Molecular subtypes of colorectal cancer: mechanisms involved in tumor progression and immune evasion

Abstract

Molecular classification of colorectal cancer (CRC) has led to the identification of four Consensus Molecular Subtypes (CMS), with different immune microenvironments linked to distinct prognosis and therapeutic responses. Recently, tumor budding has been found to be of prognostic significance for several cancers, including CRC. Still, the association between tumor budding and the different CMS subtypes of CRC and distinct immune profiles has not been fully elucidated. On the other hand, S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR) is a highly evolutionarily conserved denitrosylase enzyme, which is coded by ADH5 gene in humans and its impaired expression has been associated with different pathologies, including cancer. However, it is unknown the potential role of GSNOR/ADH5 in the pathogenesis of CRC and its relationship with the distinct CMS subtypes and tumor immune microenvironment. Therefore, the main objective of this thesis was to investigate the mechanisms involved in tumor progression and immune evasion in the different CMS subtypes, and particularly in relation with tumor budding and GSNOR/ADH5 expression. We first studied clinical CRC samples with different grades of tumor budding and their corresponding patient derived xenografts (PDXs) models, by analyzing gene expression signatures of immune checkpoints, toll-like receptors (TLRs), and chemokine families. We found that CMS subtypes and tumor budding grade were reliably reproduced in early passages of PDXs, and that high-grade tumor budding was intimately related with the poor-prognosis CMS4 mesenchymal subtype. In addition, an upregulation of negative regulatory immune checkpoints (PDL1, TIM-3, NOX2, and IDO1), TLRs (TLR1, TLR3, TLR4, and TLR6), and chemokine receptors and ligands (CXCR2, CXCR4, CXCL1, CXCL2, CXCL6, and CXCL9) was detected in high-grade tumor budding in both human samples and their corresponding xenografts. We also found a remarkable overexpression of the endothelial nitric synthase isoform (eNOS) in both the poor prognosis CMS4 subtype as well as in tumor with high-grade tumor budding, suggesting that the immunosuppressive capacity of nitric oxide (NO) may also facilitate tumor bud formation. Therefore, our data support a close link between high-grade tumor budding in CRC and a distinctive immunosuppressive microenvironment promoting tumor invasion, which may have a determinant role in the poor prognosis of the CMS4 mesenchymal subtype. In addition, our study also demonstrates that PDX models may constitute a robust preclinical platform for the development of novel therapies directed against tumor budding in CRC. We next investigated the significance of GSNOR/ADH5 in CRC, and the immunohistochemical and gene expression analyses showed that low levels of this denitrosylase enzyme were associated with the CMS4 aggressive CRC type, worse prognosis and poor survival in CRC patients. Besides, analysis of immune cell gene expression revealed an immunosuppressive microenvironment in GSNOR/ADH5-low tumors, with a marked reduction in T cell gene expression signature, downregulation of genes related to cytotoxicity (GNLY, GZMA, CXCR6, CD3D and TARP), and up-regulation of genes known to inhibit antitumor immunity (ITGA2, LGALS3 and CD46). CRISPR-Cas9–mediated ADH5 gene knockout (KO) in CRC cells confirmed that GSNOR/ADH5 deficiency confers higher tumorigenic capacity. Thus, in comparison with parental cells, ADH5-KO cells possessed greater ability to generate tumorospheres and tumor spheroids, and initiated tumors with higher efficiency in immunodeficient mice. Moreover, ADH5-KO cells had a lower expression of the intestinal differentiation marker CDX2 and a higher expression of the immune checkpoint protein PDL1, indicating enhanced immunoevasive capacity. Importantly, the higher tumorigenic potential of ADH5-KO cells was associated to a metabolic switch from oxidative phosphorylation to aerobic glycolysis, as indicated by decreased ATP content, higher 2-deoxyglucose sensitivity and increased lactate production. It is known that fragmentation of the mitochondrial network, which is accompanied by increased aerobic glycolysis and lactate production, occurs during cell dedifferentiation, malignant transformation, and cancer immune evasion. Significantly, mitochondrial network analysis confirmed that, compared to parental cells, ADH5-KO cells had a higher number of mitochondria per cell and a smaller mitochondrial diameter, which is consistent with a higher rate of mitochondrial fission and glycolytic reprogramming. Therefore, our results support that metabolic rewiring induced by impaired denitrosylation constitutes an important novel mechanism contributing to the acquisition of aggressive and immune evasive phenotypes in CRC. This new role of NO in the metabolic reprogramming of tumors may help explain some of the puzzling aspects of signaling mediated by NO in cancer, which may suggest new therapeutic approaches in this disease.

La clasificación molecular del cáncer colorrectal (CCR) ha conducido a la identificación de cuatro Subtipos Moleculares de Consenso (CMS), con diferentes microambientes inmunes vinculados a distintos pronósticos y respuestas terapéuticas. Recientemente, se ha descubierto que el budding tumoral tiene relevancia pronóstica en varios cánceres, incluido el CCR. Aun así, no se ha dilucidado por completo la asociación entre el budding tumoral y los diferentes subtipos CMS de CCR y los distintos perfiles inmunes. Por otro lado, la Snitrosoglutatión reductasa (GSNOR) es una enzima denitrosilasa altamente conservada evolutivamente, que está codificada por el gen ADH5 en humanos y cuya expresión alterada se ha asociado con diferentes patologías, incluyendo el cáncer. Sin embargo, no se conoce la relevancia de la GSNOR/ADH5 en la patogénesis del CCR y su relación con los distintos subtipos CMS y el microambiente tumoral inmune. Por tanto, el principal objetivo de esta tesis fue investigar los mecanismos involucrados en la progresión tumoral y en la evasión inmune en los diferentes subtipos CMS de CCR, especialmente en relación con el budding tumoral y la expresión de GSNOR/ADH5. En primer lugar, se estudiaron muestras clínicas de CCR con diferentes grados de budding y sus correspondientes modelos de xenoinjertos derivados de pacientes (PDXs), mediante el análisis de firmas de expresión génica de puntos de control inmune, receptores toll-like (TLRs), y familias de citoquinas. Significativamente, los distintos subtipos CMS y el grado de budding tumoral fueron fielmente reproducidos en los primeros pases de PDXs. Además, el alto grado de budding tumoral estuvo estrechamente asociado con el subtipo mesenquimal CMS4 de mal pronóstico. En los tumores con alto grado de budding se observó una sobreexpresión de reguladores negativos de puntos de control inmune (PDL1, TIM-3, NOX2, and IDO1), TLRs (TLR1, TLR3, TLR4, and TLR6), receptores de quimioquinas y sus ligandos (CXCR2, CXCR4, CXCL1, CXCL2, CXCL6, and CXCL9), tanto en las muestras clínicas como en sus correspondientes modelos PDXs. También se encontró una notable sobreexpresión de la isoforma endotelial de la sintasa de óxido nítrico (eNOS), tanto en los tumores CMS4 de mal pronóstico como en aquellos con un alto grado de budding tumoral, lo que sugiere que la capacidad inmunosupresora del óxido nítrico (NO) también puede facilitar la formación de buds tumorales. Estos resultados indican un estrecho vínculo entre el alto grado de budding tumoral en CCR y un microambiente inmunosupresor distintivo que promueve la invasión tumoral, y que puede tener un papel determinante en el subtipo mesenquimal CMS4 de mal pronóstico. Además, este estudio también demuestra que los modelos PDXs pueden constituir una sólida plataforma preclínica para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas contra el budding tumoral en CCR. A continuación, se investigó la importancia de la denitrosilasa GSNOR/ADH5 en CCR, y los análisis inmunohistoquímicos y de expresión génica mostraron que los niveles bajos de esta enzima se asociaron con el tipo agresivo CMS4 de CCR, con características clínicas de peor pronóstico y con una baja supervivencia en pacientes de CCR. Además, el análisis de expresión génica del perfil inmune reveló un microambiente inmunosupresor en tumores con niveles bajos de GSNOR/ADH5, con una marcada reducción en la firma de expresión génica de células T, una menor expresión de genes relacionados con citotoxicidad (GNLY, GZMA, CXCR6, CD3D y TARP), y una mayor expresión de genes que inhiben la inmunidad antitumoral (ITGA2, LGALS3 y CD46). La eliminación del gen ADH5 (KO) mediante tecnología CRISPR-Cas9 en células de CCR confirmó que la deficiencia de GSNOR/ADH5 confiere una mayor capacidad tumorigénica. Así, en comparación con las células parentales, las células ADH5-KO demostraron una mayor capacidad para generar tumorosferas y esferoides tumorales, e iniciaron tumores con mayor eficacia en ratones inmunodeficientes. Además, las células ADH5-KO mostraron una menor expresión del marcador de diferenciación intestinal CDX2 y una mayor expresión de la proteína del punto de control inmune PDL1, indicando una mayor capacidad inmunoevasiva. Es importante destacar que la mayor tumorigenicidad de las células ADH5-KO se asoció con una reprogramación metabólica desde la fosforilación oxidativa hacia un aumento de la glucólisis aerobia, con un menor contenido basal de ATP, una mayor sensibilidad a la 2-desoxiglucosa y una mayor producción de lactato. Se sabe que la fragmentación de la red mitocondrial, que conduce a un aumento de la glucólisis aeróbica y de la producción de lactato, se produce durante la desdiferenciación celular, la transformación maligna y la evasión inmune en cáncer. De manera significativa, el análisis de la red mitocondrial confirmó que, en comparación con las células parentales, las células ADH5-KO mostraron un mayor número de mitocondrias por célula y un diámetro mitocondrial más pequeño, lo que es consistente con una mayor tasa de fisión mitocondrial y reprogramación glucolítica. Por lo tanto, estos resultados apoyan que la reprogramación metabólica inducida por una alterada desnitrosilación constituye un importante nuevo mecanismo que contribuye a la adquisición de fenotipos agresivos e inmunoevasores en CCR. Este nuevo papel del NO en la reprogramación metabólica en cáncer puede ayudar a explicar algunos de los aspectos desconcertantes de la señalización mediada por el NO en cáncer, y puede sugerir nuevas aproximaciones terapéuticas en esta enfermedad.