles of kisspeptins and the tachykinin receptor, Tacr2, in the control of Reproduction: novel interactive pathways, regulatory mechanisms and metabolic implications

Abstract

For sake of clarity, this Doctoral Thesis has been divided in 3 main experimental sets: In the Experimental Set 1, a comprehensive series of phenotypical, pharmacological, behavioral and histological analyses were conducted in a novel mouse line with congenital ablation of Tacr2, namely, the Tacr2 KO mouse, to unravel the physiological role of neurokinin 2 receptor (NK2R) signaling, and its eventual interplay with kisspeptins, in the control of the HPG axis. Our initial pharmacological studies documented the capacity of the agonist of NK2R to evoke acute LH responses after icv administration in control mice, which was comparable with those elicited by the other TAC agonists as well as kisspeptin (Kp-10). Similar pharmacological studies in Tacr2 KO mice revealed that the LH responses to the NK1R and NK3R receptor agonists and Kp-10 were not affected by Tacr2 ablation. On the contrary, the LH response to a NK2R agonist was sexually dimorphic, so that Tacr2 KO female mice displayed an attenuated LH response while, despite effective ablation of NK2R, Tacr2 KO male mice displayed a grossly conserved LH responsiveness to NK2R agonist, which, nonetheless, was abrogated after blockade of NK3R. Next, we carried out a thorough reproductive characterization of Tacr2 null mice of both sexes, which documented that the congenital lack of NK2R signaling does not compromise the timing of puberty onset or the fertility either in males or females. Yet, a trend for increased breeding intervals together with partially alteration in LH pulsatility were observed in Tacr2 KO female mice in adulthood; the latter consisting in the suppression of basal LH levels, but no changes in the number of LH pulses. On the other hand, histological analyses suggested the existence of a defective function of Sertoli cells in their interaction with spermatids in adult Tacr2 KO male, but no gross morphological alterations in the ovary or the uterus of females KO mice. In addition, Tacr2 KO female mice failed to display a significant increase of LH levels at 2 days after ovariectomy (OVX), although no differences were detected at later periods, nor did OVX Tacr2 KO female mice showed differences in terms of tail skin temperature as compared with littermate controls. On the other hand, LH levels in Tacr2 KO mice subjected to conditions of energy deficit caused by 24-h fasting were significantly lower than in controls. A three-chamber social sex preference and female urine sniffing tests were also applied to adult male and female null mice and their controls. Yet, no differences in any of the behavioral parameters explored, including velocity, distance moved and time spent in the vicinity of the same or opposite-sex mouse, were noted between control and KO mice. Additionally, to assess the impact of the lack of NK2R signaling on key metabolic parameters, we monitored body weight gain in both adult female and male Tacr2 KO mice, which was similar to that of control littermates. Likewise, body composition analyses demonstrated similar fat and lean mass in Tacr2 KO and control mice; energy expenditure and respiratory quotient, total and nocturnal locomotor activity, and the day/night feeding patterns during 24 hours were also similar in control and Tacr2 KO mice. Moreover, measurement of blood pressure demonstrated that Tacr2 KO mice display values of systolic blood pressure similar to their control littermates. Finally, metabolic analyses addressing glucose homeostasis after challenge mice with an obesogenic diet revealed a significant increase in the basal glucose levels in Tacr2 KO males. In the Experimental Set 2, a series of proteomic, molecular and immunohistochemical analyses were implemented using genetically modified mouse lines to explore novel targets mediating kisspeptins actions. We performed a first proteomic analysis in samples from the preoptic area (POA) of Kiss1 KO male mice icv injected with Kp-10, which pointed out a set of 30 differentially-expressed proteins involved in cellular metabolism and energy balance, cell signaling, protein folding and synaptic plasticity; the later revealed that glial fibrillary acidic protein (GFAP), an astrocyte marker, was modified in response to Kp-10. In a second proteomic analysis using a next-generation technology, we found that astrocyte markers including GFAP were again modified in response to Kp-10; a finding that was also confirmed by RT-qPCR and western blot analyses. These findings led us to analyze and demonstrate for the first time the expression of Gpr54 and the presence of functional kisspeptin receptors in astrocytes. On the latter, we found in both primary astrocyte cultures from neonatal rats and mice the activation of downstream signaling pathways in response to kisspeptin. Our data also demonstrated the co-expression of Gpr54 in GFAP-positive cells in mouse brain tissue, with a substantial enrichment in the % of co-location in the hypothalamic regions of the vascular organ of lamina terminalis (VOLT) and anteroventral periventricular nucleus (AVPV). In addition, in two models of congenital ablation of Gpr54, we observed changes in astrocytic GFAP labelling by immunohistochemistry in the arcuate nucleus (ARC) of these mouse models, although immunoreactivity of S100 calcium binding protein B (S100β), another astrocytic marker protein, was not affected. Finally, in the Experimental Set 3, a series of phenotypic and pharmacological analyses were conducted in a novel mouse line with selective ablation of Gpr54 in GFAP-positive cells, namely, the G-KiRKO mouse (for GFAP cell-specific Kisspeptin Receptor KO), to evaluate the physiological role of kisspeptin signaling in astrocytes in the control of the reproductive axis. First, we carried out a set of molecular and immunohistochemical analyses that involved the use of a reporter mouse line and primary astrocyte cultures for the validation of our GKiRKO model. These analyses confirmed effective ablation of Gpr54 in astrocytes. However, despite the effective disruption of kisspeptin signaling in astrocytes, characterization of GKiRKO mice revealed normal pubertal timing, and preserved LH levels and estrous cyclicity in the adulthood of G-KiRKO mice. Yet, challenging of G-KiRKO mice with icv injection of Kp-10 demonstrated an enhancement of LH responses, suggesting a repressive role of astrocyte signaling in mediating kisspeptin actions in terms of gonadotropin secretion. The measurement of the metabolic parameters (i.e., body weight gain and body composition analysis) did not show differences in G-KiRKO vs. control mice. Nevertheless, the glucose tolerance test (GTT) revealed a subtle improvement of the response to a glucose bolus in GKiRKO mice, without showing alterations in insulin sensitivity. On the other hand, obesogenic conditions defined by chronic exposure to HFD evidenced a delay in the vaginal opening (VO), external marker of puberty in female rodents, in HFD-fed G-KiRKO mice in comparison to HFD-fed control mice. In contrast, no differences were detected in term of first estrus, indirect marker of first ovulation, neither in the age of balano-preputial separation (BSP), external marker of puberty in male rodents, in HFD-fed KO mice versus controls. In adulthood, only HFD-fed G-KiRKO female mice displayed the LH hyper-response to Kp-10, as observed in lean conditions. In addition, high-fat diet exposure induced estrous cycle irregularities in GKiRKO female mice, as evidenced by longer cycle length and a higher number of days in diestrus and reduced number of days in estrus. The metabolic parameters, such as body weight gain and body composition remained unaltered in G-KiRKO mice. In HFD-fed G-KiRKO males, the levels of glucose during the GTT were lower than those observed for control mice, as already registered in conditions of normal feeding. In contrast, no differences in terms of insulin sensitivity (assessed by ITT) were detected. In the case of HFD-fed G-KiRKO female mice, no differences in basal glucose levels, neither in the response to glucose or insulin boluses, were detected. Finally, GFAP immunoreactivity was not different in the ARC nucleus of G-KiRKO male mice fed HFD in comparison to their controls. By contrast, GFAP immunoreactivity responses to acute exposure to HFD were significantly lower in the ARC of G-KiRKO male mice.

Esta Tesis Doctoral se ha dividido en tres bloques experimentales principales: En el Bloque Experimental 1, se ha realizado una caracterización fenotípica, farmacológica y comportamental exhaustiva, incluyéndose también análisis histológicos, del modelo de ratón con ablación congénita de Tacr2, denominado Tacr2 KO, para desvelar la implicación de la señalización por NK2R, y su interacción con kisspeptinas, en el control de la función reproductiva. Los estudios farmacológicos iniciales documentaron la capacidad del agonista de NK2R para evocar una respuesta en términos de secreción de LH tras su administración icv en ratones control, en la misma medida que lo hacen los otros agonistas de taquiquininas y la kisspeptina (Kp-10). Estudios farmacológicos similares en el modelo Tacr2 KO no mostraron alteraciones en la respuesta de LH a los agonistas de NK1R y NK3R así como de Kp-10. No obstante, en la respuesta de LH al agonista de NK2R se observó un dimorfismo sexual; esto es, mientras que en hembras la respuesta apareció parcialmente atenuada, en los machos Tacr2 KO esta respuesta estuvo prácticamente conservada, siendo esta última suprimida tras el bloqueo de la señalización por NK3R. La caracterización reproductiva de este modelo reveló que el inicio de la pubertad y la fertilidad no están comprometidas por la ausencia de señalización por NK2R, aunque sí se detectó una tendencia al incremento en el intervalo de cría, así como un deterioro en la función en las células de Sertoli en su interacción con las espermátides en los ratones macho adultos Tacr2 KO, aunque ninguna alteración en ovario ni útero en el caso de las hembras KO. Por otro lado, los ratones hembra Tacr2 KO presentaron niveles basales de secreción pulsátil de LH significativamente bajos, sin cambios aparentes en el número de pulsos de LH. Además, en las hembras Tacr2 KO, no se observó el incremento de los niveles de LH tras dos días después de la ovariectomía (OVX) que sí es detectado en las hembras controles. En estas mismas hembras Tacr2 KO ovariectomizadas, el perfil de temperatura de la cola monitorizado no reveló diferencias con respecto a los controles. En el caso de los machos Tacr2 KO, en condiciones de déficit energético consecuencia de un ayudo de 24 horas de duración, se registraron niveles de LH significativamente más bajos que los de los controles. Por otro lado, los estudios de comportamiento de preferencia por el sexo opuesto y de orina de hembras, en los que se incluye la monitorización de la velocidad y distancia recorrida durante el test, no mostraron ninguna respuesta diferencial entre los ratones KO y los controles. Adicionalmente, se analizaron indicadores metabólicos para valorar el impacto de la ausencia de señalización por NK2R sobre la homeostasis metabólica. Entre ellos la ganancia de peso corporal fue similar entre ratones Tacr2 KO y sus controles. Del mismo modo, los análisis de composición corporal indicaron que no había diferencias en el porcentaje de masa grasa y magra entre KO y controles, ni tampoco en el gasto energético, coeficiente respiratorio, actividad locomotora total y nocturna, ni en los patrones de ingesta durante el día y la noche registrados durante 24 horas. La medida de la presión sanguínea tampoco evidenció diferencias entre animales controles y KO. Finalmente, se observaron niveles basales de glucosa significativamente más elevados en los ratones macho Tacr2 KO tras la exposición crónica de estos a una dieta obesogénica. En el Bloque Experimental 2, se llevaron a cabo una serie de análisis proteómicos, moleculares e inmunohistoquímicos en modelos de ratón modificados genéticamente dirigidos a identificar nuevas dianas de acción de las kisspeptinas. En el primer estudio proteómico realizado en muestras del área preóptica del hipotálamo de ratones deficientes para kisspeptina, Kiss1 KO, inyectados intracerebroventriculamente (icv) con Kp-10, se observó la expresión diferencial de 30 proteínas implicadas en el metabolismo celular y balance energético, señalización celular, plegamiento de proteínas y plasticidad sináptica; identificándose en esta última categoría a la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), marcador de astrocitos. En el segundo estudio proteómico, en el que se empleó una tecnología de nueva generación, se detectó de nuevo que la expresión de GFAP y otros indicadores de astrocitos eran modificados en respuesta a la administración de kisspeptina; efecto que fue confirmado también por análisis de RT-qPCR y western blot. A partir de estas evidencias, implementamos una serie de análisis que permitieron demostrar por primera vez en cultivos primarios de astrocitos de rata y ratón la expresión del receptor de kisspeptina, Gpr54. Además, se comprobó que la señalización por kisspeptinas era funcional en estas células. In vivo se detectó la co-expresión de Gpr54 y GFAP en cerebro de ratón, registrándose un enriquecimiento del porcentaje de co-localización Gpr54- GFAP en las áreas hipotalámicas del órgano vascular de la lámina terminal (VOLT) y del área anteroventral periventricular (AVPV). Por último, mediante análisis por inmunohistoquímica se observaron cambios en el marcaje de GFAP en el núcleo arcuato (ARC) en dos modelos de ratón con eliminación congénita de Gpr54, si bien dichos cambios no fueron extensibles a la proteína S100B de unión a calcio, otro marcador de astrocitos. Finalmente, en el Bloque Experimental 3, se llevaron a cabo una serie de estudios fenotípicos y farmacológicos en un modelo novedoso de ratón con deleción selectiva del receptor Gpr54 en células GFAP-positivas, modelo de ratón denominado como G-KiRKO (del inglés GFAP cell-specific Kisspeptin Receptor KO), a fin de caracterizar el papel fisiológico de la señalización por kisspeptinas en astrocitos en el control de la función reproductiva. Primero, se validó el modelo mediante análisis moleculares e inmunohistoquímicos empleando una línea reportera de ratón y cultivos primarios de astrocitos; análisis que confirmaron la eficiente eliminación de Gpr54 de astrocitos. Sin embargo, la eliminación efectiva de la señalización de kisspeptina en astrocitos en el modelo G-KiRKO, no afectó la edad de llegada a la pubertad, ni modificó la secreción de LH ni alteró el ciclo estral en la edad adulta. En cambio, los ratones G-KiRKO presentaron respuestas significativamente aumentadas de LH tras la administración icv de Kp-10. Por otro lado, los ratones G-KiRKO tampoco presentaron alteraciones en parámetros metabólicos como son el peso y composición corporal, pero sí se registró una respuesta glucémica mejorada en el test de sobrecarga de glucosa, sin verse afectada la respuesta a insulina. A su vez, los ratones hembra G-KiRKO mostraron una atenuación del efecto de una dieta obesogénica (HFD) sobre el adelanto de la edad de apertura vaginal, marcador externo de llegada a la pubertad en roedores hembra. No obstante, no se afectó la edad de primer estro, indicador de la primera ovulación en roedores, ni tampoco la edad de la separación balanoprepucial en el caso de los ratones macho. En la edad adulta, solo en el caso de las hembras GKiRKO se detectó un aumento excesivo de la respuesta de LH tras la administración con Kp- 10, que previamente se había observado en condicionales basales. Además, con la exposición a la dieta rica en grasas, el ciclo estral en hembras KO se vio comprometido, registrándose ciclos más largos, con un mayor número de días en la fase de diestro y menos en estro. Por otro lado, los valores de parámetros metabólicos como el peso y la composición corporal en los ratones G-KiRKO fueron comparables a los de los controles. Bajo esta condición de estrés metabólico, solo los machos G-KiRKO mostraron una respuesta glucémica mejorada, similar a la observada en condiciones fisiológicas, sin alteraciones en la respuesta a insulina, y sin diferencias en la respuesta de glucosa ni de insulina entre las hembras controles y G-KiRKO. Por otro lado, los ratones macho G-KiRKO presentaron una respuesta disminuida en términos de inmunoreactividad de GFAP en el ARC tras exposición aguda a HFD.