Sistemas de detección ultrasensible de moléculas de distinta naturaleza para la detección temprana del cáncer

Abstract

La técnica ELISA (del inglés “enzyme-linked immunosorbent assay”) es el método de rutina más utilizado y fiable para la detección de marcadores proteicos relevantes en la asistencia sanitaria. Aumentar la sensibilidad de este ensayo es crucial para detectar biomoléculas relacionadas con trastornos de salud y facilitar el diagnóstico en las primeras etapas de enfermedades como el cáncer, permitiendo de esta manera una posible disminución de la mortalidad. Así, se han desarrollado varios métodos para mejorar la sensibilidad del ELISA mediante la inmovilización de anticuerpos en las placas de poliestireno. En este trabajo hemos desarrollado dos estrategias de inmovilización de anticuerpos a un sustrato sólido con el fin de aumentar la sensibilidad en el ensayo ELISA. En una de las estrategias hemos involucrado la reacción de alta eficiencia y especificidad entre la tetracina y el trans-cicloocteno con el fin de aumentar la densidad del anticuerpo en la superficie; y en la otra, la afinidad del dominio de unión a quitina por su sustrato como método para lograr la correcta orientación del anticuerpo inmovilizado. Para la primera estrategia se prepararon superficies con tetracina, mientras que el anticuerpo fue modificado con TCO. La preparación de las superficies se llevó a cabo de tres formas diferentes: 1) partiendo de placas aminadas comerciales tratadas con glutaraldehído y lisina para aumentar el número de grupos NH2 en superficie, 2) partiendo de placas aminadas mediante un proceso de química en mojado y 3) recubriendo placas MaxiSorp con la proteína BSA marcada con 20 tetracinas por molécula. Para la evaluación de las superficies se utilizaron tres modelos de ELISA, dos de ellos recubriendo con el anticuerpo de baja afinidad anti c-myc (9E10) marcado con TCO, donde se detecta la proteína c-myc-GST-IL8h o c-myc-IL6h, y como anticuerpo de detección el específico para la citoquina correspondiente. El otro ELISA, para la evaluación de las superficies, se utilizó para detectar la proteína CEA, relacionada con el diagnóstico del cáncer colorrectal. En todos los casos se observó un aumento de la sensibilidad del ELISA desarrollado en las superficies preparadas con tetracina comparado con la superficie estándar. En la detección de c-myc-GST-IL8h se obtuvo un aumento de sensibilidad del ELISA, comparado con las superficies estándar, de 2,6 veces para las superficies preparadas a partir de placas aminadas comerciales, de 11 veces partiendo de placas aminadas mediante química en mojado y de 13,7 veces en placas previamente recubiertas con BSA-tetracina. Del mismo modo, en el ELISA de detección de c-myc IL6h se aumentó la sensibilidad 9 veces en placas con tetracina a partir de placas aminadas mediante química en mojado y, por último, el ELISA de detección de CEA tuvo un aumento de 12 veces en placas previamente recubiertas con BSA-tetracina. En la segunda estrategia fueron preparadas superficies de poliestireno con quitosano acetilado mediante un proceso de acetilación in situ, mientras que, por otro lado, fue preparado el anticuerpo anti cmyc (9E10) unido a ChBD. Esta unión fue realizada de forma química a través de una reacción de tipo química clic y de forma recombinante fusionando ChBD al carboxilo terminal del anticuerpo. Ambos anticuerpos fueron evaluados mediante el ELISA de detección de la proteína c-myc-GST-IL8h, en las placas de quitosano acetilado, observándose un aumento de la sensibilidad de 6 veces (p<0,0001) con respecto al ELISA realizado en la superficie estándar usando el anticuerpo obtenido de forma recombinante. Asimismo, se diseñó un método de detección de dos moléculas de distinta naturaleza en un ensayo tipo multiplex de spot en placas de ELISA. El objetivo fue determinar la concentración de dos moléculas relacionadas con el cáncer colorrectal, el miRNA-29b y la proteína CEA. Para la detección del miRNA mediante un ensayo inmunoenzimático, se desarrolló un método directo de hibridación in situ y otro basado en la técnica PCR-ELISA. Con esta última técnica de detección de ácidos nucleicos se logró la detección del miRNA-29b con un LOD de 1358 moléculas totales simultáneamente con la proteína CEA, con un LOD de 2,54 ng/ml. En este trabajo se demuestra, a través de la reacción tetracina - TCO, que la sensibilidad del ensayo ELISA mejora de forma significativa usando un sistema de inmovilización de anticuerpos que permita que estos queden fijados mediante un enlace covalente a la superficie. Además, la correcta orientación de los anticuerpos en la superficie de un ensayo de ELISA mejora la sensibilidad de la técnica. Se demuestra también la detección simultánea de dos moléculas de distinta naturaleza (un miRNA y una proteína) en un ensayo inmunoenzimático.

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most widely used and reliable clinical routine method for the detection of essential protein markers in healthcare. Improving ELISAs is crucial to detect biomolecules related to health disorders and facilitating diagnosis at the early disease stages such as cancer, thus allowing the possibility of a decrease in mortality. Several methods have been carried out to improve the ELISA sensitivity through antibodies immobilization on the microtiter plates. In this work we have developed two strategies of antibodies immobilization on a solid support to improve the ELISA sensitivity. To increase antibody density on the surface, one strategy was related to the highly efficient and specific reaction between tetrazine and trans cyclooctene. The second strategy was based on the affinity between chitin binding domain and its substrate to promote the adequate capture antibody orientation. To develop the first strategy, surfaces with exposed tetrazine groups were prepared, while antibody was modified with TCO. The surfaces with tetrazine were carried out in three different ways: 1) from commercial aminated plates treated with glutaraldehyde and lysine to increase the NH2 groups, 2) from aminated plates after a wet chemical process and 3) from Maxisorp plates coated with BSA modified with 20 tetrazine per molecule. The surfaces were evaluated using three ELISA models, two of them using the low affinity antibody anti c-myc (9E10) modified with TCO as a capture antibody. This procedure was carried out to detect the recombinant proteins c-myc-GST-IL8h and/or c-myc-IL6h, and the detection was performed with the corresponding specific cytokine biotinylated antibody. The third ELISA for the evaluation of surfaces was a CEA detection ELISA, a protein related with colorectal cancer. The sensitivity increased in all the surfaces treated with tetrazine in comparison with the standard unmodified surfaces. Thus, in commercial aminated plates treated with tetrazine, the detection sensitivity of c-myc-GST-human IL8 was 2.6-fold increase, on tetrazine surfaces previously aminated with a wet chemical process 11-fold and 13.7-fold on plates coated with BSA-tetrazine. On the other hand, the sensitivity of c-myc IL6h detection ELISA increased 9-fold in tetrazine treated surfaces using aminated plates after a wet chemical process, while CEA ELISA detection increased 12-fold on surfaces plates previously coated with BSA-tetrazine. For the second strategy, we combined polystyrene surfaces coated with acetylated chitosan prepared by an in-situ acetylation process. In this case, the anti-cmyc antibody (9E10) was linked to ChBD. The anti c-myc-ChBD antibody was obtained using a click chemistry reaction or cloning a recombinant protein with ChBD attached to the end carboxyl of anti c-myc. Both anti cmyc- ChBD antibodies were evaluated on chitosan acetylated surfaces using a sandwich detection ELISA to detect c-myc-GST-IL8h. The ELISA assays developed on chitin surfaces were 6-fold more sensitive (p<0.0001) than those performed on standard surface. Besides, a spot multiplex ELISA was designed to detect two molecules of different nature in the same assay: the CEA protein and the miRNA-29b, both related with colorectal cancer. The immunoenzymatic detection of miRNA was developed through in situ hybridization or by a PCRELISA technique. Using a PCR-ELISA a LOD of 1.358 molecules to miRNA-29b was obtained, while the LOD of CEA detection was 2.54 ng/ml, both molecules were simultaneously detected in the same well. In this work we show that it is possible to improve the ELISA sensitivity using an immobilization system through a tetrazine-TCO reaction, which allow the capture antibodies to bind covalently on to surfaces. Moreover, the adequate capture antibody orientation on surfaces also improves the ELISA technique sensitivity. On the other hand, we also demonstrate, the simultaneous detection of a miRNA and a protein, two different nature molecules, by mean of an immunoenzymatic assay.